NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM. LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Đoàn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực n

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Đoàn Thị Bắc

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP

PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Lê Thị Nhi Công Hướng dẫn 2: TS Tạ Thu Hằng

Hà Nội, 2020

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Đoàn Thị Bắc

Lời cảm ơn

Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới TS Lê Thị Nhi Công, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS Tạ Thu Hằng, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng, là những người thầy đã dành cho tôi những ý tưởng quý báu, cũng như sự hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Liên và các anh chị trong Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tận tình chỉ dạy, tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và Phát triển Vùng đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian để học tập trong thời gian công tác ở Viện, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình từ Phòng Công nghệ sinh học Nông nghiệp nơi tôi đang công tác, sự giúp đỡ nhiệt tình và động viên của các anh, chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm

ơn sự giúp đỡ quí báu đó

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người thân trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên

và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả

Đoàn Thị Bắc

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Chữ viết

tắt, kí hiệu

Bchl Bacteriochlorophyll Sắc tố diệp lục vi khuẩn

CoQ Coenzyme Q

CoQ10 Coenzyme Q with chain

containing 10 isoprene subunits

Coenzyme Q với chuỗi isoprene có chứa 10 tiểu đơn vị

HPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

TCL Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm 7Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 của các chủng 28Bảng 3.2 So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa chọn

với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 31

Bảng 3.3 Hàm lượng CoQ10 của các chủng VKTQH tích lũy trên môi trường nuôi cấy khác nhau 42

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Chuỗi vận chuyển điện tử 4Hình 1.2 Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp 13Hình 3.1 Khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn tía quan hợp trên môi trường DSMZ 27 sau khi hoạt hóa 27Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng thể hiện sự có mặt của Coenzyme Q10 28Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng FO2 (A, B) và của chủng DQ4 (C, D) 30Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại chủng FO2 và DQ4 dựa vào so sánh trình

tự gen 16S rRNA 32Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 34Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 35Hình 3.7 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 36Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 37Hình 3.9 Ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 39Hình 3.10 Phương pháp thu nhận CoQ10 từ 2 chủng FO2 và DQ4 40

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10 3

1.1.1 Cấu tạo của Coenzyme Q10 3

1.1.2 Đặc tính của Coenzyme Q10 3

1.1.2.1 Đặc tính lý hóa 3

1.1.2.2 Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật 4

1.1.3.1 Tổng hợp hóa học 5

1.1.3.2 Coenzyme từ động vật và thực vật 6

1.1.3.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 7

1.1.4 Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 8

1.1.5 Ứng dụng của Coenzyme Q10 10

1.1.5.1 Ứng dụng trong y học 10

1.1.5.2 Trong mỹ phẩm 11

1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10 11

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp 11

1.2.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp 12

1.2.3 Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp 13

1.2.4 Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 15

1.2.4.1 Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 15

1.2.4.2 Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 18

2.1.1 Nguyên vật liệu 18

2.1.2 Các thiết bị máy móc 18

2.1.3 Hóa chất 19

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy 19

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp 20

2.3.2 Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía quang hợp 20

2.3.3 Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp 22

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình thái 22

2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon 22

2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA 23

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 23

2.3.5.Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa chọn 25

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO 26

3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy

Coenzyme Q10 cao 26

3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp 26

3.1.1.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy Coenzyme Q10 cao 27

3.1.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn 29

3.1.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào 29

3.1.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn carbon 31

3.1.2.3 Xác định trịnh tự gene 16S rRNA của các chủng lựa chọn 32

3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN 33

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 33

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 35

3.2.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 36

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn 37

3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn 38

3.3 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN 39

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 KẾT LUẬN 44

4.2 KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

MỞ ĐẦU

Coenzyme Q10 hay còn được gọi là ubiquinone (ubidecarenone hoặc CoQ10) là một trong ba Coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở màng tế bào của sinh vật nhân sơ và lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn CoQ10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP – năng lượng sinh học của cơ thể sống Ngoài ra, CoQ10 còn có tính chất chống oxy hóa mạnh và có khả năng trung hòa các gốc tự do, vì vậy CoQ10 ngày càng được ứng dụng rộng rãi làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe; được đưa vào mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; được ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng cường hệ thống miễn dịch …

Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên và đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tổng hợp CoQ10 như: lên men, tổng hợp sinh học, tổng hợp hóa học hoặc tách chiết từ mô động vật và thực vật Đối với quá trình tổng hợp hóa học vẫn bị nhược điểm

là các chất hóa học sử dụng có thể gây độc ra môi trường CoQ10 có thể được thu nhận từ động vật và thực vật, tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể tách chiết ở qui mô công nghiệp và chi phí rất cao Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp sinh học được sử dụng rất nhiều hiện nay, có thể đem lại hiệu quả thương mại, đặc biệt sản phẩm CoQ10 rất

an toàn cho người sử dụng, đồng thời giá thành lại rẻ nhất

CoQ10 có thể được tổng hợp thông qua quá trình lên men nhờ các vi

khuẩn (Agrobacterium tumefaciens, Paracoccus denitrificans, Rhizobium

radiobacter, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus, Rhodopseudomonas palustris …), nấm mốc và nấm men (Asperillus, Bullera, Bulleromyces, Cyptococcus, Fellomyces, Kockovaella, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago) Trong số các vi khuẩn này, vi khuẩn tía quang hợp

(VKTQH) là nguồn vi sinh vật lý tưởng để thu nhận CoQ10 vì chúng có khả năng tổng hợp, tích luỹ hàm lượng ubiquinone cao hơn các vi sinh vật khác, đặc biệt cho sản phẩm chủ yếu là CoQ10 Bên cạnh đó, VKTQH có thể nuôi

cấy dễ dàng bằng môi trường đơn giản dưới ánh sáng mặt trời Vì vậy, đây có thể là nguồn tiềm năng thu nhận một lượng lớn các chất có tác dụng sinh học, đặc biệt là CoQ10

