HOÀNG THẠCH THẢO KHẢO sát hàm LƯỢNG CURCUMIN TRONG một số mẫu NGHỆ (CURCUMA SPP ) ở MIỀN bắc VIỆT NAM BẰNG TLC KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Phương pháp sắc ký lớp mỏng khảo sát hàm lượng curcumin có trong thân rễ của một số mẫu Nghệ .... Các thành phần chính tạo nên tác dụng của đa số các loài Nghệ là nhóm chất curcuminoids

Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM BẰNG TLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI, 2020

Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM BẰNG TLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Nghiêm Đức Trọng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Thực vật Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI, 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, tôi đã nhận được rất nhiều

sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các thầy cô tại Bộ môn Thực Vật, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Nghiêm Đức

Trọng – giảng viên Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã trực tiếp

hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn ThS Phạm Thị Linh Giang cùng toàn thể các thầy cô, các chị kỹ

thuật viên Bộ môn Thực Vật đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Tôi cũng xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:

Bộ môn Thực Vật đã hộ trợ trang thiết bị máy móc giúp tôi hoàn thành khóa luận Ban giám hiệu Nhà trường, các giảng viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng xin được cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên và quan tâm, chăm sóc, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Hoàng Thạch Thảo

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Curcuma L 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Curcuma L 2

1.1.1 Lịch sử về chi Curcuma L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của các loài thuộc chi Curcuma L 2

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Ứng dụng một số loài trong chi Curcuma L 5

1.2 Tổng quan về curcumin 7

1.2.1 Công thức hóa học 7

1.2.2 Tính chất vật lý 7

1.2.3 Tính chất hóa học 8

1.2.4 Hoạt tính sinh học 9

1.2.5 Ứng dụng của curcumin 9

1.2.6 Mối tương quan giữa hàm lượng curcumin với màu sắc thân rễ Nghệ 10

1.3 Các phương pháp định tính, định lượng curcumin 11

1.3.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 11

1.3.2 Định lượng curcuminoid bằng đo quang phổ hấp phụ tử ngoại và khả kiến 12 1.3.3 Định lượng curcumin bằng phương pháp HPLC 12

1.3.4 Định lượng curcumin bằng HPTLC 13

1.4 Tổng quan về phương pháp HPTLC 13

1.4.1 Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng 13

1.4.2 Nguyên tắc của HPTLC 14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.2.1 Chất chuẩn 17

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 17

2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 18

2.3.2 Nghiên cứu hàm lượng curcumin 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 18

2.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng khảo sát hàm lượng curcumin có trong thân rễ của một số mẫu Nghệ 18

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

2.4.4 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng vào định lượng một số mẫu Nghệ Curcuma spp 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Phân tích đặc điểm hình thái thân rễ của các mẫu thu được 24

3.2 Xây dựng và xác định hàm lượng curcumin các mẫu Nghệ thu được 32

3.2.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng 32

3.2.2 Khảo sát quy trình chiết xuất 32

3.3 Thẩm định quy trình phân tích 33

3.3.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc 33

3.3.2 Sự tương thích của hệ thống 34

3.3.3 Khoảng tuyến tính 34

3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp 35

3.3.5 Độ đúng 36

3.4 Ứng dụng quy trình vừa xây dựng để khảo sát hàm lượng curcumin trong một số mẫu Nghệ Curcuma spp 37

3.4.1 Quy trình chiết xuất curcumin từ củ Nghệ 37

3.4.2 Kết quả định lượng 38

3.5 Bàn luận 41

3.5.1 Về thiết kế nghiên cứu 41

3.5.2 Về hình thái và phân loại thân rễ 42

3.5.3 Về quy trình định lượng 43

3.5.4 Về kết quả định lượng curmin trong các mẫu 44

3.5.5 Về tương quan màu sắc và hàm lượng curcumin 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AOAC: Association of official Analytical Chemists – Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

BDMC: Bismethoxycurcumin

C.: Curcuma

DMC: Demethoxycurcumin

HPLC: High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatography – sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao M: khối lượng

MeOH: Methanol

RF: Retention factor – hệ số lưu giữ

RSD: Relative Standard Deviation – Độ lệch chuẩn tương đối

Spic: Diện tích pic

STT: Số thứ tự

TLC: Thin Layer Chromatography – sắc ký lớp mỏng

TNHH TM: Trách nhiệm hữu hạn Thương mại

TVO: thầy Trần Văn Ơn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các tính chất vật lý đặc trưng của các curcuminoids [40] 8

Bảng 1.2 So sánh một số tham số của HPTLC và TLC tại bảng [2] 15

Bảng 2.1 Tên khoa học và mã của các mẫu thu được 16

Bảng 3.1 Bảng mô tả đặc điểm hình thái các mẫu Nghệ 26

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết curcumin 33

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ tương thích hệ thống 34

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính 35

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp 36

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng 36

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng curcumin trong một số mẫu Nghệ (Curcuma spp.) ở miền Bắc Việt Nam 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Thành phần chủ yếu trong curcuminoids 7

Hình 1.2.Công thức hóa học chung của curcuminoids 7

Hình 2.1: Quy trình xử lý mẫu sơ bộ 19

Hình 3.1 Bảng phân loại các mẫu theo màu sắc 24

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái các mẫu Nghệ 25

Hình 3.3 Khảo sát hệ dung môi khai triển 32

Hình 3.4 Khảo sát bước sóng phát hiện (Cu-10) 32

Hình 3.5 Thẩm định độ đặc hiệu 34

Hình 3.6 Đồ thị tương quan tuyến tính giữa lượng curcumin/vết và Spic 35

Hình 3.7 Quy trình chiết xuất curcumin từ củ Nghệ 37

Hình 3.8 Vết sắc ký của một số mẫu Nghệ 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Nghệ (Curcuma L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là một chi lớn với hơn 120

loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Ở Việt Nam, hiện nay có tới 29 loài

thuộc chi Curcuma [6], [38], [39] Nghệ được sử dụng rộng rãi trong một số bài thuốc y

học dân gian và y học hiện đại, một số loài được sử dụng để cất tinh dầu, làm gia vị trong thực phẩm Trong dân gian, củ nghệ được dùng rất nhiều trong các bài thuốc chữa đau dạ dày tá tràng, làm liền sẹo lành vết thương, làm đẹp Các thành phần chính tạo nên tác dụng của đa số các loài Nghệ là nhóm chất curcuminoids và tinh dầu, trong đó curcumin nhóm curcuminoids là một thành phần được quan tâm hàng đầu Curcumin được báo cáo đóng góp vai trò quan trọng trong các hoạt tính sinh học của củ Nghệ như chống ung thư [18], [20], chống oxy hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ [45] và kháng viêm [49] Thân rễ Nghệ đa dạng về màu sắc từ trắng, vàng, đỏ, xanh, đen tương ứng với các tên gọi trong dân gian củ Nghệ trắng, Nghệ vàng, Nghệ đỏ, Nghệ đen Đã có rất nhiều nghiên cứu cũng như bài báo khoa học về chi Nghệ nhưng chưa có nghiên cứu nào nói về sự có mặt hay không có mặt của curcumin trong số lượng lớn mẫu Nghệ Curcumin

mới chỉ được nghiên cứu nhiều trên Nghệ vàng (Curcuma longa L.) còn các loài khác thì

rất ít nghiên cứu Nhiều ý kiến cho rằng Nghệ có màu vàng thì chứa nhiều curcumin còn

những loài Nghệ không có màu vàng thì không có curcumin Đề tài “Khảo sát hàm lượng

curcumin trong một số mẫu Nghệ (Curcuma spp.) ở miền Bắc Việt Nam bằng TLC”

