Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn euphorbia hirta l

Với những lí do trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên c ứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn – Euphorbia hirta L.” nhằm mục đích tách chiết và xác định cấu trúc của một số chất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

Giảng viên: Ths Lê Thị Thu Hương – Chủ nhiệm đề tài

Các sinh viên khoa Hóa ĐHSP TP.HCM gồm có:

1 Ngô Văn Khuê

2 Nguyễn Thị Mỹ Hạnh

3 Nguyễn Như Ngọc

4 Vũ Hải My

Ký hi ệu và

ch ữ viết tắt Ti ếng Anh Ti ếng Việt

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

DEPT Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer

Phổ DEPT

HMBC Heteronuclear Multiple

Bond correlation

Tương quan H-C qua 2, 3 liên kết

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Correlation

Tương quan H-C qua 1 liên kết

dd Double of Doublet Mũi đôi đôi

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bảng mỏng

TÓM T ẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn Euphorbia

hirta L.”

Mã số: CS.2015.19.18

Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Thu Hương Tel: 0963817468

E-mail: huonghctn@yahoo.com

Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện : Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Ngô Văn Khuê, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Như Ngọc, Vũ Hải My

Thời gian thực hiện: Tháng 04 năm 2015 đến tháng 04 năm 2016

1 Mục tiêu:

Cô lập 5-7 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn

Công bố 01 bài báo

Đào tạo 02 sinh viên

2 Nội dung chính:

Đã cô lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn

3 Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế-xã hội):

Công bố 01 bài báo trên Tạp chí Khoa học tự nhiên, Trường Đại học sư phạm Hà Nội,

tập 61, số 9, trang 48-52, năm 2016

04 sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp

• Viet Nam Academy of Science and Technology

• Ngo Van Khue, Nguyen Thi My Hanh, Vu Hai My, Nguyen Nhu Ngoc

Duration: from April, 2015 to April, 2016

• Six compounds were isolated from Euphorbia hirta L Their structures were

elucidated using one and two dimensional NMR spectroscopic techniques

PHẦN I MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ xưa đến nay, việc sử dụng các cây cỏ làm thuốc đóng vai trò hết sức quan

trọng trong đời sống con người Ngày nay với nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, mục tiêu chăm sóc sức khỏe con người ngày càng được nâng cao, chính vì thế, dược tính và hóa tính của nhiều loại thảo mộc đang được nghiên cứu và không ngừng phát triển

Trong đó, cây cỏ sữa lá lớn hiện diện khắp nơi và được sử dụng trong Y học cổ truyền để chữa các bệnh thông thường như: giải nhiệt, hạ sốt, an thần, kháng viêm, chữa

lỵ, hen suyễn, viêm phế quản Ngoài ra, cỏ sữa lá lớn còn chứa chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, lợi tiểu và chống ung thư

Cho đến nay việc nghiên cứu về thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn ở các nước trên thế giới rất phổ biến, đặc biệt ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn

Độ, Malaysia,… nhưng ở Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về loài cây này

Với những lí do trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên c ứu thành phần hóa

học của cây cỏ sữa lá lớn – Euphorbia hirta L.” nhằm mục đích tách chiết và xác định

cấu trúc của một số chất có trong cây cỏ sữa lá lớn được thu hái ở tỉnh Đồng Nai

2 Mục tiêu của đề tài

- Thu nhận các mẫu cặn chiết từ cây cỏ sữa lá lớn ở tỉnh Đồng Nai

- Tách chiết và xác định cấu trúc của một số hợp chất thiên nhiên có trong cây cỏ sữa lá

lớn

3 Cách tiếp cận đề tài

- Tổng quan tài liệu về cây cỏ sữa lá lớn

- Thu hái mẫu cây ở tỉnh Đồng Nai

- Tiến hành ngâm chiết bằng dung môi ether dầu hỏa, ethyl acetate, butanol để thu được các cặn chiết khác nhau

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp ngâm chiết bằng dung môi ether dầu hỏa, ethyl acetate, butanol để thu được các cặn chiết khác nhau

- Sử dụng phương pháp vật lí hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

để xác định cấu trúc của các chất cô lập được

5 Phạm vi nghiên cứu

- Cô lập các chất có trong cặn chiết ethyl acetate của cây cỏ sữa lá lớn

6 Nội dung nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp sắc kí cột, sắc kí bảng mỏng để cô lập 5-7 hợp chất có trong cây

cỏ sữa lá lớn

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất tách được bằng các phương pháp vật lí hiện đại như phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC

PHẦN II NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật

Cây cỏ sữa lá lớn hay còn gọi là cỏ sữa lông,

thiên căn thảo, cây mủ, cây vú sữa đất, có tên khoa học

là Euphobia hirta L thuộc họ thầu dầu

Euphorbiaceae.[1,2,3]

Cây có thân bò hoặc hơi đứng, cao khoảng 15-40

cm, cây có nhiều rễ phụ hơi đỏ hoặc tím, toàn cây có

lông vàng và nhựa mủ trắng[2]

Lá màu xanh lẫn màu đỏ mọc đối, cuống ngắn, phiến lá hình mũi mác, dài 1-4

cm, rộng 1-1,5 cm, mép có răng cưa nhỏ Gốc cuống lá có 2 lá kèm nhỏ, hình lông

cứng.[3]

Nhiều cụm hoa màu trắng đỏ nhạt, hình chén nhỏ ở các nách lá

Quả lúc đầu đỏ sau đó xanh rồi chuyển dần sang nâu, rất nhỏ, đường kính

khoảng 1,5 mm, khi già nứt thành 3 mảnh vỏ, có 3 hạt rất nhỏ.[1,3]

1.2 Phân bố và sinh thái

Cây cỏ sữa lá lớn mọc hoang khắp nơi ở Việt Nam, ở những chỗ đất có sỏi đá,

bãi cỏ, đường đi, ở miền Bắc cũng như ở miền Nam Cây còn mọc ở Trung Quốc,

Malaysia[26], Ấn Độ,Australia, châu Phi[23, 28],châu Mỹ

1.3 Tác dụng dược lí

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Euphorbia hirta L chứa nhiều chất trị rối loạn tiêu

hóa, tiêu chảy[6]

, loét dạ dày, ợ nóng, nôn mửa[5]

, bệnh lỵ[33]

, bệnh cao huyết áp[28]

,

chống ngứa, thông sữa, rối loạn kinh nguyệt, vô sinh và các bệnh hoa liễu[5], cây cũng

được sử dụng trong điều trị các rối loạn phế quản và đường hô hấp bao gồm cả bệnh

Cỏ sữa lá lớn có các hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn[25], kháng nấm, lợi

tiểu[5], giải lo âu[21], chống viêm và chống ung thư[12, 25]

Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tác dụng của cỏ sữa lá lớn trong việc điều trị

bệnh tiểu đường.[24]

1.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Năm 2011, Abu Arra Basma, Zuraini Zakaria và các cộng sự[5] đã nghiên cứu

về khả năng chống oxi hóa từ các bộ phận khác nhau của cây cỏ sữa lá lớn để tìm kiếm nguồn mới của chất chống oxy hóa an toàn và ít tốn kém Từ các mẫu lá, cành, hoa và

rễ người ta đã tìm ra các hợp chất phenolic và flavonoid có khả năng chống oxy hóa

mạnh

1.3.2 Hoạt tính điều trị bệnh tiểu đường

Năm 2014, Quy Trinh, Ly Le[24]đã có nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một

số chất trong cây cỏ sữa lá lớn có tác dụng trị bệnh tiểu đường bằng phương pháp gắn

kết các chất tìm được trong cây cỏ sữa lá lớn với một số protein liên quan tới bệnh tiểu

đường loại 2 Các chất này bao gồm quercetrin, rutin, myricitrin, cyanidin

3,5-O-diglucoside, pelargonium 3,5-diglucose thuộc họ flovonoid và α-amyrine, β-amyrine,

taraxerol thuộc họ terpene Kết quả nghiên cứu cho thấy sự liên kết của các chất trong cây cỏ sữa lá lớn với các protein có khả năng điều trị hiệu quả bệnh tiểu đường

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 1995, K Vijaaya, S Ananthan và các cộng sự[18] đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất chiết xuất từ Camellia sinensis L và chiết xuất

methanol của cỏ sữa lá lớn chống lại bệnh lỵ - một loại bệnh do Shigella spp gây nên

Các tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết methanol của cỏ sữa lá lớn đã được chứng minh trong phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng loài vi khuẩn Shigella Thực nghiệm

cho thấy chiết xuất không gây độc tế bào và có hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2013, A Annamalai, V.L.P Christina cùng các cộng sự[6] đã nghiên cứu

về hoạt tính kháng khuẩn của cây cỏ sữa lá lớn bằng việc tổng hợp các hạt nano vàng không độc hại (Au NPs) bằng cách sử dụng các chất chiết từ lá của cây cỏ sữa lá lớn Các Au NPs này có khả năng chống lại các chủng vi khuẩn như Escherchia coli,

