NGUYỄN MINH HƯỜNG TỔNG hợp và THỬ tác DỤNG KHÁNG tế bào UNG THƯ của một số dẫn CHẤT 2,3 DIMETHYL 2h INDAZOL 6 AMIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ hà nội 2020

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH HƯỜNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2,3-DIMETHYL-2H-INDAZOL-6-AMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH HƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT

SỐ DẪN CHẤT

2,3-DIMETHYL-2H-INDAZOL-6-AMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH HƯỜNG

1 Bộ môn Hóa Hữu cơ

2 Bộ môn Hóa dược

HÀ NỘI - 2020

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Văn Thị Mỹ Huệ, ThS Hoàng Thu Trang,

CN Dương Văn Diễn cùng các thầy cô giảng viên và kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Hóa

Hữu cơ và Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ

và tạo điều kiện tốt nhất về cả cơ sở vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội với tri thức và tâm huyết đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Để hoàn thành khóa luận này, không thể không nhắc tới sự giúp đỡ nhiệt tình của

NCS Dương Tiến Anh, DS Phùng Huy Hiệu, các bạn, các em cùng thực hiện khóa

luận và tham gia nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Hóa Hữu cơ và Bộ môn Hóa Dược

đã luôn gắn bó, động viên, chia sẻ với tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Lời cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân trong gia đình tôi, những người luôn động viên, chia sẻ và làm chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trên mọi con đường

Mọi ngôn từ đều không thể diễn tả hết lòng biết ơn của tôi tới những người đã giúp đỡ tôi trong cả quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 21 tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Minh Hường

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol 3

1.1.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol trên các đích khác nhau 3

1.1.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol trên các đích khác nhau 8

1.2 Một số phản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất indazol 10

1.2.1 Các phản ứng hóa học cơ bản 10

1.2.2 Các phản ứng tổng hợp dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Tổng hợp hóa học 16

2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Tổng hợp hóa học 17

2.3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1 Hóa học 20

3.1.1 Tổng hợp hóa học 20

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 26

3.1.3 Khẳng định cấu trúc 27

3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 31

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 33

4.1 Bàn luận về các phản ứng tổng hợp hóa học 33

4.1.1 Phản ứng methyl hóa tổng hơp chất II 33

4.1.2 Phản ứng tổng hợp chất III 34

4.1.3 Phản ứng tổng hợp chất Va-e 34

4.2 Bàn luận về khẳng định cấu trúc 35

4.2.1 Phổ hồng ngoại (IR) 35

4.2.2 Phổ khối (MS) 36

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 37

4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) 38

4.3 Bàn luận về kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance) A549 : Dòng tế bào ung thư phổi

AcOH : Acid acetic

AKSci : Công ty AK Scientific

EGFR : Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì

EtOAc : Ethyl acetat

EtOH : Ethanol

eIF-2α : Eukaryotic translation initiation factor 2

FGFR : Thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi

FBS : Huyết thanh bò chửa

FDA : Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

GCN2 : General control depressible 2

GI50 : Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư

HCT116 : Dòng tế bào ung thư đại trực tràng

HDAC : Histon deacetylase

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration) IDO1 : Indoleamin 2,3-dioxygenase 1

IR : Hồng ngoại (Infrared)

MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

mTORC1 :Mammalian target of rapamycin complex 1

NSCLC : Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ

Rf : Hệ số lưu giữ trong sắc kí lớp mỏng

Raf :Rapidly Accelerated Fibrosarcoma

RPMI : Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640

s : Singlet

SK-HEP-1 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan

SNU-638 : Dòng tế bào ung thư dạ dày

PFS : Tỷ lệ sống không tiến triển của bệnh

PDGFR : Thụ thể yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu PLK-4 : Polo-like kinase 4

UV : Tử ngoại (Ultraviolet)

VEGFR : Thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

WHO : Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 15

Bảng 3.1 Các nguyên liệu IVa-e 20

Bảng 3.2 Thông số cảm quan và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất Va-e 26

Bảng 3.3 Thông số nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf của các dẫn chất Va-e 27

Bảng 3.4 Số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất Vb-e 28

Bảng 3.5 Số liệu phổ khối lượng của các dẫn chất Va-e 29

Bảng 3.6 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của các dẫn chất Va-e 29

Bảng 3.7 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các dẫn chất Va-e 31

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất Va-e 32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Các đồng phân của vòng indazol 2

Hình 1.2 Một số thuốc mang cấu trúc indazol 2

Hình 1.3 Dẫn chất 2H-indazol ức chế CRAF 3

Hình 1.4 Các dẫn chất indazol ức chế Aurora A 4

Hình 1.5 Cấu trúc của chất 5, 6, 7 5

Hình 1.6 Dẫn chất 1H-indazol ức chế EGFR 5

Hình 1.7 Cơ chế lẩn tránh miễn dịch của tế bào ung thư qua IDO1 [24] 7

Hình 1.8 Các dẫn chất indazol ức chế enzym IDO1 7

Hình 1.9 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế PLK4 8

Hình 1.10 Cấu trúc của pazopanib 9

Hình 1.11 Dẫn chất của pazopanib ức chế VEGFR 9

Hình 1.12 Dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế FGFR 10

Hình 1.13 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế IDO1 10

Hình 4.1 Phổ hồng ngoại của hợp chất Ve 36

Hình 4.2 Phổ khối lượng của hợp chất Ve 37

Hình 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) củahợp chất Ve 38

Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) của dẫn chất Ve 39

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffmann 11

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ phản ứng khử nhóm nitro thơm bằng sắt trong môi trường acid 11

Sơ đồ 1.3 Giai đoạn tạo hợp chất trung gian imin 13

Sơ đồ 1.4 Giai đoạn khử hóa tạo sản phẩm amin 13

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin bằng tác nhân khử hóa hóa học 14

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin bằng khí H2 với xúc tác Pd/C 14 Sơ đồ 1.7 Tổng hợp dẫn chất indazol có nhóm amin bậc 2 ở vị trí số 6 14

