XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU DÂY KHỔ QUA RỪNG

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ

KHOA DƯỢC

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

DƯỢC LIỆU XÂY DỰNG TIỂU CHUẨN DƯỢC LIỆU

DÂY KHỔ QUA RỪNG

Momordica Charantia L.var.abbreviata Ser

Cần Thơ – 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu dây Khổ qua rừng” Bên

cạnh sự nổ lực của cá nhân đã vận dụng kiến thức đã tiếp thu được ở những môn

học, tìm tồi học hỏi cũng như thu thập thông tin sơ lược có liên quan đến đề tài, em

luôn nhận được sự giúp đỡ từ các bạn trong nhóm và sự hướng dẫn tận tình của cô

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Ths.Thái Thị Cẩm – Khoa Dược Trường Đại Học

Nam Cần Thơ Người đã hướng dẫn em hoàn thành đề tài này Đồng thời, em cũng

gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng nhóm thực hành đã hoàn thành cùng mình đề tài

này

Thực hiện được đề tài này cùng còn hạn chế, không thể tránh khỏi sự thiếu sót Em

mong nhận được sự góp ý chân tình từ cô và các bạn

Cần Thơ, ngày 14 tháng 12 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Thảo Ngân

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC HÌNH ẢNH 7

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1 Tổng quan về dược liệu 11

1.1 Định danh dược liệu 10

1.2 Phân bố sinh thái 11

1.3 Đặc điểm hình thái 11

Lá 11

Thân 11

Hoa 11

Quả 12

Hạt 12

1.4 Bộ phận dùng 13

1.5 Thu hái và chiến biến 13

1.6 Thành phần hóa học 13

1.7 Tác dụng dược lý 15

Đái tháo đường 15

Kháng khuẩn, Kháng viêm 15

Chống ung thư 15

Kháng viêm, Giảm đau 15

1.8 Công dụng 16

Theo YHCT 16

Theo YHHĐ 16

1.9 Các chế phẩm trên thị trường 17

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.1 Đối tượng 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp vi học 18

2.2.1.1 Soi bột 18

2.2.1.2 Vi phẫu 19

2.2.2 Phương pháp hóa học 21

2.2.3 Định lượng 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24

3 Kết quả 24

3.1 Mô tả đặc điểm hình thái 24

3.2 Đặc điểm vi phẫu 26

3.2.1 Soi bột 26

Lá 26

Thân 27

Rễ 28

3.2.2 Vi phẫu 29

Lá 29

Cuống lá 30

Thân 31

Rễ 32

3.2.3 Soi bột, vi phẫu vẽ tay 33

Vi phẫu 33

Soi bột 35

3.3 Định tính 36

3.3.1 Dịch chiết Ether 37

3.3.2 Dịch chiết Cồn 38

3.3.3 Dịch chiết Nước 40

CHƯƠNG IV: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU 43

4.1 Mô tả cảm quan 43

4.2 Đặc điểm soi bột 45

4.3 Đặc điểm vi phẫu 46

4.4 Định tính Saponin 47

CHƯƠNG V NHẬN XÉT 48

CHƯƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Sơ đồ 2.2.2 Các giai đoạnh chiết dịch chiết 22

Bảng 1.6 Thành phần hóa học 14

Bảng 3.3 Kết quả định tính các nhóm hợp chất có trong Dây khổ qua rừng 36

Hình 1.9 Các chế phẩm Dây khổ qua rừng trên thị trường 17

Hình 2.2 Ảnh chụp bột dùng để soi 19

Hình 3.1 Dây Khổ qua rừng 24

Hình 3.1 Lá Khổ qua rừng 24

Hình 3.1 Hoa Khổ qua rừng 25

Hình 3.1 Quả Khổ qua rừng 25

Hình 3.1.5 Hạt Khổ qua rừng 25

Hình 2.2.1 Bột lá dưới Kính hiển vi 26

Hình 2.2.1 Bột thân dưới Kính hiển vi 27

Hình 2.2.1 Bột rễ dưới Kính hiển vi 28

Hình 3.2.2 Vi phẫu phiến lá dưới Kính hiển vi 29

Hình 3.2.2 Vi phẫu cuống lá dưới Kính hiển vi 30

Hình 3.2.2 Vi phẫu thân dưới Kính hiển vi 31

Hình 3.2.2 Vi phẫu rễ dưới Kính hiển vi 32

Hình 3.2.3 Cấu tạo phiến lá, cuống lá vẽ tay 33

Hình 3.2.3 Cấu tạo thân, rễ vẽ tay 34

Hình 3.2.3 Bốc tách biểu bì lá vẽ tay 35

Hình ảnh các phản ứng dịch chiết Định tính dương tính 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thực vật xuất hiện khi trái đất còn rất sơ khai Nó trải qua quá trình tiến hóa lâu

