ĐỖ THỊ PHƯƠNG NGA NGHIÊN cứu điều CHẾ BERBERIN BISULFAT từ BERBERIN CLORID QUY mô PHÒNG THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ hà nội – 2020

Các loài cây này đã được sử dụng hơn 2500 năm trong nền y học của Ấn Độ và Trung Quốc với mục đích chủ yếu điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa.. Muối clopidogrel bisulfat thể h

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Đào Nguyệt

Sương Huyền, TS Nguyễn Văn Hải, TS Nguyễn Văn Giang những thầy cô

nhiệt huyết đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và truyền cảm hứng vô tận trong suốt quá trình làm khóa luận Nếu không có sự giúp đỡ của thầy cô, có lẽ tôi sẽ không thể hoàn thành được khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường cùng toàn thể các thầy

cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại trường

Ngoài ra, để hoàn thành khóa luận này không thể không kể đến sự giúp đỡ nhiệt tình của các tất cả những thành viên trong tổ Tổng hợp Hóa dược – bộ môn Công nghiệp Dược, những người bạn chân thành, sẵn sàng chia sẻ, sát cánh cùng nhau vượt qua khó khăn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình tôi, những người thân yêu luôn động viên, tạo chỗ dựa vững chắc để tôi vượt qua mọi trắc trở trong cuộc sống

Bài khóa luận được hoàn thành với sự giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, gia đình, bạn bè và sự cố gắng không ngừng nghỉ của bản thân Tuy nhiên bài khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót do thời gian nghiên cứu ngắn và kiến thức còn hạn chế của bản thân Tôi rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của thầy cô

và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Đỗ Thị Phương Nga

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về muối dược phẩm 2

1.1.1.Muối dược phẩm 2

1.1.2.Mục đích tạo muối 2

1.1.3.Phương pháp tạo muối 4

1.1.4.Muối sulfat/bisulfat 4

1.2.Tổng quan về berberin 5

1.2.1.Công thức 5

1.2.2.Tính chất 6

1.2.3.Ưu điểm của berberin bisulfat 12

1.2.4.Phương pháp điều chế 13

1.3.Lựa chọn phương pháp điều chế 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1.Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1.Nguyên liệu 16

2.1.2.Thiết bị, dụng cụ 16

2.2.Nội dung nghiên cứu 17

2.3.Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1.Phương pháp điều chế 18

2.3.2.Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng 18

2.3.3.Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 18

2.3.4.Phương pháp xác định pH 19

2.3.5.Phương pháp xác định độ tan 19

2.3.6.Phương pháp xác định cấu trúc bằng phổ 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1.Kết quả thực nghiệm 21

3.1.1.Điều chế berberin bisulfat 21

3.1.2.Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng 21

3.1.3.Kiểm tra độ tinh khiết 25

3.1.4.Xác định cấu trúc hóa học bằng phổ 26

3.2.Bàn luận 31

3.2.1.Điều chế berberin bisulfat 31

3.2.2.Độ tinh khiết của berberin bisulfat 32

3.2.3.Xác định cấu trúc sản phẩm 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

1.Kết luận 40

2.Kiến nghị 40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BBR.Cl Berberin clorid

BBR.HSO4 Berberin bisulfat

COX 2 Cyclooxygenase 2

DMSO Dimethyl sulfoxid

KH&CN Khoa học và công nghệ

LD50 Liều lượng hóa chất phơi nhiễm gây chết cho 50%

nhóm thử nghiệm (Lethal Dose)

LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LDLR Gen thụ thể lipoprotein mật độ thấp (low density

lipoprotein receptor) m/z Tỉ số khối lượng và điện tích

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory

concentration)

MRSA Tụ cầu vàng kháng methicillin (Methicillin-resistant

Staphylococcus aureus)

MS Khối phổ (Mass Spectrometry)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic

resonance spectroscopy)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục dung môi hóa chất 16

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ 16

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi ảnh hưởng tới phản ứng điều chế 22

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng tới phản ứng điều chế 22

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol H2SO4 45%: BBR.Cl ảnh hưởng tới phản ứng điều chế 23

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian ảnh hưởng tới phản ứng điều chế 24

Bảng 3.5 Kết quả so sánh nhiệt độ nóng chảy của muối berberin bisulfat, clorid và sulfat 25

Bảng 3.6 Kết quả xác định pH của berberin bisulfat và berberin clorid 25

Bảng 3.7 Kết quả xác định độ tan của berberin bisulfat và berberin clorid 26

Bảng 3.8 Kết quả so sánh phổ UV của berberin bisulfat và berberin clorid 27

Bảng 3.9 Kết quả phổ IR của berberin bisulfat 28

Bảng 3.10 Kết quả phổ khối (MS) của berberin bisulfat 29

Bảng 3.11 Phổ 1H-NMR của hợp chất berberin bisulfat (DMSO-d 6, 500 MHz) 29

Bảng 3.12 Phổ 13C-NMR của hợp chất berberin bisulfat (DMSO-d 6, 500 MHz) 30

Bảng 3.13 Sự khác biệt phổ IR của berberin bisulfat và berberin sulfat 35

Bảng 3.14 Bảng so sánh phổ 1H-NMR berberin bisulfat và berberin clorid (DMSO-d 6, 500 MHz) 37

Bảng 3.15 Bảng so sánh phổ 13C-NMR berberin bisulfat và berberin clorid (DMSO-d 6, 500 MHz) 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Phản ứng khử của berberin 6