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 20

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II 21

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III 21

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất Va 22

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất Vb 23

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất Vc 24

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất Vd 24

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất Ve 25

Sơ đồ 4.1 Các sản phẩm có thể tạo thành của phản ứng methyl hóa chất I 33

Sơ đồ 4.2 Tổng hợp 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin 34

Sơ đồ 4.3 Tổng hợp các dẫn chất 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin 34

Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất Va-e 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, sự gia tăng nhanh chóng của bệnh ung thư đang trở thành vấn đề đáng báo động của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu và ước tính khoảng 9,6 triệu người chết do ung thư năm 2018 [42] Tại Việt Nam, có 164671

ca mắc ung thư mới và có 114871 ca tử vong do ung thư trong năm 2018 [41]

Bên cạnh các phương pháp điều trị ung thư đã được sử dụng rộng rãi như: phẫu thuật, xạ trị, hóa trị liệu thì hiện nay đã có thêm một phương pháp mới với hướng điều trị nhắm tới đích phân tử, phương pháp này đang được biết đến là con đường mới đầy triển vọng cho các nhà khoa học Tuy nhiên, việc điều trị còn gặp nhiều khó khăn do số lượng thuốc điều trị còn hạn chế, giá cả đắt đỏ và tình trạng kháng thuốc xuất hiện ngày càng phổ biến Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các hợp chất mới có hoạt tính chống ung thư tiềm năng hơn là vấn đề cấp thiết của Việt Nam và cả thế giới

Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư mới, các hợp chất

dị vòng mang khung indazol đã thu hút được sự quan tâm đáng kể từ các nhà khoa học

do có hoạt tính kháng ung thư tốt [17], [20] Các dẫn chất mang khung indazol có khả năng tương tác với nhiều đích phân tử có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của ung thư [35], [39] Do vậy, khung hợp chất này mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng tế bào ung thư mới mang lại hiệu quả cao Những nghiên cứu gần đây cho thấy, các dẫn chất thế ở vị trí số 6 của indazol đã cho thấy hoạt tính chống ung thư rất tốt với khả năng ức chế nhiều đích phân tử của nhiều bệnh ung thư khác nhau [15], [28], [29], [38]

Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới trong việc tìm kiếm các dẫn chất

mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư, đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế

bào ung thư của một số dẫn chất 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin” được tiến hành

với 2 mục tiêu:

1 Tổng hợp một số dẫn chất 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin

2 Thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Các dị vòng chứa nitơ đóng vai trò quan trọng về mặt dược lý, chúng có mặt trong nhiều thuốc thương mại đã có trên thị trường Indazol là một trong những nhóm quan trọng nhất của các hợp chất dị vòng chứa nitơ với cấu trúc vòng bicyclic, được tạo thành

từ sự ngưng tụ giữa vòng pyrazol và vòng benzen Indazol thường tồn tại ở 2 dạng đồng phân do sự chuyển vị proton giữa 2 nguyên tử N ở vị trí số 1 và 2 [39] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Các đồng phân của vòng indazol

Các dẫn chất indazol rất hiếm khi được tìm thấy trong tự nhiên Mặc dù vậy, nhóm chất này vẫn thu hút được sự chú ý đáng kể từ các nhà khoa học do có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống loạn nhịp, kháng HIV, kháng tế bào ung thư [39] Đã có nhiều thuốc mang khung indazol được sử dụng rộng rãi trong y học Ví dụ, nirapanib được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc điều trị ung thư buồng trứng biểu mô tái phát, ung thư ống dẫn trứng hoặc ung thư phúc mạc nguyên phát, ung thư vú và tuyến tiền liệt [30] Pazopanib và axitinib là các chất ức chế tyrosin kinase, được sử dụng để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận [21], [33] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Một số thuốc mang cấu trúc indazol

1.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol

1.1.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol trên các đích khác nhau

1.1.1.1 Các dẫn chất indazol ức chế enzym serin/threonin kinases (STK)

Serin/threonin kinases (STK) là một nhóm enzym lớn, có ít nhất 125 trong tổng

số hơn 500 protein kinases được mã hóa trong bộ gen người là serin/threonin Các enzym serin/threonin kinases đóng vai trò quan trọng trong một số hoạt động sinh lí của tế bào Tuy nhiên, sự biểu hiện quá mức của những enzym này đã được chứng minh là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành một số tế bào ung thư [13] Do đó, việc phát triển các chất

ức chế hiệu quả chống lại một số STK như Aurora kinase, Raf kinase (A, B, C-Raf), PLK-4 là một cách tiếp cận trong điều trị ung thư

Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Aman W và cộng sự đã tổng hợp được một

dãy các chất mang khung 2H-indazol với hướng ức chế CRAF chọn lọc Các hợp chất

được đánh giá cho hoạt động chống đông với dòng tế bào u ác tính WM3629 và cho

hiệu quả khá tốt Đặc biệt, chất 1 được phát hiện là chất ức chế CRAF mạnh và chọn lọc

với giá trị IC50 là 38,6 nM, mạnh hơn rất nhiều so với khả năng ức chế của chất này trên BRAF (IC50 = 9,45 µM) [11]

Hình 1.3 Dẫn chất 2H-indazol ức chế CRAF

Hướng tới sự ức chế Aurora A, một loạt các dẫn chất của indazol (pyrrolopyridin-2-yl) đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu của Song P và cộng sự

3-Kết quả đánh giá sinh học chỉ ra rằng chất 2, 3 và 4 có khả năng ức chế mạnh Aurora A

với các giá trị IC50 tương ứng là 0,032 µM; 0,046 µM và 0,519 µM (Hình 1.4) Ngoài

ra, cả ba chất đều cho thấy khả năng ức chế chọn lọc đáng kể trên một số đích phân tử thuộc nhóm STK như CDK2, BRAF Khi đánh giá sinh học trên một số dòng tế bào ung

thư ở người, chất 4 cho thấy khả năng ức chế mạnh trên 2 dòng tế ung thư máu HL60

và ung thư đại trực tràng HCT116 với giá trị IC50 tương ứng là 8,3 nM và 1,3 nM [31]

