Việc kết hợp các hợp phần có hoạt tính sinh học để lai tạo thành các cấu trúc mới với những hoạt tính lý thú hiện đang là một hướng nghiên cứu thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học..
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA MỘT
SỐ TRITERPENOID CÓ CHỨA NHÓM BENZAMIDE VÀ
HYDROXAMATE
Chuyên ngành : Hóa hữu cơ
Mã số : 9.44.01.14
HÀ NỘI – 2020
Trang 2Công trình được hoàn thành tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt nam
Người hướng dẫn khoa học:
Hướng dẫn 1: GS TS Nguyễn Văn Tuyến
Hướng dẫn 2: TS Lê Nhật Thùy Giang
Trang 3A GIỚI THIỆU VỀ LUẬN ÁN
1 Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Ung thư là một trong những căn bệnh đe dọa nhất thế giới Toàn cầu ước tính có 8,2 triệu người chết vì ung thư vào năm 2012, bệnh ung thư phổi (ung thư phế quản và khí quản) tăng đáng kể nên trở thành nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ 5 năm 2012 giết chết 1,1 triệu nam giới và 0,5 triệu phụ nữ
Hiện nay, các thuốc có cấu trúc lai ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và tổng hợp nhằm tạo ra các hợp chất lai có hoạt tính sinh học cao vượt trội hơn so với các chất ban đầu Việc kết hợp các hợp phần có hoạt tính sinh học để lai tạo thành các cấu trúc mới với những hoạt tính lý thú hiện đang là một hướng nghiên cứu thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học
Triterpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên hoặc các dẫn xuất của nó nhận được sự quan tâm nghiên cứu đáng kể của các nhà khoa học trong những năm gần đây Nhiều hợp chất tritecpenoid như betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid được công bố là có hoạt tính chống HIV, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm và chống ung thư
Bên cạnh đó, các hợp chất benzamide như MS-275,
MGCD-0103 là những hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú, đã được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị tạng đặc, ung thư bạch cầu, u hắc sắc tố ác tính di căn giai đoạn muộn [7-11] Các hợp chất hydroxamic như vorinostat hay còn gọi là zolinza (SAHA) cũng được FDA phê duyệt vào năm 2006 trong điều trị u lympho da tế bào T, trichosatin A (TSA) và belinostat (PXD-101) sử dụng trong điều trị tặng đặc và ung thư máu, panobinostat (LBH-589) trong điều trị tạng đặc, AML, ALL, MDS [12-16]
Tuy nhiên, các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm benzamide và hydroxamate còn chưa được nghiên cứu nhiều Hướng nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm
Trang 4benzamide, nhóm hydroxamate và thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính chống ung thư là hướng nghiên cứu mới Xuất phát từ những ý tưởng như vậy nên chúng tôi
đã chọn đề tài: ‘‘Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và hydroxamate ” là vấn
đề mới, lý thú và có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao
2.Mục tiêu luận án
Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid
có chứa nhóm benzamide và nhóm hydroxamate nhằm tìm kiếm các hợp chất lai có hoạt tính sinh học cao, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra thuốc chống ung thư góp phần chăm
sóc sức khỏe cho cộng đồng
3 Điểm mới của luận án:
1 Lần đầu tiên thiết kế và tổng hợp thành công 13 hợp chất mới của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và 16 hợp chất mới của một số triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate qua cầu nối ester