Hình 1.2 Phản ứng của muối berberin trong môi trường kiềm 7

Hình 1.3 Phản ứng tạo dẫn chất 8-alkyldihydroberberin 7

Hình 1.4 Phản ứng oxy hóa của berberin 7

Hình 1.5 Phản ứng tạo dẫn chất nitril của berberin 7

Hình 1.6 Điều chế berberin bisulfat từ berberin clorid 14

Hình 3.2 Phổ UV hợp chất berberin clorid 27

Hình 3.3 So sánh phổ IR của berberin clorid và berberin bisulfat 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một alcaloid thuộc nhóm isoquinolin, có nguồn gốc từ một số loài

thực vật như Hydrastis, Berberis, Coptis, Thalictrum, Phellodendron [21] Các

loài cây này đã được sử dụng hơn 2500 năm trong nền y học của Ấn Độ và Trung Quốc với mục đích chủ yếu điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Bên cạnh đó berberin thể hiện nhiều tác dụng trên tim mạch và chuyển hóa: điều trị rối loạn lipid, đái tháo đường,…[6] Theo [50] tính đến tháng 6 năm 2020 có 40 nghiên cứu lâm sàng của berberin trên các bệnh lý: nhiễm khuẩn, đái tháo đường, viêm gan, gan nhiễm mỡ không do rượu, bệnh tim mạch, hội chứng buồng trứng

đa nang và tâm thần phân liệt Do phạm vi điều trị lâm sàng càng mở rộng, nghiên cứu phát triển berberin càng có triển vọng Các dạng dược dụng được chấp nhận trên lâm sàng bao gồm có: berberin clorid, berberin sulfat, berberin bisulfat,

berberin tannat [7] Dạng dược dụng của berberin được quy định trong Dược điển

Việt Nam V [3] là berberin clorid dihydrat Bên cạnh muối clorid, muối berberin

bisulfat đang được quan tâm do thể hiện ưu điểm về độ hòa tan và tác dụng dược

lý Berberin bisulfat được sử dụng ở một số nước Nga, Trung Quốc, Ấn Độ với

mục đích điều trị các trường hợp viêm gan, trĩ, giảm tiểu cầu [5], [47], [51] Hiện tại, berberin bisulfat có thể được sản xuất từ hai nguồn: chiết xuất và

tổng hợp hóa học Tuy nhiên, do khai thác tràn lan quá mức mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy

cơ cạn kiệt Do đó,thực tế đòi hỏi cần phải có một giải pháp thay thế cho phương pháp chiết xuất berberin truyền thống Một trong những hướng đi hứa hẹn nhiều triển vọng hiện nay là phương pháp tổng hợp hóa học, đặc biệt từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều chế

berberin bisulfat từ berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm” với mục tiêu: Điều

chế được berberin bisulfat

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về muối dược phẩm

Trong Journal of Medicinal Chemistry (2007) [35], từ năm 2002-2006, các

anion được sử dụng phổ biến trong sự hình thành muối bao gồm: clorid (38,9%), bromid (8,3%), mesylat (8,3%), tartrat (8,3%), sulfat (5,6%), phosphat (5,6%),… Cation được dùng nhiều nhất: natri (62,5%), canxi (18,8%),…

1.1.2 Mục đích tạo muối

- Tăng độ tan của thuốc

Tốc độ hòa tan của chất rắn rất quan trọng trong việc phát triển dược phẩm và kiểm soát chất lượng thuốc [17] Muối của thuốc có tính acid hoặc base thường

có độ tan cao hơn dạng tự do tương ứng, do đó hình thành muối là cách điều chế hữu dụng trong phát triển công thức thuốc tiêm [17] Muối của anion clorid, sulfat, acetat và cation natri, canxi là lựa chọn hàng đầu cho chế phẩm thuốc tiêm [15]

Sự hình thành muối cũng là cách tiếp cận phổ biến nhất nhằm tăng độ hòa tan, tốc

độ hòa tan, sinh khả dụng của thuốc ion hóa kém tan trong nước ở dạng bào chế rắn [35]

Juncher và Raaschou so sánh tỷ lệ hòa tan tương ứng với nồng độ đỉnh của thuốc trong máu của penicillin V Kết quả chỉ ra rằng muối kali> muối canxi> acid tự do>muối benzathin [16] Do đó các ion đối khác nhau gắn với một thuốc

có thể ảnh hưởng đến độ tan của thuốc khác nhau, có thể làm tăng hoặc giảm độ tan hoặc sinh khả dụng của thuốc đó

- Kéo dài tác dụng của chế phẩm thuốc

Theo Stephen M Berge và cộng sự [16], hình thành muối có thể kéo dài thời gian tác dụng của thuốc Nghiên cứu chỉ ra rằng sự phân bố một số loại kháng

sinh có thể bị thay đổi rõ rệt bằng cách điều chế muối đại phân tử Từ các phân tử lớn và các hạt keo có ái lực với hệ bạch huyết, streptomycin, neomycin, viomycin

và streptothricin đã được kết hợp với các hợp chất trọng lượng phân tử cao như acid polyacrylic, sulfonic hoặc các dẫn xuất polyuronic Tiêm tĩnh mạch những hợp chất này cho nồng độ kháng sinh trong máu thấp, kéo dài và nồng độ trong

hệ bạch huyết cao [16]

Streptomycin alginat đã được điều chế và được chứng minh là có hiệu quả trong các chế phẩm tác dụng kéo dài Một ví dụ về bào chế muối dược phẩm tác dụng kéo dài là muối pilocarpin alginat Phân tán muối này trong nước vô trùng

và sấy khô thành gel rắn, chế phẩm này rất phù hợp với việc điều chế các dạng thuốc nhỏ mắt có tác dụng lâu dài Và muối pilocarpin alginat thể rắn cho tác dụng giảm kích thước đồng tử hiệu quả hơn và thời gian tác dụng kéo dài hơn thuốc cùng hoạt chất ở thể lỏng [16]

Đánh giá độ hòa tan của 30 dạng muối diclofenac khác nhau, trong khi muối kali và dạng acid tự do được sử dụng bào chế dạng giải phóng ngay thì chỉ có muối natri là được sử dụng với dạng giải phóng kéo dài hoặc trì hoãn giải phóng

Do đó các ion đối khác nhau được gắn vào cùng một thuốc ảnh hưởng đến tốc độ hòa tan và ảnh hưởng đến dạng bào chế trên lâm sàng [15]