Hình 1.4 Các dẫn chất indazol ức chế Aurora A

1.1.1.2 Các dẫn chất indazol ức chế enzym tyrosin kinases

Tyrosin kinases là một họ enzym tham gia vào quá trình phosphoryl hóa protein,

là quá trình vận chuyển nhóm phosphat từ các phân tử ATP đến các phân tử acid amin tyrosin có trong phân tử protein đích Có 90 enzym thuộc họ tyrosin kinases và được chia thành 30 phân nhóm khác nhau [19] Tyrosin kinases đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các hoạt động của tế bào như sinh trưởng, chuyển hóa, phân chia và sự sinh tồn của tế bào Các enzym này có thể trở nên đột biến, gia tăng quá mức về mặt số lượng dẫn đến sự tăng trưởng, phân chia mất kiểm soát của các tế bào liên quan [26] Đây là cơ sở của việc hình thành các tế bào ung thư Do đó, tyrosin kinases trở thành một đích phân tử quan trọng trong việc điều trị ung thư Trong nhóm này, thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGFR), thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGFR) được coi là những đích phân tử quan trọng trong việc tìm ra hoạt chất chống ung thư hiện nay

Năm 2017, nhóm nghiên cứu của Zhu W đã tổng hợp một nhóm dẫn chất của pyridin-3-amin mang khung indazol với hướng ức chế đa mục tiêu để điều trị ung thư

phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) Ban đầu, nhóm nghiên cứu tìm ra chất 5 có khả

năng ức chế thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGFR) với giá trị IC50 trên FGFR1 là 3,8 ± 0,5 µM Nhằm mục đích cải thiện khả năng ức chế trên FGFR1 nhóm

nghiên cứu thực hiện quá trình tối ưu hóa dựa trên cấu trúc của chất 5 và tìm ra chất 6

cho khả năng ức chế mạnh FGFR1,2,3 với giá trị IC50 tương ứng là 18 nM; 1,6 nM và 27,5 nM. Đáng chú ý hơn, hợp chất 6 cũng cho thấy khả năng ức chế ở nồng độ nano

đối với một số enzym liên quan đến NSCLC như EGFR, EGFR/T790M/L858R (L858R/T790M là dạng đột biến đôi của EGFR) (Hình 1.5) [40]

Tiếp tục hướng tới đích FGFR, nhóm nghiên cứu của Yan W và cộng sự đã công

bố một dãy dẫn chất của 1H-indazol có khả năng ức chế FGFR, trong đó chất 7 cho thấy

khả năng ức chế mạnh nhất với giá trị IC50 trên các thụ thể FGFR1-4 tương ứng là 0,9 nM; 2,0 nM; 2,0 nM và 6,1 nM Đặc biệt, khi thử hoạt tính sinh học trên tế bào ung thư,

chất 7 cho thấy khả năng ức chế mạnh các dòng tế bào ung thư phổi NCI-H1581 và dòng

tế bào ung thư dạ dày SNU16 với giá trị IC50 nhỏ hơn 0,1 nM (Hình 1.5) [37]

Hình 1.5 Cấu trúc của chất 5, 6, 7

Dựa trên một lần sàng lọc từ 1500 hợp chất với 80 dòng tế bào ung thư phổi tế bào không nhỏ, Engel J và cộng sự đã tổng hợp được các chất có khả năng ức chế chọn

lọc dạng đột biến đôi L858R/T790M của EGFR Trong số đó, chất 8 mang khung

1H-indazol có tác dụng khá tốt đối với đột biến L858R/T790M của EGFR với IC50 = 0,07

µM [6]

Hình 1.6 Dẫn chất 1H-indazol ức chế EGFR

1.1.1.3 Các dẫn chất indazol ức chế enzym indoleamin 2,3-dioxygenase 1 (IDO1)

Indoleamin 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là một enzym có chứa nhân hem xúc tác

quá trình oxy hoá Tryptophan (Trp) thành N-formyl kynurenin trong bước đầu tiên của

con đường kynurenin [16] Trp là một acid amin thiết yếu của cơ thể, được chuyển hóa bởi 2 con đường là methoxyindol và kynurenin [25] Trong đó, kynurenin là con đường

chính để chuyển hóa Trp với khoảng 95% tổng lượng tryptophan được chuyển hóa bằng con đường này [16], [25]

Sự chuyển hóa của tryptophan thông qua con đường kynurenin đóng vai trò then chốt trong quá trình ức chế miễn dịch liên quan đến ung thư Với vai trò là enzym bước đầu của con đường kynurenin, IDO1 và con đường kynurenin có vai trò tương tự nhau trong việc điều hòa phản ứng miễn dịch Sự biểu lộ hoạt động của IDO1 trong các tế bào ảnh hưởng đến vi môi trường xung quanh chúng theo 2 cơ chế: sự đói Trp của tế bào và độc tính của các chất chuyển hóa qua con đường kynurenin [16], [24] Sự suy giảm Trp do hoạt động quá mức của IDO1 dẫn đến sự tích tụ của acid ribonucleic vận chuyển tryptophan (tRNA) trong tế bào, điều này dẫn đến sự hoạt hóa yếu tố general control nondepressible 2 (GCN2), sau đó phosphoryl hóa và ức chế yếu tố dịch mã eIF2α làm ngăn chặn sự tổng hợp protein và ngăn chặn sự phát tiển của tế bào [23] Mặt khác, nồng độ Trp suy giảm còn làm ức chế hoạt động của phức hợp rapamycin 1 (mTORC1), gây ra một loạt các đáp ứng bao gồm hoạt hóa quá trình tự tiêu bào, dị ứng trong tế bào T Kết quả của sự thiếu hụt Trp trong tế bào là làm ngăn chặn chu trình tế bào và tăng tính nhạy cảm với sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào lympho