VKTQH có rất nhiều loài và khả năng tích lũy CoQ10 sẽ khác nhau phụ thuộc vào sự sinh trưởng cũng như điều kiện nuôi cấy của các loài Ở tế bào VKTQH, CoQ10 nằm trong vùng kỵ nước của lớp màng phospholipid của màng tế bào, do đó điều cần thiết là phá vỡ màng tế bào để chiết xuất thành phần này Phương thức phá vỡ màng tế bào VKTQH sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của việc chiết xuất CoQ10 Một số phương pháp chiết xuất CoQ10

đã được thực hiện với hiệu quả khác nhau và chủ yếu phù hợp cho quy mô phòng thí nghiệm Các nghiên cứu về tác động của một số yếu tố như nhiệt

độ, ánh sáng, độ pH và nồng độ muối ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của VKTQH cũng như khả năng tích lũy CoQ10 của VKTQH chưa được

công bố nhiều ở Việt Nam Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam”

*Mục tiêu nghiên cứu:

- Lựa chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy CoQ10 cao

- Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 nhằm định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

*Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của 1-2 chủng VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 cao

- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh trưởng của

các chủng lựa chọn

- Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 từ các chủng VKTQH lựa chọn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10

1.1.1 Cấu tạo của Coenzyme Q10

Coenzyme Q10 (CoQ10) có công thức phân tử C59H90O4, trọng lượng phân tử 863,34 g/mol CoQ10 có cấu trúc dạng chuỗi dài nằm trên màng sinh chất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực [1] Đầu của CoQ10 là đầu quinone, nó có chức năng chuyển giao điện tử Đuôi của CoQ10 là một chuỗi isoprenoid dài, giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [2]

Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [2]

120 oC hoặc cao hơn

Molyneux (2006) cho rằng CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân hủy gần như hoàn toàn sau 24 giờ tiếp xúc với ánh sáng (bao gồm ánh sáng huỳnh quang) Hàm lượng CoQ10 không bị thay đổi khi được gói trong giấy bạc do tránh khỏi sự tác động của ánh sáng Vì vậy, trong quá trình tách chiết CoQ10 cần bảo vệ mẫu tránh tiếp xúc với ánh sáng và định lượng CoQ10 có thể được tiến hành trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm với thời gian không quá 2 giờ [1] CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo phức với

β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20 % khi có sự kết hợp chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [4, 5]

 Tính chất hóa học:

CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [6, 7] Nó rất dễ tan trong

chloroform và carbontetra chloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane, tan một phần trong acetone, hầu như không tan trong nước, methanol và ethanol

CoQ10 kỵ với các tác nhân oxy hóa mạnh, khi tiếp xúc với các hợp chất kiềm tính CoQ10 có thể tạo ra ubichromenol, là một dạng sản phẩm phân hủy

1.1.2.2.Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật

 Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng

CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ CoQ10 đóng vai trò chính trong việc chuyển điện tử giữa các phức hợp hô hấp của chuỗi vận chuyển điện tử, nằm trong màng trong ty thể, mà sản phẩm cuối cùng là adenosine triphosphate (ATP) Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp

Hình 1.1 Chuỗi vận chuyển điện tử [8]

Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của Coenzyme Q có thể di chuyển dễ dàng trong lớp màng lipid Trong chuỗi hô hấp, CoQ10 chịu trách nhiệm vận chuyển điện tử từ phức hợp protein I (NADH dehydrogenase) đến phức hợp protein II (succinate dehydrogenase) và từ phức hợp II đến phức hợp III (phức hợp bc1) [9] Khi nhận các electron từ cả phức I và phức II, nó

vẫn ở dạng khử là ubiquinol và sau khi chuyển các electron sang phức III, nó trở lại dạng oxy hóa thành ubiquinone [8] (Hình 1.1) Chính sự khuếch tán của CoQ cùng với Cytochrome C trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quan trọng trong việc luân chuyển các điện tử đến các phức hợp kế nhau trong chuỗi chuyển điện tử [2] Các cơ quan đòi hỏi nhu cầu năng lượng cao hơn như não, tim, thận và gan có hàm lượng CoQ10 cao hơn

 Chức năng chống oxy hóa

CoQ10 là chất chống oxy hóa hòa tan lipid duy nhất được tìm thấy ở người và nó tập trung vào hầu hết mọi màng, từ màng ty thể đến màng lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) [9] Nhờ tính hòa tan này CoQ10 có thể bảo vệ lipoprotein và lipid khỏi sự peroxy hóa và tổn thương oxy hóa [10] CoQ10 có thể kết hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác, chẳng hạn như vitamin C và vitamin E để chống lại tác hại của các gốc tự do phát sinh từ các phản ứng trong ty thể tạo ra năng lượng [11]

CoQ10 có khả năng dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống kém hiệu quả hơn so với các vitamin Tuy nhiên CoQ10 lại là một chất chống oxy hóa có khả năng tái tạo vitamin E [12] CoQ10 còn có chức năng bảo vệ màng tế bào, protein và các acid nucleic (DNA, RNA) khỏi quá trình oxy hóa bằng cách trực tiếp ngăn cản tia UV, làm sạch các gốc tự do hoặc gián tiếp bằng cách tái

1.1.3 Nguồn thu Coenzyme Q10

CoQ10 được sản xuất từ 3 nguồn thu: từ vi sinh vật (tổng hợp sinh học), các mô động vật và thực vật, tổng hợp từ các chất hóa học (tổng hợp hóa học)

1.1.3.1 Tổng hợp hóa học

CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [17]

Phương pháp này sử dụng solanesol một chất nền khởi đầu cho quá trình tổng

hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone, sau đó được chuyển đổi thành CoQ10 Solanesol có thể được tổng hợp hoặc dễ dàng thu được bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây [18, 19]

Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [18]

Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này thường trải qua nhiều bước và tốn kém rất nhiều chi phí liên quan đến các phản ứng xúc tác năng lượng cao do sử dụng chất nền đắt tiền và gây ra nhiều ảnh hưởng tới môi trường bởi các chất thải hóa học được tạo ra nhiều từ quá trình sản xuất [18]

Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp

1.1.3.2 Coenzyme từ động vật và thực vật

CoQ10 có trong nhiều loại thực phẩm nhưng với hàm lượng ít, nhưng hàm lượng CoQ10 đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu nành CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [20]

Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên

có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [8, 21] Ngoài

ra, CoQ10 cũng có trong cây thuốc lá (360 μg/g CoQ10), lúa (600 μg/g), các loại quả và các loại rau củ (nhiều nhất là trong bông cải xanh, rau bina, dầu đậu nành, cải dầu, dầu cọ, các loại hạt và cây họ đậu) [22, 23]

Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng

độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế

Bảng 1.1 Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm [24]

Thịt & Cá Rau củ quả Dầu và các loại hạt Tuần lộc 157,9 Trái bơ 9,5 Dầu ô liu (EV) 114-160 Tim bò 113,3 Cây cải dầu

(Hoa)

7,4

6,7-Dầu đậu phộng 77

Tim lợn 118,1-282 Bông cải

xanh

8,6

 Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc

Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 như Cryptococcus laurentii, Trichosporon sp.,

Sporobolomyces salmonicolor, và R sphaeroides và các loại nấm men khác

như Candida, Rhodotorula và Saitoella [25, 37] Các loài nấm men như

Sporidiobolus johnsonii, tích lũy CoQ10 nội bào từ 0,8 đến 3,3 μg/g khối

lượng tế bào khô [28]

Schizosaccharomyces pombe cũng là một loại nấm phổ biến để sản xuất protein và CoQ10 [29] Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên

cứu về các điều kiện tối ưu quá trình sản xuất CoQ10 [30] Trong một số loài

nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng sinh tổng

hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [31]

 Coenzyme Q10 từ vi khuẩn

Các vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10 nhiều chủ yếu tập trung ở các

chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter,

Paracoccus denitrificans và Rhodopseudomonas sphaeroides [25, 26, 27, 32] Agrobacterium tumefaciens cho thấy năng suất tổng hợp CoQ10 cao nhất

[26]

1.1.4 Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10

 Tách chiết bằng phương pháp cơ học

Có thể dùng các phương pháp như siêu âm hoặc dùng áp suất để phá

vỡ tế bào và thu nhận CoQ10 Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens 1.2554 theo quy trình: sinh khối sau ly tâm

bổ sung đệm 2 mM Tris HCl (pH 7,5), tiến hành siêu âm (12 giây on, 10 giây off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút [33]

Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), sử dụng biện pháp cơ học để tách

chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào thô được trộn

với 5 mL nước cất và bị phá vỡ ở các áp suất khác nhau (5,5; 16,5; 27,5 hoặc 38,5 MPa) bằng cách sử dụng máy đồng nhất hóa cao (Constant, England) [34]

 Tách chiết bằng phương pháp nhiệt độ

Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter

sphaeroides như sau: các tế bào ướt (0,5 g DCW) được trộn đều với nước cất

(2 mL) và để đông lạnh ở -75 oC trong 30 phút, sau đó được làm nóng ở

100 oC trong 30 phút, thêm 5 ml HCl 4N vào dung dịch mẫu Hỗn hợp được lắc votex trong 20 phút ở 30 oC, sau đó được chiết xuất với 28 ml hỗn hợp n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) và lắc đều trong 5 phút ở 40 oC Mẫu chiết sau đó được hòa tan trong ethanol 95 % Dung dịch mẫu (10 mL) là được xử lý bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng của CoQ10 [34]

 Tách chiết bằng phương pháp sử dụng các chất hóa học

Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng

Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490 20 ml dịch nuôi được ly tâm với tốc độ

1000 vòng/phút trong 20 phút để thu sinh khối Để chiết CoQ10, sinh khối được bổ sung 20 ml 100 % ethanol lắc trong nước 60 oC trong 3 giờ Tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch, ethanol được chiết lại với

20 ml n-hexane Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc tới 1 ml và đưa vào sắc ký để định lượng [35]

Narendra và cộng sự (2012) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ

Saccharomyces cerevisiae như sau: sinh khối ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ

lệ (1:5) ở 60 oC trong 1 giờ Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng n-hexane [30]

Theo Nguyễn Bá Kiên và cộng sự (2010), CoQ10 từ Rhodobacter

sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương pháp sau: 10 g sinh khối ướt

được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55 oC trong 5 phút Bổ sung 140 ml chloroform và khuấy ở 30 oC trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc (Whatman no.1) Bổ sung NaCl (0,58 %, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịch lọc Dịch lọc và dung dịch muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới, làm khô và hòa tan lại trong ethanol [36]

Thitima Rujiralai và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phương pháp chiết

xuất Coenzyme Q10 (CoQ10) từ Artemia 1 g Artemia tươi được ủ với acid

axetic 75 % ở (30 ± 2) oC trong 24 giờ, sau đó là ba lần chiết liên tiếp với hỗn hợp 5 ml hexane và 5 ml ethanol, sau đó phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được kiểm chứng với máy dò mảng diode [37]

 Tách chiết bằng phương pháp sử dụng enzyme

Theo Ha và cộng sự (2007b), khi thực hiện với chủng Agrobacterium

tumefaciens KCCM 10413 sinh khối được bổ sung dung dịch ly giải tế bào

Cellytic B, ủ 30 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi propanol và n-hexane (3:5) vào dịch ly giải tế bào và khuấy mạnh Chiết thu pha trên sau đó đem cô đặc, hòa tan trong ethanol [38]