- Giảm độc tính

Lựa chọn một muối của dược phẩm có thể liên quan đến mục đích làm giảm độc tính của thuốc đó [15], [16] Các ví dụ khác nhau đã chứng minh việc sử dụng một ion đối mà nó chuyển hóa thải trừ dễ dàng có thể hữu ích trong việc giảm độc tính trên đường tiêu hóa [15] Ví dụ một số muối của cholin base đã được chứng minh là ít độc hơn đáng kể so với hợp chất gốc của chúng Cholin theophyllin có

LD50 cao hơn theophyllin và ít gây kích ứng đường tiêu hóa hơn Bên cạnh đó salicylat được biết đến là một thuốc gây tác động lên đường tiêu hóa như loét, chảy máu,…Các nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng cholin salicylat có tỷ lệ biến cố trên đường tiêu hóa thấp hơn, dung nạp ở liều cao hơn và cho lợi ích lớn hơn so với acid acetylsalicylic (aspirin) [16]

Vitamin và acid amin cũng được sử dụng để tạo muối với mục đích giảm độc tính Keller và cộng sự sử dụng acid pantothenic như một phương tiện "giải độc" các kháng sinh streptomyces Tiêm tĩnh mạch pantothenats của streptomycin và dihydrostreptomycin có thấy sự giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm độc thần kinh cấp tính

ở mèo so với muối sulfat [16]

- Mục đích khác

Điều chế muối dược phẩm có thể phụ thuộc vào mục đích của dạng bào chế Erythromycin là một kháng sinh nhóm macrolid, vị đắng, hòa tan tự do trong nước Muối acid stearic của erythromycin đã được tìm thấy làm giảm độ hòa tan, tuy nhiên điều này cho phép xây dựng công thức hỗn dịch có hiệu quả giảm đáng kể

vị đắng của thuốc dạng tự do Điều này làm cho dạng muối erythromycin có tính acid được chấp nhận nhiều hơn về mặt dược phẩm, đặc biệt là trên bệnh nhân nhi [15]

1.1.3 Phương pháp tạo muối

Sự hình thành muối là một phản ứng acid-base liên quan đến phản ứng chuyển proton hoặc trung hòa [16] Trong dung môi nước hoặc hữu cơ, ion thuốc và ion đối tương tác với nhau bằng lực liên kết liên phân tử, dẫn đến sự hình thành muối [42]

Muối có thể được điều chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó sự tạo thành muối từ acid tự do và base tự do là phổ biến nhất Dạng acid hoặc base

tự do của thuốc được kết hợp với ion đối dạng base hoặc acid theo tỷ lệ cụ thể trong một hệ dung môi thích hợp Muối hình thành được phân lập và kết tinh lại trong dung môi phù hợp [42]

Một phương pháp ít phổ biến hơn là điều chế muối thông qua trao đổi muối Trong phương pháp này, muối ion được xử lý bằng acid tự do hoặc basơ tự do ở nồng độ mol cụ thể trong dung môi thích hợp Chất rắn sau đó được phân lập và kết tinh lại [42]

1.1.4 Muối sulfat/bisulfat

Muối sulfat/bisulfat là một trong các muối được sử dụng nhiều nhất, đặc biệt

là đường tiêm Việc sử dụng muối sulfat dược phẩm phụ thuộc vào đặc tính lý hóa, dược lý của chế phẩm muối

Clopidogrel là một trong những thuốc chống kết tập tiểu cầu được kê đơn phổ biến và có vai trò quan trọng trong phòng ngừa, điều trị bệnh tim mạch Tuy nhiên clopidogrel dạng base không ổn định và dễ bị phân hủy Hơn nữa dạng base có

độ hòa tan trong nước kém và khó tinh chế [36] Clopidogrel có thể xây dựng ở muối hydroclorid, nhưng muối này dễ hút ẩm và không ổn định Muối clopidogrel bisulfat thể hiện nhiều đặc tính mong muốn: nhiệt độ nóng chảy cao, thời gian ổn định kéo dài, không hút ẩm và tan trong nước tốt nên được sử dụng phổ biến [41] Theo Johan Wouters và Luc Quéré, indinavir được ưu tiên sử dụng ở dạng muối sulfat hơn ở dạng monohydrat do dạng muối sulfat có độ hòa tan trong nước cao hơn và dung dịch thu được có pH khoảng 3, tạo điều kiện thuận lợi trong việc hòa tan thuốc trong đường tiêu hóa [30]

Muối pioglitazone, ví dụ pioglitazone sulfat, có thể được sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường, đặc biệt là bệnh đái tháo đường typ 2 và các rối loạn tương

tự gây ra do thiếu hụt lượng đường trong máu Các chế phẩm pioglitazone có thể dùng đơn độc hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường khác để kiểm soát đường huyết [46] Theo Jie Zhu, Frantisek Picha muối pioglitazone hydroclorid được đánh giá ổn định ở nhiệt độ phòng và bền với hơi ẩm, tuy nhiên muối này cực kì kém tan trong nước, hạn chế trong dạng bào chế dạng thuốc dung dịch Muối pioglitazone sulfat được cân nhắc sử dụng vì thể hiện nhiều ưu điểm: độ tan trong nước cao, không hút ẩm và duy trì độ ổn định trong nước nhiều giờ Do đó, muối sulfat của pioglitazone thích hợp với các dạng bào chế lỏng như dung dịch uống, chế phẩm thuốc tiêm [46]

- Tên khoa học: 5,6-dihydro-9,10-dimethoxybenzo[g]-1,3-benzodioxolo[5,6-a]

quinolizini

1.2.2 Tính chất

1.2.2.1 Tính chất vật lý

- Chất rắn kết tinh màu vàng cam, không mùi, vị rất đắng [6]

- Dạng base tan được trong nước, tan ít trong methanol, ethanol, tan kém trong cloroform, ether Dạng muối clorid tan trong nước theo tỷ lệ 1/400, tan tốt trong nước nóng, hầu như không tan trong ethanol lạnh, cloroform và ether Dạng muối bisulfat tan trong khoảng 100 phần nước, hơi tan trong alcol [31]

