Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa in vitro của nam sâm bò (boerhavia diffusa l ) ở cần giờ, tp hcm

Một số phương pháp được sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa như: phương pháp bắt gốc tự do DPPH, năng lực khử, thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO, xác định hàm lượng Malonyl diald

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

─────────────────────────────

BÁO CÁO T ỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

Ở CẦN GIỜ, TP HCM

MÃ S Ố : CS.2015.19.39

Cơ quan chủ trì: KHOA SINH HỌC

Chủ nhiệm đề tài: ThS NGUYỄN THỊ HẰNG

THÀNH PH Ố HỒ CHÍ MINH - Tháng 11/2016

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

─────────────────────────────

BÁO CÁO T ỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

Ở CẦN GIỜ, TP HCM

MÃ S Ố : CS.2015.19.39

Xác nh ận của cơ quan chủ trì Ch ủ nhiệm đề tài

THÀNH PH Ố HỒ CHÍ MINH - Tháng 11/2016

NH ỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

H ọ và tên Đơn vị công tác và lĩnh vực

chuyên môn

N ội dung nghiên cứu

c ụ thể được giao Nguy ễn Thị

Mai H ữu Phương Sinh viên Khoa Sinh học - Trường

ĐH Sư phạm Tp HCM

Thu nhận cao chiết, khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao ethanol Nam sâm bò

M ỤC LỤC

M ỤC LỤC i

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH M ỤC HÌNH v

DANH M ỤC BẢNG vi

M Ở ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Cách tiếp cận của đề tài 3

5 Phạm vi nghiên cứu 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Hiện tượng oxy hóa và kháng oxy hóa 5

1.1.1 Hiện tượng oxy hóa trong tế bào 5

1.1.2 Hiện tượng kháng oxy hóa trong tế bào 6

1.2 Giới thiệu về Nam sâm bò 8

1.2.1 Phân loại 8

1.2.2 Đặc điểm sinh học 8

1.2.3 Các công trình nghiên cứu về Nam sâm bò 9

1.3 Đặc điểm tự nhiên của thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần Giờ 12

1.3.1 Vị trí địa lý 12

1.3.2 Địa hình - Đất đai 13

1.3.3 Khí hậu 13

1.4 Phương pháp chiết xuất hợp chất sinh học từ thực vật 13

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 13

1.4.2 Phương pháp chiết rắn - lỏng 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2 Hóa chất 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu đất 18

2.3.2 Phương pháp khảo sát một số điều kiện tự nhiên 18

2.3.3 Phương pháp thu mẫu, chế biến và bảo quản mẫu 19

2.3.4 Phương pháp thu nhận nước sắc 20

2.3.5 Phương pháp thu nhận cao chiết 20

2.3.6 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 21

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.4 Quy trình thí nghiệm 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả nghiên cứu 25

3.1.1 Mô tả một số đặc điểm về môi trường sinh thái của Nam sâm bò 25

3.1.1.1 Một số chỉ tiêu về đất 25

3.1.1.2 Một số chỉ tiêu về khí hậu 25

3.1.2 Mô tả hình thái Nam sâm bò thu nhận tại huyện Cần Giờ 26

3.1.3 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết ethanol Nam sâm bò29 3.1.3.1 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol lá 29

3.1.3.2 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol thân 31

3.1.3.3 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol rễ 32

3.1.4 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết chloroform Nam sâm bò 33

3.1.4.1 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chloroform lá 34

3.1.4.2 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chloroform thân 35

3.1.4.3 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chloroform rễ 38

3.1.5 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của nước sắc Nam sâm bò 40

3.1.5.1 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của nước sắc lá 40

3.1.5.2 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của nước sắc thân 42

3.1.5.3 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của nước sắc rễ 43

3.2 Thảo luận 44

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 51

PH Ụ LỤC

ROS Reactive Oxygen Species Các gốc oxy hoạt động

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1 1 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 14

Hình 1 2 Phương pháp chiết ngấm kiệt 15

Hình 1.3 Phương pháp chiết ngâm dần 16

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thu nhận cao chiết Nam sâm bò 20

Hình 2.2 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH 21

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trong phương pháp bắt gốc tự do DPPH 22

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 24

Hình 3.1 Nam sâm bò ngoài tự nhiên 26

Hình 3.2 Lá Nam sâm bò 27

Hình 3.3 Rễ Nam sâm bò 27

Hình 3.4 Hoa Nam sâm bò 28

Hình 3.5 Quả Nam sâm bò 28

Hình 3.6 Biểu đồ cột thể hiện giá trị IC50 của cao lá Nam sâm bò 35

Hình 3.7 Biểu đồ cột thể hiện giá trị IC50 của cao thân Nam sâm bò 37

Hình 3.8 Biểu đồ cột thể hiện giá trị IC50 của cao rễ Nam sâm bò 39

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bố trí nghiệm thức khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa 22

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu về đất 25

Bảng 3.2 Tỷ lệ %HTKO của cao chiết ethanol lá 30

Bảng 3.3 Tỷ lệ %HTKO của cao chiết ethanol thân 31

Bảng 3.4 Tỷ lệ %HTKO của cao chiết ethanol rễ 32

Bảng 3.5 Giá trị IC50 của các cao chiết ethanol 33

Bảng 3.6 Tỷ lệ %HTKO của cao chiết chloroform lá 34

Bảng 3.7 Tỷ lệ %HTKO của cao chiết chloroform thân 36

Bảng 3.8 Tỷ lệ %HTKO của cao chiết chloroform rễ 38

Bảng 3.9 Giá trị IC50 của các cao chiết chloroform 40

Bảng 3.10 Tỷ lệ %HTKO của nước sắc lá 41

Bảng 3.11 Tỷ lệ %HTKO của nước sắc thân 42

Bảng 3.12 Tỷ lệ %HTKO của nước sắc rễ 43

Bảng 3.13 Giá trị IC50 của các nước sắc 44

M Ở ĐẦU

1 Tính c ấp thiết của đề tài

Chi Boerhavia có hơn 40 loài, trong đó, Nam sâm bò (Boerhavia diffusa L.) là

loài rất phổ biến, mọc hoang nhiều nơi, có thể có chủng dưới loài [17] Nam sâm bò

là cây thân thảo, phân bố ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nơi có khí hậu ấm áp như: Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia Ở Việt Nam, Nam sâm bò phân bố ở

một số vùng đất cát như Quảng Ninh, Bình Thuận, thành phố Hồ Chí Minh,

Ở Ấn Độ, Brazil, Nam sâm bò thường được sử dụng trong Y học cổ truyền để

trị nhiều loại bệnh trong đó có tiểu đường và ung thư [12, 17] Theo Y học cổ truyền

