Xây dựng hệ thống mã vạch dna (dna barcode) để nhận diện phân tử một số loài đăng lan (dendrobium spp ) khu vực tp hồ chí minh báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp cơ sở

Trong các công cụ sinh học phân tử, mã vạch DNA DNA barcode được biết là công cụ hữu hiệu nhất hiện nay giúp định danh mẫu vật và phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhi

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

BÁO CÁO T ỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

(DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ

Mã số: CS.2015.19.38

Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Như Hoa

-Tp.HCM, 2017 -

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

BÁO CÁO T ỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

(DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ

Mã số: CS.2015.19.38

Cơ quan chủ trì Chủ trì đề tài

Trưởng Khoa Sinh học

TS Phạm Văn Ngọt ThS Nguyễn Như Hoa

|

Danh sách nh ững người tham gia thực hiện đề tài và đơn vị phối hợp chính

1 Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Như Hoa, giảng viên Khoa Sinh học Trường ĐH Sư

phạm Tp.HCM

2 Cơ quan chủ trì: Khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp.HCM

3 Đơn vị phối hợp chính: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

M ỤC LỤC

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu về lan Dendrobium 5

1.1.1 Vị trí phân loại 5

1.1.2 Sự phân bố 5

1.1.3 Sự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium 6

1.1.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium 9

1.2 Các loài Đăng lan trong nghiên cứu 12

1.2.1 Hoàng phi hạc (Dendrobium signatum Rchb f 1884) 12

1.2.2 Đại Ý Thảo (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) 12

1.2.3 Hoàng thảo Thái Bình (Dendrobium pulchellum Roxb ex Lindl.) 12

1.2.4 Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.) 13

1.2.5 Giả hạc xuân di linh tím (Dendrobium anosmum var alba) 13

1.2.6 Xương cá(Dendrobium aloifolium (Bl.) Rchb f.) 13

1.2.7 Thập nhất hoa (Dendrobium aduncum Wall Ex Lindl.) 13

1.2.8 Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rchb.f.) 14

1.2.9 Hoàng thảo Ngọc Thạch (Dendrobium crystallinum Rchb f.) 14

1.2.10 Hoàng thảo vôi (Dendrobium cretaceum Lindl.(D polyanthum Lindl.)) 14 1.3 Mã vạch DNA và ứng dụng trong nhận diện loài 14

1.3.1 Các gen được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA 15

1.3.2 Các công trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan 19

Chương 2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp 24

2.2.1 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu lan 24

2.2.2 Phương pháp giải phẫu hình thái 25

2.2.3 Tách chiết DNA tổng số 28

2.2.4 Kỹ thuật PCR 28

2.2.5 Phương pháp điện di trên gel agarose 29

2.2.6 Giải trình tự PCR 30

2.2.7 Hiệu chỉnh trình tự 30

2.2.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loài 33

Chương 3.KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1 Kết quả thu mẫu 35

3.2 Kết quả giải phẫu và mô tả hình thái 35

3.3 Kết quả tách chiết DNA tổng số 40

3.4 Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp mồi đặc hiệu của phản ứng PCR 41

3.5 Khuếch đại vùng matK, ITS bằng kỹ thuật PCR 43

3.6 Kết quả và hiệu chỉnh trình tự trên phần mềm FinchTV và SeaView 45

3.7 Kết quả so sánh trình tự của mẫu với cơ sở dữ liệu Genbank nhằm kiểm tra độ tin cậy của trình tự 47

3.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với trình tự matK và ITS 51

Chloroplast DNA Deoxyribonucleic acid Internal transcribed spacer Kilo-base pair

Maturase K Polymerase Chain Reaction Ribulose - 1,5 – Biphosphate Carboxylase L Ribosomal DNA

Ribonucleic acid RNA polymerase - β Ribosomal RNA Optical density Basic Local Alignment Search Tool Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Melting Temperature

Ultraviolet Cymbidium

Dendrobium

Thành phố Hồ Chí Minh National Center for Biotechnology Information

DANH M ỤC HÌNH ẢNH và BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Ký hiệu, tên loài và tên khoa học của 10 loài Dendrobium trong nghiên cứu