dài theo điều kiện tự nhiên của trái đất, nó đóng vai trò quan trọng đối với sự sống

trên trái đất và nhất là đối với con người, nó cung cấp những sản phẩm quý giá nhất

như: tinh bột, dầu béo, vitamin, đường và các loại thuốc chữa bệnh Ngoài ra nó còn

cung cấp các nguyên liệu trong công nghiệp như: cao su, gỗ, tinh dầu, nhựa …

Dù trực tiếp hay gián tiếp thì nó để góp phần xây dựng, cải thiện đời sống con

người

Ngày nay, để khai thác nguồn lợi thực vật con người đã và đang đi sâu vào

nghiên cứu, khám phá các giá trị của các loài thực vật vào đời sống Theo điều tra

của các nhà khoa học, cho đến nay đã có trên 2000 loài thực vật đã được con người

sử dụng làm thực phẩm làm thuốc chữa bệnh, làm cây cảnh phục vụ cho đời sống và

phát triển kinh tế, tạo ra hang loạt các dược phẩm có nguồn gốc nhân tạo với tính

năng chữa bệnh rất công hiệu và mang lại kết quả rất nhanh chóng Nhưng đằng sau

đó còn có những hạn chế, tác dụng phụ, v.v gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Do vậy khuynh hướng quay về với thiên nhiên sử dụng những loài thực vật có giá

trị dinh dưỡng và dược tính chữa bệnh đang ngày càng được quan tâm trong đó có

các loài thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) như: bầu, bí, mướp, gấc, mướp đắng và

đặc biệt là các loài thuộc chi Momordica (mướp đắng) như: cây gấc (Momordica

Cochinchinensis), mướp đắng (Momordica Charantia Linn), cây khổ qua rừng

(Momordica Charantia L.var.abbreviata Ser)

Momordica là một chi của khoảng 80 cây thân thảo dạng dây leo sống một năm

hay lâu năm có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Phi và miền nam Châu Á

Nước ta ở vùng nhiệt đới, thực vật phát triển quanh năm nên việc nghiên cứu các

loài thuộc chi Momordica (mướp đắng) có nhiều triển vọng loài này được con

người sử dụng như một loại thực phẩm thông dụng gần như không thể thiếu trong

mỗi gia đình Trong y học dược tính của mướp đắng được ứng dụng điều trị các loại

bệnh như: tiểu đường, viêm phổi, sốt cao,v.v Theo nghiên cứu gần đây thì thành

phần trong trái mướp đắng còn có tính diệt khuẩn cao và có cả hiệu lực chống ung

thư Vào năm 1990, Liên Hiệp Quốc đã chọn mướp đắng là một trong sáu cậy thuốc

trị bệnh tiêu biểu trên thế giới ngoài ra còn có cây gấc dầu gấc dung làm thuốc bồi

bổ cơ thể, chữa bệnh khô mắt, dùng bôi lên các vết thương, vết loét, vết bỏng,…cây

khổ qua rừng điều trị trúng nắng, sốt nóng mất nước, hội chứng lỵ…

Ngày nay, khi ngành công nghiệp dược phẩm phát triển càng nhanh thì chất

lượng của dược phẩm ngày càng được quan tâm hơn Chất lượng dược liệu là một

trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của chế phẩm

chiết xuất từ dược liệu Chất lượng dược liệu có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố

như: giống, điều kiện nuôi trồng, mùa thu hái, quy trình sơ chế và bảo quản, v.v

Hiện nay, các dược liệu kém chất lượng đang được mua bán tràn lan như: Dược

liệu giả, dược liệu bị chiết kiệt hoạt chất, các chế phẩm từ dược liệu không rõ nguồn