Việt Nam, Nam sâm bò được dùng để chữa hen suyễn, đau dạ dày, phù thũng, thiếu máu, vàng da, gan cổ trướng, phù, tiểu ít, táo bón thường xuyên, các bệnh về

lá lách, viêm nhiễm bên trong Rễ có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, trị long đờm, loét giác mạc, quáng gà Lá Nam sâm bò có tác dụng trị hen suyễn [1]

Một số công trình ngoài nước đã chứng minh Nam sâm bò thu nhận tại Ấn Độ

chứa một lượng lớn các hợp chất như flavonoid, alkaloid, steroid, triterpenoid, lipid, lignin, carbohydrate, protein, glycoprotein, punarnavine, boeravinone, trong đó,

một số chất đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như: kháng oxy hóa, chống sự di căn của tế bào ung thư, điều hòa và hỗ trợ miễn dịch, có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên nó có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá Do đó, chúng có tiềm năng trong việc điều chế các loại thuốc chữa trị các bệnh liên quan tới gốc tự do, bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu, lão hoá, thoái hoá gan, các tổn thương do bức xạ [8, 12, 15, 17, 19]

Công trình nghiên cứu của Đỗ Thị Mỹ Liên (2014) đã tiến hành khảo sát thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài thuộc chi Boerhavia, họ Bông phấn

Kết quả đã phân lập được 55 hợp chất, trong đó có 16 hợp chất mới Kết quả sàng

lọc hoạt tính ức chế các tế bào ung thư cho thấy các hợp chất boeravinone thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư cổ tử cung Hela [5]

Tuy nhiên, ở Việt Nam, các bằng chứng khoa học về loài dược liệu này còn chưa sáng tỏ

Trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, bên cạnh sự phát triển mạnh

mẽ của kinh tế - xã hội, con người phải đối mặt với nhiều bệnh tật có nguy cơ tiềm

ẩn từ môi trường Một trong những tác nhân gây ra các bệnh tật là các gốc oxy hoạt động (Reactive oxygen species: ROS) Các ROS này có thể là sản phẩm của quá trình sinh hóa trong tế bào; kết quả của quá trình tác động của các tác nhân vật lí, hóa học, ô nhiễm môi trường, viêm

Ở một nồng độ cao, các gốc tự do có khả năng tấn công các đại phân tử như DNA, protein, lipid, Từ đó, chúng hủy hoại tế bào bằng cách oxy hóa màng tế bào, gây cản trở trong việc thải chất cặn bã và tiếp nhận thực phẩm, sau đó, chúng sẽ tấn công các ty thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, gốc tự do sẽ làm suy

yếu các kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được Một số gốc tự

do phổ biến như: superoxid (O2 ●), hydroxyl (OH●), hydroperoxid (HOO●), peroxid

(ROO●), oxid nitric (NO●),…[16]

Bên cạnh đó, trong hóa trị liệu ung thư, các nhà khoa học đã chứng minh mối quan hệ chặt chẽ giữa hiện tượng kháng thuốc và nồng các gốc oxy hóa bên trong tế bào Từ đó, nó đã mở ra một hướng ứng dụng mới trong điều trị lâm sàng ung thư

nhằm hạn chế khả năng kháng thuốc và tăng cường sức đề kháng cho bệnh nhân ung thư

Trong cơ thể, tế bào có các enzyme tham gia các phản ứng chuyển hóa các ROS này Bên cạnh đó, các hợp chất có hoạt tính kháng oxi hóa có khả năng tương tác và vô hiệu hóa các ROS Một số chất kháng oxy hóa như: vitamine E, omega (ω)-3, N-acetyl-cysteine, bardoxolone, Hiện nay, nhu cầu của con người trong vấn

đề bảo vệ sức khỏe và chăm sóc sắc đẹp ngày càng tăng cao Vì vậy, ngoài các chất kháng oxy hóa nội sinh, con người có thể bổ sung thêm các chất kháng oxy hóa từ tự nhiên Trong đó, việc nghiên cứu các hoạt chất có khả năng ức chế gốc tự do từ tự nhiên đang là vấn đề thu hút được sự quan tâm chú ý của các nhà khoa học

Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học bao gồm một số đặc

điểm hình thái và khả năng kháng oxi hóa in vitro của Nam sâm bò ở khu vực Cần

Giờ - Tp HCM để cung cấp những dẫn liệu cho các nghiên cứu về sau và ứng dụng trong lĩnh vực y học

2 M ục tiêu nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa in vitro của Nam sâm bò thu nhận ở

huyện Cần Giờ (Tp HCM)

3 N ội dung nghiên cứu

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết ethanol và chloroform

của Nam sâm bò

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của nước sắc Nam sâm bò

4 Cách ti ếp cận của đề tài

Các gốc tự do có nguồn gốc từ oxy kém bền vững, năng lượng cao có khả năng

phản ứng với những đại phân tử trong tế bào như lipid, protein, DNA,… bằng cách cho điện tử; từ đó, gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Trong tự nhiên,

có rất nhiều hợp chất có khả năng tương tác và vô hiệu hóa các gốc tự do này gọi là các chất kháng oxy hóa

Một số phương pháp được sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa như: phương pháp bắt gốc tự do DPPH, năng lực khử, thử hoạt tính ức chế gốc tự do

NO, xác định hàm lượng Malonyl dialdehyde, đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt

II, thử hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase Mỗi phương pháp hướng tới các

gốc tự do khác nhau trong tế bào, vì vậy, để khảo sát đầy đủ khả năng kháng oxy hóa của một hợp chất, người ta thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau Trong đó, phương pháp bắt gốc tự do DPPH được sử dụng rất hữu hiệu, phổ biến

nhất vì nó cho kết quả tin cậy, nhanh chóng và ổn định

Với giới hạn của đề tài và điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử

dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH để khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết và nước sắc Nam sâm bò

DPPH (2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl) là một gốc tự do bền vững có màu tím, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH hấp thu cực đại

tại bước sóng 517 nm và tạo ra sản phẩm khử là 2,2-diphenyl-1-picylhydrazine (DPPH-H) màu vàng cam