24

Bảng 2.2 Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự mục tiêu và kích thước trình tự được khuếch đại 29

B ảng 3.1 Kết quả ghi nhận đặc điểm hình thái của 10 loài Dendrobium nghiên cứu 35 B ảng 3.2 Kết quả định lượng DNA tổng số của các mẫu Dendrobium trong nghiên c ứu bằng Nano Drop 40

B ảng 3.3 Nhiệt độ bắt cặp của mồi và kích thước trình tự khuếch đại của các cặp mồi nghiên c ứu 41

Bảng 3.4 Tóm tắt kết quả giải trình tự vùng matK (390F- 1326R) và ITS (1F – 4R) sau hi ệu chỉnh của các mẫu Dendrobium trong nghiên cứu 45

Bảng 3.5 Kết quả BLAST trình tự vùng matK của 27/30 mẫu Dendrobium trong nghiên c ứu với cơ sở dữ liệu Genbank 47

Bảng 3.6 Kết quả BLAST trình tự vùng ITS của 27/30 mẫu Dendrobium trong nghiên c ứu với cơ sở dữ liệu Genbank 49

Hình 1.1 Hình minh h ọa các dạng chính của Dendrobium 7

Hình 1.2 Các nhóm Dendrobium 8

Hình 1.3 Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, quả và hạt ở chi lan Dendrobium 11

Hình 1.4 Cấu trúc vùng ITS của Dendrobium 19

Hình 2.1 Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mồi xuôi trên SeaView 31

Hình 2.2 Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mồi ngược trên SeaView 31

Hình 2.3 Hình minh họa quá trình thống nhất 2 trình tự trên SeaView 32

Hình 2.4 Giao diện trang chủ NCBI 32

Hình 2.5 Giao diện BLAST 33

Hình 2.6 Hình minh họa kết quả BLAST 33

Hình 2.7 Giao diện phần mềm MEGA6.06 34

Hình 3.1 Hình chụp 10 loài Dendrobium trong nghiên cứu 39

Hình 3.2 Kết quả điện di DNA tổng số của 10 mẫu Dendrobium 41

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng matK của mẫu 2TT ở các ngưỡng nhiệt độ từ 49o C tới 58o C 42

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng ITS của mẫu 2TT ở các ngưỡng nhiệt độ từ 49o C tới 58o C 42

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng matK của 30 mẫu lan Dendrobium 44

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS của 30 mẫu lan Dendrobium 44

Hình 3.7 Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng loài của bộ dữ liệu gồm 27 trình tự nghiên cứu đối với vùng matK của Dendrobium 51 Hình 3.8 Mô hình cây phát sinh loài vùng matK c ủa nhóm Dendrobium nghiên cứu 52

Hình 3.9 Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng loài của bộ dữ liệu gồm 27 trình tự nghiên cứu đối với vùng ITS của Dendrobium 52

Hình 3.10 Mô hình cây phát sinh loài vùng ITS của nhóm Dendrobium nghiên cứu 53

Hình 3.11 Mô hình cây phát sinh loài từ trình tự vùng matK và ITS của nhóm

Dendrobium nghiên cứu 54

TÓM T ẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BẰNG TIẾNG VIỆT Tên đề tài: Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử

một số loài Đăng lan (Dendrobium spp.) khu vực Tp Hồ Chí Minh

Mã s ố: CS.2015.19.38

Ch ủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Như Hoa Tel: 0902 683 249

E-mail: hoann@hcmup.edu.vn

Cơ quan chủ trì đề tài: Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :

Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

Th ời gian thực hiện: 11/2015 – 11/2016

1 M ục tiêu:

Hệ thống hóa các loài lan nhằm mục đích bảo tồn và để làm nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu về sau

Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp

nhận diện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bất kỳ và giai đoạn phát triển bất kỳ mà không cần có hoa