gốc được người dân truyền tai nhau sử dụng Điều đó, có thể gây ảnh hưởng nghiêm

trọng đến sức khỏe cũng như đồng thời gây mất lòng tin của người dùng vào các

chế phẩm từ dược liệu khi không nhận thấy hiệu quả trong việc điều trị Do đó, việc

xây dựng tiểu chuẩn dược liệu là điều rất quan trọng nâng cao hiệu quả điều trị của

các chế phẩm từ dược liệu cũng như bổ sung tiểu chuẩn dược liệu về khổ qua rừng

vào dược điển Việt Nam IV

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu dây khổ rừng”

Đề tài được thực hiện với 3 mục tiêu:

 Quan sát vi học để đề xuất nhận diện dược liệu dây khổ qua rừng

 Chiết xuất và phân tích sơ bộ thành phần hóa học, đối chiếu với kết quả đã

công bố

 Tổng hợp tài liệu, đề xuất các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu dây khổ qua

rừng

CHƯƠNG I TỔNG QUA TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU:

1.1 Định danh dược liệu:

Tên gọi khác: Khổ qua rừng, lương qua, cẩm lệ chi

Tên khoa học: Momordica Charantia L.var.abbreviata Ser

Tên nước ngoài: Nhật bản là Nigauri – Nepal là Karelo – Quảng Đông (Trung

Quốc) là Loeng4gwaa1

1.2 Phân bố sinh thái:

Mướp đắng là loài cây hoang dại của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu

lục Từ thời xa xưa, Mướp đắng được trồng lần đầu tiên ở Đông Ấn và Nam Trung

Quốc, được sử dụng như loại rau quả giàu chất sắt và vitamin C Sau đó cây được

du nhập sang châu Phi và châu Mỹ Latinh Mướp đắng phân bố khá rộng rãi ở miền

Nam Trung Quốc (Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây…), một số nước Nam Á

như Ấn Độ, Malaysia…

Ở Việt Nam, có thể thấy cây Mướp đắng rừng ở khu vực các tỉnh trung du và miền

núi, miền Đông Nam Bộ như Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Phước, Bà Rịa- Vũng Tàu

và khu vực Tây Nguyên

Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng

Sau khi trái già, cây sẽ tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4-5 tháng tồn tại Hiện nay,

Mướp đắng rừng vẫn còn tồn tại chủ yếu ở dạng quần thể mọc hoang tuy nhiên ở

một số nơi đã được gieo trồng, thu hoạch

1.3 Đặc điểm hình thái:

 LÁ

Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm, chiều dài khoảng 5-10cm từ các đốt thân nối,

chiều rộng 4-8cm Phiến lá có lông nhám và có thùy dạng chân vịt, thùy hình bầu

dục, đầu thùy nhọn hoặc hơi tù, mép có răng cưa cạn đầu nhọn, thùy giữa kích

thước 3-4 x 2,5-3 cm, các thùy bên kích thước 2,5-3,5 x 2-2,5 cm

Phiến lá màu xanh lục ở đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới Gân lá hình chân vịt với 5

gân chính nổi rõ ở mặt dưới, các gân phụ tạo thành hình mạng

Trên gân chính phủ đầy lông dài trắng mịn, gân mặt dưới nhiều lông hơn gân mặt

trên Cuống lá màu xanh lục nhạt, mặt trên lõm có hai mép màu xanh lục đậm, mặt

dưới lồi và có nhiều lông hơn mặt trên, dài 2,5-3 cm

Hệ thống ở nách lá gồm các cơ quan: 1 chồi, 1 tua cuốn, 1-2 hoa đực hoặc 1-2 hoa

cái

 THÂN

Thân dây có cạnh, dạng dây leo bằng tua cuốn và có thể bò dài 2-3cm Thân non

màu xanh lục nhạt, có tiết diện đa giác, phủ đầy lông trắng mịn, thân già có màu

xanh lục đậm, dai hơn Tua cuốn không phân nhánh, chúng mộc lan và vươn rộng,

dạng sợi mảnh, dai, màu xanh lục nhạt, phủ nhiều lông trắng mịn, mọc ở nách lá

quấn vào các cây hoặc vật khác

 HOA

Hoa: Mọc riêng lẻ ở nách lá, đơn tính cùng gốc, đều, mẫu 5

Hoa đực: Cuống hoa màu xanh lục nhạt, dài 6-8 cm, phủ đầy lông trắng mịn Lá bắc

cách gốc cuống hoa 2-3 cm, không cuống, hình thận, màu lục đậm mặt trên, nhạt

mặt dưới, kích thước 0,7-0,9 x 0,5-0,7 cm, gân lá hình chân vịt với 5 gân chính, gân

