VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… VŨ THỊ THU LÊ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG CALLICARPA CANDICANS VÀ LOÀI TỬ C
Trang 1VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
…………***…………
VŨ THỊ THU LÊ
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG (CALLICARPA CANDICANS)
VÀ LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA)
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS.TS Phạm Thị Hồng Minh
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2 GS.TS Phạm Quốc Long
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phản biện 1: PGS TS Phan Minh Giang
Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học
Quốc gia Hà Nội
Vào hồi … giờ… ngày … tháng … năm 2020
Trang 3Có thể tìm luận án tại thư viện Quốc gia Việt Nam và thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
Trang 4MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý Việc sử dụng các loại thảo dược theo y học cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một
vị trí quan trọng trong nền y học Những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên, các kết quả nghiên cứu
sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc
cổ truyền vẫn hay được sử dụng trong dân gian
Trên thế giới những nghiên cứu về các loài chi Callicarpa chủ
yếu tập trung nghiên cứu về: thực vật học, dược lý, hóa thực vật và lâm sàng của nó Nghiên cứu dược lý được thực hiện trên dịch chiết thô hoặc các hợp chất tinh khiết cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng truyền thống Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung vào các hoạt tính: kháng viêm, cầm máu, mất trí nhớ, oxi hóa, kháng khuẩn Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới chỉ ra rằng, các hợp chất diterpenoid và triterpenoid có hoạt tính chống ung thư rất tốt mà các hoạt chất này là thành phần hóa
học phong phú nhất trong chi Callicarpa
Việc nghiên cứu nhằm tìm ra những hoạt chất có ích của thực vật đã và đang nhận được sự quan tâm của giới khoa học nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam Đây cũng là lý do đề tài
“ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla ) ở Việt Nam.” được lựa chọn để nghiên cứu
2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ loài C candicans và loài C macrophylla thu hái ở Việt Nam
Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch phân lập được
Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài C candicans và loài C macrophylla
3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
Trang 51 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá loài C candicans và loài C macrophylla ở Việt Nam
2 Xác định thành phần hóa học tinh dầu của lá loài C candicans và loài C macrophylla ở Việt Nam bằng các phương pháp chưng cất lôi quấn hơi nước
thông thường và phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng
3 Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư (gan - HepG2, tiền liệt tuyến - PC3, phổi - A549) và kháng vi sinh vật kiểm
định in vitro của tinh dầu thu được từ lá loài C candicans và loài C macrophylla
4 Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi
(Lu-1) và vú (MCF-7) in vitro của các hợp chất sạch phân lập được từ lá loài C candicans và loài C macrophylla
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
Phần tổng quan tài liệu là tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:
1.1 Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa
1.2 Tác dụng dược lý của chi Callicarpa
1.3 Thành phần hóa học các thực vật chi Callicarpa
1.4 Hoạt tính sinh học các thực vật chi Callicarpa
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu, phương pháp tạo cặn chiết, sắc ký và phân lập các hợp chất; xác định thành phần hóa học của tinh dầu và các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây
Trang 6Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck), sắc ký dây phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký điều chế pha tĩnh là silica gel
2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như: điểm nóng chảy
(Mp), độ quay cực ([α]D), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm phổ 1 chiều (1H-,
13C-NMR và DEPT) phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY)
2.2 Phương pháp chiết xuất tinh dầu
2.2.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất tinh dầu vi lượng 2.2.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng
2.2.3.Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu
Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng cách kết hợp hệ thống máy GC –MS với thư viện phổ chuẩn và phần mềm khóa thời
gian lưu Mass Finder 4.0
2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế được thử nghiệm bằng phương pháp SRB trên
ba dòng ung thư: gan (Hep-G2), phổi (LU-1) và vú (MCF-7) và phương pháp MTT [3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), tiền liệt tuyến (PC3) và phổi (A549)
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane & Kandel (1996) trên 8 chủng: Vi khuẩn Gram, nấm sợi và nấm men Các thử nghiệm được thực hiện tại tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, VAST
Trang 7Chương 3 THỰC NGHIỆM
Phần thực nghiệm đã mô tả chi tiết các quá trình: Xử lý mẫu và
phân lập các chất sạch từ lá 2 loài Tử châu lá to (C macrophylla) và Nàng nàng (C candicans); Hằng số vật lí và dữ kiện phổ của các hợp
chất phân lập được từ 2 loài được nghiên cứu
3.1 Lá cây Tử châu lá to (C macrophylla)
3.1.1 Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Tử châu lá to
Quá trình xử lý mẫu lá cây Tử châu lá to
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ ngâm chiết lá cây Tử châu lá to (C macrophylla)
3.1.2 Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Tử châu lá to
Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane và ethyl acetate của lá cây Tử châu lá to như Sơ đồ 3.2
Sơ đồ 3.2 Phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to
3.2 Lá cây Nàng nàng (C candicans)
Trang 83.2.1 Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Nàng nàng
Quá trình xử lý mẫu lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.3
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ ngâm chiết lá cây Nàng nàng (C candicans)
3.2.2 Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Nàng nàng
Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.4
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate của lá cây Nàng nàng
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chương 4 trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được, thành phần hóa học của tinh dầu và kết quả thử hoạt tính sinh học của các thành phần
4.1 Thành phần hóa học tinh dầu cây Nàng nàng và Tử châu lá to
Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39 cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng Trong đó có 25 sesquiterpene
Trang 9hydrocacbon (62,98%) và 11 sesquiterpen có chứa oxi (22,46%) Cấu
tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,97%)
Trong tinh dầu của lá cây Nàng nàng tươi có 47 cấu tử được phát hiện chiếm 93,17% tổng hàm lượng tinh dầu Trong số đó, có 28 sesquiterpene hydrocarbon (69,84%), 12 sesquiterpen (16,50%) Trong
đó, cấu tử chiếm hàm lượng lớn nhất là α-gurjunene (21,31%)
Thành phần hóa học tinh dầu từ hoa Nàng nàng cho biết có tổng 47 cấu tử, chiếm 92,86% tổng hàm lượng Các cấu tử có hàm lượng cao được xác định trong tinh dầu hoa là Các cấu tử có hàm lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là E-
caryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66%), δ-cadinene (5,44%)
Thành phần hóa học tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to phát hiện có
50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng Cấu tử chính được xác định trong
tinh dầu là Phytol (11,03%)
4.2 Các hợp chất phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng
Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu
lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học,
gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6), oleanolic acid (M10), callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy- 7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid: spinasterol (M5), β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9) Trong đó,
3β-callimacrophylla A (M1) và 3β-callimacrophylla B (M8) là hai hợp chất mới
Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng (C candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa
học, gồm 4 hợp chất flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon
(C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), Hợp chất genkwanin (C9) và cynaroside (C10); 5 hợp chất terpenoid: ursolic acid (M6),
2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9) Trong đó, hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp được từ tự nhiên
Thành phần hóa học chính của 2 loài thực vật chi Callicarpa
được nghiên cứu chủ yếu là các hợp chất flavonoid, diterpennoid và
Trang 10triterpenoid Một số hợp chất phân lập được giống nhau ở hai loài như:
ursolic acid, β-sitosterol và daucosterol
Các hợp chất triterpenoid phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ursane và oleane, phù hợp với
thành phần hóa học chính của các hợp chất triterpenoid trong chi Callicarpa
trong các tài liệu đã công bố
Các hợp chất diterpene phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy
thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ent-kaurane và abietane, phù
hợp với thành phần hóa học chính của các hợp chất diterpenoid trong chi
Callicarpa trong các tài liệu đã công bố
Các hợp chất phân lập được từ lá 2 loài nghiên cứu
Bảng 4.26 Các hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu
Tên hợp chất Lớp chất Loài phân lập (mg) KL Tính mới
callimacrophylla A (M1) Diterpneoid C macrophylla 10,8 M
ent-1α-acetoxy-7β,14
α-dihydroxy-kaur-16-en-15-on (M7) Diterpenoid C macrophylla 12,5 H
methyl seco-hinokiol (C6) Diterpenoid C candicans 31,0 H
3β-hydroxyolean-12-ene (M2) Triterpenoid C macrophylla 10,3 L
Trang 11β-amyrin (M3) Triterpenoid C macrophylla 12,7 L
ursolic acid (M6) Triterpenoid C macrophylla
C candicans
15,5 15,7
L
L
callimacrophylla B (M8) Triterpenoid C macrophylla 10,1 M
2α-hydroxy-ursolic acid (C7) Triterpenoid C candicans 12,5 L
2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic
acid (C8) Triterpenoid C candicans 11,5 L oleanolic acid (M10) Triterpenoid C macrophylla 8,5
spinasterol (M5) Steroid C macrophylla 11,2 L
β–sitosterol (M4) Steroid C macrophylla C candicans 20,0 19,0
daucosterol (M9) Steroid C macrophylla
C candicans 16,5
5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) Flavonoid C candicans 8,5 L
5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3) Flavonoid C candicans 11,2 L
genkwanin (C9) Flavonoid C candicans 13,0 L
cynaroside (C10) Flavonoid C candicans 10,8 L M: Hợp chất mới; L: Lần đầu tiên phân lập từ loài; H: Lần đầu tiên phân lập từ họ Hai hợp chất mới thu được gồm 1 chất thuộc lớp chất diterpenoid và triterpenoid Chúng được xác định cấu trúc dựa trên các
dữ liệu phổ như sau:
4.2.1.1 Hợp chất callimacrophylla A (M1) – Hợp chất mới
Hợp chất M1 thu được dưới dạng tinh thể trắng Công thức phân tử của hợp chất M1 được xác định là C20H28O5 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-
ESI-MS tại m/z 387,1940 [M + 35Cl] (tính toán lý thuyết cho
C20H32O535Cl: m/z 387,1938) và m/z 389,1918 [M + 37Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O537Cl: 389,1909).