1.3.4 Hoạt tính chống viêm

Năm 1991, khi khảo sát chiết xuất n-hexane của các bộ phận của cây cỏ sữa lá

lớn và thành phần chính của nó (triterpene, amyrin, 24-methylenecycloartenol,

β-sitosterol), M.C Lanhaers và các cộng sự[20] đã đánh giá hiệu quả kháng viêm ở chuột Chiết xuất dung dịch nước đông khô có khả năng giảm đau, hạ sốt và chống viêm Bên

cạnh đó, hoạt động trầm cảm trung ương, thể hiện bởi tác dụng an thần mạnh mẽ kết

hợp với hiệu ứng giải lo âu cũng được tiến hành nghiên cứu

1.3.5 Ho ạt tính chống ung thư

Năm 1995, K Vijaya, S Ananthan và các cộng sự[18] còn nghiên cứu khả năng gây độc của các chất trong các dịch trích khác nhau Các chất chiết xuất này đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn hiệu quả và không gây độc tế bào Riêng chiết xuất

của cỏ sữa lá lớn lại có hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc đối với một số dòng tế bào ung thư Điều đó cho thấy cây cỏ sữa lá lớn rất hữu ích trong điều trị ung thư, khối u

ác tính và ung thư tế bào vảy

1.3.6 Ho ạt tính chống nọc độc của rắn

Năm 2016, Kadiyala Gopi[36]

cho biết quercetin-3-O-rhamnoside từ Euphorbia hirta

có khả năng chống lại nọc độc của rắn

1.4 Thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn

1.4.1 Flavonoid

Năm 1972, Blanc P và các cộng sự đã cô lập được euphorbianin (1), quercitol (2), leucocyanidol (3), quercitrin (4).[9]

Năm 1991, Chen L bằng các phương pháp hóa lí và quang phổ, đã phân lập các

hợp chất từ lá của cây cỏ sữa lá lớn là quercitrin (4), myricitrin (5).[11]

Năm 2012, Wu Yi, Qu Wei, Geng Di, Liang Jing-Yu, Luo Yang-Li đã cô lập các

hợp chất là isorhamnetin (6), pinocembrin (7), kaempferol (8), luteolin (9), quercetin

(10).[33]

Năm 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki

Otsuka đã cô lập được hợp chất afzelin (11), isovitexin (12) [34]

O OH HO

OH OH

O

O HO

OH HO

OH O

(1) (2)

O OH

OH HO

OH OH

O OH

OH OH

O OH OH

OH

OH

(7) (8)

Năm 1978, Elnagar L và các cộng sự đã cô lập được acid shikimic (16) từ cao

ethanol của cây cỏ sữa lá lớn.[15]

Năm 1991, Chen L bằng các phương pháp hóa lí và quang phổ, đã phân lập

hợp chất từ lá của cây cỏ sữa lá lớn là acid gallic (14), acid 3,4-di-O-galloylquinic

(17), 2,4,6-tri-O-galloyl-D-glucose (18), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- β-D-glucose

(19).[11]

Năm 2012, Wu Yi, Qu Wei, Geng Di, Liang Jing-Yu, Luo Yang-Li đã cô lập 3

hợp chất là scopoletin (20), scoparone (21), isoscopoletin (22).[33]

Năm 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka đã cô lập được methyl 3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenylpropanoate O-β-D-

OH

(9) (10)

O HO

OCH3O

OH

O OHO OH

CH3HO

OH

O HO

OH O

OH

O HO

HO

OH OH

(11) (12)

O O

O

O

HO HO

OH OH

OH OH HO

O HO

(13) (14)

O OH HO

HO

HO HO

HO

O OH

OH OH

OH

O HO

O O OH

O

OH O O

OH HO

HO

O

OH

OH HO

O

OH

OH OH

(17) (18)

O O

O

O OO

O O

O

O O

HO OH OH

OH OH HO

OH OH HO

1.4.3 Steroid và terpenoid

Năm 1966, Gupta D R và Gard S K đã cô lập từ thân cỏ sữa lá lớn được

taraxerol (25), friedelin (26), β-sitosterol (27).[17]

Năm 1972, Ahmed M Attallad, Harold J Nicholas đã cô lập từ lá và thân cỏ

sữa lá lớn taraxerol (25), taraxerone (28), campesterol (29), stigmasterol (30) [7]

Cùng

năm 1972, Blanc P và các cộng sự đã cô lập camphol (31).[9]