giữa nổi rõ ở mặt dưới, các gân phụ tạo thành hình mạng, hai mặt đều phủ lông

trắng Lá đài 5, đều, ống đài hình chuông, màu xanh nhạt, cao 0,2-0,3 cm, trên chia

5 phiến hình bầu dục nhọn ở đầu, màu vàng nhạt, dài 0,3-0,5 cm, 2 mặt có gân dọc

và nhiều lông trắng ngắn Tiền khai đài 5 điểm

Cánh hoa 5, đều, rời nhưng dính với ống đài, phía dưới thuôn, phía trên loe rộng,

cánh hoa hơi nhăn, màu vàng, kích thước 0,6-0,8 cm x 1,2-1,4 cm, có 6-7 gân chính

màu xanh nhạt tỏa ra từ đáy và nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ tạo thành hình mạng, 2

mặt cánh hoa có lông tơ trắng, ngắn

Tiền khai cánh hoa 5 điểm Nhị 3, đều, chụm lại ở giữa hoa và dính nhau ở bao

phấn, chỉ nhị rời, màu trắng, dài khoảng 0,1-0,2 cm, 2 nhị mang bao phấn 2 ô, 1 nhị

mang bao phấn 1 ô Bao phấn dạng khúc khuỷu, màu vàng, cao khoảng 0,25 cm,

nứt dọc, đính đáy Hạt phấn rời, màu vàng cam, hình bầu dục, có rãnh

Hoa cái: Cuống hoa giống cuống hoa đực nhưng ngắn hơn Lá bắc giống lá bắc hoa

đực, cách gốc cuống hoa 1-2 cm Lá đài 5, đều, hình bầu dục khum nhọn ở đỉnh,

dính nhau một đoạn 0,1 cm tạo thành hình đĩa, phía trên chia thành 5 phiến, màu

xanh lục nhạt

Tiền khai đài 5 điểm Cánh hoa giống cánh hoa đực nhưng nhỏ hơn, dễ rụng Nhụy

có 3 lá noãn, bầu dưới 3 ô, mỗi ô mang nhiều noãn Bầu noãn hình bầu dục thuôn ở

hai đầu, bề mặt gồ ghề, phần gồ lên nhọn, phủ nhiều lông, dài 1-1,2 cm, đường kính

0,2-0,4 cm 1 vòi nhụy hình trụ màu xanh nhạt cao 0,3-0,5 cm, 3 đầu nhụy màu

vàng, mỗi đầu nhụy chia thành 2 thùy dạng chữ V

1.4 Bộ phận dùng:

Cả cây trừ Rễ: Thân, Lá, Quả

1.5 Thu hái và chế biến:

 Thời điểm thu hái:

Có thể thu hái bất kỳ vào thời điểm nào trong năm

 Cách chế biến:

Dạng tươi: Chỉ cần nhặt bỏ phần hư, bảo quản ngăn mát trong vòng 2-3 ngày

Dạng khô: Bằng cách thu hái, cắt dây phơi khô hoặc sấy khô

1.6 Thành phần hóa học:

 Theo các tài liệu đã công bố về thành phần hóa học của Mướp đắng là những

triterpen thuộc nhóm cucurbitan, olean và ursan tồn tại cả dưới dạng aglycon và

glycosid Các thành phần này có mặt trong các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất là

trong thân lá và quả của cây

 Các triterpen thuộc nhóm cucurbitan và nhóm ursan từ quả, lá Mướp đắng được các

nghiên cứu ở Nhật công bố: momordicin, momordicinin, momordicilin Các

triterpen thuộc nhóm olean là erthrodiol và một số khác được tìm thấy trong hạt

Mướp đắng

 Một số lượng lớn cucurbitan glycosid cũng đã được xác định cấu trúc:

momordicosid A, B, C, D, E,… trong đó hai chất được xác định là mang lại vị đắng

là momordicosid K và L, các momordicin: momordicin I, II, III…các saponin thuộc

nhóm olean và đặc biệt là charantin cũng đã được công bố cùng với hoạt tính kháng