Zahiri và cộng sự (2006) đã lựa chọn Lysozym thường thủy phân liên kết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan để tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm Lysozym thường được liên kết với EDTA

để tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacarit và phá hủy tế bào đặc biệt là vỏ tế bào vi khuẩn gram âm Nhóm nghiên cứu tách CoQ10 từ các

tế bào E coli tái tổ hợp theo phương pháp sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung

dung dịch ly giải tế bào [sucrose 8 %, Triton X-100 5%, Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), EDTA 50 mM (pH 8.0) và 1 mg/ml lysozyme] ủ 37 oC trong 30 phút Bổ sung n-hexane: n-propanol (5:3) (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), thu pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần Cô đặc, và hòa tan sản phẩm trong ethanol [39]

Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013) cũng xử lý enzyme để phá vỡ tế bào bằng cách: khi được rửa hai lần bằng nước cất, các tế bào ướt (0,5 g DCW) được hòa tan trong 450 µl dung dịch Cell Lytic B, trộn với 50 µl dung dịch lysozyme (10 mg/mL), sau đó được ủ trong 20 phút 25 oC để gây ra ly giải tế bào Sau khi phá vỡ tế bào, CoQ10 được chiết xuất bằng hỗn hợp 25 ml n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) Thời gian chiết là 5 phút ở nhiệt độ

40 oC Lượng CoQ10 trong mẫu được đo bằng HPLC [34]

1.1.5 Ứng dụng của Coenzyme Q10

1.1.5.1 Ứng dụng trong y học

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng CoQ10 có chức năng cải

thiện chức năng tim mạch thông qua việc tăng cường sản xuất năng lượng, co bóp cơ tim, hoạt động chống oxy hóa và ngăn chặn quá trình oxy hóa lipoprotein mật độ thấp [6, 40] Việc điều trị với CoQ10 cải thiện đáng kể

chức năng cơ tim mà không có tác dụng phụ hoặc tương tác thuốc [41]

Điều trị bằng CoQ10 làm giảm các thay đổi sinh lý bệnh tế bào liên quan đến rối loạn chức năng ty thể ở bệnh nhân Parkinson PD [42], làm giảm các biểu hiện stress oxy hóa ở bệnh nhân Huntington [43], bảo vệ thần kinh với việc điều trị các tổn thương gây ra bởi rối loạn chức năng ty thể trong biểu hiện bệnh Alzheimer (AD), có liên quan đến tổn thương oxy hóa gây ra bởi rối loạn chức năng ty thể [44, 45]

CoQ10 cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch thông qua làm tăng cường hoạt động của đại thực bào và làm tăng sinh bạch cầu hạt Điều trị CoQ10 dẫn đến làm giảm khối u và biến mất các di căn được chẩn đoán và khoảng 1-3 năm sau di căn không xuất hiện trở lại [46] Bổ sung CoQ10 giúp ngăn ngừa tổn thương tim, nhiễm độc gan, tiêu chảy và viêm miệng mà không làm giảm hiệu quả điều trị trong quá trình hóa trị với doxorubicin [47, 48] Thực phẩm và đồ uống có chứa CoQ10 đã được đề xuất để ngăn ngừa ung thư và giảm thiểu các phản ứng bất lợi của bệnh ung thư [49]

Ngoài ra, CoQ10 còn được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường [50], sơ vữa động mạch [34], bệnh hen suyễn [51], bệnh hen phế quản, đau nửa đầu [52]

1.1.5.2 Trong mỹ phẩm

CoQ10 được bổ sung vào mỹ phẩm có tác dụng ngăn ngừa các nếp nhăn CoQ10 có hiệu quả trong việc bảo vệ các tế bào sừng bởi sự phá hủy của tia UVA CoQ10 cũng có hiệu quả đáng kể trong việc giảm sự lão hóa cơ thể người bằng cách làm giảm nếp nhăn thông qua khả năng làm tăng cường sức đề kháng của da, giảm sự lão hóa da và dọn dẹp gốc tự do CoQ10 có thể xâm nhập vào lớp biểu bì, nơi mà có sự biến đổi từ dạng oxy hóa sang dạng khử và hoạt động như một chất chống oxy hóa Hiện nay CoQ10 được kết hợp với retinoic acid dùng để điều trị bệnh lão hóa

Như vậy có thể thấy, CoQ10 có rất nhiều ứng dụng trong thực tế và có thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như tổng hợp hóa học, từ động

thực vật, đặc biệt là từ vi sinh vật Trong các nhóm vi sinh vật, vi khuẩn tía

quang hợp là một trong những vi sinh vật tiềm năng và có khả năng tích lũy CoQ10 khá cao

1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp

Đây là nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố quang hợp Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn (bacteriochlorophyll) khác với sắc tố quang hợp của thực vật Đặc biệt VKQH không sử dụng nước làm nguồn hidro như thực

vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi Chúng sử dụng nguồn hidro là sunfit thiosunfat, hidro tư do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh

1.2.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp

Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi Các loài

vi khuẩn tía quang hợp đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảy chồi [53]

Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quang hợp kị khí VKTQH thường có màu hồng đến màu đỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b Cơ quan quang hợp là màng quang hợp được gắn với màng tế bào

Năm 1907, Molish là người đầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc tố màu đỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi chủng vi khuẩn quang hợp này

là Rhodobacteria Nhóm này gồm hai họ là Thiorhodaceae (những vi khuẩn tía

có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những

vi khuẩn tía không có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) [54] Nhóm vi khuẩn tía bao gồm hai họ này sau này được đổi tên là bộ Rhodosprillales và hai họ Choromatiaceae và Rhodospirillaceae [55]

Vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh ban đầu được phân biệt dựa trên cơ sở sinh lý (dựa trên khả năng chứa và sử dụng sulfide của chúng) Nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh là các loài có thể chống chịu được hàm lượng sulfide trong môi trường ở mức độ cao và trong quá trình oxy hóa sulfide, "giọt" lưu huỳnh được tích lũy bên trong tế bào, trong khi đó, nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh thì có thể chống chịu sulfide ở mức độ thấp hơn và không tích lũy giọt lưu huỳnh bên trong tế bào (Hình.1.2a)

Vì vậy, khi sinh trưởng trên môi trường chứa sulfide thì có thể dễ dàng phân biệt được nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh và nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh nhờ sự quan sát giọt lưu huỳnh tích lũy trong hay ngoài tế bào dưới kính hiển vi điện tử phản pha (Hình 1.2a)

Hình 1.2 Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp [56]

Ngoài ra, phân tích phylogenetic của VKTQH dựa trên trình tự so sánh 16S rRNA đã chỉ ra rằng vi khuẩn tía lưu huỳnh là loài vi khuẩn gammaproteobacteria trong khi vi khuẩn tía không lưu huỳnh là alpha hoặc betaproteobacteria [57]

1.2.3 Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp

 Ảnh hưởng của pH

Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3-11 [58] Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6-7

VKTQH ưa acid là khá ít, chỉ có hai chi (ba loài) được biết đến như là

Rhodoblastus acidophilus (trước đây là Rhodopseudomonas acidophila) là

phổ biến trong môi trường acid yếu như đầm lầy Các chủng này đều cho thấy

sự tăng trưởng bị giới hạn khi pH gần bằng 4 [59] Rhodopila continiformis

được phân lập từ các suối nước nóng có tính acid (pH 3,5 – 4) [60]

Rhodopila continiformis có độ pH tối ưu cho sự tăng trưởng tương tự như của

các loài Rhodoblastus, nhưng có khả năng chịu acid cao hơn vì tính chất acid

mạnh hơn trong môi trường sống của nó Rất ít vi khuẩn tía quang hợp sống ở

điều kiện acid và điều này có thể là do ở môi trường acid pH thấp, sulfide sẽ tồn tại ở dạng độc hại H2S

 Ảnh hưởng của ánh sáng

Vi khuẩn tía lưu huỳnh sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh ở môi trường có ánh sáng đỏ hơn ánh sáng vàng và ánh sáng xanh [61]

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể phát triển quang dưỡng và trong điều

kiện bóng tối [58] Biểu hiện gen của VKTQH ảnh hưởng bởi cường độ ánh

sáng khác nhau Cường độ ánh sáng thấp tạo ra các sắc tố quang hợp cao; cường độ ánh sáng cao gây ra sự suy giảm các sắc tố quang hợp

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Năm 1980, vi khuẩn tía lưu huỳnh Thermochromatium (ban đầu là

Chromatium) được phân lập trong nuôi cấy thuần [62] là một loài vi khuẩn ưa

nhiệt (tối ưu hóa nhiệt độ ~ 50 ºC, nhiệt độ tối đa 57 ºC) và tạo ra một phức hợp hấp thụ ánh sáng (LH) hấp thụ tối đa gần 920 nm [63]

Các vi khuẩn tía ưa nhiệt nhẹ khác (nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ~ 40 ºC)

đã được nuôi cấy từ thảm vi khuẩn suối nước nóng Chúng bao gồm các loài

có chứa BChl như Rhodopseudomonas sp chủng GI, Rhodocista cryptolactis

và Rhodocista centenum Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra ở nhiệt độ

lên tới 57 oC và xuống tới 0 oC [64] Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của hầu hết vi khuẩn tía là 30 oC

 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như là chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM (tương đương 64 mgS-2/L) Nếu môi trường sống có nồng độ sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng

[58] Hai loài Rhodobacter Sulfi dophilus và loài Rhodoferax antarcticus có thể

chịu đựng được sulfide với nồng độ hơn 4 mM [65] Ngoài ra, nồng độ NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn tía Có loài sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8-11 % NaCl

1.2.4 Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp

1.2.4.1 Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số loài VKTQH

Tian và cộng sự (2010) nghiên cứu về tối ưu môi trường nuôi cấy đối

với loài Rhodospirillum rubrum nhằm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 bằng

phương pháp phản ứng bề mặt (RSM) trong nuôi cấy ống nghiệm tĩnh Môi

trường tối ưu để sản xuất CoQ10 là: 2,5 g/l axit malic; 1,29 g/l chiết xuất

men; 1,34 g/l (NH4)2SO4; 0,20 g/l MgSO4.7H2O; 0,9 g/l K2HPO4; 0,6 g/l

KH2PO4; 0,08 g/l citrat sắt; 0,02 g/l EDTA Hàm lượng thu được cao nhất của CoQ10 là 9,76 mg/l, phù hợp với hàm lượng dự đoán RSM (9,63 mg /l) Năng suất của CoQ10 trong thiết bị lên men 3 l cao hơn so với đạt được trong nuôi cấy tĩnh và đạt 10,81 mg /l, có thể được quy cho sự khuấy trộn liên tục (400 vòng/phút) giúp tăng cường tiếp xúc với chất nền tế bào trong suốt quá trình lên men [66]

Jiang và cộng sự (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa

tan (DO) về khả năng tích lũy CoQ10 của Rhodopseudomonas palustris bằng

cách sử dụng quy trình lên men hai giai đoạn J001 Hàm lượng DO tối ưu cho

sự phát triển của tế bào và tích lũy CoQ10 lần lượt là 45 % và 15 % Quá trình lên men hai giai đoạn, bao gồm giai đoạn 1 với 45 % DO, giai đoạn 2 với 15