đã thu thập được số lượng lớn mẫu (23 mẫu) , với các hình thái, kích thước và màu sắc thân

rễ hết sức đa dạng đã bước đầu xây dựng phương pháp nghiên cứu thành phần curcumin trong thân rễ cây Nghệ, xác định sự có mặt của curcumin trong các mẫu để định hướng khai thác và sử dụng nguyên liệu này tại Việt Nam làm tăng giá trị sử dụng của dược liệu Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Phân tích sự đa dạng về hình thái, màu sắc thân rễ của các mẫu Nghệ thu được

- Xây dựng, thẩm định phương pháp và xác định hàm lượng curcumin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Curcuma L

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [4], chi Curcuma L có vị

trí phân loại như sau:

Chi Curcuma được Linnaeus được mô tả năm 1753 [37] Tên chung có nguồn gốc

từ tiếng Ả Rập là “Kurcum” có nghĩa là màu vàng, và Curcuma là tên phiên dịch của Tiếng

Latin Hai loài Nghệ đầu tiên được báo cáo dưới tên là “Kua” và “Manjella Kua”, sau này

được đổi tên là C zedoaria Rosc và C longa L [44]

Năm 1890, Baker thống kê 29 loài ở Ấn Độ Năm 1908, Gagnepain đã báo cáo 17 loài từ Indo-China Năm 1924, Ridley và Holttum năm 1950 đã công nhận 9 loài từ Malay Peninsula Năm 1963, Backer và Bakhuizen đã báo cáo 18 loài từ Java [46]

Năm 1999, Velayudhan và cộng sự đã báo cáo có 40 loài ở Ấn Độ [44] Ở Trung Quốc, năm 2000 Wu và Larsen báo cáo có 12 loài [52] Theo Nguyễn Quốc Bình, chi

Curcuma L có khoảng 120 loài và phân bố khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu

Á, châu Phi đặc biệt là ở Nam Á và Đông Nam Á Ở Việt Nam, hiện nay đã thống kê được

29 loài Curcuma và phân bố khắp từ Bắc vào Nam [6], [38], [39]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của các loài thuộc chi Curcuma L

Cây thảo, cao 0,5 – 2 m, rễ phần lớn dạng ống, thân rễ có nhánh, dày, nạc, có mùi thơm Lá có phiến hình mác rộng hay thuôn, hiếm khi là hình dải hẹp; cuống lá thường dài; lưỡi ngắn Cụm hoa mọc từ thân rễ hay giữa các bẹ lá, thường hoa xuất hiện sau khi có lá,

đôi khi hoa xuất hiện cùng lá hay trước lá Các lá bắc dính với nhau nhiều hay ít ở phía dưới và làm thành dạng túi, phần trên xòe ra, mỗi lá bắc chứa một cụm nhỏ có 2 – 7 hoa, phía đầu các lá bắc có màu sắc khác nhau, các lá bắc con mở đến gốc Hoa có phần dưới đài hình ống hay chuông ngắn, trên xẻ sâu 1 bên, đầu xẻ thành 2 hoặc 3 thùy dạng răng nhỏ; ống tràng dạng phễu hẹp, trên 3 thùy, các thùy gần bằng nhau hay thùy giữa hơi dài hơn hai thùy bên, đầu dạng mũ; bộ nhị có chỉ nhị ngắn, rộng; bao phấn 2 ô, gốc ô bao phấn kéo dài xuống phía dưới thành dạng cựa hay không, phần phụ trung đới kéo dài lên trên thành mào hay không; cánh môi có phần giữa dày, mỏng hơn ở hai bên [5]

Khóa định loại các loài chi Curcuma L ở Việt Nam [5]

1A Cụm hoa ở giữa các lá

2A Gốc bao phấn có cựa

3A Phiến lá dạng dài hay mũi mác hẹp, chiều dài hơn chiều rộng 10 lần hay hơn 4A Lá bắc bất thụ ở phía trên, màu hồng tím, lá bắc hữu thụ ở phía dưới màu xanh

lục, cánh môi màu tím ……… C alismatifolia

4B Tất cả các lá bắc đều có màu tím hồng, cánh môi màu vàng ở giữa, không có

màu tím……….……… C sparganifolia

3B Phiến lá dạng trái xoan, bầu dục rộng hay dạng trứng, chiều dài hơn chiều rộng 1,3-3,5 lần

5A Mặt dưới phiến lá có lông

6A Cây cao đến 1m, phiến lá dài 30-60 cm, trung đới không kéo dài thành

9A Tất cả các lá bắc đều chứa hoa, màu xanh……… C harmandii

9B Có lá bắc chứa hoa, có lá bắc không chứa hoa, màu trắng-xanh hay trắng

hồng……… ……….C longa

8B Trung đới kéo dài lên phía trên tạo thành mào

10A Cây cao 0,6-1,1 m, cuống cụm hoa dài đến 2 cm……… C rhomba

10B Cây cao 20-40 cm

11A Cây cao đến 20 cm, cánh môi màu trắng, gân giữa màu vàng

……… C pierreana 11B Cây cao 35-40 cm, cánh môi màu vàng……… C stenochila

2B Gốc bao phấn không có cựa

12A Phiến lá dạng dài, chiều dài hơn chiều rộng 6-18 lần……… …….C gracillima

12B Phiến lá dạng trứng hay xoan, chiều dài hơn chiều rộng không quá 3-4

lần……… ……… C parviflora

1B Cụm hoa mọc ở bên, riêng với thân có lá

13A Dọc hai bên gân giữa lá mặt trên có màu nâu đỏ

14A Lá không có cuống, thân rễ cắt ngang có màu xanh xám … … C aeruginosa

14B Lá có cuống, cuống dài 1-30 cm, thân rễ cắt ngang màu vàng hay màu vàng da cam

