NGUYỄN NGỌC VIỆT NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật, THÀNH PHẦN hóa học của một LOÀI THUỘC CHI panax l ở lào KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ hà nội 2020

Phan Kế Lộc - Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, đã cung cấp cho tôi những tài liệu quý báu về mô tả hình thái và tài liệu về phân loại thực vật, hướng dẫn tô

LOÀI THUỘC CHI Panax L Ở LÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

LOÀI THUỘC CHI Panax L Ở LÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ rất quý

báu và hữu ích từ các thầy cô, bạn bè và chuyên gia về thực vật Tôi rất trân trọng và

hiểu rằng thực sự bản thân sẽ không thể hoàn thành được đề tài này trọn vẹn nếu thiếu

đi những lời khuyên và sự giúp đỡ từ những con người này

Với lòng biết ơn và sự kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS

Nguyễn Viết Thân - giảng viên bộ môn Dược liệu, là người thầy đã dìu dắt, hướng

dẫn, truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học và giúp tôi có được đề tài này

Tôi cũng muốn gửi đến một lời cám ơn chân thành tới HVCH Phonesouphavanh

MAYVANH, đã cung cấp dược liệu nghiên cứu và giúp tôi hiểu hơn về đất nước, văn

hóa, ngôn ngữ và con người Lào

Tôi xin gửi một lời cám ơn chân thành tới TS Nguyễn Quỳnh Chi - giảng viên

bộ môn Dược liệu, là người cô đáng kính đã giúp đỡ tôi, cung cấp cho tôi những tài

liệu rất giá trị để tôi có thể hoàn thành được phần tổng quan về chi Panax L

Tôi cũng xin được chân thành cám ơn GS.TS Phan Kế Lộc - Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, đã cung cấp cho tôi những tài

liệu quý báu về mô tả hình thái và tài liệu về phân loại thực vật, hướng dẫn tôi mô tả

đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu cũng như đã tư vấn cho tôi trong quá trình xác

định tên khoa học của loài

Tôi cũng xin gửi một lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới DS NCS Nguyễn

Thanh Tùng - giảng viên bộ môn Dược liệu, là người thầy đã hướng dẫn tôi từ những

điều nhỏ nhất khi tiến hành thực nghiệm, cho tôi lời khuyên và giải đáp những câu hỏi,

những khó khăn mà tôi gặp phải, định hướng con đường và giúp tôi có thể hoàn thiện

được các nội dung trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi cũng thực sự cám ơn các thầy cô giảng viên, kĩ thuật viên khác

trong bộ môn Dược liệu và các sinh viên cùng nghiên cứu trên bộ môn, đã giúp đỡ tôi

trong quá trình làm thực nghiệm

Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Việt

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

1.1 Tổng quan về đặc điểm thực vật và phân bố chi Panax L 2

1.4 Tình hình khai thác sử dụng và các nghiên cứu về chi Panax L ở Lào 13

1.4.2 Tình hình khai thác sử dụng và các nghiên cứu về chi Panax L ở Lào 13

2.3.3 Bán định lượng acid oleanolic tự do trong dịch chiết dược liệu đã thủy phân

20

3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật và xác định tên khoa học của mẫu

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 23

3.1.2 So sánh đặc điểm hình thái thực vật của mẫu nghiên cứu với một số loài

3.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

29

3.4 Bán định lƣợng acid oleanolic tự do trong dịch chiết sau thủy phân 32

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang

1 Bảng 1.1 Tên và phân bố các loài và thứ loài đƣợc ghi nhận

2 Bảng 3.1.So sánh đặc điểm hình thái thực vật của mẫu nghiên cứu

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Cấu trúc sapogenin và đường đơn trong các hợp chất

2 Hình 1.2 Cấu trúc khung aglycon nhóm flavonoid ở chi Panax

3 Hình 1.3 Bản đồ vị trí địa lý của CHDCND Lào và tỉnh Xiêng

7

Hình 3.4 Sắc ký đồ dịch chiết S1 so sánh với các chất chuẩn

định tính Sâm Việt Nam sau khi phun thuốc thử vanilin - acid

sulfuric

30

8 Hình 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết trước và sau thủy phân so sánh

9

Hình 3.6 Đồ thị 3D diện tích pic sắc ký của dịch chiết trước và

sau thủy phân so sánh với chất chuẩn OA sau khi phun thuốc thử

AS sulfuric quan sát ở ánh sáng trắng

32

10 Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định hàm lượng acid oleanolic trong

13 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn độ đặc hiệu và độ chọn lọc của

14 Phụ lục 2: Hình ảnh mẫu tiêu bản loài nghiên cứu

15

Phụ lục 3: Hình ảnh mẫu tiêu bản loài Panax zingiberensis C Y

Wu & K M Feng ở Thư viện tài nguyên mẫu thực vật quốc gia

Trung Quốc

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHDCND Lào nằm ở trung tâm lục địa Đông Nam Á và có diện tích 236.800

km2, được bao quanh bởi Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam và Trung Quốc Địa hình của Lào chủ yếu là đồi núi, với dãy Trường Sơn ở phía đông bắc đến phía đông và dãy Luông Pha Băng ở phía tây bắc Với độ cao trải dài từ 500m đến 2.819 m, khí hậụ nhiệt đói gió mùa, với tháng mưa rõ rệt từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô mát

từ tháng 11 đến tháng 2 và mùa khô nóng vào tháng 3 và tháng 4 [76] và diện tích rừng phủ xanh lớn, CHDCND Lào là một quốc gia rất đa dạng và phong phú về tài nguyên thiên nhiên, rừng và các loại cây cỏ, trong đó nhiều loài quý hiếm có giá trị cả

về kinh tế và về phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học [80] Tuy nhiên hiện nay, các nghiên cứu về cây thuốc ở Lào còn tương đối hạn chế Trong các loài cây thuốc có