ĐTĐ của hoạt chất này Các acid amin: acid aspartic, threonin, serin, acid glutamic,

prolin, alanin, glycin, valin, cystein, phenylalanin, histidin, lysin, arginin … Các sắc

tố lycopen, vitamin, chất khoáng như Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, P, N…, các alcol,

aldehyd, acid béo

Bảng 1.6 Thành phần hóa học

 Alkaloid, charantin, charine, cryptoxanthin, cucurbitins, cucurbitacins, cucurbitanes,

cycloartenols, diosgenin, axit elaeostearic, axit lauric, axit linoleicid acid linolenic,

momordenol,momordicilin,momordicins,momordicinin,momordicosides,momordin,

multiflorenol, acid myristic, nerolidol, acid oleanolic, axit oleic, axit oxalic,

pentadecans, peptide, axit petroselinic, polypeptide, protein ribosome khử hoạt tính

protein, acid rosmarinic, rubixanthin, spinasterol, glycosides steroid, stigmasta-diol,

stigmasterol, taraxerol, trehalose, chất ức chế trypsin, uracil, vacine, v-insulin,

verbascoside, vicine, zeatin, riboside zeatin, zeaxanthin, và zeinoxanthin

 Trong đó những hoạt chất làm giảm lượng đường trong máu bao gồm hỗn hợp các

saponin steroid được biết đến như charantins, peptide insulin, và ancaloit

1.7 Tác dụng dược lý:

Mướp đắng rừng có nhiều dược lý có giá trị đã được các nhà khoa học trên thế giới

nghiên cứu và chứng minh

o Điều trị đái tháo đường:

Việc điều trị ĐTĐ bằng Mướp đắng được khẳng định có triển vọng Các tác giả Ali

L., Khan A K., Mamum M I … đã thử nghiệm hiệu quả hạ đường huyết của dịch

chiết từ quả, hạt, toàn cây Mướp đắng trên chuột ĐTĐ thấy có kết quả rõ rệt [15]

Min– Jia Tan và cộng sự đã chiết tách momordicosid Q, R, S, và T từ Momordica

charantia Sau đó nghiên cứu tác dụng trị ĐTĐ và béo phì của các chất này Kết quả

cho thấy các momordicosid làm tăng quá trình oxy hoá acid béo và glucose trên cả

chuột còn nhạy cảm insulin và chuột đề kháng insulin do kích thích GLUT4, bước

cần thiết cho cảm ứng glucose vào tế bào Điều này có liên quan với các hoạt động

tang AMP-activated protein kinase (AMPK), một con đường trung gian hấp thu

glucose và quá trình oxy hoá acid béo

o Kháng khuẩn, kháng virus:

Nghiên cứu in vitro cho thấy chất chiết xuất từ Mướp đắng điển hình protein

MAP30 được phân lập từ những hạt của Mướp đắng có hoạt động kháng sinh phổ

rộng Dịch chiết cây Mướp đắng ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn gram âm

và gram dương, E.coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Pseudomonas,

Streptobacillus, Streptococcus, Helicobacter pylori, ký sinh trùng E histolytica và

Plasmodium falciparum, ức chế sự nhiễm và tăng trưởng của một số virus, bao gồm

cả HIV, Herpes simplex…

o Chống ung thư:

Mặc dù các thử nghiệm lâm sàng sử dụng chiết xuất Mướp đắng ở những bệnh nhân

ung thư chưa được thực hiện nhưng các nghiên cứu in vitro cho thấy chiết xuất từ

quả và hạt Mướp đắng có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số dòng tế bào

ung thư, bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột kết và các di căn ung thư vú

dòng tế bào MDAMB 231

o Kháng viêm, giảm đau:

Saponin momordin I và aglycon tương ứng là acid oleaneolic được biết là các chất

có tác dụng chống viêm, giảm đau Dịch chiết quả Mướp đắng có tác dụng ức chế vi

khuẩn H pylori, một vi khuẩn gây ra bệnh loét dạ dày, tá tràng Mướp đắng đã được

chứng minh có tác dụng chống loét dạ dày trên chuột do rượu gây ra sau khi dùng

indomethacin

1.8 Công dụng:

 Theo Y học cổ truyền:

Trong Đông Y, khổ qua rừng có vị đắng, tính mát, không độc, hiện chưa có tài liệu

nào nhắc đến quy Kinh của dược liệu

Theo đó, cây khổ qua rừng có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu đờm, nóng họng,

tiêu viêm, an thần, hạ đường huyết, chữa đau bụng, chữa vết côn trùng cắn,…

Nhờ đó, dân gian thường sử dụng dược liệu này để làm mát nhanh, chữa say nắng,

chữa mụn nhọt, viêm nhiễm, sốt cao, viêm họng, đau bụng, chữa bệnh gan, tiểu

đường, căng thẳng đầu óc,…

 Theo y học hiện đại:

Trong vài thập kỷ trở lại đây Tây y đã tập trung nghiên cứu tính dược từ cây khổ

qua rừng nhằm kiểm tra lại tính hiệu quả của các bài thuốc dân gian được dùng phổ

biến ở Châu Á và Châu Phi cũng như tìm cơ sở khoa học cho các thức ăn thực

dưỡng và điều chế tân dược

+ Điều trị Gout, Đái tháo đường, Ngăn ngừa ung thư, Thanh nhiệt giải đọc

1.9 Các chế phẩm trên thị trường:

(1) (2)

Hình 1.9 Các chế phẩm Dây Khổ qua rừng (Nguồn Internet) – Chú thích: 1.Trà

khổ qua rừng, 2.Thực phẩm chức năng khổ qua rừng, 3.Mask khổ qua rừng,

4.Cao lỏng khổ qua rừng

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.1 Đối tượng:

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phương pháp vi học:

Cơ sở của kiểm nghiệm vi học là dựa vào cấu tạo giải phẫu thực vật và một số phản

ứng hóa học thực vật Những kiến thức cơ bản này sẽ giúp nhiều cho việc xác định

các đặc điểm điển hình, các phản ứng đặc trưng của đối tượng nghiên cứu

2.2.1.1 Soi bột

Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi nhằm mục đích tìm ra những đặc điểm vi

học đặc trưng của bột dược liệu giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết của

dược liệu, phân biệt với dược liệu dễ nhầm lẫn và phát hiện sự giả mạo nếu có

Các bước quá trình soi bột:

Chuẩn bị soi bột: Lấy bộ phận dược liệu cần khảo sát (cũng là mẫu dùng cắt vi

phẫu) cắt nhỏ và sấy nhiệt độ khoảng 60°C, tán nhỏ, nghiền nát hoặc dùng máy xay

Rây qua số 32 (rây mịn) Phần còn lại trên rây tán hoặc xay và rây tiếp (có thể sấy

lại cho dễ xay, tán nếu cần) cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn (Không

được bỏ qua phần còn lại trên rây)

Chú ý: Nếu sấy dược liệu ở nhiệt độ quá cao dễ làm nát hoàn toàn các mô hoặc tế

bào khi xay tán, không thể nhận dạng đù bằng kính hiển vi Trước khi soi kính hiển

vi phải quan sát bột bằng cảm quan (nhận định màu sắc, mùi vị, độ mịn, xơ, ) để

thêm có yếu tố kiểm nghiện

+ Bột lá: Thường có màu xanh lục tới xanh nâu Các cấu tử thường thấy: Biểu bì

mang khí khổng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch gỗ như

mạch vành, mạch xoắn,v.v

+ Bột vỏ thân, vỏ rễ: Thường có màu vàng nâu đến nâu Các cấu tử thường thấy:

Mảnh bần, mảnh mô mềm, các loại sợi (Sợi có vácn dày và mỏng, khoang rộng hay

hẹp), tinh thể calci oxalat, tế bào mô cứng, mạch gỗ,v.v

+ Bột hoa, quả, hạt (Nếu có): Có màu sắc thay đổi tùy theo dược liệu Việc xác định

các cấu tử cần kết hợp, so sánh với từng bộ phận dược liệu Ví dụ: Cần xác định

mảnh cánh hoa ở phần soi bột thì phải tách cánh hoa ở hoa, đem soi riêng mới đi

đến kết luận Dược liệu là hoa cần chú ý đến đặc điểm của hạt phấn

Bột lá Bột thân Bột rễ

Hình 2.2.1 Ảnh chụp bột dùng để soi

Cách lên tiêu bản bột soi:

Phương pháp thường: Cho một giọt chất lỏng thích hợp vào giữa phiến kính, dùng

que sạch trộn đều bột, lấy bột một ít bột cho vào giữa giot chất lỏng, dùng một góc

của lá phiến kính khuấy nhẹ để phân tán bột và đậy lá kính lại Lấy ngón trỏ di nhẹ

trên lá kính để các phân tử của bột tách rời ra và phân tán đều Loại bỏ phần bột và

chất lỏng thừa nằm ngoài lá kính bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên phiến kính và lá

kính trước khi soi kính hiển vi

Thông thường bột dược liệu được phân tán trong nước cất Đối với tinh bột và các

dược liệu chứa nhiều tinh bột có thể giảm bớt ánh sáng Nếu không thấy rõ vân và

tễ, có thể thêm 1 giọt KOH 5% ở mép lá kính rồi quan sát ngay, KOH sẽ khuếch tán

vào bột làm cho vân và tễ của hạt tinh bột rõ hơn Nếu để lâu, hạt tinh bột sẽ bị thủy

phân, tan rã

2.2.1.2 Vi phẫu:

Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng kiểm

nghiệm dược liệu Trong phần lớn các trường hợp: Hình dạng và cấu trúc của vách

tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học Vì vậy, khi quan sát các

mẫu (Đặc biệt là các tiêu bản cắt ngang hay dọc của các mô) người ta thường loại

bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát được dễ dàng hơn

Tiêu bản vi phẫu thực vật được chuẩn bị qua các giai đoạn sau:

Chọn mẫu:

Dùng mẫu tươi đã được rửa sạch Mẫu được chọn phải chính xác, có tính đại diện

không quá già hoặc quá non

Cắt vi phẫu:

Có thể cắt bằng tay với lưỡi lam hay bằng dụng cụ gọi là dao cắt cầm tay Chọn các

lát cắt thật mỏng để nhuộm Nếu mẫu có kích thước nhỏ thì cắt tiết diện, nếu mẫu

có kích thước to thì cắt phần đại diện

Nếu mẫu cắt là lá thì thường giai lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với

cuống và một phần phiến lá ở hai bên

Nếu mẫu cắt là thân thì thường cắt ở lóng

Nếu mẫu cắt là rễ thì thường ở phần giữa, không non cũng không quá già

Các lát cắt nên được ngâm ngay vào dung dịch thích hợp để tránh bị khô Cắt theo

phẫu thức ngang là loại thông dụng nhất trong nghiên cứu dược liệu, lát cắt nằm

trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt

Nhuộm vi phẫu:

Sử dụng phương pháp nhuộm kép carmine - luc iod

Hóa chất: (Sách bài giảng trang 2)

Dung dịch Javel 50% (hay nước có clor như cloramin 5%)

Dung dịch cloral hydrat 50% trong nước

Dung dịch acid acetic 1%

KOH hay NaOH 5%

- Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat 50% (Nếu thẫy lát cắt chưa thật sự

trắng và trong) khoảng 10-15 phút Rửa bằng nước cất

- Ngâm vào dung dịch lục iod từ 5-10 giây Rửa bằng nước cất

- Ngâm tiếp vào dung dịch son phèn (Dung dịch Carmine) 15-30 phút Rửa lại bằng

nước cất đến khi dung dịch rửa hết màu

Các chú ý khi quan sát vi phẫu thực vật:

- Vi phẫu Lá: Quan sát hình dạng tổng quát của vi phẫu, độ lồi, lõm của gân lá; cấu

tạo tế bào biểu bì, lông che chở, lông tiết, cấu tạo bó gỗ của gân chính và gân phụ,

tầng cutin mỏng hay dày, mô mềm giậu một tầng hay nhiều tầng, phiến lá cấu tạo

đồng thể hay dị thể,v.v

- Vi phẫu Thân: Quan sát tiết diện thân (Tròn, vuông, đa giác,v.v ), tỷ lệ của các

thành phần, phân bố libe và gỗ, hình dạng các mô, vị trí các bộ máy tiết, vị trí đặc