15A Lá bắc chứa hoa dài 2,8-3 cm, ngắn hơn chiều rộng, màu xanh tái

……….… ….…C zanthorrhiza

15B Lá bắc chứa hoa dài 4-5 cm, dạng trái xoan hay mũi mác, màu xanh tái, mép

màu đỏ……… ……….………… C zedoaria

13B Dọc hai bên gân giữa lá mặt trên không có màu nâu đỏ

16A Cây cao đến 50 cm, phiến lá dài 15-30 cm

17A Cuống lá dài 12-15 cm, thùy tràng dài 1,2-1,5 cm, cánh môi hình bầu dục, dài

18A Lá bắc hữu thụ gần tròn, đường kính 5-6 cm……….C elata 18B Lá bắc hữu thụ hình trái xoan, cỡ 4,5-5 x 2-2,5 cm……….C aromatica Khóa định loại các loài trên là của 19 loài thuộc chi Curcuma Hiện nay mới tìm thêm được 10 loài nữa vẫn chưa được bổ sung vào danh sách đó là: C arida Škorničk & N.S.Lý [29], C sahuynhensis Škorničk & N.S.Lý [29], C cotuana Lưu, Škorničk &

H.Đ.Trần [38],C leonidii Škorničk & Lưu [31], C newmanii Škorničk [30], C xanthella Škorničk [30], C pambrosima Sˇkornicˇk & N S Lý [33], C pygmaea Škornicˇk & Šída

f [34], C singularis Gagnep [39], C vitellina Škorničk & H Đ Trân [32]

Tinh dầu Nghệ có thể được thu từ lá, thân rễ bằng phương pháp cất kéo hơi nước Trong tinh dầu có một số thành phần như: aliphatic, monoterpen, sesquiterpen và các hợp chất chứa nhân thơm, trong đó có nhóm monoterpen và sesquiterpen là 2 nhóm chất chính [50] Thành phần tinh dầu khá đa dạng và phức tạp, chủ yếu là các hợp chất sesquiterpen

Ngoài thành phần về tinh dầu và curcuminoids thân rễ Nghệ còn chứa các hợp chất

flavonoid (loài C longa có quercetin, C zedoaria có naringenin, lá bắc trên của C

alismatifolia có anthocyamin) [50], alcaloid (rễ loài C longa có anrantiamid, rễ loài C wenyujin Y.H.Chen & C.Ling có curcuminol [50]), glycosid tim [8] và các hợp chất khác

như chất màu, acid amin, chất béo, đường khử, acid hữu cơ [10], [14], diphenylalkaloids, dẫn xuất phenylpropen, terpenoids, steroids,…[50]

1.1.4 Ứng dụng một số loài trong chi Curcuma L

Nghệ là cây thuốc quý, không độc, có ứng dụng rất thiết thực trong dược phẩm và thực phẩm Nghệ có rất nhiều ứng dụng, đặc biệt là Nghệ vàng và Nghệ đen

Thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) được dùng với công dụng chữa kinh nguyệt

không đều, bế kinh, ứ máu, đau tức vùng ngực bụng, viêm loét dạ dày, sau đẻ máu xấu không ra, kết hòn cục đau bụng [7], [15] Rễ củ của Nghệ vàng (uất kim) dùng để chữa khí huyết uất trệ, chảy máu cam, đái ra máu, dùng ngoài chữa vết thương lâu lên da [15]

Nghệ đen (C zedoaria) dùng trong đông y và tây y: có tác dụng hành khí, phá huyết,

chữa đau bụng, đau ngực, ăn uống không tiêu, chữa ho, , đã được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng chữa một số bệnh đường tiêu hóa, cảm lạnh, làm sạch mụn nhọt, các vết thương, do loài Nghệ đen có tính kháng khuẩn và chống oxy hóa [12], [27]

Loài C aeruginosa Roxb được trồng làm thuốc chữa bệnh đau bụng, ăn không tiêu,

hành kinh không thông, đầy hơi [12]

Nghệ trắng (C aromatica Salisb.) là vị thuốc dùng chữa bệnh đau dạ dày, đau bụng,

đầy hơi, ăn không tiêu, viêm gan mạn tính, xơ gan, hoàng đản, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, sử dụng để chống oxy hóa và kháng khuẩn [7], [27]

Loài C mangga Valeton & Zijp có chứa curcuminoids và diterpen có tác dụng

chống viêm, giải độc, điều trị loét dạ dày, đau ngực sốt, bệnh ngoài da và chữa lành tử cung [48]

Nghệ rừng (C kwangsiensis S.G.Lee & C.F.Liang) thân rễ (củ) ngâm rượu uống

chữa đau bụng (kinh nghiệm ở Đắk Choong, huyện Đắk Glei, Kon Tum) [6]

Nghệ Nam Bộ (C cochinchinensis Gagnep.) thân rễ có vị cay, hơi có mùi Nghệ,

được dùng chữa bệnh đau dạ dày [6]

Nghệ lá hẹp (C angustifolia Roxb.) thân rễ giàu chất dinh dưỡng dùng để phục hồi

sức khỏe cho người ốm, đặc biệt cho trẻ em cai sữa, vàng da, rối loạn thận [6]

Nghệ rễ vàng (C zanthorrhiza Roxb.) thân rễ được dùng làm thuốc chữa bệnh (các

bệnh liên quan đến gan; bệnh đường tiết niệu và viêm mô tế bào) [6]

1.2 Tổng quan về curcumin

Hình 1.1 Thành phần chủ yếu trong curcuminoids

Cấu trúc của curcuminoids (C21H20O6) được xác định lần đầu tiên vào năm 1910 (Kazimierz Kostanecki, J Miłobędzka and Wiktor Lampe) Curcuminoids là những dẫn xuất diarylheptan gồm curcumin, DCM, BDCM Chúng là những hợp chất phenolic, hầu hết các dẫn xuất đều khác nhau nhóm thế trên gốc phenyl Hợp chất chiếm chủ yếu và được nghiên cứu nhiều nhất là curcumin (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC (3%) [18], [19] Curcumin tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DCM và BDCM vẫn chưa có trên thị trường

1.2.1 Công thức hóa học

Hình 1.2.Công thức hóa học chung của curcuminoids

Curcumin: R1 = R2 = OCH3; DMC: R1 = H, R2 = OCH3; BDMC: R1 = R2 = H Danh pháp quốc tế của các curcuminoid:

- Curcumin:1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione [18]

- DCM: dione [19]

1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 BDCM: 1,71-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 bis1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 (41-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 hydroxyphenyl)1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 hepta1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 1,61-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 diene1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 3,51-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5 dione [19]

1.2.2 Tính chất vật lý

Curcumin có dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi, bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng Nhiệt độ nóng chảy 180 – 185oC Khi ở dạng dung dịch curcumin

dễ bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ, tan trong chất béo, ethanol, methanol, diclomethan, aceton, acid acetic và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan < 10 mg ở 25oC).Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngả tím, tan trong môi trường acid có màu đỏ tươi Không tan trong n-hexan [41].Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 420 – 430 nm

Bảng 1.1 Các tính chất vật lý đặc trưng của các curcuminoids [40]

Hình dạng Tinh thể hình kim

màu vàng tươi

Tinh thể hình kim màu đỏ cam

Tinh thể hình kim màu vàng cam

1.2.3 Tính chất hóa học

❖ Sự điện ly

Trong môi trường pH < 1, curcumin có màu đỏ thể hiện trạng thái proton hóa H4A+

Ở pH từ 1 – 7, hầu hết các diferulylmethane ở dạng trung hòa H3A, có khả năng hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng Ở pH > 7,5, màu dung dịch chuyển sang đỏ Giá trị hằng

số phân ly pKa của 3 proton dạng acid của curcumin (dạng H2A-, HA2, A3- ) được xác định tương ứng là 7,3, 8,5 và 9,0 [23].