% DO và 2,0 % NaAc tại thời điểm chuyển đổi (42 giờ sau khi tiêm chủng),

đã được chứng minh là tối ưu quá trình lên men để sản xuất CoQ10 Sinh khối tối đa, hàm lượng CoQ10 và tỷ lệ tích lũy CoQ10 lần lượt là 1,31 mg/l; 89,1 mg/l và 1,142 mg/l, tăng lần lượt 28 %; 585 % và 426 % so với quá trình lên men giai đoạn 1 với nồng độ DO là 45 % Nồng độ DO là yếu tố chính để tăng hàm lượng CoQ10 theo quy trình lên men hai giai đoạn [67]

Nghiên cứu của Whu và cộng sự (2013) về tách và tinh chế CoQ10 từ

các tế bào ướt được sản xuất bởi Rhodobacter sphaeroides BCRC 13100

Hàm lượng của CoQ10 được xử lý trước bằng cách sử dụng enzyme, ethanol hoặc homogenizer cao ở nông độ lần lượt là 2,85 mg/g; 2,01 mg/g và 2,11 mg/g CoQ10 được chiết xuất với các dung môi hữu cơ khác nhau Sử dụng ethanol để chiết xuất CoQ10 hai lần trực tiếp từ các tế bào thô sau khi lên men tạo ra năng suất CoQ10 là 2,9 mg/g Chiết xuất thô được tinh chế bằng cách

sử dụng chiết xuất ethanol, sử dụng hexane để phá vỡ tế bào, sự kết tinh để tinh chế CoQ10 tinh khiết Độ tinh khiết của CoQ10 được xác định bằng phương pháp HPLC đạt 96 % [34]

Wang và cộng sự (2016) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất

CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides Các quy trình tối ưu để sản xuất CoQ10

từ Rhodobacter sphaeroide là: hàm lượng chủng thêm vào là 2 % so với môi

trường, nhiệt độ lên men 30 °C, thời gian lên men 72 h, thể tích môi trường đến bình tổng thể tích 60 %, nhiệt độ chiết 90 °C, giá trị pH của nước axit trong chất chiết là pH=3 Trong các điều kiện tối ưu, năng suất của CoQ10 được tăng thêm 141 % so với các điều kiện trước khi tối ưu hóa [68]

1.2.4.2 Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp

Từ năm 1999, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Quang Huấn đã có những kết quả ban đầu về khả năng tích lũy CoQ10 của một chủng VKTQH

thuộc chi Rhodobacter Nhóm tác giả đã tinh sạch được ubiquinone với phổ

hấp thụ đặc trưng ở dạng oxy hóa tại bước sóng 275 nm và phổ hấp thụ đặc trưng ở dạng khử tại bước sóng 291 nm [69]

Năm 2005, nhóm tác giả Đỗ Thị Tố Uyên và Trần Văn Nhị đã bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất ubiquinone từ sinh khối VKTQH Kết quả cho thấy, nhóm tác giả đã lựa chọn được bể thủy tinh để nuôi lấy sinh khối VKTQH và sử dụng phương pháp siêu âm để phá vỡ tế bào Từ đó, tách chiết ubiquinone dạng thô bằng hệ dung môi diethyl ether/ethanol với tỷ lệ 3/1 (v/v) [70]

Trong nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thảo, tiến hành khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng như nguồn carbon, nguồn nitơ, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch

chiết cà chua đến sự tăng trưởng tế bào cũng như sản xuất CoQ10 của các

chủng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31 được

phân lập tại Việt Nam Bổ sung vào môi trường nuôi cấy mannitol, pepton, cao nấm men và vitamin E sẽ làm tăng việc sản xuất CoQ10 từ các chủng vi khuẩn khảo sát Chọn được phương pháp chiết Q10 từ tế bào vi khuẩn và chủng PN31 có hàm lượng Q10 là 399,8 µg/g sinh khối sau thời gian nuôi cấy

là 72 giờ [71]

Tuy nhiên, khu hệ vi sinh vật ở nước ta là rất đa dạng, nhưng số lượng nghiên cứu và công bố về VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 còn chưa phong phú Qua so sánh với các công bố trên thế giới, có thể thấy rằng hàm lượng tích lũy CoQ10 ở các chủng này còn chưa cao và quy trình tách chiết

còn chưa được tối ưu [9, 49] Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu khả năng tích lũy

Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam” đã được đặt ra

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC

2.1.1 Nguyên vật liệu

- 06 chủng VKTQH có khả năng tích lũy sinh khối cao được phân lập

từ các mẫu nước nhiễm dầu được ký hiệu là: FO2, DQ1, DQ2, DQ3, DQ4 và

DQ5 và chủng Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408

được lưu giữ tại Phòng CNSH Môi trường, Viện Công nghệ sinh học

- Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng để tách gen 16S rRNA: cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC AGCC-3′)

- Vector pCRTM được sử dụng làm vector tách dòng nhân đoạn gen 16S

rRNA, chủng E coli DH5 được sử dụng cho biến nạp do Phòng Vi sinh vật

học phân tử, Viện Công nghệ sinh học

2.1.2 Các thiết bị máy móc

Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm thiết bị của Phòng công nghệ sinh học Môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học:

+ Tủ nuôi cấy vi sinh (Binder, infors, Đức);

+ Bình khí nitơ (Nga), máy quang phổ NOVASPEC II (Anh);

+ Máy quang phổ UV-1650PC (Shimazdu, Nhật Bản);

+ Cân phân tích Mettler toldo (Thụy Sỹ);

+ Máy li tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi);

+ Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ);

+ Máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ);

+ Máy soi DNA (mini-transllumminator, Bio-Rad, Mỹ);