Hình 4.7 Phổ ESI-MS của M1
Phổ 1H-NMR của hợp chất M1 cho thấy sự xuất hiện hai tín
hiệu dưới dạng singlet của 2 nhóm methyl [H 0,65 (3H, s, H3-19) và 1,02 (3H, s, H3-20)], 1 nhóm oxymethine [H 3,62 (1H, dd, J = 10,5; 5,5
Trang 12Hz, H-7)], tín hiệu của 2 nhóm oxymethylen [H 2,85 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Ha-18); 3,18 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Hb-18) và H 3,45 (1H,
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất M1 xuất hiện tín
hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm keton tại C 219,3 15), 1 nhóm oxymethine tại C 69,5 (C-7), 2 nhóm oxymethylene [C
(C-61,4 (C-17) và 69,9 (C-18)], 2 nhóm methyl tại C 17,4 (C-19) và C
17,7 (C-20), 4 tín hiệu carbon bậc 4 [C 36,9 4), 38,6 1), 58,4
Trang 13(C-8) và 78,4 (C-16)], 6 nhóm methylene [C 38,6 (C-1), 17,3 (C-2), 34,7 (C-3), 26,9 (C-6), 17,9 (C-11), 28,0 (C-12) và 25,3 (C-14)] và 3 nhóm methine [C 44,9 (C-5), 52,6 (C-9) và 38,7 (C-13)] Các dữ liệu trên cho
thấy hợp chất M1 là một hợp chất ent-kaurane diterpen và có cấu trúc
tương tự hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one ngoại trừ nhóm acetoxy tại C-18 của hợp chất ent-7α,16β,17-
trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one [101]
Hình 4.10 Phổ DEPT của M1
Phổ HSQC cho thấy các proton tại H 0,65 (H3-19); H 1,02 (H3-20)
và H 3,62 (H-7) liên kết với các nguyên tử carbon tương ứng C 17,4 (C-19);
C 17,7 (C-20) và C 69,5 (C-7) cũng như các proton tại H 2,85/3,18 (H-18)
và H 3,45/3,54 (H-17) có tương tác với các nguyên tử carbon tương ứng tại
C 69,9 (C-18) và 64,1 (C-17) Ngoài ra, bốn tín hiệu proton tại H 4,30 OH); 4,43 (17-OH); 4,49 (18-OH) và H 4,78 (16-OH) không liên kết với bất
(7-kỳ nguyên tử carbon nào trên phổ HSQC chứng tỏ rằng hợp chất M1 có 4
nhóm hydroxyl (hình 4.6 và bảng 4.3)
Trang 14
Hình 4.11 Phổ HSQC của M1
Hình 4.12 Phổ HMBC của M1
Phổ HMBC của hợp chất M1 xuất hiện các tương tác xa dị hạt
nhân của các proton tại H 0,65 (H3-19) và 2,85/3,18 (H-18) với các nguyên tử carbon tại C 34,7 (C-3), 36,9 (C-4) và C 44,9 (C-5); proton tại H 1,02 (H-20) với C 38,6 (C-1), C 44,9 (C-5), C 52,6 (C-9) và C
38,5 (C-10) Hơn nữa, các liên kết từ proton tại H 3,45/3,54 (H-17) đến các nguyên tử carbon tại C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15) và C 78,4 (C-16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC, điều đó khẳng định rằng 3 nhóm hydroxyl nằm ở vị trí C-18, C-6 và C-17 (Hình 4.6) Nhóm hydroxyl cuối cùng được xác định tại C-7 bởi các liên kết HMBC giữa proton tại H 4,30 (7-OH) với các nguyên tử carbon tại C 26,9 (C-6), C 69,5 (C-7) và C 58,4 (C-8) Ngoài ra, các liên kết từ proton
Trang 15tại H 4,49 (18-OH) với các nguyên tử carbon tại C 69,9 (C-18) và C
36,9 (C-4); từ proton tại H 4,78 (16-OH) với các nguyên tử carbon tại
C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15), C 26,9 (C-16) và từ proton tại H
4,43 (17-OH) tới các nguyên tử carbon tại C 61,4 (C-17)/C 78,4 16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC (Hình 4.6) Mặt khác, độ dịch chuyển hóa học carbon tại vị trí C-18 (C 69,9) và C-19 (C 17,4) của
định hướng α của nhóm hydroxyl (7-OH) trong hợp chất M1 Độ dịch
chuyển hóa học của các nguyên tử carbon tại C-16 (C 78,4) và C-17 (C 61,4) của hợp chất M1 phù hợp với các giá trị carbon tương ứng
của hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxykaur-18-acetoxy-15-one [C 77,4 (C-16) và C 63,1 (C-17)] [101] và khác hẳn so với hợp chất 16α,17-
Hình 4.6 Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC(HC) của M1
Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M1 và chất tham khảo