❖ Phản ứng phân hủy

Curcumin dễ dàng phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng hoặc môi trường kiềm:

Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng: Dưới tác dụng của ánh sáng, curcumin phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic, acid ferulic Curcumin cũng không bền ngay cả khi có hoặc không có mặt oxy Khi có mặt của oxy và ánh sáng curcumin phân hủy thành 4-vinylguaialcol và vanillin [25]

Phân hủy trong môi trường kiềm: Tonnesen và Karlsen (1985) đã nghiên cứu quá trình kiềm phân hủy của curcumin trong khoảng pH từ 7 đến 10 bằng HPLC Sản phẩm của quá trình phân hủy là acid ferulic và feruloylmethan [25], [51]

❖ Phản ứng cộng với H 2

Trong hợp chất curcumin có chứa các hydrocarbon chưa no, do đó có khả năng tham gia phản ứng cộng một, hai hoặc ba phân tử H2 tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin [19]

❖ Phản ứng tạo phức với kim loại

Phức kim loại bao gồm ion kim loại trung tâm liên kết với các phân tử khác bằng liên kết cộng hóa trị Curcuminoids với cấu trúc β – diceton trong môi trường acid hay trung tính nằm dưới dạng hỗ biến ceton – enol đối xứng và ổn định, làm cho curcuminoids có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại khác: Mn2+, Fe2+, Cu2+, Ga3+, … [42]

❖ Phản ứng amin hóa

Curcumin là hợp chất diceton nên có thể cho phản ứng với các amin bậc nhất (RNH2), semicarbazid (NH2NHCONH2), hydroxylamin (NH2OH), hydrazin (NH2-NH2) …

để tạo thành các dẫn xuất amin tương ứng

❖ Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzene

Các cặp electron chưa liên kết của oxy nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng benzen làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl trở nên linh động hơn Điều này giải thích tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin [26]

Curcumin thuộc nhóm chất màu curcuminoids, là hoạt chất chính có vai trò quan trọng trong tác dụng sinh học của cây Nghệ Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để chứng minh tác dụng điều trị của curcumin: chống viêm tủy, ung thư tụy, ung thư ruột kết, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến [43] Các nghiên cứu cũng đã cho thấy tác dụng chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, chống thiếu máu cục bộ Đặc biệt là khả năng vô hiệu hóa các

tế bào ung thư và hình thành các tế bào ung thư mới mà không gây hại cho các tế bào lành bên cạnh, curcumin có tác dụng ngăn ngừa và chống ung thư Nhiều nghiên cứu cũng chỉ

ra curcumin có khả năng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày, ruột, vòm họng,

dạ con và bàng quang [16], [35] Ngoài ra, curcumin còn có tác dụng ức chế sự phát triển

của trực khuẩn lao, Salmonella paratiphi và tụ cầu vàng Vì vậy, curcumin còn có tác dụng

kháng khuẩn, kháng nấm và điều trị lao [3], [11]

❖ Trong công nghiệp thực phẩm

Curcumin đã được các tổ chức FDA ở Mỹ, Canada và EU cho phép sử dụng làm chất màu (mã số E100) để tạo màu vàng hay vàng cam cho nước giải khát, pho mát, cà ri,

mù tạt… Liều lượng sử dụng cho phép là 0 – 0,5 mg/kg thể trọng

❖ Trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm

Hiện nay, curcumin ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là thực phẩm chức năng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư, viêm loét dạ dày tá tràng, giải độc gan, tăng sức đề kháng của cơ thể Nó được dùng dưới nhiều dạng: bột, viên ép, viên con nhộng, dạng trà, dạng thuốc tinh chất để tăng thêm việc tiêu hoá và chức năng gan, để giảm đau khớp và điều kinh Vì Nghệ có nhiều ứng dụng trong y học nên nó

đã được nhiều nhà sản xuất quan tâm và cho ra nhiều sản phẩm trên thị trường như Biocurmin của công ty TNHH Dược phẩm Châu Á (Biocurmin là sự kết hợp giữa Nghệ

và tiêu giúp cho việc hấp thụ Nghệ trong dạ dày nhanh hơn); sản phẩm Bách phụ khang của Công ty TNHH TM Mediproducts (đây là sự kết hợp giữa curumin và trinh nữ hoàng cung giúp điều trị bệnh u xơ tử cung)…

Curcumin là một polyphenol có nguồn gốc từ phương thuốc thảo dược và bột Nghệ gia vị Nó sở hữu các đặc tính chống viêm và chống ung thư đa dạng sau khi uống hoặc bôi Ngoài khả năng chống oxy hóa mạnh của curcumin ở pH trung tính và axit, cơ chế hoạt động của nó bao gồm ức chế một số con đường truyền tín hiệu tế bào ở nhiều cấp

độ, tác dụng lên các enzyme của tế bào như cyclooxygenase và glutathione S-transferase,

điều chế miễn dịch và ảnh hưởng đến sự hình thành mạch và sự kết dính tế bào Khả năng của curcumin ảnh hưởng đến phiên mã gen và gây ra apoptosis trong các mô hình tiền lâm sàng có khả năng liên quan đặc biệt đến hóa trị ung thư và hóa trị liệu ở bệnh nhân Mặc dù khả dụng sinh học toàn thân thấp của curcumin sau khi uống có thể hạn chế truy cập nồng độ đủ cho tác dụng dược lý ở một số mô, nhưng việc đạt được mức độ hoạt tính sinh học trong đường tiêu hóa đã được chứng minh ở động vật và người Hiện tại có

đủ dữ liệu để ủng hộ đánh giá lâm sàng giai đoạn II của curcumin đường uống ở bệnh nhân có khối u ác tính xâm lấn hoặc tổn thương tiền xâm lấn đường tiêu hóa, đặc biệt là đại tràng và trực tràng [21]

1.2.6 Mối tương quan giữa hàm lượng curcumin với màu sắc thân rễ Nghệ

Curcumin được biết là có ảnh hưởng đến các loại bệnh khác nhau ở người, được

tìm thấy trong Curcuma longa L Các báo cáo trước đây cho biết rằng chất curcumin thay

đổi giữa các dòng khác nhau của loài này Theo Sun Wen và các cộng sự, khi nghiên cứu

về thành phần hóa học của 32 loài nghệ khác nhau thì 10 trong số đó chứa curcumin Đó

là các loài C amada, C aromatica, C chuanyujin, C heyneana, C longa, C oligantha,

C phaeocaulis, C wenyujin, C zanthorrhiza, C zedoaria Các loài còn lại được báo cáo

là không tìm được curcumin [50] Theo Hiroshi Hayakawa và các cộng sự, curcumin được