ở Lào, các loài thuộc chi Panax L là những loài có giá trị lớn với nhiều tác dụng dược

lý nổi bật như chống ung thư [18] [19] [31] [33] [34] [37] [58] [66] [71], chống viêm [11] [43] [52] [63] [70], bảo vệ gan [14] [45], bảo vệ thần kinh [21] [35] [73], điều hòa miễn dịch [9] [16] [50] [55] [59] [77], bảo vệ tim mạch [32] [53] [64], điều trị đái tháo đường [12] [24] [57], điều trị tăng huyết áp và cầm máu [15] [20] [25] [38] nhưng hiện

chưa có nghiên cứu nào được công bố Trong khi đó, các loài thuộc chi Panax L ở

Lào đang bị khai thác quá mức, dẫn đến nguy cơ nguồn tài nguyên dược liệu này sẽ bị cạn kiệt trước khi được nghiên cứu và đánh giá Điều này đặt ra sự cần thiết cho việc

nghiên cứu về các loài thuộc chi Panax L ở Lào

Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực

vật, thành phần hóa học của một loài thuộc chi Panax L ở Lào” với 2 mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm thực vật, từ đó xác định tên khoa học loài nghiên cứu

2 Nghiên cứu thành phần hóa học: Định tính các nhóm hợp chất bằng các phản ứng hóa học thường quy và sắc ký lớp mỏng; bán định lượng một số hợp chất có trong loài nghiên cứu bằng hệ thống sắc ký lớp mỏng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về đặc điểm thực vật và phân bố chi Panax L

1.1.1 Vị trí phân loại chi Panax L

Theo hệ thống phân loại Thực vật hiển hoa (Flowering plants) của Takhtajan

công bố năm 2009 trong [51], chi Sâm (Panax L.) có vị trí phân loại như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa cúc (Asteridae)

Liên bộ Sơn thù du (Cornanae)

Bộ Hoa tán (Apiales)

Họ Nhân sâm (Araliaceae)

Chi Sâm (Panax L.)

Bên cạnh đó, theo hệ thống phân loại của The PLANTS Database của USDA PLANTS [83], có một sự khác biệt so với hệ thống phân loại của Takhtajan công bố

năm 2009 Cụ thể, chi Panax L theo hệ thống phân loại The PLANTS Database có vị

Họ Nhân sâm (Araliaceae)

Chi Sâm (Panax L.) Như vậy, theo THE PLANTS Database, chi Panax L được phân loại vào phân

lớp Hoa hồng (Rosidae) còn theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009,

chi Panax L nằm trong phân lớp Hoa cúc (Asteridae)

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Panax L

Theo thực vật chí Trung Quốc [62], chi Panax L bao gồm các cây thân cỏ,

sống lâu năm, có thân rễ mập mạp; thân đơn, không gai, có vẩy ở gốc Cây chỉ có hoa lưỡng tính hoặc cây có cả hoa lưỡng tính và hoa đực cùng gốc Lá kép chân vịt, mọc

vòng 3-5 lá; lá chét nguyên đến có răng nhỏ, có răng hay có thùy lông chim; lá kèm nhỏ Cụm hoa đơn độc, mọc ở đỉnh cành, dạng tán Cuống hoa có khớp dưới hoa lưỡng tính, không có khớp dưới hoa đực Đài có 5 răng ngắn Tràng 5, rời, xếp lợp Nhị 5, chỉ nhị dài bằng hoặc dài hơn cánh tràng, chỉ nhị xếp xen kẽ với cánh tràng Bầu 2- hay 3 (-5) - lá noãn; vòi nhụy xếp rời hay hợp ở gốc, số lượng bằng số lá noãn Quả hạch, hình hơi cầu đôi khi hơi dẹt hoặc có 3 góc Hạt thường dẹt một bên, số lượng hạt bằng số lá noãn; nội nhũ mịn

Typus: Panax quinquefolius L

1.1.3 Phân bố các loài thuộc chi Panax L

1.1.3.1 Danh sách các loài thuộc chi Panax L và tình hình phân bố trên thế giới

Hiện tại, trên thế giới có tất cả 12 loài và 1 thứ loài được ghi nhận thuộc chi

Panax L [85] Về phân bố, các loài thuộc chi Panax L chủ yếu phân bố ở khu vực

Đông Á, khu vực dãy Himalaya, khu vực Bán đảo Đông Dương, phía Bắc châu Mỹ, Trung Quốc [62] Các thông tin cụ thể về danh sách các loài và phân bố được tổng hợp

ở bảng 1.1

1.1.3.2 Danh sách các loài thuộc chi Panax L ở CHDCND Lào

Trước đây, có 3 loài ở Lào được ghi nhận thuộc chi Panax L., đó là: Panax

armatus Wall Ex G.Don, Panax fragrans Roxb và Panax fruticosa L [40] Tuy nhiên,

hiện nay, các loài này đều đã được chuyển sang các chi khác và tên gọi trước đây chỉ còn là các tên đồng nghĩa của các loài thuộc các chi khác của họ Nhân sâm

(Araliaceae) Cụ thể, trong cuốn Trích yếu thực vật có mạch của Lào, tên Panax

armatus Wall Ex G.Don được thay bằng tên Aralia armata (G.Don) Seem., tên Panax fragrans Roxb được thay thế bằng tên Heteropanax fragrans (Robx.) Seem., tên Panax fruticosa L được thay thế bằng tên Polyscias fruticosa (L.) Harms [40] Sau khi

chúng tôi tham khảo thêm các tài liệu khác mới nhất về thực vật có mạch ở Lào như

[78] [79] [80] thì kết quả cho thấy rằng hiện nay ghi nhận 2 loài thuộc chi Panax L là

Panax vietnamensis Ha & Grushv và Panax laosensis Dung Tuy nhiên, hiện chưa có

các thông tin cụ thể về đặc điểm thực vật và phân bố của loài này ở Lào

Bảng 1.1 Tên và phân bố các loài và thứ loài đƣợc ghi nhận thuộc chi Panax L trên thế giới

[6] [62] [84]

Công bố gốc [85]

Panax major (Burkill) K.C.Ting ex C.Pei &Y.L.Chou Panax pseudoginseng var bipinnatifidus (Seem.) H.L.Li Panax pseudoginseng var elegantior (Burkill) G.Hoo & C.J.Tseng Panax pseudoginseng subsp himalaicus H.Hara

Panax pseudoginseng var major (Burkill) H.L.Li

Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), Assam (Ấn Độ), phía bắc Trung Quốc, phía đông và tây