T [23], [24]

Theo cơ chế chuyển hóa Trp, các chất chuyển hóa của Trp qua con đường kynurenin gián tiếp ngăn chặn hoạt động của tế bào T bằng việc gây hoạt hóa tế bào T

ức chế (Treg) thông qua aryl hydrocarbon receptor (AhR) [24] Các tế bào diệt tự nhiên

NK là thành viên quan trọng trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh, có vai trò kìm hãm sự phát triển của một số khối u Kynurenin có nguồn gốc Trp có thể làm giảm số lượng tế bào NK và làm suy giảm độc tố tế bào NK bằng cách ức chế các thụ thể tế bào NK, do

đó góp phần vào sự tiến triển của khối u [18], [36]

Các nghiên cứu đã xác nhận được rằng IDO1 hoạt động quá mức trong các tế bào ung thư như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư đại trực tràng, ung thư vú, ung thư biểu mô

tế bào gan, ung thư phổi tế bào không nhỏ, ung thư biểu mô dạ dày, ung thư buồng trứng [14], [22], [34] Thêm vào đó, sự hoạt động của IDO1 được cảm ứng bởi nhiều tác nhân gây viêm như IFN-γ, lypopolysaccharid (LPS) và một số cytokin như TNF-α, IL-6, IL-

10 [32] Trong đó IFN-γ là một trong những tác nhân gây cảm ứng IDO1 mạnh nhất Với cơ chế chống lại sự hình thành và phát triển của khối u các cytokin cũng như các tác nhân gây viêm được giải phóng xung quanh khối u để tiêu diệt cũng như hoạt hóa

hệ miễn dịch thông qua quá trình hóa ứng động Nhưng chính quá trình này gây cảm ứng IDO1 trong tế bào ung thư, ngay cả đối với các tế bào không có sự hoạt động quá mức của IDO1, dẫn đến ức chế hệ miễn dịch xung quanh tế bào khối u Tất cả những điều này cho thấy sự có mặt của IDO1 làm cho hệ thống miễn dịch của cơ thể bị ức chế, gây ra sự dung nạp miễn dịch của cơ thể đối với khối u, giúp cho khối u tồn tại và kháng lại các liệu pháp điều trị

Hình 1.7 Cơ chế lẩn tránh miễn dịch của tế bào ung thư qua IDO1 [24]

Các nghiên cứu lâm sàng cũng đã chỉ ra rằng, sự biểu hiện quá mức của IDO1 trên bệnh nhân là nguyên nhân dẫn đến việc kém đáp ứng trong hóa trị và xạ trị Do vậy, việc tìm ra các chất ức chế IDO1 là một phương pháp tiềm năng trong điều trị ung thư [22] Gần đây, nhóm nghiên cứu của Pradhan N và cộng sự đã tổng hợp được một dãy các hợp chất mang khung indazol có khả năng ức chế IDO1 ở ngưỡng µM với giá trị IC50 trong khoảng từ 0,72 µM-10 µM Trong đó hợp chất 9 và 10 cho thấy khả năng ức chế IDO1 mạnh nhất với giá trị IC50 tương ứng là (9, IC50 = 0,77 µM; 10, IC50 = 0,72 µM) (Hình 1.8) [27]

Hình 1.8 Các dẫn chất indazol ức chế enzym IDO1

1.1.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol trên các đích khác nhau

1.1.2.1 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế enzym serin/threonin kinase (STK)

Hướng tới đích phân tử là PLK4, nhóm nghiên cứu của Sampson P.B và cộng sự

đã tổng hợp được một dãy các dẫn chất thế ở vị trí số 6 của indazol có khả năng ức chế

tốt PLK4 Trong số đó, hợp chất 11, 12, 13 là những hợp chất được quan tâm nhiều nhất

với khả năng ức chế mạnh trên cả enzym và một số dòng tế bào ung thư Trên enzym, các hợp chất ức chế PLK4 với giá trị IC50 tương ứng là 11, IC50 = 1,3 nM; 12, IC50 = 7,4

nM và 13, IC50 = 2,8 nM Tiếp tục đưa 3 chất trên đi thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi A549 và ung thư đại trực tràng HCT116 Kết quả cho thấy, chất 11 có khả năng

ức chế A549 tốt nhất với giá trị GI50 là 0,004 μM, còn chất 13 cho khả năng ức chế

HCT116 tốt nhất với giá trị GI50 là 0,004 μM (Hình 1.9) [29]

Hình 1.9 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế PLK4

1.1.2.2 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế enzym tyrosin kinases

Pazopanib là một thuốc điển hình nằm trong số những dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol Pazopanib là một chất ức chế tyrosin kinase thứ 3 (TKI) và là liệu pháp nhắm tới đích phân tử thứ 6 được FDA phê duyệt với chỉ định điều trị ung thư biểu mô tế bào thận (RCC) vào năm 2009 Cơ chế hoạt động chính của pazopanib trong việc điều trị RCC là nhắm vào việc ức chế các thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGFR)

và thụ thể yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGFR)

Hình 1.10 Cấu trúc của pazopanib

Trong thử nghiệm lâm sàng pha III, pazopanib đã cải thiện đáng kể tỷ lệ đáp ứng

và tỷ lệ sống không tiến triển (PFS) của bệnh ở cả bệnh nhân chưa điều trị hoặc đã được điều trị bằng cytokin trước đó Với những bệnh nhân chưa từng điều trị, tỷ lệ đáp ứng

và PFS là 32% và 11,1 tháng; còn đối với những bệnh nhân đã được điều trị bằng cytokin trước đó thì cho tỷ lệ đáp ứng và PFS là 29% và 7,4 tháng [21]