định lượng bằng HPLC trên các loài 1 loại Curcuma alismatifolia Gagnep ở Sawang, Chiang Mai, 3 loại C aromatica Salib., 12 loại C longa L and 1 loại C zedoaria Rosc Trồng tại các địa điểm khác nhau Kết quả cho thấy hàm lượng curcumin trên C longa trồng ở Nam Á (nghệ vàng) > domestic C longa và C longa (Indonesia B) > C

aromatica (nghệ trắng)> C zedoaria (nghệ đen) và C longa (Wakayama B) > C alismatifolia Điều đó cho thấy các giống nghệ khác nhau cho lượng curcumin khác nhau,

tuy nhiên curcumin còn chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường, cùng loài C longa L

nhưng khi trồng ở các địa điểm khác nhau thì hàm lượng curcumin trong thân rễ dao động đáng kể [24]

1.3.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng: Silica gel G Dung môi triển khai: Cloroform – acid acetic (9: 1) Dung dịch thử: Lấy 0,1 g bột dược liệu cho vào cốc thủy tinh, thêm 5 ml methanol (TT), đun tới sôi rồi để nguội, lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan curcumin chuẩn trong methanol (TT) để được dung dịch nồng độ khoảng 0,3 mg/ml Nếu không có curcumin chuẩn, dùng 0,1 g bột Nghệ (mẫu chuẩn) chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 25 µl mỗi dung dịch trên Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun hỗn hợp gồm 15 ml dung dịch acid boric 3 % (TT) và 5 ml dung dịch acid oxalic 10 % (TT), đã trộn kỹ Quan sát dưới ánh sáng thường

Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có các vết (3 vết) cùng màu sắc và giá trị RF với

3 vết của curcumin chuẩn hoặc có các vết cùng màu sắc và giá trị RF với các vết trên sắc

ký đồ của dung dịch đối chiếu [9]

1.3.2 Định lượng curcuminoid bằng đo quang phổ hấp phụ tử ngoại và khả kiến

Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan curcumin chuẩn trong methanol (TT) đổ được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 400 µg/ml

Lập đường chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc tiến hành pha dãy dung dịch curcumin chuẩn trong methanol (TT) có nồng độ lần lượt là 0,8; 1,6; 2,0; 2,4 và 3,2 µg/ml Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại bước sóng 420 nm, dùng mẫu trắng là methanol (TT)

Từ kết quả thu được lập đường chuẩn biểu thị sự liên quan giữa nồng độ curcumin và độ hấp thụ

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 300 mg bột thô dược liệu, cho vào bình định mức 10 ml, thêm tetrahydrofuran (TT), trộn đều và pha loãng tới vạch bằng cùng dung môi Để ở nhiệt độ phòng trong 24 h, thỉnh thoảng lắc Để lắng, lấy chính xác 1 ml dịch trong ở phía trên vào bình định mức 25,0 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng methanol (TT) và đo độ hấp thụ của dung dịch tại bước sóng 420 nm, mẫu trắng là methanol (TT)

Dựa vào đường chuẩn đã lập ở trên và kết quả thu được, tính hàm lượng curcumin trong dung dịch thử và trong dược liệu [9]

1.3.3 Định lượng curcumin bằng phương pháp HPLC

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 100 mg chuẩn curcumin vào bình định mức

50 ml, định mức bằng methanol được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 2 mg/ml Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với methanol để có dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 0,1

-Cột Zorbaz Eclipse XDB-C18 (150 × 4,6 mm; 5 μm)

-Detector PDA, bước sóng phát hiện: 420 nm

-Pha động: Acetonitril: Acid acetic 2% (45:55)

-Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

-Thể tích tiêm: 20 μl

-Thời gian phân tích: 15 phút [13]

1.3.4 Định lượng curcumin bằng HPTLC

Chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 500µg/ml

Thử: cân chính xác khoảng 1gam bột thân rễ nghệ, chiết hồi lưu trong chính xác 50ml methanol loại HPLC trong 2h dưới nhiệt độ 70oC Dịch chiết được lọc qua màng lọc Whatman No#42 Dịch chiết sau đó được tập trung lại và điều chỉnh thể tích tới 50ml bằng methanol để phân tích

Điều kiện sắc ký: bản mỏng 60F254 Merck, sử dụng máy chấm Camag Linomat V khoảng cách giữa 2 vết là 4 mm, điều kiện pha động Toluen: Cloroform: Methanol = 5 : 4,5 : 1, bão hòa dung môi 15 phút, độ dài dung môi 8 cm Phát hiện bằng Densitometer tại bước sóng 430 nm

Kết quả: Hệ thống này đã được tìm thấy có điểm curcumin nhỏ gọn ở giá trị RF là (0,31 ± 0,02) Đối với quy trình đề xuất, độ tuyến tính (r2 = 0,99354± 0,00120), giới hạn phát hiện (50 ng/điểm), giới hạn định lượng (200 ng/điểm), độ thu hồi (dao động từ 98,35%

- 100,68%) và độ chính xác (≤ 2,25%) đã được tìm thấy là thỏa đáng Phân tích thống kê cho thấy hàm lượng curcumin ở các khu vực địa lý khác nhau thay đổi đáng kể [17]

quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả thu được là một sắc

ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển RF được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

RF = 𝑎 𝑏Trong đó:

a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;

b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu

RF: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1 [9]

1.4.2 Nguyên tắc của HPTLC

HPTLC bản chất là TLC, trong đó các bước tiến hành đều được tự động hóa một phần hoặc toàn bộ, và sử dụng bản mỏng hiệu năng cao Về nguyên tắc, bản mỏng hiệu năng cao không khác nhiều so với bản mỏng sắc ký thông thường, chỉ khác là được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân tích được tăng lên bởi vì: Vết sắc ký nhỏ hơn, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi cần ít hơn

Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao Các bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các sai số có thể gặp phải Quá trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích phun mẫu, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [1]

Thiết bị HPTLC bao gồm:

- Thiết bị chấm mẫu tự động

- Thiết bị khai triển tự động

- Buồng chụp ảnh được điều khiển thông qua phần mềm winCATs và phần mềm

Videoscan trên máy tính: quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera

kĩ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hỉnh ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu bằng

Giới hạn phát hiện(sử dụng

Giới hạn phát hiện(sử dụng

Các ưu thế của HPTLC so với HPLC là:

- Thời gian phân tích ít hơn và chi phí phân tích rẻ hơn

- Chi phí duy tu, bảo dường thấp

- Không cần biện pháp đuổi khí đối với dung môi pha động

- Lượng pha động sử dụng ít hơn cho mỗi mẫu

- Không có sự liên quan giữa lần phân tích trước, pha tĩnh, pha động hoàn toàn mới cho

mỗi lần phân tích, không có chất nhiễm

- Có thể phát hiện bằng mắt thường vì đây là hệ thống mở

- Những hợp chất không hấp thụ UV có thể phát hiện bằng cách phun hiện màu sau khi

khai triển mẫu [48]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thân rễ của một số loài trong chi Curcuma L được thu hái từ nhiều nơi trên miền