Phương pháp này ban đầu được nêu ra bởi Blois (1958) sau đó được phát triển

bởi nhiều nhà khoa học khác (Brand – Williams – 1995; Kim – 2002; Zhu – 2002)

Về nguyên tắc, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sáng màu vàng nhạt [10]

5 Ph ạm vi nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của nước sắc, cao chiết ethanol, cao chloroform (thân, lá, rễ) Nam sâm bò bằng phương pháp bắt các gốc tự do DPPH

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hi ện tượng oxy hóa và kháng oxy hóa

1.1.1 Hi ện tượng oxy hóa trong tế bào

Oxy đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình hô hấp tế bào Nó là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi electron hô hấp trên màng ty thể Cụ thể, chuỗi truyền điện tử bao gồm các phản ứng oxy hóa – khử, trong đó những chất cho điện tử được

gọi là chất khử (NADH, FADH2), những chất nhận điện tử gọi là chất oxy hóa

(NAD+, FAD, O2).

Chính vì vậy, quá trình phản ứng oxy hóa – khử sẽ hình thành nên các gốc oxy

hoạt động - ROS Các gốc ROS là những gốc thiếu một electron ở lớp ngoài cùng nên dễ nhận điện tử từ những phân tử khác Một số gốc ROS phổ biến trong tế bào như: hydroxyl (OH●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●),

lipoperoxyde (LOO●), H2O2.

Ở một nồng độ nhất định, các gốc ROS đóng vai trò cung cấp năng lượng cho

cơ thể, kích thích sự tổng hợp sắc tố melamine, sản xuất prostaglandin (là chất có vai trò ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch, tạo thuận lợi cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh và co bóp cơ)

Tuy nhiên, ở nồng độ cao, các gốc ROS có khả năng gây hại cho tế bào và cơ

thể Vì gốc ROS là những phân tử hay nguyên tử bị mất đi một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng nên các gốc ROS không ổn định và có xu hướng chiếm đoạt điện tử từ các cấu trúc lân cận Quá trình đó tạo ra hàng loạt các gốc ROS mới Các gốc ROS

có khả năng tấn công vào các phân tử DNA Từ đó, nó có khả năng gây đứt gãy chuỗi đơn, chuỗi đôi của phân tử DNA và dẫn đến đột biến gen, gây rối loạn quá trình truyền đạt và biểu hiện thông tin di truyền Ngoài ra, các gốc ROS có khả năng

tấn công vào các phân tử protein và gây oxy hóa màng tế bào Kết quả là quá trình

vận chuyển các chất qua màng tế bào và quá trình hô hấp tế bào bị rối loạn Chính vì

vậy, nếu các gốc ROS không được kiểm soát ở một nồng độ nhất định thì nó sẽ dẫn

đến quá trình lão hóa và các bệnh tật như: xơ vữa động mạch, suy yếu hệ thống miễn

dịch, giảm trí tuệ, tiểu đường, ung thư,…[16]

Theo một số công trình nghiên cứu cho thấy, nồng độ các gốc ROS phụ thuộc vào yếu tố bên trong và bên ngoài cơ thể Các gốc ROS tăng cao khi cơ thể mắc

bệnh, căng thẳng hoặc môi trường bị ô nhiễm, tia UV, thuốc lá, [8]

Tuy nhiên, tế bào có cơ chế tự điều chỉnh để cân bằng lại các gốc ROS Những

chất có khả năng chống lại các gốc ROS gọi là các chất kháng oxy hóa (Antioxidant)

1.1.2 Hi ện tượng kháng oxy hóa trong tế bào

Chất kháng oxy hoá được chia thành 2 loại: Các chất kháng oxy hoá có bản

chất enzyme và các chất kháng oxy hoá không có bản chất enzyme (hình 1.1)

Trong tế bào, một số loại enzyme có khả năng xúc tác cho các phản ứng bắt các gốc ROS tạo thành những sản phẩm không độc hại cho cơ thể Chúng bao gồm các enzyme: Superoxid dismutase, catalase, peroxidase [16]

Superoxid dismutase là enzyme xúc tác cho phản ứng trung hòa gốc anion dioxide (O2•), theo sơ đồ như sau:

2 O2• + 2H+ → H2O2 + O2 Catalase là enzyme xúc tác cho phản ứng phân huỷ H2O2 tạo thành H2O và O2 theo sơ đồ như sau: H2O2 → H2O + O2

Peroxidase là một nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử, chuyển phân tử H2O2 thành một chất không có khả năng oxy hóa và H2O:

AH2 + H2O2 → A + 2 H2O (AH2 là cơ chất hữu cơ) Ngoài ra, tế bào còn có các enzyme khác xúc tác cho các phản ứng oxy hóa –

khử như glutathion reductase, gluthion peroxidase

Bên cạnh đó, các chất kháng oxy hóa không có bản chất là enzyme như vitamine A, vitamine E, bioflavoid, coenzyme Q, glutathione, N-acetyl cystein, cũng có khả năng tham gia vào quá trình ngăn chặn các gốc ROS

Vitamine E ngăn cản quá trình oxy hóa các acid béo chưa bão hòa của màng tế bào bằng cách liên kết với phần hydrocarbon và dập tắt những phản ứng dây chuyền, ngăn chặn quá trình tạo ra những gốc tự do mới theo phản ứng sau:

R•(ROO•) + Vitamine E → RH(ROOH) + Vitamine E•

R•(ROO•) + Vitamine E• →RH(ROOH) + Tocopherol quinon

(RH là các acid béo chưa bão hòa) Trong quá trình này, vitamine E tạo thành tocopherol quinon – là chất không

có khả năng gây độc cho tế bào Vì vậy, vitamine E có tác dụng loại bỏ các gốc tự

do trong cơ thể giúp duy trì độ bền và sự nguyên vẹn của màng tế bào và DNA Các flavonoid được cấu tạo bởi các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzen Chúng có khả năng tham gia vào các phản ứng chuyển các gốc ROS thành những chất mới bền vững hơn Những chất này không có khả năng tham gia vào phản ứng oxy hóa – khử, vì vậy flavonoid giúp ngăn chặn sự hình thành các

gốc ROS mới trong tế bào

Vitamine C có khả năng kháng oxy hóa theo cơ chế như sau:

Vitamine E-O• + Vitamine Ckhử→ Vitamine E-OH + Vitamine Coxy hoá

Trong quá trình khử các gốc tự do, vitamine C có khả năng phục hồi vitamine

E ở trạng thái oxy hóa thành vitamine E ở trạng thái khử

Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, vitamine C còn có khả năng loại bỏ các gốc hydrogen peroxide, superoxide (O2•), hydroxyl (•OH) Vì vậy, vitamine C giúp tăng cường sức đề kháng cho cơ thể chống lại nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch, viêm nhiễm,

Một số hợp chất như glutathione, mercaptopropionyl glyxin, N-acetyl cystein

có tính khử mạnh, có khả năng trung hoà gốc tự do như •OH tạo ra gốc thiyl theo phản ứng sau:

R-SH + HO•→ RS•

+ H2O Các gốc thiyl (RS• ) có thể kết hợp với chính nó để tạo thành phức hợp chất disulfur (RS-SR) hoặc trung hoà một gốc oxy hoá khác theo phản ứng sau:

RS• + O2 → RSO2•

Các nghiên cứu gần đây cho thấy những chất có khả năng kháng oxy hóa như vitamine C, vitamine E có nhiều trong các loại rau quả, thảo dược Vì vậy,

để ngăn chặn quá trình lão hóa và bệnh tật, các nhà khoa học không ngừng tìm tòi

và sàng lọc các chất có khả năng kháng oxy hóa từ tự nhiên

1.2 Gi ới thiệu về Nam sâm bò

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái Nam sâm bò

Nam sâm bò là cây thân thảo, mọc toả ra sát mặt đất Rễ củ, hình thoi Thân hình trụ, phân cành ở các lóng trên, có màu xanh đến tím Lá mọc đối, dày, có hình

bầu dục hoặc hình thon, không có lông hoặc có lông thưa, gân lộ rõ, mép lượn sóng,

mặt dưới có nhiều lông màu trắng lục, mặt trên nhẵn có màu lục thẫm, dài 2 – 4 cm,

rộng 0,15 – 0,3 cm Cuống lá dài 1 – 1,5 cm có phủ lông ngắn

Phát hoa tận cùng và cụm hoa hình xim mang 3 hoa không cuống mọc ở nách

lá hay đầu cành Các nhánh hoa có nhiều lông tròn dính Hoa lưỡng tính, màu đỏ tía,

có 1 – 2 nhị Quả hình trụ dài 0,3 cm, phồng ở đầu, có 5 cạnh, có lông dính [4]

1.2.2.2 Đặc điểm sinh thái Nam sâm bò

Nam sâm bò phân bố ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nơi có khí hậu ấm áp Trên thế giới, Nam sâm bò phân bố ở một số nước như: Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia và các nước nhiệt đới khác Ở Việt Nam, Nam sâm bò mọc hoang nhiều nơi, phân bố ở một số vùng đất cát như Quảng Ninh, Bình Thuận, thành phố Hồ Chí Minh, [4]

1.2.3 Các công trình nghiên c ứu về Nam sâm bò

1.2.3.1 Ở Việt Nam

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự, Nam sâm bò được dùng để chữa hen suyễn, đau dạ dày, phù thũng, thiếu máu, vàng da, gan cổ trướng, phù toàn cây, tiểu ít, táo bón thường xuyên, các bệnh về lá lách, viêm nhiễm bên trong Rễ có tác dụng lợi

tiểu, nhuận tràng, trị long đờm, loét giác mạc, quáng gà Lá Nam sâm bò có tác

1.2.3.2 Trên th ế giới

Năm 2009, Manu, A G., Kuttan, G đã nghiên cứu sự chết theo chương trình

của tế bào ung thư ác tính B16F-10 dưới tác dụng của hợp chất alkaloid thu nhận từ Nam sâm bò (Ấn Độ) Kết quả cho thấy hợp chất punarnavine có khả năng ức chế

nhân tố phiên mã phụ thuộc nhân (NF-kB) [18] Từ đó, nghiên cứu cho thấy Nam sâm bò có tiềm năng kháng ung thư

Năm 2010, Srivastava, R và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư cổ tử cung của cao ethanol rễ Nam sâm bò Kết quả cho thấy cao chiết ethanol từ rễ có khả năng chống lại sự tăng sinh của các tế bào Hela

bằng cách ức chế sự tổng hợp DNA ở pha S trong chu kỳ tế bào [22]

Năm 2010, các cao chiết (ethyl acetate, ethanol và chloroform) thu nhận từ rễ Nam sâm bò (ở Ấn Độ) được khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH bởi Gopal, T K và cộng sự Kết quả cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate và cao chloroform thấp hơn cao ethanol Giá trị IC50 (là nồng độ cao chiết mà tại đó nó có khả năng bắt 50% gốc tự do DPPH) của cao chiết ethanol từ rễ là 134 µg/ml [11]

Cao chiết ethanol từ lá Nam sâm bò (ở Nigeria) đã thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp thử năng lực khử và phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ 1000 µg/ml, cao chiết ethanol có khả năng bắt 78,32 ± 2,41% gốc tự do DPPH Theo phương pháp thử năng lực khử, kết quả cho thấy cao chiết ở nồng độ 1000 µg/ml cho giá trị mật độ quang là 0,65 ± 0,02 (Tollulope O M và cộng sự, 2010) [23]

Năm 2011, nghiên cứu của Guha, G và cộng sự đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các chiết xuất khác nhau từ lá Nam sâm bò (ở Ấn Độ) bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy giá trị IC50 của các mẫu cao chiết là: cao nước (200,82 ± 0,55 µg/ml, cao methanol (327,40 ± 0,68 µg/ml), cao chloroform (409,81 ± 0,62 µg/ml), cao hexane (2351,60 ± 0,18 µg/ml) [13] Thông qua giá trị IC50, cao nước và methanol có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với cao chloroform và hexane Với kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả trên, Nam sâm

bò thể hiện khả năng bắt gốc tự do mạnh ở những dung môi có tính phân cực

Năm 2012, Apu, S A và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của cao chiết methanol, hexane, ethyl acetate từ Nam sâm bò (ở Bangladesh) theo

phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy cao chiết methanol (IC50 = 8,18 µg/ml) cho khả năng kháng oxy hóa cao hơn cao chiết hexane (IC50 = 40,61 µg/ml)

và ethyl acetate (IC50 = 43,81 µg/ml) [7] Tương tự như trên, thông qua giá trị IC50,

kết quả nghiên cứu này cũng đã chứng minh cho thấy các cao chiết có tính phân cực (methanol) thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH tốt hơn so với các dung môi có tính phân cực yếu (hexane, ethyl acetate)

