BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Trần Thu Trang NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
Trần Thu Trang
NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ
ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY
BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học 1: TS Chu Nhật Huy
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Phạm Bích Ngọc
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài
Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở
nước ta, phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt và một số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường Các công trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị trong kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh lực… Hiện nay, cây Bá bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu sử dụng thảo dược ngày càng tăng Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng, với thời gian thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm còn gặp nhiều khó khăn Đến nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 30-
40 ngày làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu Công nghệ nuôi cấy
mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST) Tuy nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng Vấn đề này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối
rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác như có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo
Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor
giúp tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình
nhân nhanh sinh khối rễ Nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu
dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích được rất thấp Hơn nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra do thiếu một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so
Trang 4với rễ thu ngoài tự nhiên Kể từ khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ các tác nhân gây hại cây trồng được phát hiện làm kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thông qua con đường truyền tín hiệu của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phòng vệ, đồng thời sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp Các elicitor đã được ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong nuôi cấy nhiều loài cây dược liệu quý Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng
tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro vẫn chưa có
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan Hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp
Xuất phát từ các cơ sở khoa học và luận cứ trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài nhằm tìm kiếm những alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu những hoạt tính mới từ những alkaloid từ đó nghiên cứu nuôi cấy tăng tích luỹ hàm lượng các alkaloid bằng cách bổ sung các elicitor Sau đó,
rễ tơ được nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu bằng cách tối ưu hoá hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
(Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít”
Trang 5Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh để tìm ra những hoạt tính mới
Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và phát triển
Xác định nồng độ của ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid và Yeat extract) lên quá trình sản xuất và tích luỹ các alkaloid phân lập được từ rễ tơ
cây Bá bệnh in vitro
Xây dựng được hệ thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao chiết alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
Nội dung 2: Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng
rễ tơ và tích luỹ các alkaloid (1) propenoic acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong rễ tơ cây Bá bệnh
7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít Đánh giá hàm lượng của các alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có trong sinh khối thu được nuôi cấy ở hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ
tự nhiên
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây Bá bệnh
Bá bệnh, còn gọi là mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa
học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae
Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh là loại cây gỗ nhỏ, thân nhỏ, cao 2-8 m ít phân cành, lúc nhỏ ít khi có nhánh, vỏ và rễ rất đắng Lá dài, gồm hơn 10 cặp lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lông màu xám Toàn cây (trừ quả chín)
có vị đắng
Trang 61.2 Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền
Bá bệnh được dùng nhiều trong y học cổ truyền để chữa bệnh đau lưng, khó tiêu, thuốc bổ sau khi sinh đẻ, sử dụng để điều trị sốt, vàng da, suy mòn và cổ chướng Bá bệnh là một trong những thuốc dân gian phổ biến cho các tác dụng kích thích tình dục và điều trị sốt rét Nước lá nấu được sử dụng trị ngứa ngoài da, trong khi quả được sử dụng chữa kiết lỵ, vỏ được sử dụng như một loại thuốc tẩy giun Rễ được sử dụng để chữa rối loạn chức năng tình dục, lão hóa…
1.3 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ
1.3.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ
Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ nhỏ có lông được sản sinh ra
mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao Năm 1981, Takayama và Misawa đã đề xuất một
hệ thống nuôi cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên ngoài vào với tên gọi Bioreactor Hệ thống bioreactor là thường được dùng nhiều, chủ yếu
để nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp trên nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau và hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor
để nuôi cấy rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp
1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTC trong nuôi cấy rễ tơ
Sự lựa chọn dòng, hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gen, sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, giai đoạn phát triển của rễ tơ trong quá trình nuôi cấy, các yếu tố khác…
1.3.3.Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong quá trình nuôi cấy rễ tơ