và amide
2 Đã tổng hợp được 3 dẫn xuất amide mới 91, 93, 95, chưa
thấy công bố trong các tài liệu nào
3 Đã đưa ra phương pháp cải tiến tổng hợp các dẫn chất benzamide và hydroxamate bằng tác nhân hoạt hóa BOP thay vì sử dụng các tác nhân hoạt hóa cũ là DCC hay CDI, từ đó mở ra hướng mới hiệu quả tổng hợp các hợp chất này
4 Đã khẳng định được cấu trúc của các hợp chất mới từ kết quả phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng proton và phổ khối lượng
5 Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 29 hợp chất mới trên 2 dòng tế bào ung thư ở người, tế bào KB (ung thư biểu mô) và tế bào Hep-G2 (ung thư gan), trong đó có 5 hợp chất mới
89c, 89e, 89f, 92a, 96b có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh với
giá trị IC50 < 10 µM
Trang 54 Bố cục của luận án:
Luận án gồm 127 trang gồm:
Mở đầu 2 trang
Chương 1: Tổng quan 25 trang
Chương 2: Thực nghiệm 35 trang
Chương 3: Kết quả và thảo luận 61 trang
Kết luận : 1 trang
Phần tài liệu tham khảo có 100 tài liệu về lĩnh vực liên quan của luận
án, được trích dẫn một cách trung thực và khách quan, các tài liệu được cập nhật đến năm 2018
Phần phụ lục gồm 51 trang gồm các loại phổ của các chất tổng hợp được
5 Phương pháp nghiên cứu
Các chất được tổng hợp theo các phương pháp tổng hợp hữu
cơ hiện đại đã biết, có cải tiến và vận dụng thích hợp vào các trường hợp cụ thể Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng phương pháp sắc
kí cột Cấu trúc của sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: IR, 1H-NMR, 13C-NMR, LC-MS/MS Hoạt tính sinh học được đánh giá theo phương pháp của Mossman trên hai dòng tế bào ung thư ở người là KB và Hep-G2
- Các dẫn xuất triterpenoid và hoạt tính sinh học của chúng
- Tổng hợp và hoạt tính sinh học của lớp chất benzamide
- Tổng hợp và hoạt tính sinh học của lớp chất hydroxamate
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
Trang 6Thực nghiệm gồm 35 trang, trình bày chi tiết về các phương pháp nghiên cứu, quy trình tổng hợp, tinh chế, các tính chất vật lý của các sản phẩm nhận được như: điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng và dữ liệu chi tiết các phổ IR, HRMS, 1H-NMR, 13C-NMR, LC-MS/MS
Đi từ các dẫn xuất của một số triterpenoid chúng tôi đã tiến hành tổng hợp được 2 dãy phản ứng: 1 dãy các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm benzamide và 1 dãy các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate Phương pháp tối ưu được sử dụng các hợp chất này là sử dụng tác nhân hoạt hóa nhóm cacboxylic
là BOP và xúc tác là DMAP trong môi trường bazơ yếu là Et3N và tác nhân phản ứng là các amine trong dung môi DMF
Chúng tôi đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp được trên 2 dòng tế bào ung thư ở người là KB và Hep-G2
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Mục tiêu của đề tài
Đầu tiên thực hiện các chuyển hóa nhóm –OH ở C-28 của một số triterpenoid để tạo thành các dẫn xuất ester và dẫn xuất amide, sau đó cho phản ứng với các amine khác nhau để tạo thành các hợp chất mới có chứa nhóm benzamide và hydroxamate Một số hợp chất triterpenoid thì được cho phản ứng trực tiếp luôn ở C-28 với các amien khác nhau như trong sơ đồ 3.1
Trang 7Sơ đồ 3.1: Chiến lược mục tiêu của luận án
3.2 Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide
3.2.1 Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulin có chứa nhóm benzamide qua cầu nối ester