Panax repens var angustifolius (Burkill) F.H.Chen Panax sikkimensis R.N.Banerjee

Assam (Ấn Độ), phía nam Trung Quốc, phía đông và phía tây Himalaya, Nepal, Thái Lan, Tây Tạng

Proc Int Ginseng Workshop

Panax quinquefolius var ginseng (C.A.Mey.) Regel & Maack Panax schin-seng var coraiensis T.Nees

Panax verus Oken

Quốc, phía đông Nga

Rep

Pharm Prakt Chem

Panax angustatus (Makino) Honda Panax ginseng f angustatus Makino Panax ginseng f dichrocarpus Makino Panax ginseng var japonicus (Nees) Makino Panax ginseng var repens (Maxim.) Makino Panax ginseng f xanthocarpus Makino Panax japonicus f incisus Nakai

Panax japonicus var japonicus Panax japonicus var parvifolius C.Y.Cheng & C.Y.Chu Panax pseudoginseng var japonicus (T.Nees) G.Hoo & C.J.Tseng Panax pseudoginseng subsp japonicus (C.A.Mey.) H.Hara

Panax quinquefolius var coreensis Siebold Panax repens Steud Ex Maxim

Panax schin-seng f angustatus (Makino) Makino Panax schin-seng var japonicus T.Nees

Việt Nam, Trung Quốc, Bhutan, khu vực phía bắc Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Myanmar, Nepal, khu vực đông bắc Thái Lan

Bull Cl Phys.- Math Acad Imp Sci Saint- Pétersbour

Acta Phytotax Sin 13(2):

Panax schin-seng T.Nees

Sapa, Hà Giang, Cao Bằng, Tam Đảo Vĩnh Phúc, Kon Tum (Việt

Trans Med Soc Calcutta 4:

Panax schin-seng var nepalensis T.Nees Nam), Trung Quốc,

Aralia quinquefolia (L.) Decne & Planch

Ginseng quinquefolium (L.) Alph.Wood Panax americanus (Raf.) Raf

Panax americanus var elatus Raf

Panax americanus var obovatus (Raf.) Raf

Panax cuneatus Raf

Panax quinquefolius var americanus Raf

Panax quinquefolius var obovatus Raf

trồng rộng rãi ở Trung Quốc

44 1975

10 Panax

trifolius L

Aralia trifolia (L.) Decne & Planch

Aralia triphylla Poir

Ginseng trifolium (L.) Alph Wood Panax lanceolatus Raf

Panax pusillus Sims

1059 1753

Panax trifolius var roseus N.Coleman

11 Panax

vietnamensis

Ha & Grushv

Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai Quảng Nam, Gia Lai

Kon Tum (Việt Nam), khu vực phía bắc, phía nam và đông nam Trung Quốc

Bot Zhurn (Moscow

&

Leningrad) 70: 519

Lào Cai (Việt Nam),

Quốc)

Acta Phytotax Sin 13(2):

42 1975

1.2 Tổng quan về thành phần hóa học của chi Panax L

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Panax L

Các loài thuộc chi Panax L đều là những cây thuốc quý và đã được sử dụng

trong y học trên 4000 năm Kể từ những năm 1970, với sự phát hiện nhiều loài mới

được ghi nhận thuộc chi này (ví dụ như P vietnamensis Ha et Grushv và P

sokpayensis), các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu nhiều hơn về chi này và thu

được nhiều kết quả có giá trị to lớn về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học

Vào năm 1985, ginsenosid đầu tiên là ―panaquilon‖ đã được phân lập từ loài P

quinquefolius bởi Garrignes [71] Từ những năm 1970 đến 2000, nhiều hợp chất

saponin đã được tìm thấy ở chi này tuy nhiên việc xác định cấu trúc hóa học của chúng còn nhiều khó khăn Kể từ năm 2000, sự phát triển của những phương pháp mới như sắc ký, quang phổ và khối phổ đã giúp chúng ta nhanh chóng khám phá được thành

phần hóa thực vật của chi Panax L Đã có rất nhiều hợp chất saponin được phân lập,

có thể kể đến như 945 ginsenosid đã được xác định có trong bộ phận lá của P

notoginseng và trong đó, 662 ginsenosid là hợp chất mới bởi Yao và cộng sự bằng hệ

thống sắc ký lỏng 2 chiều [82]

1.2.2 Thành phần hóa học của chi Panax L

Các nghiên cứu được công bố trên thế giới, đặc biệt trên 3 loài P ginseng, P

notoginseng và P quinquefolius, chứng tỏ thành phần hóa học của các loài thuộc chi Panax L rất đa dạng, rất phong phú, bao gồm saponin, phytosterol, flavonoid,

polyacetylen, polysaccharid, các acid béo, coumarin, polyphenol, acid phenolic, acid sulfonic, aldehyd, ceton, lactam, amino acid, các nguyên tố vô cơ và dipeptid vòng [2][7]

1.2.2.1 Saponin

Các saponin, hay còn gọi là ginsenosid, được xem là thành phần hóa học đặc

trưng, quyết định hoạt tính của các loài thuộc chi Panax L [67] Tính đến cuối năm

2012, ít nhất 289 hợp chất saponin đã được phân lập từ 11 loài khác nhau thuộc chi

Panax L [67] hay từ các sản phẩm đã qua chế biến có liên quan như hồng sâm [27]

[42] và các sản phẩm thủy phân bằng acid thành phần của lá và rễ của loài P

notoginseng [10] [54] Các hợp chất saponin trong chi Panax L, hầu hết đều là saponin

triterpenoid, được chia thành 4 nhóm là protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT), acid oleanolic (OA) và ocotillol (OT) dựa trên sự khác nhau về cấu trúc

sapogenin; glucose (Glc), acid glucoronic (GlcA), rhamnose (Rha), xylose (Xyl) và

arabinose (Ara) là 5 loại đường đơn tạo thành hợp chất saponin của chi Panax (Hình

1.1) Bên cạnh đó, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, giữa các loài, các bộ phận, thời điểm thu hái và khu vực phát triển thì sẽ có sự sai khác về thành phần hóa học và hàm lượng của các chất, làm cho tác dụng dược lý của chúng sẽ không giống nhau