Dựa trên cấu trúc của pazopanib, một số hợp chất đã được tổng hợp hướng đến mục đích điều trị ung thư Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Zang J và cộng sự, đã công

bố một dãy các dẫn xuất của pazopanib có khả năng ức chế VEGFR trong đó chất 14 cho thấy khả năng ức chế VEGFR tương đương với pazopanib (pazopanib, IC50 = 34

nM, 14, IC50 = 37 nM) Đặc biệt, chất 14 cho thấy độc tính trên tế bào ung thư đại trực

tràng HT29 còn tốt hơn SAHA – chất ức chế histon deacetylase (HDAC) đã được cấp

phép sử dụng trong lâm sàng (14, HT29 IC50 = 1,07 μM; SAHA, HT29 IC50 = 1,51 μM)

Hơn nữa, thử nghiệm trên chuột cũng cho thấy chất này có sinh khả dụng đường uống lên tới 72% [38]

Hình 1.11 Dẫn chất của pazopanib ức chế VEGFR

Nhằm mục đích tối ưu hóa khả năng ức chế FGFR của các dẫn chất

1H-indazol-3-amin, nhóm nghiên cứu của Cui J đã tổng hợp được một dãy các dẫn chất thế ở vị trí

số 6 của indazol có khả năng ức chế tốt trên FGFR Trong đó hợp chất 15 cho thấy khả

năng ức chế FGFR mạnh nhất, cụ thể: với FGFR1, IC50 < 4,1 nM; với FGFR2, IC50 =

2,0 ± 0,8 nM Đặc biệt hơn, hợp chất 15 cho thấy khả năng ức chế tương đối tốt trên các

dòng tế bào KG1 và SNU16 với giá trị IC50 tương ứng là 25,3 ± 4,6 nM và 77,4 ± 6,2

nM [15]

Hình 1.12 Dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế FGFR

1.1.2.3 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế enzym indoleamin-2,3-dioxygenase 1

Nhận thấy tiềm năng của các dẫn chất indazol trong việc điều trị ung thư thông qua việc ức chế IDO1, hai nhóm nghiên cứu độc lập của Yang L và Qian S đã tìm ra

phương pháp để tối ưu hóa cấu trúc của các dẫn chất 1H-indazol để ức chế IDO1 tốt

nhất Trong số các dẫn chất 1H-indazol hai nhóm tổng hợp được, chất 16 và 17 là 2 chất

có khả năng ức chế IDO1 mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 5,3 µM và 0,74 µM [10], [28]

Hình 1.13 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế IDO1

Dựa vào phân tích cấu trúc-tác dụng của phức hợp chất ức chế-IDO1, nhóm nghiên cứu đã kết luận nhóm thế halogen ở vị trí số 6 đóng vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt tính ức chế IDO1 [28]

1.2 Một số phản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất indazol

1.2.1 Các phản ứng hóa học cơ bản

1.2.1.1 Phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffman

Phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffmann là phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử

(SN2) của tác nhân ái nhân là amoniac và các amin với các alkyl halogenid [1]

Sơ đồ phản ứng như sau:

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffmann

Các amin có tính ái nhân yếu cần sử dụng chất xúc tác là base để chuyển từ dạng phân tử về dạng anion giúp làm tăng tính ái nhân

Tỷ lệ mol của các chất phản ứng ảnh hưởng đến mức độ alkyl hóa sản phẩm, việc lựa chọn tỷ lệ mol ban đầu có ý nghĩa quyết định đến tỷ lệ tạo thành các bậc amin trong sản phẩm [3] Trên thực tế, phương pháp này thường thu được hỗn hợp các amin có bậc khác nhau và cả muối amoni bậc 4 [1]

1.2.1.2 Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm

Khử hóa là quá trình làm giảm độ oxy hóa của chất đem khử Trong đó hợp chất hữu cơ lấy thêm nguyên tử hydro, loại khỏi nó các dị tố (thường là oxy) hoặc nhận thêm điện tử Trong công nghiệp hóa dược, quan trọng nhất là quá trình khử các nitro thơm thành amin [3]

Tác nhân khử hóa có nhiều loại khác nhau, chúng được chia thành 3 nhóm sau: tác nhân khử hóa hóa học (bao gồm kim loại trong môi trường acid, kiềm; hỗn hống kim loại; kim loại và amin; các hydrid kim loại…); tác nhân là hydro phân tử với xúc tác và tác nhân khử hóa điện hóa Trong đó, tác nhân hay dùng để khử nhóm nitro thơm thành amin là sử dụng kim loại trong môi trường acid (Fe/HCl, Sn/HCl) và tác nhân là hydro phân tử với xúc tác

a Kim loại trong môi trường acid

- Sắt trong môi trường acid (phản ứng Bechamp)

Phản ứng khử hóa bằng tác nhân Fe trong môi trường acid HCl (phản ứng Bechamp) có ý nghĩa thực tế lớn nhất Đây là phản ứng quan trọng để điều chế các amin thơm trong công nghiệp Phản ứng xảy ra theo phương trình sau:

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ phản ứng khử nhóm nitro thơm bằng sắt trong môi trường acid

Phản ứng đạt hiệu quả tốt nhất khi sử dụng tác nhân là bột gang xám Bột gang này giàu graphit, dễ nghiền thành bột mịn Nó không đồng nhất nên tạo nhiều cặp pin điện hóa tham gia quá trình khử

- Thiếc trong môi trường acid

Ngoài hợp chất nitro, tác nhân này còn khử được nhiều loại hợp chất khác Tuy nhiên, do giá thành cao, nên việc sử dụng thiếc trong công nghiệp làm tác nhân khử còn hạn chế

1.2.1.3 Khử hóa bằng hydro phân tử với xúc tác

Ở điều kiện thường, hydro phân tử ít có khả năng phản ứng Khi tiếp xúc với xúc tác, hydro được hoạt hóa và có khả năng tham gia phản ứng Vì vậy phản ứng hydro hóa bao giờ cũng cần xúc tác Độ hoạt hóa của các chất xúc tác được thể hiện bằng lượng hydro hấp phụ trên một đơn vị khối lượng Xúc tác có thể sử dụng riêng hoặc đưa lên một chất mang