Hình 1.2 Phản ứng của muối berberin trong môi trường kiềm

- Phản ứng tạo dẫn chất 8-alkyldihydroberberin [21]:

Hình 1.3 Phản ứng tạo dẫn chất 8-alkyldihydroberberin

- Muối của berberin bị oxy hóa bởi KMnO4 [21]:

Hình 1.4 Phản ứng oxy hóa của berberin

- Berberin clorid phản ứng với cyanid tạo ta dẫn chất nitril [21]:

Hình 1.5 Phản ứng tạo dẫn chất nitril của berberin

1.2.2.3 Tác dụng sinh học

a Tác dụng của gốc berberin

- Tác dụng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của protoberberin alkaloid, berberin, phân lập từ

Mahonia aquifolium, đã được đánh giá chống lại 17 loại vi sinh vật bao gồm hai

loại vi khuẩn gram âm: Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli (kháng và nhạy cảm); vi khuẩn gram dương: Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus,

Zoogloea; nấm: Penicilium chrysogenum, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans (chủng đen và trắng), Trichoderma viride (chủng xanh và đột biến màu

nâu), Fusarium nivale, Mycrosporum gypseum và hai nấm men: Candida albicans,

Saccaromyces cerevisiae Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ vi sinh tối

thiểu (MMC) thay đổi đáng kể tùy thuộc vào vi sinh vật được thử nghiệm, độ

nhạy giảm như sau: S aureus> P aeruginosa S (sensitive)> E coli S> P

aeruginosa R (resistant)> E coli R> B subtilis> Z ramigera> C albicans> S cerevisiae [13]

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của berberin chống lại MRSA dao động từ 32

đến 128 µg/mL Berberin ức chế 90% MRSA ở nồng độ 64 µg/mL hoặc ít hơn Berberin làm hạ thấp đáng kể MIC của ampicillin và oxacillin chống lại MRSA, tác dụng hiệp đồng được tìm thấy giữa berberin và oxacillin chống lại MRSA Với sự hiện diện của berberin 1-50 µg/mL, độ bám dính và xâm lấn nội bào của MRSA đã giảm đáng kể so với nhóm đối chứng Những kết quả này cho thấy berberin có hoạt tính kháng khuẩn và khả năng hiệp đồng tác dụng với kháng sinh beta-lactam chống lại MRSA và ức chế sự bám dính và xâm lấn nội bào của MRSA [43]

- Tác dụng hạ glucose huyết

Berberin làm tăng vận chuyển glucose bằng cách tăng cường biểu hiện gen GLUT1, làm kích hoạt AMPK, dẫn đến sự cải thiện trong sản xuất năng lượng và giảm lưu trữ năng lượng Cụ thể, sự kích hoạt AMPK dẫn đến tăng hấp thu glucose từ máu đến các cơ quan đích Một thử nghiệm mù đôi trên lâm sàng chứng minh berberin làm giảm đường huyết lúc đói và sau ăn, giảm insulin sau ăn và

giảm trọng lượng cơ thể ở bệnh nhân đái tháo đường typ 2 so với nhóm dùng giả dược [6]

Một nghiên cứu được tiến hành trên 80 bệnh nhân mắc hội chứng chuyển hóa được điều trị tại Bệnh viện Trung ương Linyi, bệnh nhân được chia ngẫu nhiên vào 2 nhóm: nhóm quan sát (dùng berberin) và nhóm đối chứng, 40 bệnh nhân trên mỗi nhóm Sau 1 tháng điều trị, mức độ đường huyết lúc đói, chỉ số kháng đường huyết và kháng insulin sau 2 giờ ở nhóm quan sát đã giảm đáng kể so với những người trong nhóm đối chứng trong cùng thời kỳ (P <0,05) [6] Một nghiên cứu của Yin và cộng sự trên 48 bệnh nhân có ĐTĐ typ 2, có sự giảm đáng kể HbA1c (từ 8.1 ± 0.2 xuống 7.3 ± 0.3%, P< 0,001), insulin huyết tương lúc đói đã giảm 28,1% (P< 0,001) Tác dụng hạ đường huyết của BBR được đánh giá tương

tự như của metformin [11]

- Tác dụng hạ lipid

Berberin thông qua kích hoạt AMPK ức chế tổng hợp cholesterol và TG trong

các tế bào gan Berberin làm tăng sự biểu hiện của thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp (LDLR) sau phiên mã bằng cách ổn định LDLR-mRNA thông qua điều hòa tín hiệu ERK Berberin tác động lên chuyển hóa LDL bằng cách kéo dài thời gian bán hủy mARN của nó cũng như tăng protein thông qua việc ngăn chặn sự thoái hóa qua trung gian PCSK9 [6]

Nghiên cứu của Kong W chỉ ra rằng sử dụng berberin đường uống trên 32 bệnh nhân tăng cholesterol máu trong 3 tháng làm giảm cholesterol huyết thanh 29%, triglycerid 35% và LDL-cholesterol 25% [25] Theo nghiên cứu của Yueshan Hu, năm 2012, các đối tượng béo phì người da trắng đã được dùng 500

mg berberin ba lần một ngày trong mười hai tuần Berberin chứng minh rằng có tác dụng làm giảm trọng lượng cơ thể và giảm đáng kể nồng độ lipid trong máu (giảm 23% lượng triglycerid và giảm 12,2% nồng độ cholesterol) ở người Tác dụng hạ lipid của berberin cũng đã được chứng minh trong thí nghiệm với chuột (giảm 34,7% chất béo trung tính và giảm 9% mức cholesterol) Cortisol, calcitriol, ACTH, TSH, FT4 và mức SHBG không thay đổi đáng kể sau 12 tuần điều trị berberin [19]

Khác với berberin, statin tác động lên phiên mã PCSK9, làm cho BBR trở thành tác nhân để tăng cường hiệu quả của statin Trong điều trị chuột bị tăng lipid máu do thực phẩm, kết hợp berberin với simvastatin đường uống làm giảm LDL- cholesterol huyết thanh 46,2%, hiệu quả hơn của simvastatin (28,3%) hoặc berberin (26,8%) đơn trị liệu (P < 0,01 cho cả hai) [26]