Hình 1.1 Cấu trúc sapogenin và đường đơn trong các hợp chất saponin

phân lập từ chi Panax L

a Nhóm protopanaxadiol (PPD)

Trong tất cả các saponin triterpen 4 vòng khung dammaran đã được phát hiện,

94 saponin được phân vào nhóm PPD và 93 saponin được phân vào nhóm PPT Trong nhóm PPD, phần đường thường gắn ở vị trí carbon số 3 và/hoặc carbon số 20 như trong ginsenosid Rg3, Rb1, Rb2, Rc và Rd Trong khi đó, nhóm OH ở vị trí carbon số 6 của glucose thường được acyl hóa và xảy ra ở phân tử đường cuối của chuỗi gắn tại vị

trí carbon số 3 trên khung dammaran, ví dụ như ginsenosid Ra4-Ra9 được phân lập từ

rễ của P ginseng [75] Ngoài ra, một số trường hợp có nhóm thế malonyl là một kiểu

acyl hóa phân cực đặc biệt, gặp ở ginsenosid m-Ra3, m-Rb1, m-Rb2, m-Rc, m-Rd và m-notoginseng R4 [69]

b Nhóm protopanaxatriol (PPT)

PPT và PPD là 2 nhóm saponin phổ biến và được tìm thấy ở nhiều loài thuộc

chi Panax L [46] PPT có cùng cấu trúc khung dammaran với PPD, được đặc trưng

bởi sự có mặt nhóm thế OH ở vị trí carbon số 6 Đây là nhóm saponin với nhiều tác dụng sinh học quan trọng và hiện có 93 saponin được ghi nhận thuộc nhóm PPT Trong saponin PPT, phần đường thường gắn vào khung dammaran tại vị trí carbon số

6 (như trong ginsenosid Rg1, Re và Rg5) và vị trí carbon số 20

c Nhóm acid oleanolic (OA)

Saponin nhóm OA là những ginsenoid chiếm thành phần nhỏ với tổng cộng 34 hợp chất đã biết đến Chúng được đặc trưng bởi các nhánh ở vị trí nhóm OH carbon số

3 và/hoặc chuỗi glycosyl ở vị trí nhóm carboxyl COOH ở carbon số 28 và sự có mặt của acid glucoronic (GlcA) gắn vào vị trí carbon số 3 Một số ví dụ như: Ginsenosid

Ro, đại diện của nhóm saponin OA, được cho là tổng hợp từ acid oleanolic, có nhiều ở

2 loài P ginseng và P quiquefolius nhưng hàm lượng rất ít ở rễ loài P notoginseng

[68]; stipuleanoside R1 và R2 được phân lập từ thân rễ của loài P stipuleanatus [49];

Bifinoside A-C được phân lập từ phân đoạn phân cực của dịch chiết methanol của rễ

loài P bipinnatifidus [56]; Ginsenosid Ro, chikusetsusaponin IV, IVa và zingibrosid

R1 được phân lập từ dịch chiết ethanol 60 % của bộ phận rễ và thân rễ của P

zingiberensis [29]

d Nhóm ocotillol (OT)

Các saponin nhóm ocotillol là những saponin triterpenoid 4 vòng có chứa vòng

furan ở nhánh tại vị trí cacbon số 17 trên khung, mới được tìm thấy ở rất ít loài như P

pseudoginseng, P quinquefolius, P vietnamensis và P japonicus Các saponin thuộc

nhóm OT bao gồm pseudo-ginsenosid F11 (PF11), pseudo-ginsenosid RT2, RT4, RT5, vina-ginsenosid R1 (VR1), VR2, VR5, VR6, VR13, majonosid R1, mR2 và yesanchinosid A-C 2 ginsenosid PF11 và RT5 là thành phần hóa học đặc trưng của P quinquefolius khác biệt so với loài P ginseng 2 ginsenosid VR1 và VR2 đều có nhóm thế acetyl ở chuỗi đường gắn vào vị trí carbon số 6 trên khung cấu trúc của ginsenosid PF11 và

MR2 nên có gọi tên lần lượt là monoacetyl 24(S)-PF11 và monoacetyl MR2 [65]; VR5

và VR6 lần đầu tiên được phân lập từ thân rễ và rễ của P vietnamensis mà có phần

đường dạng α-glucosyl [17]

1.2.2.2 Flavonoid

Hiện tại, có rất hạn chế các nghiên cứu đã công bố về hợp chất flavonoid có ở

chi Panax L Các kết quả đều cho thấy kaempferol và quercetin là 2 aglycol phổ biến gặp ở các hợp chất flavonoid có trong các loài thuộc chi Panax L (Hình 1.2) Nghiên cứu về flavonoid trong P notoginseng đã được bắt đầu khá sớm và đã phân lập được một số chất như quercetin và quercetin glycosid từ rễ của loài này; quercetin-3-O- sophora glycosid được tìm thấy ở lá của loài P notoginseng; kaempferol, quercetin, kaempferol-7-O-α-L-rhamnosioid, kaempferol-3-O-β-D-galactosid, kaempferol-3-O-

quercetin-3-O-(2''-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid được tìm thấy ở thân và lá của loài P

notoginseng [13] [61] [74] Bên cạnh đó, 3 flavonoid, là ginsenosid, trifolium glycosid

và kaempferol đã được phân lập từ thân và lá của P ginseng [60]; 2 hợp chất khác là

kaempferol-3-O-(2,3-di-trans-p-hydroxycinnamoyl)-α-L-rhamnosid được phân lập từ nụ hoa của P ginseng [41]

Trong những năm gần đây, một vài nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có thành phần

flavonoid trong rễ của P quinquefolius [72]

Hình 1.2 Cấu trúc khung aglycon nhóm flavonoid ở chi Panax L

1.2.2.3 Phytosterol

Hiện nay, chỉ có khoảng 10 hợp chất sterol được tìm thấy ở chi Panax L Một

số ví dụ có thể kể đến như: β-sitosterol được phân lập từ dịch chiết ethanol bộ phận lông rễ của P notoginseng và trong khi β-sitosterol-D-glucosid thì được phân lập từ dịch chiết ether bộ phận lông rễ của P notoginseng [26] Một hợp chất glucosid sterol

mới 3-O-β-D-glucopyranosyl-5,22,24-stigmastatrienol và một sterol đã biết stigmastadienol được phân lập từ hạt của P ginseng [28]