Niken (Ni) là chất xúc tác được sử dụng phổ biến nhất, có thể sử dụng một mình hoặc đưa lên chất mang Ni-Raney được dùng nhiều vì độ hoạt hóa rất tốt của nó Một gam chất xúc tác này có thể hấp phụ 25-150 cm3 khí hydro Xúc tác Ni-Raney có thể dùng để hydro hóa các alken, alcol, ceton, nitril và các hợp chất thơm

Bột đồng được sử dụng làm chất xúc tác để khử các hợp chất nitro thơm thành amin (xúc tác này không ảnh hưởng nhân thơm) Có thể sử dụng một mình hoặc cùng chất mang Hỗn hợp Cu-Cromit là xúc tác có giá trị thực tế lớn Xúc tác này có thể hydro hóa các ester và amid Phản ứng hydro hóa được tiến hành ở điều kiện áp suất, nhiệt độ trên 100oC

Các kim loại quý như platin, palladi, rutheni và rhodi cũng được dùng để khử hóa nhiều nhóm chức khác nhau Vì giá thành cao nên các xúc tác nhóm này thường được trộn với chất mang (đất sét, silicagel, than hoạt ) Xúc tác chứa khoảng 3-10% kim loại Platin được dùng để khử hóa nhiều nhóm chức một cách dễ dàng (trừ acid carboxylic, amid và ester) Xúc tác Palladi về hoạt tính cũng giống như platin, nhưng hoạt tính yếu hơn platin khi dùng để khử ceton mạch thẳng và nhân thơm Duy nhất rutheni có thể xúc tác khử hóa acid carboxylic Nó có ưu điểm là không bị độc bởi lưu huỳnh Phản ứng khử hóa với xúc tác là các kim loại quý thường được tiến hành ở áp suất thường

1.2.1.4 Phản ứng amin hóa khử

Các hợp chất chứa nhóm carbonyl như aldehyd, ceton có thể phản ứng với amoniac hoặc các amin bậc thấp để tạo thành các amin có bậc cao hơn khi có mặt tác nhân khử hóa

Quá trình phản ứng trải qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Các hợp chất carbonyl ngưng tụ với amoniac hoặc các amin bậc

thấp để tạo thành imin, đồng thời loại một phân tử nước Giai đoạn 1 như sau:

Sơ đồ 1.3 Giai đoạn tạo hợp chất trung gian imin

Đây là phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl Phản ứng này có thể sử dụng chất xúc tác là acid, xúc tác proton hóa nguyên tử oxy của nhóm carbonyl, tạo điều kiện cho phản ứng xảy ra dễ dàng hơn Tuy nhiên, khi sử dụng quá thừa acid có thể làm giảm khả năng phản ứng của các amin Nhìn chung, phản ứng tạo imin được tối ưu hóa

ở pH hơi acid (pH = 4-5) [12]

Giai đoạn 2: Các hợp chất imin bị khử hóa thành amin khi có mặt tác nhân khử

hóa là hydro phân tử có xúc tác là các kim loại nặng như (Ni, Pd, Pt ) hoặc natri cyanoborohydrid (NaBH3CN) (Sơ đồ 1.4) NaBH3CN là chất được sử dụng rộng rãi trong phản ứng amin hóa khử có khả năng khử chọn lọc liên kết đôi C=N, do đó làm hạn chế tạo sản phẩm phụ của quá trình khử hóa các aldehyd và ceton là alcol [12]

Sơ đồ 1.4 Giai đoạn khử hóa tạo sản phẩm amin

1.2.2 Các phản ứng tổng hợp dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol

Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Boloor A và cộng sự đã tiến hành phản ứng

khử hóa nhóm nitro thơm của 2,3-dimethyl-6-nitro-2H-indazol bằng tác nhân khử là

SnCl2 trong môi trường acid (HCl), dung môi phản ứng là 2-methoxyethyl ether (Sơ đồ 1.5) Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ thường trong vòng 30 phút Sau khi kết thúc phản ứng

sử dụng diethyl ether để kết tủa hỗn hợp phản ứng, tủa thu được được lọc và rửa lại bằng diethyl ether, cuối cùng thu được chất rắn màu vàng là dạng muối HCl của 2,3-dimethyl-

2H-indazol-6-amin với hiệu suất phản ứng là 95% [5]

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin bằng tác nhân khử hóa hóa học

Trong một nghiên cứu khác, nhóm nghiên cứu của Terentjeva S và cộng sự đã

thực hiện khử nhóm nitro thơm của 2,3-dimethyl-6-nitro-2H-indazol bằng khí H2 với

xúc tác 10% Pd/C và dung môi phản ứng là MeOH để thu được sản phẩm (Sơ đồ 1.6)

Phản ứng diễn ra ở 25-30°C Hỗn hợp phản ứng sau đó được lọc loại bỏ chất xúc tác và

rửa bằng methanol để thu sản phẩm ở dạng base với hiệu suất phản ứng là 89% [9]

Nhận xét: Cả 2 phương pháp đều cho thấy phản ứng dễ thực hiện ở điều kiện

thường và hiệu suất phản ứng của cả 2 phương pháp đều khá cao Mặc dù phương pháp

của Boloor A cho hiệu suất phản ứng cao hơn nhưng lại có môi trường phản ứng là

2-methoxyethyl ether là một dung môi đắt tiền và khó kiếm, quá trình xử lý phức tạp hơn,

trong khi hiệu suất phản ứng cao hơn không đáng kể so với phương pháp của Terentjeva