Để tổng hợp các dẫn chât benzamide qua cầu nối ester, đầu tiên luận án tiến hành tổng hợp các dẫn xuất ester của betulin Betulin
(1) được cho phản ứng với các anhydride acid cacboxylic với tỉ lệ
mol là 1:4 trong dung môi CH2Cl2 khan với xúc tác bazơ là triethyl
amine, trong thời gian phản ứng là 24 giờ Các dẫn xuất acid 76a-f
thu được là các tinh thể màu trắng, có hiệu suất tổng hợp từ 60% đến 79% Phổ hồng ngoại (IR) của các hợp chất 76a xuất hiện vân hấp
thụ ở 1732 và 1642 cm-1 là đặc trưng của nhóm -C=O trong nhóm chức ester và acid trong khi đó phổ hồng ngoại của betulin không xuất hiện các
Trang 8vân hấp thụ này Trên phổ cộng hưởng proton 1H-NMR xuất hiện tín
hưởng doublet doublet của proton H-3 (3,19 ppm) với hằng số J = 11
và 5 Hz, các tín hiệu ở Ha-28 và Hb-28 xuất hiện lần lượt ở 4,31 và 3,90 ppm; các tín hiệu singlet 1H của Ha-29 và Hb-29 xuất hiện ở 4,68 và 4,58 ppm, 6 nhóm methyl xuất hiện đầy đủ với tín hiệu singlet ở vùng 0,75 - 1,68 ppm, các tín hiệu này không thay đổi nhiều
so với phổ chuẩn của betulin Ngoài ra trên phổ proton của hợp chất
76a còn xuất hiện đầy đủ các proton ở mạch nhánh (2,71-2,64 ppm, 2H-2’ và 2H-3’) Riêng hợp chất 76e tác nhân phản ứng là anhydride
acid cis-1,2,3,6-tetrahydro phtalic khi phản ứng với betulin tạo thành
dẫn xuất ester 76e thì thấy rằng hai tín hiệu cộng hưởng của mỗi
proton Ha-28 và Hb-28 đã bị tách làm hai tín hiệu doublet với cường
độ 0,5H hằng số tương tác J là 11,0 Hz cho phép khẳng định cấu hình
cis ở nối đôi của anhydride acid cis-1,2,3,6-tetrahydro phtalic đã
chuyển thành cấu hình trans ở hợp chất 76e khi mà cho anhydride
acid này phản ứng với betulin Các hợp chất khác cũng được chứng minh tương tự So sánh các kết quả phân tích phổ này với tài liệu
Trang 9tham khảo [66] có thể khẳng định cấu trúc của các dẫn xuất ester
76a-f là phù hợp với sắc ký trên phổ đồ
chất 76a-f
Từ các dẫn xuất ester của acid 76a-e, tiếp tục được cho phản
ứng với 1,2-diaminobenzene (tỉ lệ mol là 1:1,5) trong dung môi DMF với sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N nhận được các sản phẩm 77a-e Nhóm chức acid -COOH được chuyển hóa thành nhóm amide, phản ứng này xảy ra nhanh và có hiệu suất cao, sản phẩm của phản ứng rất
chọn lọc Cấu trúc của các sản phẩm 77a-e được khẳng định bằng các
dữ liệu phổ Trên phổ IR của hợp chất 77c xuất hiện pic hấp thụ ở
3373 cm-1 đặc trưng của nhóm -NH và có pic hấp thụ mạnh đặc trưng của nhóm -C=O trên nhóm amide ở 1655 cm-1 Trên phổ 1H-NMR
của hợp chất 77c, bên cạnh các tín hiệu của khung lupan còn xuất
Trang 10hiện thêm các tín hiệu của nhómbenzamide như ở tín hiệu singlet 1H (7,55 ppm) là của nhóm -NH Tín hiệu ở vùng 7,18 - 6,76 ppm là của vòng thơm, cụ thể tín hiệu doublet doublet ở 7,18 ppm (1H), hằng số
J = 1,5 Hz là của proton 6”; 7,06 ppm (1H, td, J = 7,5; 1,5 Hz,
H-4”); 6,78 (1H, dd, J = 7,5; 2,0 Hz, H-3”) và 6,76 (1H, td, J = 7,5; 1,5
Hz, H-5”) ( hình 3.2)
Hình 3.2 : Phổ giãn 1 H-NMR của hợp chất 77c
Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 77c xuất hiện đẩy đủ tín
hiệu của các nguyên tử cacbon có mặt trong phân tử Ngoài những tín hiệu của khung lupan thì còn xuất hiện thêm các tín hiệu của nhóm cacbonyl của ester và amide và của vòng thơm, cụ thể như ở tín hiệu 175,6 ppm là của nhóm cacbonyl của ester (C-1’); ở tín hiệu 172,7 ppm là của nhóm cacbonyl của amide (C-4’); tín hiệu của các nguyên