5,22-1.2.2.4 Polyacetylen

Các hydrocarbon alkyn phân bố ít trong chi Panax, chủ yếu có ở bộ phận dưới mặt đất của các loài P notoginseng, P ginseng, P quinquefolius và P vietnamensis Một số hợp chất đã được tìm thấy có thể kể đến như panaxynol và panaxydol có ở P

notoginseng [36], 7 polyacetylen có ở phần nằm dưới mặt đất của P vietnamensis, 2

trong số đó là các hợp chất mới, có tên là 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-ene-4,6-diyn-3-o

và heptadeca-l,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol [39], panaxfuraynes A và B được

tách riêng từ rễ của loài P ginseng, ginsenoyn A-E được phân lập từ phân đoạn hexan

từ rễ loài P ginseng [23] [30], 2 hợp chất C17- và C14-polyacetylen đã được phân tách từ rễ đã sấy khô của loài P quinquefolius [72]

1.2.2.5 Polysaccharid

Những polysaccharid có tính sinh học quan trọng không phân bố rộng ở chi

Panax L Tới hiện tại, 30 hợp chất polysaccharid đã được phân lập từ thân rễ của các

loài P japonicus, P quinquefolius, P notoginseng và nụ hoa của P ginseng

1.2.2.6 Acid béo

Lipid là một thành phần quan trọng của loài P ginseng Các acid béo không chỉ

có tác dụng sinh học rộng mà còn là tiền chất tổng hợp rất nhiều chất sinh học quan

trọng Các acid béo trong rễ của P ginseng chủ yếu là những acid béo chưa bão hòa và

acid linoleic có hàm lượng lớn nhất Hiện nay, 24 acid béo chính (bao gồm acid pentadecylic, acid palmitic, acid stearic, acid margaric, acid oleic và acid linoleic) đã

được tìm thấy ở trong rễ 2 loài P ginseng và P notoginseng

1.2.2.7 Các hợp chất khác

Các coumarin như skimming, apiosylskimmin và daphnin methyl ether đã được

tách chiết từ loài P notoginseng Các hợp chất bao gồm phenol, ester, aldehyd và

ceton cũng được phân tách và xác định cấu trúc, 14 dipeptid vòng và 5 lactamid đã

được phân lập và xác định từ 2 loài P notoginseng và P ginseng; 18 amino acid và 72 vết nguyên tố cũng được phân lập từ P notoginseng và P trifolius

1.3 Tổng quan về tác dụng sinh học của chi Panax L

Các nghiên cứu về dược lý hiện đại đã chứng tỏ chi Panax có vai trò quan trọng

trong chống ung thư [18] [19] [31] [33] [34] [37] [58] [66] [71], chống viêm [11] [43]

[52] [63] [70], bảo vệ gan [14] [45], bảo vệ thần kinh [21] [35] [73], điều hòa miễn dịch [9] [16] [50] [55] [59] [77], bảo vệ tim mạch [32] [53] [64], điều trị đái tháo đường [12] [24] [57], điều trị tăng huyết áp và cầm máu [15] [20] [25] [38]

1.4 Tình hình khai thác sử dụng và các nghiên cứu về chi Panax L ở Lào

1.4.1 Vị trí địa lý của Lào

CHDCND Lào nằm ở trung tâm lục địa Đông Nam Á và có diện tích 236.800

km2 Nó được bao quanh bởi Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam và Trung Quốc (Hình 1.3) Địa hình của Lào chủ yếu là đồi núi, với dãy Trường Sơn ở phía đông bắc đến phía đông và dãy Luông Pha Băng ở phía tây bắc Địa hình có độ cao trải dài từ 500m đến 2.819 m Lào có khí hậụ nhiệt đói gió mùa, với tháng mưa rõ rệt

từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô mát từ tháng 11 đến tháng 2 và mùa khô nóng vào tháng 3 và tháng 4 [76] Với diện tích rừng phủ xanh lớn và điều kiện khí hậu thích hợp, CHDCND Lào là một quốc gia rất đa dạng và phong phú về tài nguyên thiên nhiên, rừng và các loại cây cỏ, trong đó nhiều loài quý hiếm có giá trị cả về kinh tế và phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học [80]

1.4.2 Tình hình khai thác sử dụng và các nghiên cứu về chi Panax L ở Lào

Thông qua khảo sát sơ bộ tại tỉnh Xiêng Khoảng nước CHDCND Lào, chúng tôi thấy rằng hiện nay ở Lào có một số dược liệu với tên gọi là Sâm như Sốm Lào (ໂສມລາວ), Sốm bai sách (ໂສມໃບແຆັກ), Sốm khính yai (ໂສມຂ ຽຄໃຫຽງ), Sốm phải (ໂສມຝ຾າງ), Sốm măn kha kai (ໂສມມັນຂາໄກຽ), Sốm đín (ໂສມຈ ນ), Sốm pác cát kháo (ໂສມພັກກາຈຂາວ), Sốm pác cát sí ít (ໂສມພັກກາຈສີ ຬ ຈ), Sốm nok en (ໂສມນົກແຬຽນ), Sốm kin bai (ໂສມກ ນໃບ), Sốm sâm (ໂສມເຆ ມ), Sốm phá (ໂສມຜາ), Sốm phá Ngan (ໂສມຜາຄານ), Sốm si pa (ໂສມຆີ ປຽ າ), Sốm phá ô líp (ໂສມຜາໂຬລ ບ),