2 N ội dung chính:

- Thu thập, hệ thống 10 loài Đăng lan khu vực tp HCM

- Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp HCM

- Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR

- Giải và hiệu chỉnh trình tự 2 chiều cho mỗi marker

- Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng loài

3 K ết quả chính đạt được:

- Hệ thống mã vạch DNA cho các loài lan đã thu thập dựa trên trình tự DNA

của 2 marker

- Các bài báo cáo tại hội nghị và đăng kỉ yếu:

+ Nguyễn Như Hoa, Trần Hoàng Dũng, Dương Hoa Xô, Huỳnh Hữu Đức (2016), Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài của một số giống lan

Dendrobium dựa trên trình tự vùng ITS, Hội nghị CNSH toàn quốc khu vực phía Nam – lần thứ IV – năm 2016

SUMMARY

Project Title: Construction DNA barcode to identify molecular some Dendrobium

species (Dendrobium spp.) in Ho Chi Minh city

Code number: CS.2015.19.38

Coordinator: MS Nguyễn Như Hoa

Implementing Institution: Department of Biology, HCM City University of

Pedagogy

Cooperating Institution(s): Biotechnology Center HCM City

Duration: from September -2015 to September -2016

1 Objectives:

- Some orchids codified to preserve and provide materials for future research

- Two markers sequenced to create barcode system helps identify molecular DNA samples spread in any department and any stage of development without flowers

2 Main contents:

- Systems 10 Dendrobium species in HCM city

- Separation DNA total for 30 Dendrobium samples in HCM city

- Amplifying the target marker by PCR

- Sequencing and correction sequence for each marker

- Analysis and construction of DNA barcodes for each species

3 Results obtained:

- DNA barcode system for the orchids were collected based on the DNA sequence

of the 2 markers

- Publish academic reports using data collected from the research:

+ Nguyen Nhu Hoa, Tran Hoang Dung, Duong Hoa Xo, Huynh Huu

Đuc (2016), Analysis phylogenetic relationship of Dendrobium based ITS

region, The 4th national conference on biotechnology of Sothern Vietnam 2016

“Application of biotechnology”

M Ở ĐẦU

1 TÍNH C ẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lan Việt Nam với các loài có hoa đẹp, hương thơm quý phái là đối tượng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Hằng năm, Việt Nam thường xuyên phát hiện các loài mới bổ sung vào danh sách các loài lan phân bố ở Việt Nam Lan Việt Nam là một

họ phong phú và đặc sắc của hệ thực vật ở nước ta, có giá trị tài nguyên về nhiều mặt đối với nền kinh tế, đời sống con người

Nhiều loài lan rừng Việt Nam, đặc biệt là các loài thuộc chi Dendrobium cho hoa

đẹp, kết hợp nhiều màu sắc phong phú, hài hòa; hoa có hương thơm, lâu tàn, nở kéo dài từ 1 – 2 tháng Tình trạng thu hái, buôn bán lan rừng trái phép phổ biến như hiện nay có thể dẫn đến nguy cơ làm mất nguồn gen lan rừng Bên cạnh đó, việc du nhập và lai tạo ngày càng nhiều giống lan mới cũng làm rất nhiều giống dần dần bị lãng quên

Từ thực tế đó, rất nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm bảo tồn đa dạng

các loài lan, trong đó có lan Dendrobium

Cho đến nay, việc nghiên cứu về lan chủ yếu về hệ thống phân loại, nuôi cấy mô

một số loài Việc nghiên cứu, sưu tập, lai tạo các giống lan đã được thực hiện khá nhiều ở các trường, viện nghiên cứu, các nghệ nhân Tuy nhiên, quá trình nhận diện các giống lan vẫn dựa trên hình thái bên ngoài, đặc biệt là phải có hoa và quá trình lai

tạo vẫn mang tính ngẫu nhiên không dựa trên nền tảng di truyền Do vậy, rất cần một

hệ thống nhận diện nhanh và chính xác các mẫu lan thu thập

Trong các công cụ sinh học phân tử, mã vạch DNA (DNA barcode) được biết là công cụ hữu hiệu nhất hiện nay giúp định danh mẫu vật và phân tích tiến hóa sinh học

của loài vật đó trong tự nhiên, giúp các nhà chọn giống và di truyền học cập nhật nhanh chóng các thông tin như tên, thuộc tính sinh học… nhằm đánh giá mối quan hệ

giữa các loài, đồng thời bảo tồn nguồn gen; từ đó có thể quản lý và khai thác tốt hơn nguồn gen mình đang có [16,18,19]