- Tác dụng trên tim

Berberin làm tăng phosphat năng lượng cao trong suy tim và ngăn ngừa rung tâm thất do tác động của nó trên các kênh kali, làm tăng canxi nội bào và ngăn chặn sự chậm trễ khử cực do dòng natri [45] Mặt khác, BBR có tác dụng điều chế hoạt động giao cảm trên cơ tim [39] Ở những con chuột bị chứng phì đại tim

do thí nghiệm gây co thắt động mạch chủ, BBR làm giảm nồng độ noradrenalin

và adrenalin trong huyết tương và adrenalin trong mô não thất, cải thiện khả năng

co bóp của tim [18] Trong một mô hình suy tim thiếu máu cục bộ ở chó, berberin tiêm tĩnh mạch làm tăng cung lượng tim, giảm áp lực cuối tâm trương thất trái nhờ tăng co bóp cơ tim và giãn mạch toàn thân nhẹ [20]

Năm 2003, một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên đã đánh giá hiệu quả và độ

an toàn của berberin trên 156 bệnh nhân bị suy tim sung huyết mạn tính: 79 bệnh nhân được dùng berberin với liều 1,2 đến 2,0 g/ngày, 77 bệnh nhân còn lại được dùng giả dược Nhóm được điều trị bằng berberin cho thấy sự gia tăng đáng kể trong phân suất tống máu thất trái và khả năng vận động, cũng như cải thiện đáng

kể về chỉ số khó thở và giảm tỷ lệ biến cố sớm trên thất Ngoài ra, tỷ lệ tử vong

đã giảm đáng kể trong quá trình theo dõi lâu dài [44]

- Tác dụng kháng ung thư

26 nghiên cứu từ năm 2000 đến 2018, tập trung nghiên cứu tác dụng của berberin trên các loại ung thư khác nhau bao gồm: ung thư vú, ung thư gan, ung thư đại trực tràng, ung thư vòm họng, ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư biểu

mô thần kinh, ung thư nội mạc tử cung, ung thư thực quản Nhìn chung, berberin giảm khối lượng khối u, ức chế sự hình thành mạch trong các mô khối u nhưng

nó không có ảnh hưởng đáng kể đến trọng lượng cơ thể của động vật thí nghiệm [22]

- Tác dụng sinh học khác

Berberin còn thể hiện tác dụng chống viêm [27], chống oxy hóa, chống xơ gan [10], chống trầm cảm, làm giảm đáng kể các hành vi trầm cảm, lo lắng liên quan đến cai nghiện morphin [29] sau khi ngừng sử dụng morphin và ngăn ngừa tổn thương tế bào thần kinh do thiếu máu cục bộ hoặc stress oxy hóa, có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer [8]

b Tác dụng riêng của berberin bisulfat

- Chỉ định điều trị giảm tiểu cầu

Nghiên cứu trên của 30 bệnh nhân bị giảm tiểu cầu nguyên phát và thứ phát

đã dùng berberin bisulfat 3 và 5 mg x 3 lần/ngày trong 15 ngày Các dữ liệu cho thấy sự gia tăng đáng kể về mặt thống kê số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi sau khi dùng berberin bisulfat trong tất cả các ngày quan sát [5]

Theo Catherine Ulbricht, berberin bisulfat được chỉ định trong điều trị bệnh giảm tiểu cầu với liều 5 mg x 3 lần/ngày, trong 15 ngày, uống trước ăn 20 phút [12]

- Chỉ định điều trị leishmania

Sử dụng berberin bisulfat đường tiêm đã được sử dụng ở Ấn Độ trong điều trị bệnh leishmania dưới da

- Chỉ định điều trị rò hậu môn, trĩ

Công ty TNHH Dược phẩm Nam Kinh Baijingyu, Trung Quốc đăng ký sản xuất và lưu hành thuốc mỡ berberin bisulfat:

Tên thương mại: Thuốc mỡ hợp chất berberin bisulfat

Thành phần: 1g thuốc mỡ có chứa 0,01g berberin bisulfat và 0,01g benzocain Chỉ định: bệnh rò hậu môn, bệnh trĩ ngoại viêm, bệnh trĩ ngoại huyết khối (giai đoạn cấp tính), chảy máu trĩ và tống máu trĩ

Một thử nghiệm lâm sàng so sánh hiệu quả điều trị của thuốc mỡ berberin bisulfat và thuốc mỡ Ma Yinglong (thành phần bao gồm: xạ hương, ngưu hoàng,

hổ phách, ngọc trai, borneol, calamin, borax) Nghiên cứu tiến hành trên 120 bệnh nhân bị nứt hậu môn được điều trị tại Khoa Điều trị bệnh hậu môn trực tràng của Bệnh viện Y học Cổ truyền Trung Quốc từ tháng 6 năm 2012 đến tháng 5 năm

2014 [47] 120 bệnh nhân chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm (60 bệnh nhân mỗi nhóm): nhóm dùng thuốc mỡ berberin bisulfat (nhóm điều trị), nhóm dùng kem trĩ Ma Yinglong (nhóm đối chứng) Kết quả: (1) Không có phản ứng bất lợi rõ ràng, không có tổn thương gan, thận trong nhóm điều trị (2) Hiệu quả giảm đau tại mỗi thời điểm trong nhóm điều trị tốt hơn đáng kể so với nhóm đối chứng đồng thời lượng thuốc sử dụng ít hơn, thời gian lành vết thương ngắn hơn so với nhóm đối chứng trong vòng 48 h sau phẫu thuật

- Chỉ định điều trị bệnh gan mạn tính, bệnh đường mật

Công ty dược phẩm VIFITEH [56], Nga sản xuất và lưu hành viên nén berberin bisulfat

Mã ATX: [A05AX]

Viên nén chứa 5mg berberin bisulfat

Chỉ định: các bệnh mãn tính của gan, túi mật, đường mật và cơ vòng của Oddi Liều lượng và cách dùng: uống 5-10 mg 3 lần một ngày, trước bữa ăn Quá trình điều trị là 2-4 tuần