… Người dân địa phương sử dụng chúng làm thuốc bổ với giá trị kinh tế rất lớn Giá bán của các dược liệu này trên thị trường dao động từ 450,000 KIP đến 25,000,000 KIP (khoảng 1 triệu đến 65 triệu VND) Tuy nhiên, như đã trình bày, qua tham khảo các tài liệu về thực vật ở Lào [40] [78] [79], có thể thấy hiện chưa có các nghiên cứu

nào được công bố về các loài thuộc chi Panax L ở Lào, khiến cho việc đánh giá và

quản lý chất lượng các dược liệu thuộc chi này còn gặp nhiều khó khăn

Nghiên cứu này sẽ cung cấp các thông tin về đặc điểm thực vật, thành phần hóa

học của một loài thuộc chi Panax L ở Lào, đóng góp 1 phần nhỏ vào nguồn thông tin

về các loài thuộc chi Panax L ở CHDCND Lào

Hình 1.3 Bản đồ vị trí địa lý của CHDCND Lào và tỉnh Xiêng Khoảng nơi thu mẫu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là toàn cây tươi mang lá, mang hoa và quả của một loài

thuộc chi Panax L được thu hái tại vùng Ngan, huyện Khoun, tỉnh Xiêng Khoảng,

nước CHDCND Lào vào tháng 10/2019

sạch bằng nước, sau đó được bảo quản bằng silica gel trong túi nilon kín Phần còn lại được phơi, sấy khô bằng tủ sấy, tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để nghiên cứu đặc điểm bột và thành phần hóa học

Tiêu bản mẫu nghiên cứu được sấy khô, ép và lưu tại Bảo tàng Thực vật thuộc khoa Sinh Học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo trong Dược điển Việt Nam V

- Dung dịch nước Javen/Cloramin B, dung dịch acid acetic 5%, dung dịch xanh methylen 1%, dung dịch đỏ son phèn, nước cất, glycerin

- Bản mỏng tráng sẵn TLC silica gel 60 F254 của Merck (Đức)

- Các chất chuẩn định tính Sâm Việt Nam bao gồm: G-Rg1, G-Rb1, M-R2, G-Rd được cung cấp bởi khoa Hóa Phân tích - tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

- Acid oleanolic được cung cấp bởi công ty Biopurify Phytochemicals (Trung Quốc) đạt độ tinh khiết 98%

- Thuốc thử vanilin-acid sulfuric, thuốc thử AS

2.2.2 Phương tiện và máy móc

- Kính hiển vi Leica DM 1000 Kính lúp soi nổi Stereo Blue Cân kỹ thuật Sartorius TE412 Cân phân tích Precisa và cân phân tích vi lượng HA 225SM-DR Tủ sấy Memmert Máy xác định hàm ẩm OHAUS Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay Máy ảnh kĩ

thuật số Canon

- Bếp đun cách thủy, hệ thống đun hồi lưu Bể siêu âm Wisd Máy ly tâm Centrifuge

Harmonic Series Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm: Cốc có mỏ, đũa thủy tinh, mao quản, pipet, bình nón, bình định mức, phễu lọc …

- Bình chạy sắc ký 2 ngăn kích thước 20 x 10 cm của hãng CAMAG (Thụy Sĩ)

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC của CAMAG (Thụy Sĩ) tại Bộ môn Dược liệu bao gồm: hệ thống chấm mẫu Linomat 5, buồng triển khai tự động ADC-2, buồng chụp sắc ký Visualizer Hệ thống được điều khiển qua máy tính có cài đặt phần mềm visionCATs phiên bản 2.5

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

2.3.1.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học

Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây dựa theo phương pháp

mô tả phân tích [3] [8] [22], đối chiếu với khóa phân loại chi Panax L trong các tài

liệu phân loại thực vật như Thực vật chí Trung Quốc, Thực vật chí Campuchia, Lào, Việt Nam và các mẫu tiêu bản chuẩn của loài trên thế giới Thu hái, làm tiêu bản và lưu giữ tiêu bản

2.3.1.2 Nghiên cứu về đặc điểm cấu tạo giải phẫu thực vật

Làm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép [4]: Mẫu dược liệu được ngâm mềm, cắt bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay Lựa chọn những lát cắt mỏng, nguyên vẹn Tiến hành ngâm bằng nước Javen hoặc sử dụng dung dịch Cloramin B để tẩy đến khi trắng, sau đó rửa lại nhiều lần bằng nước Ngâm 30 phút trong acid acetic 5%, sau

đó rửa lại với nước Nhuộm vi phẫu thu được bằng xanh methylen 1 % đã pha loãng với nước trong 30 phút rồi rồi rửa lại bằng nước Nhuộm bằng đỏ son phèn trong khoảng 30 phút, sau đó rửa lại bằng nước Đặt vi phẫu lên phiến kính đã có sẵn 1 giọt glycerin, đậy lá kính Tiến hành soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và

mô tả mẫu quan sát được

2.3.1.3 Nghiên cứu về đặc điểm bột Dược liệu

Mẫu dược liệu sau khi thu hái được phơi, sấy khô, nghiền thành bột thô, rây qua rây 150 µm Dùng kim mũi mác để lấy 1 lượng vừa đủ bột dược liệu, để lên phiến kính có sẵn 1 giọt nước cất, đậy lá kính và quan sát đặc điểm dưới kính hiển vi quang học ở vật kính có độ phóng đại x10 và x40 lần Tiến hành chụp ảnh và mô tả đặc điểm bột dược liệu [4]

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.2.1 Xác định hàm ẩm bột dược liệu

Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu, xác định hàm ẩm bằng máy xác định

độ ẩm OHAUS Đo 3 lần và lấy giá trị hàm ẩm trung bình

2.3.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa

học thường quy theo tài liệu [4] [5]

 Định tính saponin:

- Quan sát hiện tượng tạo bọt:

Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm vào đó 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm 5

ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

- Sơ bộ phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid:

Cân khoảng 0,1 g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm khoảng 5 ml ethanol 30%, đun sôi cách thủy vài phút Lọc lấy dịch chiết Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống nghiệm thứ nhất 5 ml NaOH 0,1 N (pH=13) và ống nghiệm còn lại 5 ml HCl 0,1 N (pH=1) Thêm 5 giọt dịch chiết dược liệu vào cả 2 ống nghiệm Lắc mạnh trong 1 phút Để yên, nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang bằng nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid

- Phản ứng Liebermann - Burchard:

Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90% và đun cách thủy trong 5 phút Lọc nóng qua giấy lọc vào 1 chén sứ, cô cách thủy đến cắn Để nguội Hòa tan cắn này bằng hỗn hợp gồm 1 ml anhydride acetic và 1 ml cloroform, lọc nhanh qua bông lấy dịch trong cho vào 1 ống nghiệm khô Để nghiêng ống nghiệm, dùng pipet hút khoảng 1 ml acid sulfuric đậm đặc cho chảy nhẹ nhàng dọc theo thành ống nghiệm, không lắc ống nghiệm