Bắc Việt Nam về trồng tập trung ở xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên

Thời điểm thu mẫu: 21/02/2020

Phần thân rễ sau khi thu hái được rửa sạch, chụp ảnh toàn bộ phần thân rễ, lát cắt ngang và lát cắt dọc, mô tả về sự phân nhánh, hình dạng, kích thước, màu sắc, đường kính, lát cắt Các mẫu này sau đó được xử lý để chiết và định lượng curcumin

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu Nghệ trong bài nghiên cứu

Cu-4 Curcuma elata Roxb Tiên Yên – Quảng Ninh

Cu-6 Curcuma elata Roxb Tiên Yên – Quảng Ninh Cu-7 Curcuma virdiflora Roxb Tiên Yên – Quảng Ninh

Cu-13 Curcuma virdiflora Roxb Tiên Yên – Quảng Ninh

Cu-17.2 Curcuma kwangsiensis S G Lee

Mã TVO cấp Tên khoa học Nguồn gốc

Cu-33 Curcuma aromatica Salisb Hoàng Su Phì – Hà Giang

2.2.1 Chất chuẩn

Curcumin ở Viện Dược Liệu Việt Nam, CAS 458-37-7, Lot: PRF8081721, độ tinh khiết 99,91%

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag: bộ chấm mẫu Linomat 5, bộ

phận triển khai sắc ký ADC2, buồng chụp ảnh sắc ký Vidualised, phần mềm phân tích winCATs và phần mềm xử lý kết quả Videoscan

- Bản mỏng nhôm silicagel 60F254 (Merck)

- Bể chiết siêu âm WISD, dụng cụ chiết hồi lưu

- Máy đun cách thủy điều nhiệt WiseBath

- Tủ sấy Memmert, tủ hốt

- Ống nghiệm, bình nón, cốc có mỏ 50,100 ml

- Máy xay nghiền, dao thái

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích Shimadzu (AY 220), độ chính xác 0,1 mg

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái, màu sắc thân rễ của mẫu nghiên cứu

- Phân loại mẫu theo màu sắc

2.3.2 Nghiên cứu hàm lượng curcumin

- Xây dựng phương pháp bán định lượng curcumin trong mẫu Nghệ bằng phương pháp

định lượng TLC với phần mềm Videoscan

- Thẩm định phương pháp với các tiêu chí: Độ đặc hiệu, sự phù hợp hệ thống, khoảng

tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng Thẩm định phương pháp với phần mềm Videoscan

- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng vào định lượng hàm lượng curcumin trong một

số mẫu Nghệ (Curcuma spp.) ở miền Bắc Việt Nam

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật

Quan sát và mô tả mẫu thân rễ thu được các đặc điểm quan sát được về hình dạng, kích thước thân rễ, đường kính, màu sắc, sự phân nhánh

của một số mẫu Nghệ

2.4.2.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng TLC

- Quy trình xử lý mẫu (Hình 2.1): Thân rễ nghệ sau khi được thu hái được mang về

xử lý, rửa sạch, để ráo nước, được thái lát và sấy khô ở nhiệt độ 45oC bằng tủ sấy tại bộ môn Thực Vật Dược liệu sau sấy được nghiền nhỏ và rây qua rây 300 µm để đồng đều kích thước Bột dược liệu sau đó được sấy đến khối lượng không đổi để xác định hàm ẩm

Hình 2.1: Quy trình xử lý mẫu sơ bộ

- Dung dịch chuẩn gốc (0,5 mg/ml): Cân chính xác 5,14 mg chuẩn curcumin (99,91%)

cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm khoảng 8 ml dung môi ethanol, siêu âm 5 phút cho đến khi tan hết, bổ sung thể tích đến vạch, lắc đều Bảo quản dung dịch chuẩn gốc

ở 2-8oC dùng trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn làm việc: pha loãng chính xác từ chuẩn gốc với tỷ lệ 2/10 được

dung dịch chuẩn 0,1027 mg/ml

- Chuẩn bị dung dịch thử: Chọn mẫu có màu vàng để làm khảo sát (mẫu Cu-10), cân

chính xác khoảng 0,50 gam bột dược liệu bằng cân phân tích cho vào 03 bình nón Thêm chính xác 25,0 ml dung môi bằng pipet định mức Cân khối lượng tổng của bình sau khi bổ sung dung môi Tiến hành chiết curcumin bằng phương pháp thích hợp Bổ sung thể tích bằng khối lượng ban đầu Gạn dịch chiết thu được, ly tâm để loại bỏ cắn Pha loãng dung dịch với hệ số pha loãng S phù hợp Phần dịch trong làm dịch chấm sắc ký

- Pha tĩnh: Bản mỏng nhôm 60F254 (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

- Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm sắc ký

Linomat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng 8,0 mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép bản mỏng là 10,0 mm Độ rộng vết chấm là 6,0 mm Thể tích chấm: mẫu thử

10 µl; mẫu chuẩn 5 µl

- Điều kiện triển khai sắc ký:

Điều kiện môi trường: nhiệt độ 24oC; độ ẩm tương đối 65%

Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; dung môi khai triển 10,0 ml

Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút

Độ dài dung môi khai triển: 80,0 mm

- Phần mềm phân tích: Videoscan

- Khảo sát các chương trình chạy sắc ký dựa trên các tài liệu có sẵn như dược điển, các tài liệu nghiên cứu trong nước và ngoài nước về định lượng curcumin bằng HPTLC

❖ Khảo sát thành phần, tỷ lệ hệ dung môi khai triển:

Tiến hành khảo sát trên các hệ dung môi, lựa chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất, vết được tách gọn, không bị kéo, không bị lẫn vết phụ:

1 Cloroform: acid acetic = 97:3; 9:1

2 N- hexan: ethyl acetat = 3:2

3 Cloroform: ethanol = 25:4

4 Toluen: cloroform: methanol = 5:4,5:0,5; 4:3:1; 1:3:1

5 Cloroform: methanol = 97:3

6 Cloroform: methanol: acid acetic = 95:4:1

❖ Khảo sát bước sóng phát hiện: So sánh sự phát hiện ở các điều kiện phát hiện tại ánh

sáng thường, UV 254 nm, UV 366nm Lựa chọn bước sóng phát hiện tối ưu nhất

2.4.2.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất

Lựa chọn kỹ thuật chiết: khảo sát ba phương pháp chiết: chiết ngâm, chiết ngâm có hỗ

trợ siêu âm và chiết hồi lưu Cân chính xác khoảng 0,5 gam bột dược liệu vào bình chiết thích hợp, thêm chính xác 25,0 ml dung môi thích hơp Cân khối lượng bình chiết đã thêm dung môi Tiến hành hồi lưu 2 giờ, chiết ngâm: để qua đêm 20 giờ, chiết ngâm có

hỗ trợ siêu âm: để qua đêm 20 giờ, siêu âm 30 phút Sau khi chiết bổ sung thể tích đến khối lượng ban đầu của bình chiết Lọc dịch chiết, bỏ 10ml dịch lọc đầu Tiến hành sắc

ký với dung dịch thu được, bán định lượng hàm lượng curcumin và lựa chọn kỹ thuật chiết tối ưu nhất Thí nghiệm được lặp lại 03 lần và lấy kết quả trung bình