điểm của tầng phát sinh,v.v

- Vi phẫu Rễ và Thân rễ: Chú ý cấu tạo lớp bần, suberoid, tỷ lệ các thành phần, cách

bố trí của các mạch gỗ, libe, tia tủy, hình dạng các mô, vị trí của các bộ máy tiết,v.v

2.2.2 Phương pháp hóa học:

Nguyên tắc: Chiết hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thực vật thành 3 giai

đoạn theo độ phân cực tăng dần: Kém phân cực, phân cực trung bình và phân

cực mạnh bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: Ether dầu, ethanol và

nước Sau đó, xác định các nhóm hợp chất trong dịch chiết bằng các phản ứng

đặc trưng hoặc bằng SKLM

Ether ethylic/soxhlet

Sơ đồ 2.2.2 Các giai đoạn chiết hỗn hợp

+ Dịch chiết ether: Chiết 10-25g bột dược liệu bằng diethyl ether lắc trong bình nón

khoảng 20 phút Chiết cho tới khi dịch chiết ether sau khi bốc hơi không còn để lại

lớp mờ trên mặt kính đồng hồ Gộp dịch chiết lại, lọc và cô lại đến khi còn khoảng

50ml dịch chiết ether

+ Dịch chiết cồn: Bã dược liệu chiết tiếp bằng cồn cao độ trong bình nón đun hồi

lưu 15-20 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 2-3 lần Gộp các dịch chiết lại, lọc và

cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết cồn

+ Dịch chiết nước: Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng với

nước trong bình nón đun trên bếp cách thủy sôi Gộp các dịch chiết lại, lọc và cô lại

đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết nước

Bã dược liệu Dịch chiết nước

Nước/ cách thủy

Dịch chiết nước thủy phân

HCL 10%/ cách thủy Chiết lại bằng ehter Khoảng 20 phút

15-20 phút

 Xác định các chất tan trong dịch chiết ether:

Dịch ether được dùng xác định các nhóm hợp chất sau: Chất béo, alkaloid, tinh dầu,

counmarin, carotenoid, anthraquinone, trierpenoid, flavonoid

 Xác định các chất tan trong dịch chiết cồn:

Dịch chiết không thủy phân được dùng để xác định các nhóm hợp chất: Alkaloid,

tanin, counmarin, saponin, glycoside tim, các chất khử, flavonoid, acid hữu cơ

Dịch chiết thủy phân được dùng để xác định các nhóm hợp chất: Triterpenoid thủy

phân, glycoside tim, counmarin, flavonoid, anthraquinone

 Xác định các chất tan trong dịch chiết nước:

Dịch chiết nước không thủy phân được dùng để xác định các nhóm hợp chất:

Alkaloid, tanin, counmarin, saponinside, glycoside tim, các chất khử, flavonoid,

acid hữu cơ, polyuronic

Dịch chiết nước thủy phân được dùng xác định các nhóm hợp chất: Triterpenoid

thủy phân, glycoside tim, flavonoid, anthraquinone

2.2.3 Định lượng:

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3 KẾT QUẢ:

3.1 Mô tả đặc điểm hình thái:

Khổ qua rừng là loài dây leo thân thảo chu kỳ sống theo mùa, sinh trưởng và phát

triển từ 5-6 tháng Thân cây có cạnh, dạng dây leo có tua cuốn và có thể bò dài từ 2

đến 3 mét Chúng mộc lan và vươn rộng, ban đầu dây mềm và quấn vào các cây

hoặc vật khác khi cây bám chắc vào trở nên dai hơn khi về già

Hình 3.1 Dây khổ qua rừng Lá: Mọc so le, chiều dài khoảng từ 5-10cm từ các đốt của thân nối, chiều rộng: 4-

8cm Mặt trước của lá được chia thành 5-7 thùy Mặt dưới lá màu nhạt hơn mặt trên,

gân lá có lông tơ ngắn

Hình 3.1.2 Lá khổ quả rừng