Phản ứng dương tính khi mặt ngăn cách giữa 2 lớp chất lỏng có 1 vòng màu nâu

đỏ, đỏ tím hay tím; lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lơ đến xanh lá nếu là dẫn chất steroid hoặc có màu hồng đến tía nếu là dẫn chất triterpenoid

 Định tính các thành phần có trong dịch chiết ethanol:

Cân khoảng 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 50 ml ethanol 90% Đun sôi cách thủy vài phút Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid và coumarin

Định tính flavonoid:

- Phản ứng với dung dịch kiềm:

Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10% sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng Thêm khoảng 1-2 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của

dung dịch được tăng thêm

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%:

Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% rồi lắc

sẽ thấy xuất hiện tủa xanh đen

- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%:

Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt chì acetat 10 % sẽ thấy xuất hiện tủa

- Phản ứng Cyanidin:

Cho 1ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên một vài phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ

- Phản ứng với thuốc thử Diazo:

Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam

Định tính Coumarin:

- Phản ứng mở, đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch lọc, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun sôi cách thủy cả 2 ống nghiệm trong vài phút Để nguội rồi quan sát thấy ống 1 có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát, thấy ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì ống 1 trở lại đục như ống 2

 Định tính các thành phần trong dịch chiết nước:

Lấy 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính nhóm đường khử, acid hữu cơ và tanin

Định tính tanin:

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%:

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1 % sẽ xuất hiện tủa bông trắng

- Phản ứng với muối kim loại:

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch FeCl3 5 % sẽ xuất hiện tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch chì acetat 10 % sẽ xuất hiện tủa bông

Dung dịch thử 1: Cân chính xác 1 g bột dược liệu thô Thêm vào 5ml

methanol, chiết siêu âm 3 lần, mỗi lần trong 30 phút Để nguội, lọc dịch chiết qua màng 0,22 µm, thu được dịch chiết toàn phần Ký hiệu là S1

Dung dịch thử 2: Chúng tôi dự đoán thành phần hóa học của loài thuộc chi Panax

L nghiên cứu có chứa các hợp chất saponin với phần aglycon có cấu trúc khung acid oleanolic Do đó bên cạnh dịch chiết toàn phần, chúng tôi chuẩn bị dịch chiết sau thủy phân Cách tiến hành như sau: cân chính xác 1 g bột dược liệu thô, đun cách thủy 3 lần, mỗi lần trong 30 phút với 20 ml nước cất Tiến hành ly tâm, lọc và gộp lấy dịch chiết nước Sau đó, cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa tan cắn trong 30 ml dung dịch acid hydrocloric 1N, đun sôi hồi lưu trong 4 giờ, để nguội Chuyển dịch thủy phân vào bình gạn, lắc kỹ với cloroform 3 lần, mỗi lần 20 ml Gộp lấy dịch chiết cloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, cô trên cách thủy đến cạn, thu lấy cắn Hòa cắn trong chính xác 5 ml methanol, lọc qua màng 0,22 µm thu được dịch chiết sau thủy phân Ký

hiệu là S2

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chất chuẩn acid oleanolic và các chất chuẩn định

tính Sâm Việt Nam (G-Rg1, G-Rb1, M-R2, G-Rd) được hòa tan trong methanol với lượng thích hợp để dùng làm dung dịch đối chiếu

Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 của Merck đã hoạt hóa ở nhiệt độ

110 oC trong 1 giờ

Triển khai SKLM : Đưa dịch chiết toàn phần trước thủy phân S1, dịch chiết sau

thủy phân S2 và các dung dịch chất chuẩn thích hợp lên cùng 1 bản mỏng sử dụng hệ

thống chấm sắc ký Linomat 5, để khô tự nhiên Đặt bản mỏng vào bình chạy sắc ký đã

bão hòa dung môi, đậy kín để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên của bản mỏng khoảng 1 cm thì kết thúc quá trình Đánh dấu đường dung môi

và để khô tự nhiên trong tủ hốt Quan sát và chụp ảnh bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm Sau khi hiện màu bằng thuốc thử thích hợp, quan sát và chụp ảnh bản mỏng dưới ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại bước sóng

366 nm

a Sắc ký lớp mỏng so sánh với các chất chuẩn định tính Sâm Việt Nam

- Để xác định xem sự có mặt hay không của 1 số hợp chất dùng để định tính Sâm Việt

Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) trong mẫu nghiên cứu, chúng tôi triển khai

SKLM sử dụng hệ dung môi: n-butanol - nước - acid acetic (4:5:1, lớp trên) theo chuyên luận Sâm Việt Nam trong Dược điển Việt Nam V [1]

- Đưa dịch chiết toàn phần trước thủy phân S1 và các chất chuẩn lên cùng một bản mỏng Tiến hành triển khai SKLM Sau khi quá trình kết thúc, hiện màu bằng thuốc thử vanilin - acid sulfuric và quan sát, chụp ảnh ở ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm

b Sắc ký lớp mỏng so sánh với chất chuẩn acid oleanolic

- Chúng tôi dự đoán trong thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu có các saponin triterpenoid có phần aglycon là acid oleanolic Do đó, dịch chiết toàn phần trước thủy phân S1, dịch chiết sau thủy phân S2 và dung dịch chất chuẩn acid oleanolic được đưa lên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi thích hợp Sau khi quá trình triển khai kết thúc, bản mỏng được hiện màu bằng thuốc thử AS và quan sát, chụp ảnh ở ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm

2.3.3 Bán định lượng acid oleanolic tự do trong dịch chiết dược liệu đã thủy phân

- Từ kết quả triển khai SKLM so sánh với OA, chúng tôi nhận thấy có vết tương ứng

về màu sắc và vị trí với OA trên sắc ký đồ của dịch chiết S2 Do đó, chúng tôi tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định hàm lượng OA dạng tự do trong S2