2.4.2.3 Thẩm định lại phương pháp

❖ Độ đặc hiệu

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi chất khác có trong mẫu thử

Cách tiến hành: chuẩn bị 03 mẫu sau:

1 Mẫu chuẩn curcumin trong ethanol

2 Mẫu thử: dịch chiết dược liệu theo quy trình chiết đã chọn

3 Mẫu trắng: dung môi đã chọn

Tiến hành khai triển sắc ký đồng thời các mẫu trên theo điều kiện đã chọn Soi và chụp ảnh các vết, sử dụng phần mềm Videoscan để phân tích dữ liệu, chồng phổ và nhận xét

Phương pháp được coi là có chọn lọc khi:

- Trong sắc ký đồ mẫu trắng không có vết có RF tương ứng với RF của curcumin chuẩn

- Vết mẫu phân tích khai triển có vết tương ứng với vết curcumin chuẩn, cùng màu sắc,

hình dạng, giá trị RF trùngvới RF của mẫu chuẩn; vết tách hoàn toàn

❖ Sự phù hợp của hệ thống

Khái niệm: độ tương thích của hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết

bị, dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký ngay trong ngày tiến hành thử nghiệm

Cách tiến hành: Đánh giá độ ổn định của hệ thống với RF và diện tích pic khi phân tích lặp lại 6 lần đối với dung dịch chuẩn đã chuẩn bị Ghi lại các giá trị RF và diện tích pic Yêu cầu RSD của RF không quá 2% và RSD của Spic không quá 3%

❖ Đường chuẩn và khoảng hồi quy

Chấm trên bản mỏng triển khai 5 vết dung dịch chuẩn có thể tích khác nhau tương ứng với lượng chuẩn khác nhau bằng máy chấm sắc ký Linomat 5 Khai triển sắc ký và ghi lại các giá trị RF và diện tích pic của từng vết Xây dựng đường chuẩn thể hiện tương quan giữa lượng chất phân tích và diện tích pic

Nếu 0,99 ≤ r2 ≤ 1: có tương quan hồi quy rõ rệt

❖ Độ lặp lại phương pháp

Phân tích 6 mẫu thử T1 – T6 từ mẫu dược liệu khảo sát, tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của kết quả giữa các lần phân tích

Giới hạn độ lặp lại đối với phương pháp định lượng theo AOAC là RSD ≤ 2,7% nếu hàm lượng ≥ 1% và RSD ≤ 3,7% nếu hàm lượng ≥ 0,1%

❖ Độ đúng

Được đánh giá qua độ thu hổi, sử dụng phương pháp thêm chuẩn tiến hành như sau: lấy 3 mẫu thử phân tích, thêm cùng một lượng chuẩn bằng 80%, 100%, 120% hàm lượng curcumin có trong mẫu thử vào từng mẫu thử trước khi xử lý mẫu sẽ được các mẫu T+80%C, T+100%C, T+120%C, sau khi xử lý mẫu thì tiến hành sắc ký các dung dịch trên trong cùng điều kiện, tính độ thu hồi theo công thức:

Độ thu hồi (%)= Lượng chất tìm thấy−lượng chất có sẵn

Lượng chất chuẩn thêm vào ×100%

Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi từ 98-102% nếu hàm lượng ≥ 10%, 97-103% nếu hàm lượng trong khoảng 1-10% và 95-105% nếu hàm lượng trong khoảng 0,1-1%

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm có sẵn trong thiết bị HPTLC Ảnh chụp sắc ký đồ được chuyển sang xử lý bằng phần mềm Videoscan Phần mềm này sẽ dựa trên hình ảnh sắc ký đồ vừa chụp để ghi lại thành các pic

và tính toán diện tích pic tương ứng

Dựa trên kết quả thu được, tính toán số dựa vào 1 số hàm trên Excel:

- Hàm AVERAGE tính giá trị trung bình (x̅)

- Hàm STDEV tính độ lệch chuẩn (SD)

- Độ lệch chuẩn tương đối tính theo công thức: RSD= SDx̅ ×100%

- Tương quan hồi quy tuyến tính: phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ

giữa diện tích pic sắc ký và lượng chất trên vết phân tích y=ax+b (r)

Trong đó: Hệ số góc a: hàm SLOPE

Hệ số chắn b: hàm INTERCEPT

Hệ số tương quan r: hàm CORREL

2.4.4 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng vào định lượng một số mẫu Nghệ Curcuma

H: hàm ẩm dược liệu (%) m: khối lượng dược liệu đem chiết (g)

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Các mẫu thu được có sự đa dạng về đặc điểm, kích thước có loài có kích thước nhỏ

từ 2-3 cm (Cu-20, Cu-21…), lại có những loài có kích thước rất lớn 15-18 cm (Cu-24) Màu sắc của các mẫu khác nhau: trắng, vàng, cam, xanh lá, xanh lam với độ đậm nhạt khác nhau Các đặc điểm hình thái: hình dạng, màu sắc, kích thước, độ phân nhánh, kích thước đường kính, đặc điểm lát cắt của thân rễ được quan sát và mô tả trong hình 3.1 và bảng 3.1

Từ hình 1.1 và bảng 1.1, phân loại các mẫu thu được theo màu sắc như sau:

1 Màu cam: Cu-20, Cu-21

2 Màu vàng: Cu-13, Cu-7, Cu-33, Cu-22, Cu-10, Cu-15, Cu-14, Cu-5

3 Màu xanh lá mạ: Cu-17.2, Cu-27, Cu-8

4 Màu xanh xám: Cu-3, Cu-1

5 Màu trắng: Cu-8*,Cu-9, Cu-18, Cu-24, Cu-6, Cu-4, Cu-2, Cu-31

Hình 3.1 Bảng phân loại các mẫu theo màu sắc

Cu-1 Cu-2 Cu-3 Cu-4 Cu-5 Cu-6

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái các mẫu Nghệ

Bảng 3.1 Bảng mô tả đặc điểm hình thái các mẫu Nghệ

Thân rễ cấp 1, cấp 2, cấp 3

Rất ít phân nhánh

ít, thân rễ cấp 1, cấp 2

rễ cấp 2,3 thon dài ít cong Cấp 2 dài 13-14cm; cấp 3:5-7cm

Thân rễ cấp 1 hình trứng,nón;

thân rễ cấp 2,3 thon dài, cong hướng lên Cấp 2 dài 8-9cm; cấp 3:2-3cm

Thân rễ cấp 1 hình cầu, hình trứng, cấp 2 to, ngắn, cong lên trên mặt đất Cấp

1 đến cấp 3

Trắng hơi vàng, màu sắc các cấp giống nhau

Màu xanh xám,

độ đậm màu sắc giảm dần từ cấp 1 đến cấp 3

Màu trắng sữa

Để 1 thời gian hóa nâu

Cấp 1: khoảng 5cm; cấp 2 khoảng 1,5 cm;