Các công trình nghiên cứu cho thấy một số các hợp chất như flavonoid, alkaloid, steroid, triterpenoid, lipid, lignin, carbohydrate, protein và glycoprotein Các hợp chất punarnavine, boeravinone, hypoxanthine 9-L-arabinofuranoside, acid ursolic, punarnavoside, lirodendrin, acid arachidic, β-Sitosterol, α-2-sitosterol, acid palmitic, β-sitosterol, acid stearic, hentriacontane, triacontanol,… được thu nhận từ Nam sâm bò đều thể hiện nhiều hoạt tính sinh học Các hợp chất flavonoid đã được

chứng minh là những chất kháng oxy hóa, có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá Do đó, các

hợp chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến

mạch, lão hoá, thoái hoá gan, các tổn thương do bức xạ Bên cạnh đó, một số hợp

chất flavonoid đã được phân lập từ Nam sâm bò (ở Ấn Độ) là boeravinone A, B, C,

D, E, F, G,… đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa Đặc biệt, boeravinone G được

chứng minh có hoạt tính kháng oxy hoá mạnh, có tiềm năng trong việc điều chế các

loại thuốc chữa trị các bệnh liên quan tới gốc tự do Một số hợp chất phenolic được phân lập từ Nam sâm bò là eupalitin 3-o-galactoside, quercetin và kaempferol Trong đó, quercetin được chứng minh có khả năng kháng virus, kháng khuẩn, kháng ung thư và kháng viêm Quercetin làm gia tăng sự chết của các tế bào, ức chế sự

tổng hợp DNA, ức chế sự tăng trưởng tế bào và biến đổi con đường truyền tín hiệu ở các tế bào bị đột biến Từ đó cho thấy, quercetin có tiềm năng kháng ung thư Các

hợp chất alkaloid (punarnavine, hypoxanthine 9-L-arabinofuranoside,…) trong Nam sâm bò cũng có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Một trong những hợp chất alkaloid được chiết xuất từ Nam sâm bò là punarnavine (C17H22N2O) được chứng minh có khả năng chống lại sự di căn của các tế bào ung thư, điều hòa miễn dịch,

chống viêm, giảm đau, Rễ Nam sâm bò có chứa 0,04% hợp chất này [8, 12, 17, 18,

19, 22]

Năm 2014, Sharma, P., Bhardwaj, R., Yadav, A và Sharma, A R đã nghiên

cứu khả năng kháng oxy hóa của cao chiết methanol từ các bộ phận cây Nam sâm

bò bằng phương pháp năng lực khử Kết quả cho thấy, hoạt tính kháng oxy hóa cao

Từ các công trình nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy Nam sâm bò thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa Tuy nhiên, với các dẫn

liệu trên, các công trình nghiên cứu trong nước về dược tính sinh học của loài này còn hạn chế Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cây Nam sâm bò ở huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh với mục tiêu cung cấp các

cơ sở khoa học cho các ứng dụng trong y học cũng như các nghiên cứu sâu hơn

1.3 Đặc điểm tự nhiên của thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần Giờ

1.3.1 V ị trí địa lý

Thị trấn Cần Thạnh cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh 57 km, cách Đặc khu Vũng Tàu - Côn Đảo 15 km theo đường biển Phần đất liền tiếp giáp biển Đông

- Tọa độ: 10°24'43"B 106°56'47"Đ

- Phía Bắc giáp xã Thạnh An – huyện Cần Giờ

- Phía Nam và phía Đông giáp Biển Đông

- Phía Tây giáp xã Long Hòa – huyện Cần Giờ

1.3 2 Địa hình – Đất đai

Đất ở thị trấn Cần Thạnh gồm hai loại phổ biến là đất cát và đất phèn mặn

Độ cao trung bình trên dưới 1 m; thấp nhất 0,5 m so với mực nước biển Nhìn chung, địa hình Cần Thạnh chủ yếu là giồng cát và đồng trũng, bờ biển thoải, bằng phẳng, nhiều phù sa

Đất phèn mặn là nhóm đất có diện tích lớn nhất Theo độ mặn và thời gian ngập mặn, nhóm đất mặn chia làm hai loại: đất phèn mặn theo mùa và đất phèn mặn thường xuyên Tuy nhiên, về mùa mưa, nước mặn được pha loãng trong thời gian dài từ 4 đến 5 tháng; đồng thời đất có lớp phù sa non mịn nên các loài cây ngập mặn phát triển mạnh, có tác dụng giữ bờ, lấn biển, bảo vệ môi trường cảnh quan, phục vụ phát triển du lịch sinh thái và nuôi dưỡng hệ sinh thái giàu tiềm năng ở vùng ven

biển phiá Đông – Nam của thành phố [24]

1.3 3 Khí hậu

Thị trấn Cần Thạnh nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa cận xích đạo và cận

duyên hải Đặc điểm chung của khí hậu – thời tiết là nhiệt độ cao đều trong năm,

có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô Mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau [24]

1.4 Các p hương pháp chiết xuất hợp chất sinh học từ thực vật

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phương pháp chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao ethanol thô

hoặc dịch chiết ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên

tắc là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt các chất phân cực trung bình, dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các chất phân cực mạnh

Hình 1.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phương pháp chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó, cao ethanol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước Các dung môi hữu cơ (không hòa tan với nước) được sử dụng lần lượt để chiết các hợp chất có tính phân cực khác nhau từ pha nước Tùy vào tỉ trọng giữa các dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở

lớp trên hoặc dưới so với pha nước (hình 1.1)

Việc chiết được thực hiện với dung môi kém phân cực (ete dầu hỏa hoặc hexane) trước, sau đó lần lượt đến các dung môi phân cực mạnh như: chloroform, ethyl acetate, buthanol,… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung

dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm mất nước với các chất như: Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, tiến hành đuổi dung môi ta thu được cao chiết [6]

1.4 2 Phương pháp chiết rắn – lỏng

Phương pháp chiết rắn – lỏng bao gồm 2 phương pháp là: chiết ngấm kiệt và ngâm dầm

1.4 2.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt

Phương pháp này sử dụng một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điểu chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra Một bình chứa bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cùng của bình ngấm kiệt là bình lóng chứa dung môi tinh khiết (hình 1.2) [6]