Hơn nữa, việc sử dụng trình tự mã vạch DNA để xây dựng cây phát sinh chủng loài

sẽ giúp chỉ ra mối quan hệ di truyền giữa các loài thu thập được Từ đó chỉ ra các loài

có quan hệ xa, quan hệ gần trong cùng chi cùng loài Cây phát sinh chủng loài sẽ là cơ

sở khoa học quan trọng để xây dựng các tổ hợp lai giữa các mẫu lan (lai cùng chi, giữa

hai chi, giữa bốn chi) Các tổ hợp lai sẽ giúp cho công tác lai tạo các loài lan rút ngắn

thời gian, công sức nhưng vẫn cho ra các dòng con lai đạt giá trị khoa học và kinh tế

phục vụ nhu cầu nội địa và xuất khẩu, đây là một nhiệm vụ có tầm chiến lược lâu dài

Hiện nay, những nghiên cứu trong việc xây dựng mã vạch DNA nói chung và cụ thể

với đối tượng phong lan bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu ở Việt Nam mới có một

số nhóm nghiên cứu bắt đầu thực hiện Có rất nhiều marker tham gia trong phân tích phân loại như: ITS, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK, …trải rộng từ bộ cho đến

mức dưới loài Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân

biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau Ví dụ, các đoạn DNA như: 18S, 16S, 5,6S có

khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn DNA, như: 26S, rbcL, ndnF,

atp β có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn DNA, như: ITS, matK, cytb,

5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài (subspecies, variety, strain) Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn DNA nào được sử

dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn DNA (gen) đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao [36, 27, 30]

Trên đối tượng lan Dendrobium, cho đến thời điểm hiện tại, những nghiên cứu trong

việc xây dựng mã vạch DNA cho bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu vẫn chưa hoàn

chỉnh Để góp phần vào việc định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn, khai thác và

sử dụng nguồn gen Dendrobium một cách có hiệu quả, chúng tôi đề xuất “Xây dựng

hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử một số loài Đăng lan

(Dendrobium spp.) ở khu vực Tp Hồ Chí Minh”

2 M ỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Hệ thống hóa các loài lan nhằm mục đích bảo tồn và để làm nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu về sau

Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp

nhận diện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bất kỳ và giai đoạn phát triển bất kỳ mà không cần có hoa

3 CÁCH TI ẾP CẬN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, PHẠM VI NGHIÊN

C ỨU, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1 Cách ti ếp cận

- Tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, chú trọng đến nguồn tài liệu ở những quốc gia có nền khoa học kỹ thuật và đã có những thành tựu quan trọng trong lĩnh vực bảo tồn nguồn gen để phân tích trên cơ sở lý luận thực tiễn

nhằm định hướng nhanh nhất cho các phương pháp và nội dung nghiên cứu trong đề tài

Điều tra, đánh giá một số đặc điểm hình thái lan Dendrobium khu vực tp HCM; từ đó,

xây dựng báo cáo mô tả một số đặc điểm hình thái của lan Dendrobium khu vực tp

HCM

Kế thừa các kết quả nghiên cứu về lan Dendrobium ở Việt Nam hoặc một số tài liệu,

bài viết có tính tham khảo, chuyên khảo

Lan Dendrobium thu thập được định danh phân tử bằng cách xây dựng hệ thống DNA barcode Hệ thống này sẽ giúp các nhà khoa học, nghệ nhân địa phương dễ dàng tiến hành xác định nguồn gốc loài và bảo vệ các loài đang có nguy cơ tuyệt chủng