+ Máy Vortex (Đức),

+ Máy đo pH (Thommas Scientific, Mỹ),

+ Máy lắc ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc),

+ Bể ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc),

+ Máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),

+ Tủ lạnh thường GR-K22EA (Toshiba) và

+ Tủ lạnh sâu -20oC (Alaska),

+ Box cấy Biocyt ESI Flufrance (Pháp),

+ Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản) và

+ Kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản),

+ Máy đọc trình tự gene tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer

2.1.3 Hóa chất

- CoQ10 chuẩn từ hãng Sigma Các hóa chất thông thường dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử đều là các hóa chất có độ tinh khiết cao

đặt từ các hãng như Merk (Đức), Ferrmentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Ấn Độ

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy

- Môi trường phân lập và nuôi cấy VKTQH là môi trường DSMZ 27 bao gồm các thành phần sau: Cao nấm men (0,3 g/l), succinate –Na (1 g/l), acetate (0,5 g/l), K2HPO4 (1 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4.7H2O (0,4 g/l), CaCl2.2 H2O (0,05 g/l), NH4Cl (0,4 g/l), vi lượng SL6 (1 ml/l), dung dịch vitamin B12 (0,4 ml/l), nước cất (1000 ml), pH (6,8)

- Môi trường DSMZ 27 có bổ sung 2% thạch

- Vitamin và vi lượng bổ sung:

+ Dung dịch vi lượng SL6 (mg/l): HCl (25%) 6,5 ml; FeCl2.4H2O 1,5 g;

H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03 g; CoCl2.6H2O 0,2 g; ZnSO4 7H2O 0,1 g; CuCl2.2H2O 17 mg; NiCl2.6H2O 24 mg; Na2MoO4.2H2O 36 mg, H2O 993 ml + Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng màng lọc và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Thời gian thực hiện: từ 15/8/2018 đến 15/8/2019

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ sinh học Môi trường (CNSHMT), Viện Công nghệ sinh học, VAST

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của

vi khuẩn tía quang hợp

VKTQH được nuôi cấy trong ống thủy tinh có nắp đậy cao su hoặc trong các bình thủy tinh hình trụ có thể tích chứa dịch môi trường DSMZ 27 Môi trường trong các bình và các ống thủy tinh được sục khí nitơ qua màng lọc vô trùng thay thế khí oxy trong môi trường sao cho nồng độ oxy hòa tan

0 mg/l Các chủng VKTQH được nuôi trong lọ penicillin V=10 ml hoặc bình thủy tinh V=100 ml chứa môi trường DSMZ 27 ở điều kiện kỵ khí, ánh sáng đèn sợi đốt có cường độ 5000 lux, nhiệt độ 27-30 oC

Hoạt hóa các chủng VKTQH bằng cách: Khi sinh trưởng của các chủng VKTQH được nuôi cấy ở pha log với mật độ tế bào khoảng 109 thì được cấy vào bình thí nghiệm thể tích 500 ml khoảng 5-10 % (v/v) để đạt mật độ ban đầu OD800 khoảng 0,1 Sau đó các chủng VKTQH được nuôi bằng cách nuôi tĩnh trong môi trường DSMZ 27 điều kiện kỵ khí với cường độ ánh sáng 5000 lux từ đèn sợi đốt Mỗi chủng VKTQH được hoạt hóa làm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình thí nghiệm

Sinh trưởng của các chủng VKTQH được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở pha log (khoảng 5 ngày nuối cấy) tại bước sóng 800

nm (OD800), vì trong tế bào VKTQH Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ hấp thụ này tỷ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỷ lệ thuận với sinh khối của tế bào Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ UV-1650 PC

2.3.2 Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía quang hợp

- Tách chiết, tinh sạch CoQ10 [13]: Dịch nuôi cấy các chủng VKTQH trong môi trường DSMZ 27 sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm loại dịch thu

sinh khối tươi (ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút) CoQ10 được tiến hành chiết xuất dựa theo phương pháp của Paterson và Buddie [72]

+ Cân khoảng 2,5 g sinh khối tươi cho vào ống falcol được thêm 25 ml hỗn hợp methanol: n- hexane (tỉ lệ thể tích 3:2) Sau đó lắc votex hỗn hợp trong 20-30 phút, ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút Tách lấy dịch trên và cô chân không ở 60 oC thu được cặn thô

+ Cặn khô có chứa CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dung môi methanol: hexane và chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được cô đặc đến khô (quá trình lặp lại 3 lần) Sau đó CoQ10 tiếp tục được tinh sạch bằng cột silica với dung môi methanol làm pha động và được cân bằng 10 lần thể tích cột Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa lên cột và chạy với hệ dung môi rửa giải là ethanol Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành thu nhận các phân đoạn chứa CoQ10 Cặn thô được hòa tan dung môi n –hexan được gọi là dịch thô chứa CoQ10

- Xác định sự có mặt của CoQ10 bằng sắc ký bản mỏng (TCL): Dịch thô thu được từ sinh khối các chủng được sử dụng để xác định sự có mặt của CoQ10 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng tráng silicagel 60 F254 (TCL) pha thường với hệ dung môi n–hexan: etyl ete với tỉ lệ là 4:1 (v/v) Lượng dịch thô của mỗi chủng tiêm vào sắc kí bảng mỏng là 5 µl Chủng VKTQH có vết CoQ10 đậm nhất và sinh trưởng tốt nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

- Định lượng CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [73]

Xây dựng đường chuẩn Q10 bằng phương pháp HPLC

Xây dựng đồ thị mối quan hệ giữa nồng độ Q10 và diện tích píc hấp thụ sắc ký trong khoảng nồng độ là 1200; 2400; 3600; 4800 và 6000 mg/l Phân tích từng mẫu trên với thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC 1100 tại bước sóng  = 280 nm cho ra đường chuẩn dùng để xác định hàm lượng Q10 trong mẫu thí nghiệm

Phân tích hàm lượng CoQ10 được thực hiện trên hệ thống HPLC: Dịch thô thu được từ sinh khối các chủng VKTQH được xác định hàm lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với các điều kiện: sử dụng cột Hypersil C18 (200 x 4 mm); tỷ lệ pha động Hexan : Aceton = 90: 10 (v/v); tốc