2.3.3.1 Nguyên tắc của quá trình bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng

Đối với sắc ký lớp mỏng TLC, diện tích và mật độ của một vết tách ra trên sắc

ký đồ trong cùng một điều kiện xác định thì tỷ lệ với lượng chất có trong vết đó Vì thế

ta có thể xác định được hàm lượng của acid oleanolic tự do trong dịch chiết sau thủy

phân bằng cách đo mật độ quang của vết thử với một dãy mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau được triển khai trên cùng một bản mỏng

2.3.3.2 Cách tiến hành

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,00200 g chất chuẩn acid

oleanolic, hòa tan trong chính xác 5 ml methanol thu được dung dịch chất chuẩn có nồng độ 0,4 mg/ml

Triển khai sắc ký lớp mỏng:

- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 kích thước 10 cm x 10 cm, đã hoạt hóa

ở nhiệt độ 110 oC trong 1 giờ

- Pha động: Hệ dung môi n-hexan-ethylacetat-toluen-acid formic (14,5:4:2:0,05)

(v/v/v/v)

- Chấm sắc ký: Chấm lần lượt dịch chiết sau thủy phân và dung dịch chất đối chiếu

acid oleanolic lên trên cùng một bản mỏng bằng hệ thống chấm sắc ký Linomat 5, để

khô tự nhiên

- Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình chạy sắc ký đã bão hòa dung môi pha

động, đậy kín, để yên, quan sát quá trình tách cho đến khi vết dung môi cách mép trên của bản mỏng khoảng 1 cm thì kết thúc quá trình, lấy bản mỏng ra, đánh dấu mép trên

bờ dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

- Hiện màu bằng thuốc thử AS, sấy bản mỏng ở nhiệt độ 110 oC trong 3 phút để hiện

rõ màu các vết Quan sát và chụp ảnh bản mỏng ở ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại

bước sóng 366 nm

- Hàm lượng acid oleanolic trong mẫu được xác định dựa vào diện tích pic ở ánh sáng

trắng

Xây dựng đường chuẩn định lượng: Đưa lần lượt lên bản mỏng 5 vết của dung

dịch acid oleanolic chuẩn (0,4 mg/ml) có cùng nồng độ nhưng với 5 thể tích khác nhau lần lượt là 2,5 µl; 4,0 µl; 5,0 µl; 7,5 µl và 10,0 µl tương ứng với lượng chất là 980 nanogam; 1568 nanogam; 1960 nanogam; 2940 nanogam; 3920 nanogam Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa vào cường độ màu pic sắc ký trên sắc ký đồ quan sát ở ánh sáng trắng sau khi hiện màu bằng thuốc thử AS:

Y = mX + C Trong đó: Y là diện tích dưới đường cong pic hấp thụ AUC

X là lượng chất đưa lên bản mỏng

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định từ đường chuẩn theo công thức:

LOD = 3,3 x б/m và LOQ = 10 x б/m Trong đó: б là độ lệch chuẩn của độ đáp ứng

m là độ dốc của đường tuyến tính

Xác định hàm lượng acid oleanolic tự do trong dược liệu: Dịch chiết methanol

sau thủy phân của dược liệu tương ứng với nồng độ 0,1763 g dược liệu khô tuyệt đối/ml được đưa lên bản mỏng với thể tích là 5 µl Sau khi hiện màu bằng thuốc thử

AS và sấy bản mỏng ở 110 oC trong 3 phút, quan sát và chụp ảnh, xác định diện tích dưới đường cong pic hấp thụ của acid oleanolic trong mẫu thử tại ánh sáng trắng Dựa

vào phương trình đường chuẩn để tính toán hàm lượng acid oleanolic trong dược liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật và xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật:

Cây thân cỏ, sống lâu năm, cao khoảng 36-43 cm (1) Thân rễ (8 và 9) mọc nằm

ngang, có các đốt gần giống thân rễ ở các loài thuộc chi Gừng (Zingiber) Thân mọc

thẳng, chiều dài khoảng 35-42 cm, nhẵn Lá thường 5, mọc vòng trên đỉnh thân Cuống lá dài khoảng 11-12 cm; lá kép chân vịt một lần, 5 lá chét, khi khô mỏng như màng, cuống lá chét dài 0,5-1,5 cm; hai lá chét dưới (4) có phiến hình trứng không đối xứng, kích thước khoảng 7-8 x 3-4 cm; 3 lá chét trên có phiến hình mũi giáo ngược, kích thước khoảng 12-14 x 4-5 cm; lá chét ở chính giữa lớn hơn lá chét 2 bên; chóp lá

có đuôi, gốc lá thót nhọn; bề mặt lá xa trục có gai móc ở trên gân; bề mặt lá gần trục

có ít gai móc hơn bề mặt lá xa trục; gân lá của lá chét trên hình lông chim, gồm gân chính và 7-9 cặp gân bên nổi rõ ở mặt dưới (7) Mép lá có răng cưa nhỏ, hướng lên

Cụm hoa (6) mọc ở đỉnh thân, giữa các lá; cụm hoa đơn, dạng tán, có cuống dài khoảng 19 cm, cuống cụm hoa nhẵn, mang 65-70 hoa Cuống hoa dài khoảng 0,5-1

cm Quả chín (5) màu đỏ, hình gần cầu, đường kính khoảng 8 mm Hạt hình gần cầu Hoa khoảng tháng 7-8 Quả khoảng tháng 10 (Hình 3.1)

Mẫu thu ở tỉnh Xiêng Khoảng, huyện Khoun, mọc dưới tán rừng rậm thường xanh

3.1.2 So sánh đặc điểm hình thái thực vật của mẫu nghiên cứu với một số loài thuộc chi Panax L

Từ kết quả mô tả về đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu đã trình bày ở phần

3.1.1, kết hợp với các mô tả về một số loài thuộc chi Panax L trong tài liệu phân loại

thực vật là Thực vật chí Trung Quốc [62], chúng tôi nhận thấy mẫu nghiên cứu có rất

nhiều đặc điểm tương đồng với 3 loài P japonicus, P stipuleanatus và P

zingiberensis Do đó, chúng tôi tiến hành so sánh đặc điểm hình thái của mẫu nghiên

cứu với 3 loài trên và thu được các kết quả trình bày trong bảng 3.1