4-cấp 3: khoảng 1cm

Cấp 1: 8-9cm; Cấp 2 khoảng 3cm

Lát

cắt

2 lớp, lớp lõi xanh lam, hơi

2 lớp gần như nhau

2 lớp, lớp ngoài xanh, lớp lõi trong hơi vàng,

độ dày 2 lớp bằng

nhau

2 lớp, lớp lõi màu hơi nâu, lớp ngoài trắng sữa, độ dày

2 lớp bằng nhau

Mẫu Cu-5 Cu-6 Cu-7 Cu-8*

Phân

nhánh

Phân nhánh nhiều, thân rễ cấp

Phân nhánh, thân

rễ cấp 1, cấp 2, cấp 3

Phân nhánh, thân

rễ cấp 1, cấp 2, cấp 3

đất

Thân rễ cấp 1 hình nón, hình trứng, cấp 2 hướng lên mặt đất, dài 9-10cm

Thân rễ cấp 1 hình nón, hình trứng, cấp 2 vuông góc với cấp 1, dài 7-8cm

Màu vàng hơi cam, độ đậm giảm dần từ cấp 1 đến cấp 3

2-Cấp 1:2-3cm;

Cấp 2: 1,5cm

Cấp 1: 5cm Cấp 2:2-3cm

Lát

cắt

2 lớp, lớp lõi vàng đậm hơn

lớp ngoài

2 lớp, lớp lõi màu hơi nâu, lớp ngoài trắng sữa, độ dày

2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi vàng đậm hơn, độ dày lõi gấp 2 lần

độ dày lớp ngoài

2 lớp, lõi hơi vàng, lớp ngoài trắng xanh nhạt,

độ dày 2 lớp bằng

nhau

Mẫu Cu-8 Cu-9 Cu-10 Cu-13

Phân nhánh, thân

rễ cấp 1, cấp 2, cấp 3

Phân nhánh, thân

rễ cấp 1, cấp 2, cấp 3

đất, dài 8-9cm

Thân rễ cấp 1 hình nón, hình trứng, dài khoảng 8cm; cấp 2 hướng lên, dài 10-12cm

Thân rễ cấp 1 hình nón, hình cầu, dài khoảng 6cm; cấp 2 hướng lên, dài 9-10cm

Thân rễ cấp 1 hình cầu, dài khoảng 3cm; cấp

2 hướng lên, dài 4-8cm

Vàng hơi cam độ đậm giảm dần từ cấp 1 đến cấp 3

Đường

kính

Cấp 1: khoảng

3cm Cấp 2: 2-3cm

Cấp 1: khoảng 6cm Cấp 2: khoảng 3cm

Cấp 1: khoảng 5cm Cấp 2: khoảng 2-

3cm

Cấp 1: khoảng 4cm Cấp 2: khoảng 2cm

2 lớp, lớp lõi vàng đậm, lớp ngoài vàng, độ dày 2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi vàng cam, lớp ngoài vàng, độ dày lõi gấp 2 lần

độ dày lớp vỏ

Mẫu Cu-14 Cu-15 Cu-17.2 Cu-18

Phân

nhánh

Phân nhánh nhiều, mọc thành

chùm, thân rễ cấp

1, cấp 2, cấp 3

Phân nhánh thành thân rễ cấp 1, cấp

2, cấp 3, cấp 3 mọc vuông góc cấp 2

Phân nhánh thành thân rễ cấp 1, cấp

2, cấp 3, cấp 2 mọc vuông góc cấp 1

Không phân nhánh

7-10cm

Thân rễ cấp 1 hình nón, hình trứng, dài khoảng 5cm; cấp 2 hướng lên, dài 7-9cm

Thân rễ cấp 1 hình cầu, hình trứng, dài khoảng 6cm; cấp 2 phần đầu hướng lên, phình to, dài 8-10cm

Màu vàng xanh, cấp 1 xanh nhiều hơn, cấp 2,3 vàng

hơn

Màu trắng sữa, rất dễ mốc

Cấp 1: khoảng 5cm Cấp 2: khoảng 2-

lớp ngoài

2 lớp, lớp lõi vàng đậm hơn lớp ngoài, độ dày 2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi vàng, lớp ngoài xanh, độ dày 2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi hơi nâu, lớp ngoài trắng sữa, độ dày lớp lõi gấp 2 lần lớp vỏ

Mẫu Cu-20 Cu-21 Cu-22 Cu-24

Phân

nhánh

Phân nhánh thành thân rễ cấp

1, cấp 2, cấp 3,

cấp 2 mọc hướng

lên

Phân nhánh thành thân rễ cấp 1, cấp

2, cấp 3, cấp 2 mọc hướng lên

Phân nhánh thành thân rễ cấp

1, cấp 2, cấp 3

Không phân nhánh

4cm, khoảng cách giữa các đốt

ngắn

Thân rễ cấp 1 hình thuôn dài, dài khoảng 5cm;

cấp 2, dài khoảng 5cm, khoảng cách giữa các đốt ngắn

Thân rễ cấp 1 hình cầu, hình trứng, dài khoảng 4cm; cấp 2 hướng lên, dài 3-4cm, khoảng cách giữa các đốt ngắn

Hình trứng, dài khoảng 18cm

Màu vàng, độ đậm giảm dần từ cấp 1 đến cấp 3

2cm

Cấp 1: khoảng 2cm Cấp 2: khoảng 1,5cm

Cấp 1: khoảng

2-3cm Cấp 2: khoảng 1-

2 lớp, lớp lõi màu vàng đậm hơn lớp ngoài, độ dày 2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi hơi nâu, lớp ngoài trắng sữa, lớp vỏ dày hơn lớp lõi

Mẫu Cu-27 Cu-31 Cu-33

cấp 2 hướng lên, dài

6-8cm

Thân rễ cấp 1 cầu, dài khoảng 6-7cm; cấp 2 ngắn, dài 6-7cm

Thân rễ cấp 1 hình nón, hình trứng, dài khoảng 6cm; cấp 2 vuông góc cấp 1, cấp 3 vuông góc cấp 2, khoảng cách giữa các đốt ngắn

Màu vàng, độ đậm giảm dần từ cấp 1 đến

cấp 3

Đường

kính

Cấp 1: khoảng 2-3-4cm Cấp 2: khoảng 1-1,5cm

Cấp 1: khoảng 6cm Cấp 2: khoảng 4cm

Cấp 1: khoảng 4cm Cấp 2: khoảng 2cm

Lát cắt

2 lớp, lớp lõi vàng, lớp ngoài xanh, độ dày 2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi hơi nâu, lớp ngoài trắng sữa, độ dày 2 lớp bằng nhau

2 lớp, lớp lõi vàng đậm, lớp ngoài vàng nhạt hơn, độ dày lớp lõi gấp

2 lần lớp ngoài