tử cacbon trong vòng thơm như sau: ở tín hiệu 142,0 ppm là của 2”; 127,5 là của C-1”; 123,5 là của C-6”; ở tín hiệu 118,9 là của C-5”; 117,2 là của C-3” (hình 3.3) Trên phổ khối lượng phân giải cao
C-của hợp chất 77c tìm thấy mảnh m/z [M+H]+ là 661,4883 (hình 3.4) phù hợp với khối lượng tính toán theo lý thuyết cho công thức phân
tử C42H65N2O4 của hợp chất 77c là 661,4866 So sánh các kết quả phân tích phổ này với các tài liệu tham khảo đã được công bố trước
Trang 11đó [38, 41, 42, 88-90] có thể khẳng định cấu trúc của hợp chất 77c phù hợp với các dữ liệu trên phổ đồ, cấu trúc của các hợp chất 77a-b, 77d-e cũng được khẳng định tương tự
600.79724
556.83197
Trang 12Cơ chế hình thành hợp chất 77c đầu tiên là quá trình thế nguyên tử hydro của hợp chất 76c trong môi trường bazơ yếu là
triethyl amine bằng nhóm (NMe2)3P- trong tác nhân hoạt hóa BOP
để tạo thành hợp chất trung gian 76c 1, tiếp theo dưới xúc tác DMAP
hợp chất 76c 1 được chuyển thành hợp chất trung gian 76c 2 và sau đó
là phản ứng thế bằng tác nhân thế ái nhân là 1,2-diaminobenzene để
hình thành sản phẩm 77c (sơ đồ 3.3)
3.2.2 Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của diacid pentacyclic triterpenoid có chứa nhóm benzamide
Bằng các phương pháp tương tự, luận án tổng hợp các hợp chất lai của diacid pentacyclic triterpenoid có chứa nhóm benzamide với mong muốn tìm kiếm các hợp chất lai mới có hoạt tính sinh học
lý thú Dẫn xuất diacid pentacyclic triterpenoid 78a-b được phân lập
từ loài Cheffleraoctophylla ( Ivy tree) [91] được cho phản ứng với tác nhân oxy hóa Jone (Cr3O/H2SO4) trong dung môi acetone nhận được
các sản phẩm oxy hóa 79a-b [30, 31] (sơ đồ 3.5) Hợp chất 79b sau
Trang 13đó được cho phản ứng trực tiếp với 1,2-diaminobenzen với tỉ lệ mol
là 1:1,5 trong dung môi DMF với sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N
thu được hợp chất 80 (sơ đồ 3.4)
Sơ đồ 3.4 : Tổng hợp hợp chất 80
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 80 ngoài các tín hiệu của
khung lupan còn xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm -NH ở 7,47 ppm;
Hình 3.5 : Phổ 1 H-NMR của hợp chất 80
tín hiệu của 4 proton vòng thơm ở 7,08-6,78 ppm (hình 3.5) Trên phổ 13C-NMR cũng xuất hiện đầy đủ tín hiệu của khung lupan và của vòng thơm Hai nhóm keton vòng của C-3 và C-11 xuất hiện ở vùng
Trang 14trường yếu 213,2 và 210,8 ppm, nhóm cacbonyl C-28 ở 174,6 ppm, các nguyên tử cacbon của vòng thơm xuất hiện ở vùng 118,5 – 140,9 ppm (hình 3.6)
Hình 3.6 : Phổ 13 C-NMR của hợp chất 80
Hình 3.7 : Phổ LC-MS/MS của hợp chất 80
Cấu trúc của hợp chất 80 còn được chứng minh bằng phổ
khối lượng, trên phổ khối lượng của hợp chất 80 tìm thấy mảnh m/z
[M+H]+ là 545,3702 (hình 3.7) phù hợp với khối lượng tính toán
C_82 # 880 RT: 2.99 AV: 1 NL: 1.98E8
T: FTMS + p ESI SIM ms [542.5000-545.5000]
m/z 0
542.8172
Trang 15theo lý thuyết cho công thức phân tử C35H49N2O3 của hợp chất 80 là
545,3737
Hợp chất 79a được tiến hành khử hóa bằng tác nhân khử
NaBH4 với tỉ lệ mol là 1:4 trong dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng thì nhóm C=O ở vị trí C-3 được khử thành nhóm -OH có cấu hình
3β-hydroxy (hợp chất 81) theo sơ đồ 3.5
Sơ đồ 3.5: Tổng hợp các hợp chất 83a-b
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 81 xuất hiện
tín hiệu của một proton doublet ở vị trí δH 3,71 ppm (dd, J = 2,5 Hz, H-3β) đặc trưng cho nhóm 3β-OH ở vị trí C-3 Để bảo vệ nhóm 3β-
OH này thì trước khi cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene, hợp chất