S Do vậy, để tiết kiệm chi phí và thời gian chúng tôi tiến hành phản ứng theo phương

pháp của Terentjeva S

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Miloudi A đã tiến hành N-aryl hóa để tổng hợp

amin bậc 2 của 2-methyl-2H-indazol-6-amin Tác nhân N-aryl được sử dụng là

triphenylbismuth diacetat Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ với

xúc tác là Cu(OAc)2 và dung môi DCM Sản phẩm sau đó được cất chân không rồi tinh

chế bằng sắc kí cột ở hệ dung môi ether: pentan (1:1) Hiệu suất phản ứng đạt 66% [8]

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp dẫn chất indazol có nhóm amin bậc 2 ở vị trí số 6

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Các dung môi, hóa chất dùng trong tổng hợp hóa học chủ yếu có nguồn gốc xuất

xứ từ hãng AKSci (Mỹ), Trung Quốc, Merck (Đức) Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế và được trình bày trong Bảng 2.1 dưới đây:

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

1 3-methyl-6-nitro-1H-indazol Trung Quốc

2 Iodomethan (CH3I) AKSci - Mỹ

8 Ethyl acetat (EtOAc) Trung Quốc

10 Methanol (MeOH) Trung Quốc

11 Acid acetic (AcOH) Trung Quốc

12 N,N-dimethylformamid (DMF) Trung Quốc

13 Dicloromethan (DCM) Trung Quốc

22 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merck – Đức

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn (1 cổ dung tích 25 ml, 1 cổ dung tích 50 ml,

2 cổ dung tích 100 ml), sinh hàn, pipet chia vạch, cốc thủy tinh, bình định mức, bình chiết, bình nón, bình chịu áp Sigma-Aldrich, phếu lọc, ống đong…

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)

- Cân kĩ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Tủ sấy Memmer (Đức)

- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)

- Máy sinh khí Hydro PH200 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 120 (Mỹ) tại bộ môn Hóa Hữu Cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy đo phổ khối lượng LTQ-Oritrap hãng Thermo-Scientific (Mỹ) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tổng hợp hóa học

- Tổng hợp 5 dẫn chất của 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin, bao gồm:

- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được

- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Các dẫn chất 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin sau khi được tổng hợp, tinh chế

và khẳng định cấu trúc được đem đi thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư như A549 (tế bào ung thư phổi), SNU-638 (tế bào ung thư dạ dày), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú), SK-HEP-1 (tế bào ung thư biểu mô tế bào gan) và HCT116 (tế bào ung thư đại trực tràng)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc kí lớp mỏng TLC

- Tinh chế các chất tổng hợp được bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng hoặc sắc kí cột hở

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, độ tinh khiết của sản phẩm sau tinh chế) kết hợp với đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Các chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon (1H-NMR và 13C-NMR)

2.3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) và giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm Probits

2.3.2.1 Nguyên tắc thử

Dựa trên khả năng gắn thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong

tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng

tế bào ung thư sống sót

2.3.2.2 Các dòng tế bào thử nghiệm

Các dòng tế bào thử nghiệm bao gồm:

+ A549 (tế bào ung thư phổi)

+ HCT116 (tế bào ung thư đại trực tràng)

+ MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú)

+ SNU-638 (tế bào ung thư dạ dày)

+ SK-HEP-1 (tế bào ung thư biểu mô tế bào gan)

Các dòng tế bào này được mua từ Viện bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ (ACTT, Manas VA, USA) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc RPMI 1640 (RPMI), bổ sung penicillin, streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kích thích tăng trưởng tế bào và huyết thanh bò chửa (FBS)

2.3.2.3 Chất chuẩn đối chiếu dương tính

Ellipticin pha trong DMSO được dùng làm chất chuẩn có khả năng diệt tế bào được dùng làm chất đối chiếu dương

2.3.2.4 Các bước tiến hành

- Bước 1: Chuẩn bị

Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI được bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng

độ 2.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 180 µL Các đĩa sau đó được ủ ở 37℃ trong điều kiện 5% CO2

Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 µL môi trường DMEM/RPMI

bổ sung 10% từ FBS từ dung dịch gốc trong dimethylsulfoxid (DMSO) rồi được thêm vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, sau đó ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%

- Bước 2: Tiến hành thử

Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50 µL dung dịch tricloroacetic 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 4℃ trong 1 giờ rồi sau đó rửa 5 lần với nước máy

Các đĩa được để khô trong không khí và được nhuộm với sulforhodamin B 0,4% trong acid acetic 1% trong 30 phút rồi sửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm không kết dính

Tiếp theo, các đĩa này được để khô ở nhiệt độ phòng và phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bởi 200 µL dung dịch chứa 10 mM Tris-base không đệm (pH 10,0) Độ hấp thụ được đọc bằng thiết bị ELISA ở 515 nM

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Hóa học

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 5 chất Va-e trong khóa luận được tổng hợp theo sơ đồ quy

trình như sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Trong đó, các nguyên liệu IVa-e được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Các nguyên liệu IVa-e

IVc

3.1.1.1 Tổng hợp dẫn chất trung gian 2,3-dimethyl-6-nitro-2H-indazol (II)

Hợp chất 2,3-dimethyl-6-nitro-2H-indazol (II) được tổng hợp từ nitro-1H-indazol (I) theo sơ đồ sau:

3-methyl-6-Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II

➢ Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,708 g (4 mmol) chất I vào 20,0 ml DMF khan trong bình cầu đáy

tròn dung tích 100 ml, sau đó thêm 1,106 g (8 mmol) K2CO3

- Khuấy hỗn hợp trong bình phản ứng khoảng 1 giờ ở 60℃

- Thêm 0,5 ml (8 mmol) CH3I vào bình phản ứng, tiếp tục khuấy hỗn hợp ở 60℃ trong vòng 3 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EtOAc:n-hexan (1:1)

➢ Xử lý phản ứng

- Làm nguội bình phản ứng

- Phân tán khối phản ứng vào 25 mL nước cất

- Chiết thu sản phẩm bằng dung môi EtOAc (3 lần, mỗi lần 40 mL), gộp dịch chiết

của 3 lần chiết

- Lắc dịch chiết với dung dịch NaCl bão hòa, sau đó loại nước bằng Na2SO4 khan

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hở với hệ dung môi EtOAc:n-hexan, chất II thu được ở hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 40:60