độ dòng chảy 0,5 ml/phút và áp suất là 220 bar

Tiến hành: Sau khi đặt xong các thông số cần thiết, tiến hành rửa bơm, rửa cột, chạy đường nền và áp suất ổn định 30  45 phút Lọc mẫu trước khi

đo bằng micro filter 2-3 lần, lượng mẫu tối thiểu đạt 0,5 ml Dùng Micropipet lấy 5 ml dung dịch phân tích đưa vào buồng mẫu Máy sẽ tự động ghi các thông số: Thời gian lưu (RT), chiều cao pic và tính điện tích cũng như thành phần phần trăm (%) của từng cấu tử trong hỗn hợp

+ Sau khi đo xong mẫu để thiết bị chạy đường nền 10 phút trước khi

bơm mẫu tiếp theo

2.3.3 Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng

vi khuẩn tía quang hợp

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình thái

Chủng VKTQH sinh tổng hợp CoQ10 tốt nhất được nuôi cấy đồng thời trên môi trường DSMZ 27 thạch để quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào Hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)

và chụp ảnh tế bào trên kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản) và được tiến hành tại phòng Vi sinh vât – Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội

Phương pháp nhuộm Gram: Xác định Gram của vi khuẩn theo phương

pháp của Harry, sử dụng chủng vi khuẩn E coli và vi khuẩn Bacillus subtillis

làm đối chứng

2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon

Các chủng lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường DSMZ-27 trong đó nguồn carbon được thay thế bằng các nguồn như: glucose, acetate, fructose, citrate, succinate, benzoate với nồng độ 1 g/l Khả năng sinh trưởng của

chúng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí, có chiếu sáng với cường độ khoảng 5000 lux

2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA

ADN của các chủng lựa chọn đã được tách chiết bằng bộ kit QIAmp ADN mini và Blood Hard Book theo quy trình của nhà sản xuất Qiagen Phản ứng PCR để nhân đoạn gen 16S rARN với cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC

AGCC-3′) Quá trình nhân tiến hành với tổng thể tích 25 l bao gồm: 12,5 l PCR master mix; 0,75 l mồi (20 M) mỗi loại; 8 l dH2O; 3 l ADN khuôn Việc nhân gen được tiến hành với chu trình nhiệt: 94 0C trong 5 phút; 32 chu

kỳ lặp lại (94 oC trong 1 phút; 56 oC trong 50 giây; 72 oC trong 50 giây);

72 oC trong 7 phút và 4 oC để bảo quản

Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1 % và tinh sạch bằng

bộ kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình của nhà sản xuất Bioneer Tiếp đó sản phẩm PCR (kích thước khoảng 1500 bp) được gắn vào vectơ tách

dòng, biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Dòng plasmid chứa đoạn

gen mong muốn được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer Việc so sánh trình tự nucletide và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng BTLP1 với các chủng vi khuẩn đại diện khác sử dụng phần mềm Blast, Bioedit, Clustal X

độ khác nhau 14-16 oC, 27-30 oC, 38-40 oC Mỗi thí nghiệm về khoảng nhiệt

độ nuôi cấy làm lặp lại 3 lần Các bình được nuôi ở điều kiện kỵ khí, có ánh sáng Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào

ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 100 ml, nhiệt độ 27-30 oC dưới ánh sáng đèn sợi đốt, có 6 mức cường độ ánh sáng thí nghiệm là 0, 1000,

2000, 3000, 4000 và 5000 lux Ở mỗi thí nghiệm về cường độ ánh sáng làm lặp lại 3 lần Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của pH: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 10 ml chứa các môi trường DSMZ-27 được điều chỉnh với 9 mức pH: 4; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 và 9 Các bình được nuôi trong điều kiện kị khí, sáng, nhiệt độ 27 – 30 oC Ở mỗi thí nghiệm pH làm lặp lại 3 lần.Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1, các chủng lựa chọn được nuôi trong các bình thủy tinh hình trụ 10

ml chứa môi trường DSMZ-27 với nồng độ muối ban đầu được điều chỉnh ở

10 mức nồng độ: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và 5 % Ở mỗi thí nghiệm nồng độ muối làm lặp lại 3 lần Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trự 100 ml chứa các môi trường DSMZ-27 có thay thế hàm lượng nitơ trong NH4Cl bằng 7 nguồn nitơ từ pepton, (NH4)2SO4, ure, NH4NO3, KNO3, NaNO3 và Ca(NO3)2.4H2O Ở mỗi thí nghiệm về các nguồn nitơ làm lặp lại 3 lần Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành

đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng

800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

2.3.5 Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa chọn

Tiến hành nuôi cấy các chủng VKTQH lựa chọn trong bình 500 ml có chứa môi trường DSMZ 27 và môi trường tối ưu thu được từ các điều kiện nuôi cấy ở trên

Sau đó tiến hành tách chiết, xác định hàm lượng CoQ10 theo các bước

ở mục 2.3.2 và so sánh đánh giá kết quả hàm lượng CoQ10 thu được

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD) Sử dụng phương pháp

xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Irristat 5.0

để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa là α = 0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO

3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy Coenzyme Q10 cao

Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cao trước tiên dựa trên khả năng sinh trưởng (tạo sinh khối)

và hàm lượng CoQ10 tích lũy

3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp

06 chủng VKTQH từ bộ sưu tập chủng giống của phòng CNSH Môi trường được hoạt hóa trên môi trường DSMZ 27 Sau 5 ngày nuôi tĩnh trong điều kiện kỵ khí, sáng, chúng tôi tiến hành đo độ huyền phù tế bào OD800 của các chủng và thu được kết quả thể hiện ở Hình 3.1A và Hình 3.1B

(A)