Năm 1980, từ thân cỏ sữa lá lớn, Baslas R K., Agarwai R đã cô lập

cycloartenol (32), euphorbol (33).[8]

Năm 1984, Sofowora và các cộng sự đã cô lập được các hợp chất

24-methylenecycloarternol (34), β-amyrin (35), β-amyrin acetate (36), ingenoltriacetate

(37), tinyaloxin (38).[30]

Năm 1999, Mariano Martinez Vazquez đã cô lập hợp chất 12-O-tetradecanoyl

phorbol acetate (TPA) (39).[19]

Năm 2011, Shijun Yan và các cộng sự đã tìm ra 3 hợp chất

2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane (40), 2 β,16α-dihydroxy-ent-kaurane (41), ent-kaurane (42).[29]

O O

HO

OH OH

(23) (24)

Năm 2013, Consolacion Y Ragasa, Kimberly B Cornelio đã cô lập hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol (43), 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol (44),

25-cycloartenol (45), lupeol (46), α-amyrin (47), cycloartenol fatty acid ester (48), lupeol fatty acid ester (49), α-amyrin fatty acid ester (50), β-amyrin fatty acid ester (51).[12]

Năm 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka đã cô lập được hirtionoside A (52), hirtionoside B (53), hirtionoside C (54), blumenol C glucoside (55), citroside A (56), corchoionoside C (57).[34]

HO

H3C CH3

CH3 CH3H

H3C CH3

(34) (35)

H H H

CH3

H

(40) (41)

H3C OH

OH

CH3H

CH3

H3C

CH3H

CH3

CH3

H2C

(48) (49)

OH OH HO

O O

CH3

CH3O

HO

OH OH HO

O O

(52) (53)

CH3

CH3O

HO

OH OH HO

O O

O HO

C CH3

CH3O

HOHO

OH

O HO

Năm 2009, Uppuluri V Mallavadhani và Kilambi Narasimhan đã tìm ra 2 đồng

phân anomer: n-butyl-1-O- β-L-rhamnopyranoside (62), n-butyl-1-O- α-L

O OH

OH HO

HOHO

OH OH HO

HO

(66) (67)

O

O CH3O

O HO

C HƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu cây Euphorbia hirta L được thu hái ở Đồng Nai vào tháng 7 năm 2013,

được định danh bởi TS Phạm Văn Ngọt - Bộ môn Thực vật học - Trường Đại học Sư

phạm Tp Hồ Chí Minh Mẫu cây được phơi khô trong bóng râm, để nơi khô thoáng,

sấy ở 50-550C Sau đó xay thành bột, ngâm trong ethanol để điều chế các cao

+ Máy soi UV

+ Cân điện tử Sartorius Mass 620g

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ

hạt nhân Bruker AC.500, tần số cộng hưởng 500MHz

− Tất cả phổ được ghi tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hóa Học - Viện Khoa Học

và Công Nghệ Việt Nam, 18 - Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội và phòng Phân Tích Trung Tâm trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

2.2 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN

12 kg mẫu cây khô (phần trên mặt đất) được ngâm với ethanol 960, dịch chiết được gom lại rồi cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất thấp thu được

635 gam cao thô Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với ether dầu hoả, ethyl acetate thu được cao ether dầu hoả (60,4 gam), cao ethyl acetate (335,3 gam) Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1

Sắc ký cột silica gel phần cao ethyl acetate (335,3 gam) với hệ dung môi ED:EA có độ phân cực tăng dần Dịch từ cột sắc ký được hứng vào các bình tam giác

250 ml Sau đó, cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hũ bi Dùng sắc ký bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom

lại thành một phân đoạn Kết quả thu được 5 phân đoạn kí kiệu là EA1-5, các phân đoạn được trình bày trong bảng 2.1

2.2.1 Sắc ký cột phân đoạn EA.1

Phần cao thu được từ phân đoạn EA.1 tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ED:EA tỷ lệ 5:5 Kết quả thu được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 2.2

Tiếp tục sắc kí cột với phân đoạn EA.1.1 với hệ dung môi C:M (9:1) thu được 4

mg hợp chất EH5

2.2.2 Sắc ký cột phân đoạn EA.2

Phần cao thu được từ phân đoạn EA.2 (54,5 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ED:EA tỷ lệ 3:7 Kết quả thu được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 2.3

Tiếp tục sắc kí cột với phân đoạn EA.2.1 với hệ dung môi C:M (8:1) thu được 8

mg hợp chất EH2 và 4 mg hợp chất EH3