Dung môi trong bình lóng chảy từ từ xuống lớp bột cây chứa trong bình

ngấm kiệt Các chất tự nhiên có trong bột cây sẽ hòa tan vào dung môi và theo dung môi chảy xuống bình chứa bên dưới

Hình 1.2 Phương pháp chiết ngấm kiệt

1.4.2.2 Phương pháp chiết ngâm dầm

Phương pháp chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ phương pháp chiết ngấm

kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với lượng lớn mẫu cây

Bột cây được ngâm trong bình thủy tinh có nắp đậy, tránh sử dụng bình bằng

nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất chứa trong cây Dung môi tinh khiết được rót vào bình, giữ yên ở nhiệt độ phòng để cho

dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dịch chiết sẽ được lọc qua giấy lọc, cô quay đuổi dung môi sẽ thu được cao chiết Các bước trên được tiến hành cho đến khi chiết kiệt mẫu cây (hình 1.3)

Thời gian ngâm bột cây với dung môi khoảng 48 giờ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi tới mức bão hòa [6]

Hình 1.3 Phương pháp chiết ngâm dầm

Trong nghiên cứu này, với điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm để thu nhận các cao chiết ethanol và cao chloroform

từ Nam sâm bò

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 V ật liệu nghiên cứu

Nam sâm bò (thân, lá, rễ) được thu nhận tại thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần

Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thu mẫu vào tháng 9 năm 2014 Nam sâm

bò được định danh theo “Cây cỏ Việt Nam” (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [4]

Mẫu được bảo quản tại phòng thí nghiệm Di truyền – Thực vật, trường Đại học

Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Hóa ch ất

 Hóa ch ất sử dụng trong phương pháp thu nhận cao chiết:

- Ethanol tuyệt đối (xuất xứ Trung Quốc)

- Chloroform tuyệt đối (xuất xứ Trung Quốc)

 Hóa chất sử dụng trong phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH:

Acid ascorbic (15 μg/ml, Sigma): Nồng độ 15 μg/ml là giá trị IC50 của acid ascorbic được khảo sát tại điều kiện của phòng thí nghiệm Giá trị IC50 là nồng độ mà

tại đó acid ascorbic bắt 50% gốc DPPH

Cách pha: Cân 0,001 g acid ascorbic, bổ sung 1 ml nước cất hai lần thu được dung dịch có nồng độ 1000 μg/ml (dung dịch gốc) Sau đó, pha loãng dung dịch acid arcosbic có nồng độ 1000 μg/ml thành dung dịch có nồng độ 15 μg/ml bằng nước

cất hai lần theo công thức sau:

C1 x V1 = C2 x V2 Trong đó: C1: nồng độ dung dịch ban đầu (1000 μg/ml)

C2: nồng độ dung dịch sau (15 μg/ml)

V1: thể tích dung dịch tại nồng độ 1000 μg/ml cần để pha loãng

V2: thể tích dung dịch tại nồng độ 15 μg/ml cần cho nghiệm thức nghiên cứu trong đề tài

Dung dịch gốc được bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng, ở 40

C Các dung dịch có nồng độ khảo sát trong nghiệm thức được pha loãng trước khi tiến hành thí nghiệm

DPPH (80 μM, Sigma): Pha 3,3 mg DPPH trong methanol tuyệt đối tạo thành 100

ml dung dịch có nồng độ 80 μM Dung dịch được bảo quản ở 40C trong điều kiện không có ánh sáng Dung dịch DPPH được pha loãng trước khi tiến hành thí nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu đất

Phương pháp lấy mẫu đất và xử lý được thực hiện theo tác giả Đoàn Văn Cung

và cộng sự, 1998 [2]

Mẫu đất được lấy ở tầng 0 – 30 cm và tầng 30 – 60 cm tại địa điểm thu mẫu để xác định pH, độ ẩm và hệ số khô kiệt Lấy đất ở 5 điểm phân bố khác nhau, trộn thành hỗn hợp chung có khối lượng 2 kg Đất sau khi thu về được để khô tự nhiên

tại nhiệt độ phòng, loại bỏ rác Mẫu đất được nghiền nhỏ và được xác định các chỉ tiêu pH, độ ẩm và hệ số khô kiệt

2.3.2 Phương pháp khảo sát một số điều kiện tự nhiên

2.3.2.1 Phương pháp xác định độ pH đất

Phương pháp xác định pH đất, độ ẩm đất, độ khô kiệt được thực hiện theo tác

giả Đoàn Văn Cung và cộng sự, 1998

Lấy 20 g mẫu đất cho vào bình có dung tích 100 ml Bổ sung thêm 50 ml nước

cất vào bình Huyền phù đất 4 – 5 lần và tiếp tục huyền phù trên máy lắc 30 phút (150 vòng/phút) Sau khi huyền phù, để lắng khoảng 2 giờ Huyền phù lại bằng tay

2 – 3 lần pH đất được đo bằng pH kế điện cực thủy tinh Vị trí bầu điện cực ở vị trí trung tâm và trung điểm độ sâu của dung dịch trong huyền phù Đọc chỉ số sau khi kim chỉ ổn định 30 giây

2.3.2.2 Phương pháp xác định hệ số khô kiệt và độ ẩm đất

Lấy 5 g mẫu đất cho vào đĩa Petri và sấy ở nhiệt độ 100 – 105oC trong 4 giờ

Để nguội trong bình hút ẩm cho đến khi nhiệt độ mẫu đất bằng nhiệt độ phòng Cân

khối lượng lần thứ nhất Tiếp tục sấy ở 100 – 1050

C trong 2 giờ Để nguội trong bình hút ẩm cho đến khi nhiệt độ mẫu đất bằng với nhiệt độ phòng Cân khối lượng

lần thứ 2 Tiếp tục lặp lại các bước như trên cho đến khi khối lượng lần cân sau

không thay đổi hoặc thay đổi không quá 0,001 g so với lần trước thì dừng lại [2]

- Độ ẩm đất được tính theo công thức như sau:

𝐴𝐴% = 𝑃𝑃𝑃𝑃1− 𝑃𝑃2

2− 𝑃𝑃3× 100 Trong đó: P1: Khối lượng đĩa Petri có đất trước khi sấy (g)

P2: Khối lượng đĩa Petri có đất sau khi sấy (g)

P3: Khối lượng đĩa Petri không có đất (g)