81 được acetyl hóa bằng tác nhân anhydride axetic với tỉ lệ mol là 1:1,5 trong dung môi DCM, nhận được sản phẩm 3-acetyl (82) Hợp chất 82 sau đó được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene với tỉ lệ
mol là 1:1,5 trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N thu được sản phẩm benzamide 83a (sơ đồ 3.5) Để
thu thêm được một sản phẩm benzamide mới nữa thì hợp chất 83a
Trang 16tiếp tục được thủy phân bằng bằng tác nhân LiOH trong dung môi
MeOH thu được hợp chất 83b (sơ đồ 3.5) Cấu trúc của các hợp chất 83a-b cũng được khẳng định tương tự bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR
3.2.3 Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulinic acid có chứa nhóm benzamide
Betulinic acid (2) cũng là một dẫn chất của triterpenoid với
nhiều hoạt tính sinh học nên luận án cũng tiếp tục khai thác hướng
Sơ đồ 3.6: Tổng hợp các hợp chất 84 và 85
nghiên cứu tổng hợp các hợp chất benzamide đi từ betulinic acid Betulinic acid được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N nhận được
sản phẩm 84 (sơ đồ 3.6)
Tiếp theo, betulinic acid (2) được oxi hóa bằng tác nhân Jone
(Cr3O/H2SO4) trong dung môi acetone thu được hợp chất 69 (sơ đồ
điều này được khẳng định trên phổ proton khi tín hiệu đặc trưng của
proton H-3 không xuất hiện trên phổ của hợp chất 69 Ngoài ra trên
Trang 17phổ IR của hợp chất 69, xuất hiện tín hiệu hấp thụ đặc trưng của
nhóm cacbonyl keton vòng tại bước sóng 1701cm-1 Như vậy các dữ
liệu cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 69 [30,31] Hợp chất
69 sau đó được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene trong dung
môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMP/Et3N nhận được sản phẩm
benzamide 85 (sơ đồ 3.6) Cấu trúc của hợp chất 84 và 85 cũng được
chứng minh tương tự
3.2.4 Kết quả tổng hợp các hợp lai của một số triterpenoid khác có chứa nhóm benzamide
Ursolic acid (3) và 3-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid
(5) cũng là những dẫn chất triterpenoid được nghiên cứu nhiều Vì
thế luận án tiếp tục nghiên cứu tổng hợp các hợp chất benzamide đi
từ các acid này Ursolic acid đã được acetyl hóa tương tự như hợp
chất 81 để thu được hợp chất 86 Sau đó cho hợp chất 86 phản ứng
với 1,2-diaminobenzene trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N nhận được sản phẩm benzamide 87 (sơ đồ 3.7)
Hợp chất cuối cùng là hợp chất triterpenoid (5) cũng được
cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene với tỉ lệ mol là 1:1,5 trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N thu được hợp
chất 88a Giống như hợp chất 83a, hợp chất 88a cũng được thủy
phân bằng LiOH với tỉ lệ mol là 1:5 trong dung môi MeOH thì nhận
được hợp chất 88b (sơ đồ 3.8), trên phổ proton của hợp chất 88b
không còn thấy tín hiệu singlet 3H ở 2,05 ppm nữa, điều này chứng
tỏ nhóm acetoxy của hợp chất 88a đã chuyển thành nhóm
3β-hydroxy ở hợp chất 88b Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 87 ngoài
các tín hiệu của khung ursan còn xuất hiện tín hiệu singlet 1H ở 7,53 ppm là của nhóm -NH, 4 proton của vòng thơm xuất hiện ở vùng từ 7,13 - 6,77 ppm (hình 3.8)
Trang 19Hình 3.8 : Phổ 1 H-NMR của hợp chất 87
Hình 3.9 : Phổ 13 C-NMR của hợp chất 87
Cấu trúc của hợp chất 87 còn được chứng minh bằng phổ
khối lượng phân giải phân giải cao Trên phổ khối lượng phân giải
cao của hợp chất 87 tìm thấy mảnh m/z [M+H]+ là 589,4329 (hình