1.2.3 Ưu điểm của berberin bisulfat

Muối berberin tan tốt trong nước có làm tăng sinh khả dụng, dẫn tới tăng hấp thu, tác dụng dược lý mạnh hơn và hiệu quả điều trị tốt hơn [24] Một số muối berberin tan tốt trong nước có thể bào chế dạng thuốc tiêm, điều trị trong trường hợp khẩn cấp, mở rộng đường dùng cho berberin [7] Berberin bisulfat thể hiện khả năng tan trong nước tốt (1:100) nên có thể sản xuất ở nhiều dạng bào chế khác nhau như viên nén, thuốc mỡ, thuốc tiêm…

Berberin bisulfat giữ nguyên đặc tính về lý hóa và tác dụng sinh học của gốc berberin Trong thực tế, berberin bisulfat có nhiều ứng dụng cụ thể trên lâm sàng Berberin bisulfat được chỉ định trong điều trị và đánh giá tác dụng trên bệnh giảm tiểu cầu mà các hợp chất khác của berberin chưa được chứng minh rõ với tác dụng này Bên cạnh đó, hoạt chất này được sử dụng để điều trị bệnh leishmania dưới

da, bệnh rò hậu môn và được chỉ định trong viêm gan mạn và các bệnh đường mật

Từ đó, chúng tôi nhận thấy sự cần thiết của việc điều chế berberin bisulfat do hoạt chất có nhiều ưu điểm và tính ứng dụng thực tế so với các hợp chất khác của berberin

1.2.4.Phương pháp điều chế

1.2.4.1 Phương pháp chiết xuất

a Phương pháp của V Boldyrev

Berberin được chiết xuất từ rễ của cây dâu Berberis Vulgaris L [37] bằng cách

hồi lưu hai lần với dung dịch acid axetic 5% trong ethanol Dịch chiết được cô đặc, pha loãng bằng ethanol và đem lọc Tách riêng dịch lọc và tủa

Dịch lọc được acid hóa đến pH 4 bằng acid sulfuric đặc, để lạnh Tiếp tục acid hóa dịch lọc lạnh đến pH 2 bằng acid sulfuric đậm đặc, để lạnh, kết tinh lại bằng chloroform thu được berberin bisulfat

Tủa được hòa tan trong nước, điều chỉnh đến pH 9 bằng dung dịch amoniac đậm đặc, tách phần tủa Phần dịch base được acid hóa bằng acid clorid thu được berberin clorid Berberin clorid được kiềm hóa bằng dung dịch ammoniac đậm đặc thu được berberin base Berberin bisulfat được tạo bằng cách acid hóa berberin base bằng acid sulfuric đậm đặc, để lạnh, kết tinh lại bằng ethanol Tổng sản lượng của sản phẩm từ rễ cây dâu là 0,77% trọng lượng của nguyên liệu thô, có tính đến độ ẩm [37]

b Phương pháp của I Churadze Luiza

Vỏ của cây Phellodendron Lavallei (Dode) được nghiền nhỏ, chiết xuất bằng

ethanol hoặc methanol Dịch chiết được bay hơi thu được cặn gôm, cặn được phân tán bằng acid sulfuric 10% Cặn dư sau loại bỏ dịch acid được chiết 5 lần với nước

ở nhiệt độ 10-25oC theo tỷ lệ cặn: nước (1:5) Dung dịch này được acid hóa bằng acid sulfuric đậm đặc đến pH 1,5-3,3 Hỗn hợp được làm lạnh đến 6-8 °C và duy trì trong 8-10 giờ Kết tủa kết tủa được tách ra và kết tinh lại bằng ethanol 60%, thu được berberin bisulfat [14]

1.2.4.2 Phương pháp điều chế hóa học

a Phương pháp điều chế theo United Nations Industrial Development Organization:

Hòa tan 100 g berberin clorid trong methanol nóng Thêm từ từ hỗn hợp dung dịch H2SO4 (19 ml) và methanol (190 ml) (hỗn hợp được chuẩn bị bằng cách thêm

từ từ dung dịch H2SO4 vào dung dịch methanol lạnh) Hỗn hợp được làm lạnh, lọc rửa với nước lạnh và aceton, thu được berberin bisulfat [38]

b Phương pháp điều chế của An Xiaoxia và cộng sự

Theo An Xiaoxia và cộng sự, phản ứng điều chế được diễn ra theo sơ đồ:

Hình 1.6 Điều chế berberin bisulfat từ berberin clorid

Quy trình điều chế: Berberin clorid đã tinh chế được hoà tan trong môi trường nước ở 85-90 oC, thêm acid sulfuric loãng, khuấy phản ứng ở 70-95 °C trong 3-5 giờ Làm lạnh, lọc, rửa và sấy khô để thu được berberin bisulfat

92,00 g berberin clorid thô (berberin 42%, hàm lượng nước 43%) được tinh chế sau đó hòa tan trong 900 ml nước cất, đun nóng đến 85-90 °C Thêm 30 ml acid sunfuric 45% (0,25 mol), khuấy đều và giữ ở nhiệt độ 85-90 °C trong 3 giờ sau đó làm mát 4 giờ Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, lọc, rửa tinh thể với

ít nước để thu được 44,50 g berberin hydro sulfat, hàm lượng là 81,1%, hàm lượng nước là 13,2% và hiệu suất là 93,3% [7]

1.3 Lựa chọn phương pháp điều chế

Nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt do khai thác tràn lan và chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý Do đó, phương pháp điều chế hóa học đang được quan tâm

Phương pháp điều chế hóa học có ưu điểm là nguyên liệu đầu vào rẻ tiền, phản ứng điều chế đơn giản, ít công đoạn, hiệu suất cao Phương pháp điều chế theo [38] sử dụng dung môi methanol, độc hại và tốn kém, không được ưu tiên trong tổng hợp hóa dược Trong khi đó, phương pháp của An Xiaoxia và cộng sự [7] được tiến hành trong dung môi nước, rẻ tiền, không độc hại; phản ứng điều chế

dễ tiến hành, hiệu suất cao Do đó, phương pháp này được lựa chọn để điều chế berberin bisulfat