- Hệ số khô kiệt được tính theo công thức như sau:

𝐾𝐾 = 100 + 𝐴𝐴100Trong đó: A: Độ ẩm đất

2.3.2.3 Phương pháp xác định nhiệt độ, độ ẩm và cường độ ánh sáng

Tại vị trí thu mẫu, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu: nhiệt độ và độ ẩm không khí được đo bằng ẩm kế (Extech, Mỹ) cường độ ánh sáng được đo bằng lux kế (Tenmars, Đài Loan), định vị (Garmin, Thụy Sỹ)

2.3.3 Phương pháp thu mẫu, chế biến và bảo quản mẫu

Nam sâm bò (thân, lá, rễ) được thu cả cây tại huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thu mẫu vào tháng 9 năm 2014

Nam sâm bò được rửa sạch, phân loại các bộ phận và thân cắt nhỏ Sau đó,

mẫu đem sấy khô ở 500C cho đến khi trọng lượng không đổi

Sau đó, mẫu sẽ được xay thành bột mịn giữ ở nơi thoáng mát để làm cao chiết

Mẫu thu nhận nước sắc giữ nguyên, bảo quản trong điều kiện thoáng mát tại phòng thí nghiệm Di truyền - Thực vật

2.3.4 Phương pháp thu nhận nước sắc

Nước sắc được thu nhận theo phương pháp của Hồ Huỳnh Thùy Dương

(2003) Quy trình thu nhận nước sắc như sau: 10 g mẫu khô được bổ sung khoảng

500 ml nước cất hai lần, tiến hành nấu trong thời gian ba giờ ở nhiệt độ 70 - 800

C Nước sắc thu nhận được được cô trên bể ổn nhiệt, ở nhiệt độ 50 - 600C cho đến khi

thể tích thu nhận được đạt tỉ lệ tương ứng với khối lượng ban đầu là 1: 1 (w/v; g/l)

.3.5 Phương pháp thu nhận cao chiết

Các cao chiết (ethanol, chloroform) được thu nhận theo phương pháp chiết ngâm dầm của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Sơ đồ thu nhận cao chiết được minh

họa theo hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thu nhận cao chiết Nam sâm bò

Mẫu bột Nam sâm bò (thân, lá rễ)

Ngâm trong dung môi ethanol tuyệt

đối theo tỉ lệ 1 : 10 (w/v; g/l)

Ngâm trong dung môi chloroform tuyệt đối theo tỉ lệ 1 : 10 (w/v; g/l)

Thu nhận dịch chiết qua lọc Thu nhận dịch chiết qua lọc

Cô quay đuổi dung môi Cô quay đuổi dung môi

Sau 48 giờ

Cao chiết ethanol

Cao chiết chloroform

Sau 48 giờ

Bảo quản 40

C

2.3.6 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết và nước sắc Nam sâm bò được

khảo sát theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH của Brand Williams, 1995

Năm 1922, Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra gốc tự do DPPH diphenyl-1-picylhydrazyl) có màu tím đậm, bền, hầu như không bắt và không phản ứng với oxy, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có

(2,2-độ hấp thu cực đại tại bước sóng 517 nm Khi tham gia vào phản ứng oxy hóa – khử

sẽ tạo ra sản phẩm là 2,2-diphenyl-1-picylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng cam [10] Ngày nay DPPH được dùng để khảo sát khả năng bắt gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu, được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và có độ tin cậy cao

Nguyên t ắc:

Các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho H+

, làm giảm

độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển

từ màu tím sang màu vàng nhạt (theo hình 2.3)

IC50 được xác định Hợp chất nào có giá trị IC50 càng thấp, hoạt tính kháng oxy hóa càng cao

Quy trình bắt gốc tự do DPPH được thực hiện theo hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trong phương

ODc: giá trị mật độ quang OD của chứng âm

Các nghiệm thức khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa được bố trí như sau:

B ảng 2.1 Bố trí nghiệm thức khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Nước cất hai lần Acid ascorbic 15 μg/ml

Cao ethanol, cao chloroform được pha loãng tạo thành dãy nồng độ 100 -

1000 μg/ml Nước sắc được pha loãng từ nồng độ 100% xuống 0%

1 ml cao chiết ở các nồng độ khảo sát

Bổ sung 5 ml DPPH pha trong methanol

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm

Ủ 30 phút Tránh sáng

2.3.7 Phương pháp xử lý thống kê

Các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn giữa các lần lặp lại trong thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsoft office excel 2010

Kết quả thí nghiệm sẽ được phân tích thống kê ANOVA để so sánh sự khác

biệt giữa các nghiệm thức; phương trình hồi quy giữa nồng độ và tỷ lệ %HTKO được xây dựng bằng phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 16.0

Theo đó, một số phương trình phổ biến như:

Trong đó: Y: tỉ lệ % HTKO (hoạt tính bắt gốc tự do DPPH)

X: nồng độ cao chiết; b0 : hằng số; b1, b2, b3: các hệ số hồi quy Phương trình hội quy được chọn là phương trình có hệ số tương quan và tương quan hiệu chỉnh cao (phản ánh sự biến thiên của tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH được giải thích bởi nồng độ cao chiết); với độ tin cậy 95% thì P- value - giá

trị Sig của phương trình và các tham số thường ≤ 0,05 là có ý nghĩa

2.4 Quy trình thí nghi ệm

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Kh ảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Kh ảo sát điều kiện sinh thái, mô t ả hình thái

Thu m ẫu, xử lỹ

m ẫu Nam sâm bò

Thu nh ận nước sắc Thu nh ận cao chiết

Điều kiện sinh thái

Mô t ả hình thái

Ho ạt tính bắt gốc

t ự do DPPH

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 K ết quả nghiên cứu

3.1.1 Mô t ả một số đặc điểm về môi trường sinh thái của Nam sâm bò

Nam sâm bò được thu nhận vào tháng 09/2014 tại vùng đất cát ven biển Cần

Giờ (thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần Giờ) Tọa độ: 10°23'14.2"B 106°55'21.7"Đ

3.1.2 Mô t ả hình thái Nam sâm bò thu nhận tại huyện Cần Giờ

Chúng tôi ghi nhận được các đặc điểm hình thái của Nam sâm bò thu tại huyện

Cần Giờ như sau:

Nam sâm bò có thân thảo, mọc tỏa ra sát mặt đất (hình 3.1) trên nền đất cát Đặc điểm này giúp cây không bị ngã khi thường xuyên chịu tác động của gió biển Thân hình trụ, có màu xanh hoặc tím

Hình 3.1 Nam sâm bò ngoài t ự nhiên

Lá: Nam sâm bò có lá đơn, mọc đối, hình bầu dục Mặt dưới màu trắng lục, có nhiều lông ngắn Mặt trên màu lục thẫm Lá có gân dạng lông chim, mép lá lượn sóng (hình 3.2)

Hoa: Cụm hoa hình xim mang từ 3 – 4 hoa lưỡng tính, màu hồng đậm, cuống

ngắn, mọc ở nách lá Hoa mẫu 5, cánh hoa dính lại hình thành bao hoa dạng ống

Hợp bầu dưới, đính noãn đáy Nhánh hoa có nhiều lông tròn, dính (hình 3.4)

A Hoa B Hoa (cắt dọc)

Hình 3.4 Hoa Nam sâm bò

Quả: hình trụ, đầu hơi tròn, phần gần cuống nhọn Quả có 5 cạnh, bề mặt quả

có lông dính đa bào giúp quả phát tán đi xa Quả dài khoảng 4 mm (hình 3.5)

A Quả B Quả (cắt ngang) C Quả (cắt dọc)

Hình 3.5 Qu ả Nam sâm bò

Kết quả mô tả một số đặc điểm hình thái Nam sâm bò tại khu vực thu mẫu cũng tương tự như mô tả của Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, 1999)

3.1.3 Ho ạt tính bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết ethanol Nam sâm bò

Dựa trên các công trình nghiên cứu ngoài nước, đặc biệt là công trình của Gopal, T K và cộng sự (2010), Guha, G và cộng sự (2011) về Nam sâm bò ở Ấn

Độ, khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết nước, methanol thể hiện mạnh hơn so

với cao hexane, cao chloroform Điều này có thể do các hợp chất kháng oxy hóa từ Nam sâm bò là những chất có tính phân cực Do vậy, với mục tiêu khảo sát khả năng kháng oxy hóa của Nam sâm bò tại huyện Cần Giờ, Tp HCM, đề tài sử dụng ethanol là dung môi để thu nhận cao chiết thân, lá, rễ Bởi vì, ethanol và methanol

có tính phân cực gần giống nhau

3.1.3.1 Ho ạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol lá

Để xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH, cao ethanol lá được pha loãng thành dãy nồng độ từ 1000 µg/ml xuống 100 µg/ml Thông thường, trong chiến lược sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên (theo viện ung thư Hoa Kỳ NCI - National Cancer Institute), các cao chiết được nghiên cứu hoạt tính có nồng

độ dưới 1000 µg/ml Từ đó, các cao chiết nào có hoạt tính sinh học mạnh được nghiên cứu sâu hơn để đưa ra các bằng chứng khoa học cụ thể cho các ứng dụng trong thực tiễn

Chứng dương sử dụng là acid ascorbic ở nồng độ 15 µg/ml (là nồng độ của acid ascorbic mà tại đó bắt 50% gốc DPPH, được khảo sát trong điều kiện của phòng thí nghiệm Di truyền - Thực vật) Acid ascorbic là một chất đã được chứng minh có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, được sử dụng trong đề tài như là chứng dương cho quy trình thử nghiệm Chứng âm là nước cất hai lần Các nghiệm thức trong đề tài được lặp lại ba lần

Tỷ lệ % bắt gốc tự do DPPH (%HTKO) được xác định, từ đó, xây dựng phương trình hồi quy trên phần mềm thống kê SPSS 16.0 và xác định giá trị IC50

của các cao chiết để làm nền tảng so sánh hoạt tính kháng oxy hóa giữa các cao chiết khác nhau

Kết quả vể khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol lá Nam sâm bò được thể hiện qua bảng 3.2

B ảng 3.2 Tỷ lệ % HTKO của cao chiết ethanol lá

N ồng đô (µg/ml) %HTKO Độ lệch chuẩn

P -value ≤ 0,05) Đồng thời, chứng dương acid ascorbic tại nồng độ 15 µg/ml có tỷ

lệ %HTKO là 45,959 ± 3,276 cho thấy các giá trị thu nhận được trong kết quả trên

có tính ổn định, tin cây cao

Đồng thời, từ các giá trị %HTKO trên, các phương trình hồi quy giữa nồng độ cao chiết ethanol lá và tỷ lệ %HTKO đã được xây dựng Phương trình được chọn là

những phương trình có hệ số tương quan và tương quan hiệu chỉnh cao (R> 0,9), thông số P-value của phương trình ≤ 0,05; thông số P-value của từng tham số ≤ 0,05 (Phụ lục 13)

Kết quả ghi nhận được phương trình mũ (Power): y = 0,100x 0,990

(R = 0,995,

R2 sau hiệu chỉnh = 0,987; độ tin cậy của phương trình P-value = 0,000; P-value của

hệ số hồi quy = 0,000; P-value của hằng số = 0,030)

Theo phương trình trên, giá trị IC50 của hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao

ethanol lá Nam sâm bò được xác định là: 528,196 ± 24,172 µg/ml

3.1.3.2 Ho ạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol thân

Tương tự, cao chiết ethanol từ thân Nam sâm bò được khảo sát khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả nghiên cứu cho thấy khi tăng nồng độ từ 100 µg/ml lên 1000 µg/ml, hoạt tính bắt gốc tự do DPPH tăng dần (bảng 3.3) Tại nồng độ 1000 µg/ml, tỷ lệ phần trăm HTKO đạt 75,877% Giữa các

nồng độ thử nghiệm, giá trị %HTKO có sự khác biệt về mặt thống kê với P-value ≤ 0,05 Kết quả khảo sát %HTKO của acid ascorbic (15 µg/ml) = 49,506 ± 1,475 cho

thấy các giá trị ghi nhận được trong bảng 3.3 là các giá trị có độ tin cậy

B ảng 3.3 Tỷ lệ % HTKO của cao chiết ethanol thân

N ồng đô (µg/ml) %HTKO Độ lệch chuẩn

Ghi chú: a, b, c, d, e, f: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ

Dựa vào phầm mềm thống kê, các phương trình hồi quy giữa nồng độ cao chiết ethanol thân Nam sâm bò và tỷ lệ %HTKO đã được xác định (Phụ lục 14)