- Cất quay chân không ở 70℃ loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,306 g sản phẩm II

➢ Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng

- Hiệu suất: 44,8%

- to nc = 183-184℃

- Rf = 0,54 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất trung gian 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin

Hợp chất III được tổng hợp từ chất II bằng phản ứng hydrogen hóa theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III

➢ Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,765 g (4 mmol) chất II vào 10,0 mL MeOH trong bình phản ứng Sau

đó thêm từ từ 100 mg 10% Pd/C Lắp bình phản ứng vào thiết bị Hydrogen hóa,

- Khí H2 được tạo thành trong máy sinh khí hydro và chuyển vào thiết bị Hydrogen hóa

- Đuổi không khí khỏi bình phản ứng bằng cách sục khí H2 từ thiết bị Hydrogen hóa vào bình phản ứng liên tục nhiều lần

- Thêm khí H2 vào bình phản ứng đến áp suất 3,5 bar Hỗn hợp được hydro hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động EtOAc:n-hexan = 1:1

➢ Xử lý phản ứng

- Lọc khối phản ứng qua Celite, rửa bằng MeOH

- Cô quay đuổi dung môi ở 55oC

- Sấy khô trong tủ hút chân không thu được 0,580 g sản phẩm III

Các dẫn chất 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin (Va-e) được tổng hợp bằng phản

ứng amin hóa khử giữa chất III với các aldehyd hoặc ceton (IVa-e), sử dụng tác nhân

- Hòa tan 0,645 g (4 mmol) chất III vào 0,232 g (4 mmol) chất IVa vào hỗn hợp

dung môi gồm 1,1 mL (20,0 mmol) AcOH vào 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL

- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 1,256 g (20,0 mmol) NaBH3CN

- Khuấy hỗn hợp ở 40oC trong 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EtOAc: n-hexan = 1:1

➢ Xử lý phản ứng

- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM

- Chiết với dung dịch Na2CO3 (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết

- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hở với hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 60:40

- Cất quay chân không ở 50oC loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,738 g sản phẩm Va

➢ Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Hiệu suất: 90,8%

- tonc = 100-102℃

- Rf = 0,47 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần 3.1.3

b Tổng hợp chất Vb

Tổng hợp N-cyclopentyl-2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin (Vb) từ nguyên liệu 2,3-dimethyl-2H-indazol-6-amin (III) và cyclopentanon (IVb) theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất Vb

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng: tương tự như chất Va, thay 0,232 g chất

IVa bằng 0,336 g (4,0 mmol) chất IVb Thu được 0,837 g sản phẩm Vb

➢ Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Hiệu suất: 90,5%

- to nc = 107-109℃

- Rf = 0,49 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày

➢ Cách tiền hành và xử lý phản ứng: tương tự như chất Va, thay 0,232 g chất

IVa bằng 0,393 g (4,0 mmol) chất IVc Thu được 0,883 g sản phẩm Vc

➢ Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Hiệu suất: 90,0%

- to nc = 112-113℃

- Rf = 0,51 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày

➢ Cách tiến hành và xử lý phản ứng: tương tự như chất Va, thay 0,232 g chất

IVa bằng 0,424 g (4,0 mmol) chất IVd Thu được 0,936 g sản phẩm Vd

➢ Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu hồng

- Hiệu suất: 93,6%

- to nc = 118-120℃

- Rf = 0,40 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày

➢ Cách tiến hành và xử lý phản ứng: tương tự như chất Va, thay 0,232 g chất

IVa bằng 0,496 g (4,0 mmol) chất IVe Thu được 1,020 g sản phẩm Ve

➢ Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Hiệu suất: 95,1%

- tonc = 122-124℃

- Rf = 0,45 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày

cụ thể ở phần 3.1.3

Kết quả tổng hợp được các dẫn chất như sau:

Bảng 3.2 Thông số cảm quan và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất Va-e

Các chất Va-e sau khi tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng

phương pháp sắc kí lớp mỏng với bản mỏng Silica gel 60 F254 Các chất đã tổng hợp được hòa tan bằng dung môi EtOAc và chấm lên bản mỏng Tiến hành chạy sắc kí lớp

mỏng với các hệ dung môi khác nhau: DCM:MeOH (9:1), EtOAc:n-hexan (1:2), EtOAc:n-hexan (1:1) Sau khi chạy sắc kí, bản mỏng được sấy khô và đem quan sát dưới

đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm, thấy một vết tròn và rõ ràng Giá trị Rf khi chạy với

hệ dung môi EtOAc:n-hexan (1:1) được xác định và tổng hợp trong Bảng 3.3

3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy

Đo nhiệt độ nóng chảy của các chất Va-e bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 12 Kết quả cụ thể được trình bày ở Bảng 3.3 Kết quả nhiệt độ nóng chảy cho thấy: các chất Va-e có điểm chảy rõ ràng khoảng dao động hẹp 1-2℃.

Bảng 3.3 Thông số nhiệt độ nóng chảy và giá trị R f của các dẫn chất Va-e

Các kết quả về sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy cho thấy tất cả các chất

tổng hợp được Va-e là tinh khiết và đủ điều kiện để đo phổ

3.1.3 Khẳng định cấu trúc

Để xác định cấu trúc các chất đã tổng hợp được, chúng tôi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), và phổ cổng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) Kết quả được trình bày dưới đây:

Bảng 3.4 Số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất Vb-e

Các dẫn chất tổng hợp được ghi phổ khối lượng theo phương pháp phun mù điện

tử (ESI-MS) trên máy phổ khối lượng LTQ- Orbitrap hãng Thermo- Scientific (Mỹ) tại Khoa Hóa học- Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội Các phổ đồ được

ghi ở Phụ lục 5-9 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất Va-e được trình bày trong Bảng 3.5