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1.Nguyên liệu

Đề tài sử dụng nguyên liệu chính là berberin clorid, được tổng hợp tại phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, bộ môn Công nghiệp Dược Các dung môi, hóa

chất sử dụng để thực hiện khóa luận được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục dung môi hóa chất

1 Acid hydrochloric đặc Trung Quốc

2 Acid sulfuric đậm đặc Trung Quốc

3 Berberin clorid Việt Nam- đạt TC Dược

điển Việt Nam V

5 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ chính xác 0,01 g Thụy Sĩ

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ (tiếp)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Điều chế muối berberin bisulfat

Nghiên cứu điều chế muối berberin bisulfat từ berberin clorid theo sơ đồ hình 1.6

Khảo sát quá trình điều chế

Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều chế muối berberin bisulfat (nhiệt độ, thời gian, dung môi, tỷ lệ mol)

Đánh giá một số đặc tính của sản phẩm

- Đánh giá nhiệt độ nóng chảy và hàm lượng BBR.HSO4

- Xác định pH

- Xác định độ tan: Xác định sơ bộ độ tan của nguyên liệu và sản phẩm tại

nhiệt độ phòng và áp suất khí quyển theo phương pháp Yang Wenge và

cộng sự [40]

- Xác định cấu trúc của sản phẩm bằng: phổ UV, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và Carbon-13 (13C-NMR)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

và sấy khô thu được berberin bisulfat

2.3.2 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

Khảo sát các yếu tố dung môi, nhiệt độ, tỷ lệ mol, thời gian ảnh hưởng tới độ tinh khiết của sản phẩm Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng H+ (HSO4-) bằng chuẩn độ acid- base

Khảo sát yếu tố dung môi: Giữ nguyên các yếu tố nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ mol,

thay đổi yếu tố dung môi Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng H+ (HSO4-) bằng chuẩn độ acid- base

Khảo sát yếu tố nhiệt độ: Giữ nguyên các yếu tố về thời gian, dung môi, tỷ lệ

mol, thay đổi yếu tố nhiệt độ Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng

đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng H+ (HSO4-) bằng chuẩn độ acid- base

Khảo sát yếu tố tỷ lệ mol: Giữ nguyên các yếu tố nhiệt độ, thời gian, dung môi,

thay đổi yếu tố tỷ lệ mol Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng H+ (HSO4-) bằng chuẩn độ acid- base

Khảo sát yếu tố thời gian: Giữ nguyên các yếu tố về nhiệt độ, dung môi, tỷ lệ

mol, thay đổi yếu tố thời gian Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng

đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng H+ (HSO4-) bằng chuẩn độ acid- base

2.3.3 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Sản phẩm thu được từ quá trình điều chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng H+ (HSO4-):

Nhiệt độ nóng chảy: được đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Định lượng H + (HSO 4 - ) bằng chuẩn độ acid-base:

Theo dược điển Nhật Bản [28], gốc bisulfat (trong tiêu chuẩn tham khảo tetrabutylammonium hydrogensulfat) được định lượng bằng phương pháp chuẩn

độ acid-base, sử dụng chất chuẩn độ NaOH 0,1 mol/L Hòa tan một lượng chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm trong 100 ml nước sôi để nguội, thêm chất chỉ thị bromocresol xanh-methyl đỏ, chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1 M

Pha dung dịch natri hydroxyd 0,1 M: Hòa tan 4,50 g tinh thể natri hydroxyd trong 5 ml nước Đậy kín bình bằng nút cao su, để yên qua đêm, gạn phần dung dịch trong ở trên và pha loãng với nước không có carbon dioxyd vừa đủ 1000

Để xác định cấu trúc sản phẩm, các mẫu được ghi và phân tích bằng: phổ UV, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và Carbon-13 (13C-NMR)

Phổ UV: được ghi trong vùng tử ngoại bước sóng 200-500 nm tại Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương

Phổ hồng ngoại (IR): được ghi trên thiết bị Shimadzu IRAffinity-1S trong

vùng hồng ngoại 400-4000 cm-1 tại khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phổ khối lượng (MS): được đo trên máy LTQ Orbitrap XL™ tại tại khoa Hóa

học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và Carbon-13 ( 13 C-NMR):

được đo trên máy AVANCE III HĐ 500MHz tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả thực nghiệm

3.1.1 Điều chế berberin bisulfat

Berberin bisulfat được điều chế theo sơ đồ:

Hình 1.6 Điều chế berberin bisulfat từ berberin clorid

Quy trình điều chế: Cho 2,00 g berberin clorid và 46 ml nước cất vào bình

cầu dung tích 100 ml Nâng từ từ nhiệt độ bình phản ứng lên tới 90 oC để chất rắn hòa tan hoàn toàn Thêm từ từ 1,6 ml dung dịch H2SO4 45% (pha loãng H2SO4

98% với nước theo tỷ lệ 1:1,2), tỷ lệ mol H2SO4 45%: BBR.Cl= 2,5:1 Khuấy hỗn hợp, đun cách dầu, duy trì nhiệt độ phản ứng 90 oC trong 3 giờ Kết thúc phản ứng, bình phản ứng được làm lạnh trong 4 giờ Tiến hành lọc hút chân không thu hồi sản phẩm, sấy bằng đèn hồng ngoại (~ 70 ºC) thu được berberin bisulfat

3.1.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

3.1.2.1 Khảo sát yếu tố dung môi

Để đánh giá được ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất và hàm lượng berberin bisulfat, các thí nghiệm được tiến hành với lượng berberin clorid tham gia phản ứng là 2,00 g, giữ nguyên các yếu tố thời gian (3 h), nhiệt độ (nhiệt độ sôi), tỷ lệ mol H2SO4: BBR.Cl (2,5:1) và thay đổi yếu tố dung môi