Trang 7Elicitor là các hợp chất kích thích mọi dạng tự vệ của thực vật Định nghĩa rộng về các elicitor bao gồm các chất của yếu tố gây bệnh (ngoại sinh) hoặc được giải phóng bởi chính thực vật do phản ứng với yếu tố gây bệnh (nội sinh) Các elicitor có thể gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ dẫn đến gen được biểu hiện và kích thích tích luỹ các HCTC trong điều kiện không gây ảnh hưởng đối với thực vật hay trong nuôi cấy tế bào
1.3.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy sinh khối rễ
tơ thu nhận các HCTC
Ở trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về rễ tơ của một số loài khác nhau, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về rễ tơ của loài Bá bệnh Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Bá bệnh mới chỉ dừng lại ở phân tích thành phần hóa học và các tác dụng dược lý, những nghiên cứu về rễ tơ của một số loài cũng còn rất hạn chế Việc nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ
tơ của các loài cây dược liệu và thu nhận HCTC hiện nay không chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm mà đã được công nghiệp hoá bằng nuôi cấy bioreactor
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu
Chúng tôi sử dụng sinh khối khô rễ tơ cây Bá bệnh (90 g) và rễ tơ cây Bá bệnh được nuôi cấy trên môi trường thạch do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp
Rễ tự nhiên cây Bá bệnh được thu thập tại vườn Quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hoá học các chất từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng
Trang 8hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC,
Phân lập các chất từ cao chiết alkaloid
2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro
2.1.2.1 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của A Monks (1991) Phép thử này xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB)
2.1.2.2 Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào RAW264.7, chuột và THP-1 kích thích bởi LPS
Lấy 1 ml tế bào thêm vào 1 µl mẫu thử sao cho nồng độ cuối cùng của chất
được kích thích với 1 µg/mL LPS (Sigma, Tokyo, Japan) Dịch nổi được thu sau 24 giờ Nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α của tế bào đại thực bào chuột, RAW264.7, THP-1 được xác định bằng ELISA (Quantikine ELISA của R&D) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính ImageJ 1.50i
Chất mới 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1- yl)-(E)-3-propenoic acid 9-hydroxycanthin-6-one
SKC SiO2, Grad
CH 2 Cl 2 /MeOH (25:1)
Trang 92.2.3 Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thông qua phương pháp HPLC-DAD
Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh: kí hiệu ĐK-Bb
2.2.4 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml
Một số yếu tố như trạng thái môi trường, ánh sáng, chiều dài mẫu ban đầu, khối lượng rễ cấy chuyển, các elicitor jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE) được đánh giá ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ
2.2.5 Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống Bioreactor 20 lít
Dựa trên hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật có sẵn thiết kế một
số mẫu bioreactor sử dụng được cho các thí nghiệm nuôi cấy sinh khối với các dung tích 5 – 20 lit Dựa vào tài liệu tham khảo, tôi lựa chọn mô hình bioreactor dạng sủi bọt dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh
Trang 10Hình 2.5 Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt
dạng cầu tự tạo
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết alkaloid
Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cao chiết alkaloid của rễ
tơ cây Bá bệnh được nghiên cứu Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao chiết alkaloid cho thấy cây có chứa các hợp chất β-Carboline alkaloids (7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid), hợp chất Canthin-6-one alkaloids (9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one)
3.2 Hoạt tính sinh học của các chất 7-MCPA , methoxycanthin-6-one, hydroxycanthin-6-one
9-3.2.1 Khả năng gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3)
Các kết quả thử nghiệm cho thấy: hợp chất (2) thể hiện hoạt tính gây
độc tế bào tốt hơn chất (3) trên dòng KB, LU-1, MCF-7, HepG2 (bảng 3.1)
So sánh cấu trúc hợp chất (2) và (3) cho thấy 2 chất này chỉ khác nhau nhóm
Màng lọc khí Ống tiếp môi trường Ống thoát khí Ống dẫn khí
ống nối
Đầu sục khí
Trang 11methoxy và hydroxy gắn ở vị trí cacbon số 7 Có thể nói, nhóm chức methoxy
có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính ức chế dòng tế bào KB, MCF7, LU-1, HepG2 của chất (2) Chất (1) có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên dòng MCF-7 với IC50 đạt 6,3 (µg/ml)
Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các chất thử (1), (2), (3)
STT Chất
thử
Dòng tế bào % ức chế tại nồng độ
và cs, năm 2016 làm sáng tỏ cơ chế phân tử hoạt động chống viêm thông qua con đường p38 MAPK phụ thuộc ROS và hiệu ứng chống viêm kết hợp với hoạt hóa con đường Nrf2/HO-1 Cần tiếp tục nghiên cứu hoạt chất 9-methoxycanthin-6-one có tương tác với con đường NF-κB trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS hay không Chất (3) thể hiện ức chế IL-6 và
Trang 12TNF-α ở hai dòng đại thực bào RAW264.7 và chuột, ức chế kém trên dòng THP-1
Bảng 3.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α của tế bào
ĐTB
ở chuột
THP-1
RAW 264.7
ĐTB
ở chuột
9-one
Chất chuẩn (3) hydroxycanthin- 6one
9-Nồng độ
(µg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng
độ (µg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng
độ (µg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
Trang 13(A) (B) ©
Hình 3.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng
độ chất chuẩn A) Chất chuẩn (1); B) Chất chuẩn (2); C) Chất chuẩn (3)
Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với các hợp chất nghiên cứu
Định lượng:
Các mẫu cao chiết rễ tơ và rễ tự nhiên cây Bá bệnh được bơm vào
hệ thống sắc ký với các điều kiện phân tích (ĐK-Bb) được trình bày ở phần
phương pháp Kết quả hàm lượng các chất được tính toán bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn
3.4 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các chất (1), (2), (3) của rễ tơ trên bình tam giác 500 ml
3.4.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của
Số nhánh trung bình trên 1 rễ
Chiều dài
rễ trung bình (cm)
Hình thái rễ sau 30 ngày nuôi cấy
Rễ nhỏ, màu vàng CT2 Lỏng 0,63 ±
0,03 5,3 ± 1,3 7,5 ± 2,1
Rễ to, màu vàng