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi ảnh hưởng tới phản ứng điều chế

Sản phẩm (g)

T nc ( o C) Hiệu suất

(%)

Hàm lượng BBR HSO 4

Nhận xét: Khi khảo sát 3 dung môi (ethanol 96%, ethanol tuyệt đối, nước),

sản phẩm thu được không khác biệt nhiều về hàm lượng (92,71%; 92,65%; 92,63%) và hiệu suất phản ứng (73,47%; 73,42%; 72,97%) Trong đó, nước là dung môi xanh, do vậy dung môi nước được chọn để tiếp tục tiến hành đánh giá thử nghiệm

3.1.2.2 Khảo sát yếu tố nhiệt độ

Để đánh giá được ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất và hàm lượng berberin bisulfat, các thí nghiệm được tiến hành với lượng berberin clorid tham gia phản ứng là 2,00 g, giữ nguyên các yếu tố thời gian (3 h), dung môi (nước), tỷ lệ mol

H2SO4 45%: BBR.Cl (2,5:1) và thay đổi yếu tố nhiệt độ

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng tới phản ứng điều chế

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng tới hàm lượng

berberin bisulfat và hiệu suất phản ứng Khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 60 oC đến

80 oC, sản phẩm thu được không có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng berberin bisulfat (85,71%; 86,47%; 86,97%) và hiệu suất phản ứng (65,90%; 66,08%; 67,28%) Hàm lượng berberin bisulfat và hiệu suất phản ứng tăng khi tiến hành ở

90 oC, và đạt lớn nhất ở 100 oC (hàm lượng 92,63%, hiệu suất 72,97%) Do vậy, nhiệt độ 100 oC (nhiệt độ sôi) được chọn là nhiệt độ tối ưu cho phản ứng điều chế muối berberin bisulfat

3.1.2.3 Khảo sát yếu tố tỷ lệ mol

Để đánh giá được ảnh hưởng tỷ lệ mol H2SO4 45%: BBR.Cl đến hiệu suất và hàm lượng berberin bisulfat, các thí nghiệm được tiến hành với lượng berberin clorid tham gia phản ứng là 2,00 g, giữ nguyên các yếu tố thời gian (3 h), nhiệt

độ (100 oC), dung môi (nước) và thay đổi yếu tố tỷ lệ mol

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol H2SO4 45%: BBR.Cl ảnh hưởng tới phản

Sản phẩm (g)

T nc ( o C) Hiệu suất

(%)

Hàm lượng BBR HSO 4

45%:BBR.Cl tăng từ 1,0:1 đến 4,0:1 Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ mol H2SO4

45%:BBR.Cl đến 6,0:1, hàm lượng berberin bisulfat và hiệu suất phản ứng không

có sự thay đổi đáng kể Do đó, tỷ lệ mol H2SO4 45%:BBR.Cl= 4,0:1 (hàm lượng 96,76%; hiệu suất 75,86%) là tỷ lệ thích hợp cho phản ứng tạo muối

3.1.2.4 Khảo sát yếu tố thời gian

Để đánh giá được ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất và hàm lượng berberin bisulfat, các thí nghiệm được tiến hành với lượng berberin clorid tham gia phản ứng là 2,00 g, giữ nguyên các yếu tố nhiệt độ (100 oC), dung môi (nước), tỷ lệ mol H2SO4:BBR.Cl (4,0:1) và thay đổi yếu tố thời gian

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian ảnh hưởng tới phản ứng điều chế

gian (h)

Sản phẩm (g)

T nc ( o C) Hiệu suất

(%)

Hàm lượng BBR HSO 4

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy thời gian có ảnh hưởng tới hàm lượng

berberin bisulfat và hiệu suất phản ứng Khi tăng thời gian phản ứng từ 2,0 đến 4,0 h, hàm lượng berberin bisulfat tăng từ 78,73% đến 98,80% và hiệu suất phản ứng tăng 60,90% đến 78,30% Tuy nhiên khi tiếp tục tăng thời gian phản ứng đến 4,5 h, hàm lượng berberin bisulfat và hiệu suất không có sự khác biệt đáng kể so với 4 h (hàm lượng 98,83%, hiệu suất 78,32%) Do vậy, thời gian phản ứng 4 h

là thời gian thích hợp cho phản ứng tạo muối

Từ kết quả khảo sát, chúng tôi đề nghị quy trình điều chế berberin bisulfat với nguyên liệu đầu vào 2,00 g berberin clorid như sau:

Cho 2,00 g berberin clorid và 46 ml nước cất vào bình cầu dung tích 100 ml Nâng từ từ nhiệt độ bình phản ứng lên tới 100 oC (nhiệt độ sôi) để chất rắn hòa tan hoàn toàn Thêm từ từ 2,5 ml dung dịch H2SO4 45% (pha loãng H2SO4 98% với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:1,2), tỷ lệ mol 4,0:1 Khuấy hỗn hợp, đun cách dầu, duy trì nhiệt độ phản ứng 100 oC (nhiệt độ sôi) trong 4 giờ Kết thúc phản ứng, bình phản ứng được làm lạnh trong 4 giờ Tiến hành lọc hút chân không thu hồi sản phẩm, sấy đèn hồng ngoại (~ 70 ºC) thu được sản phẩm Lặp lại trung bình 3

lần, thu được sản phẩm có khổi lượng trung bình 1,68 g, hiệu suất trung bình 78,30%, hàm lượng trung bình 98,80%, to

T= 1,8 oC, chứng tỏ mẫu khá tinh khiết

Kết quả so sánh nhiệt độ nóng chảy của muối berberin bisulfat, clorid và sulfat được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả so sánh nhiệt độ nóng chảy của muối berberin bisulfat, clorid

Nhận xét: Kết quả xác định pH của berberin bisulfat (4 mg/ml) là 2,15 trong

khi pH của nguyên liệu berberin clorid là 4,53 Kết quả pH chứng tỏ rằng khi phân

ly trong dung môi nước, berberin bisulfat có tính acid hơn berberin clorid

- Xác định độ tan