3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu mẫu – Giải phẫu hoa

- Phương pháp tách DNA tổng số, khuếch đại các marker bằng kỹ thuật PCR

- Phương pháp hiệu chỉnh trình tự

3.3 Ph ạm vi nghiên cứu

- 30 mẫu lan Dendrobium (10 loài) thu thập tại tp HCM Mỗi mẫu sẽ được giải

trình tự 2 marker là ITS và matK để xây dựng DNA barcode

3.4 N ội dung nghiên cứu

- Thu thập, hệ thống các mẫu Đăng lan khu vực tp HCM

- Xây dựng hệ thống mã vạch DNA cho mẫu vật nghiên cứu

+ Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp HCM

+ Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR

+ Giải trình tự 2 chiều cho mỗi marker

+ Hiệu chỉnh trình tự đã giải bằng phần mềm FinchTV, Seaview

+ Kiểm tra tương đồng trên ngân hàng gen GenBank

+ Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng loài

Dendrobium với số lượng loài lớn, đa dạng về hình dáng, màu sắc, kích thước,

là chi lớn thứ hai trong họ Phong lan, chỉ sau chi lan Lọng (Bulbophyllum).[11]

Theo Dương Đức Huyến, 1992, Dendrobium có những đặc điểm khác biệt với

những chi lân cận như luôn mọc cụm và có phân đốt, số lượng khối phấn luôn là 4, không có lông mềm trên lá hay các bộ phận của hoa Nhóm tác giả này đã dựa trên hệ

thống của Seidenfeden (1985) và Holttum (1964) để sắp xếp 97 loài Dendrobium ở

Việt Nam thành 15 nhóm (section) [3]

Theo Phong lan Việt Nam của Trần Hợp (1998), ở Việt Nam, Dendrobium có

đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa [11]

1.1.2 S ự phân bố

Chi Dendrobium có khoảng 1.600 loài và hiện đã được lai tạo thêm nhiều loại

mới Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp, trong đó “Dendro”- có nghĩa là

gỗ, “bio”- có nghĩa là sống Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên

vỏ cây Ở Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng lan hay Đăng lan

Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông bán cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt

Nam Thái Bình Dương, Philippine, Ấn Độ, một số xuất hiện ở Nhật Bản và xuất hiện nhiều nhất ở Đông Nam Á Trong khi các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc chi

Cattleya tuy ệt đẹp, các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có chi Dendrobium vô

cùng phong phú Theo nghiên cứu của Dressler (1981), châu Á có khoảng 1.400 loài thuộc chi Dendrobium [11]

Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và

ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thích nghi với

bất cứ điều kiện khí hậu nào

Ở Việt Nam, năm 1932, các nhà thực vật người Pháp (Gagnepsin và Guillaumin) đã công bố 53 loài Hoàng thảo ở Việt Nam, và sau đó đã công bố bổ sung thêm một số loài (1932 – 1964) 1992, Dương Đức Huyến và cộng sự cũng đã phân

loại và định danh 97 loài Dendrobium ở Việt Nam, trong đó có 48 loài có giá trị làm

cảnh và 21 loài đặc hữu của Việt Nam [3] 1998, Trần Hợp mô tả 93 loài Dendrobium

trong cuốn Phong lan Việt Nam [11] Ở miền Nam Việt Nam, tác giả Phạm Hoàng Hộ cũng đã mô tả 56 loài Hoàng thảo trong Cây cỏ miền Nam Việt Nam 2 [7]

Theo công bố “Trích yếu được cập nhật hóa về các loài lan ở Việt Nam, ở Việt Nam hiện đã biết được 897 loài lan thuộc 152 chi, chúng chiếm khoảng 75-80% trong

tổng số 1.000 - 1.100 loài ước tính có ở đây Trong đó, chi Dendrobium có số lượng

loài cao nhất (107 loài), tiếp đến là Bulbophyllum, Eria, Liparis… Công bố này cung

cấp các thông tin về tên khoa học, khu phân bố, cách sống, độ thường gặp của loài và tình trạng bị đe dọa tiêu diệt của từng loài.[1]

1.1.3 S ự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium

Dendrobium là chi lan (genus) đông đảo với hơn 1.000 loài (species) nguyên

thủy được chia thành 40 nhóm (sections) thuộc dòng Dendrobiinae như Phalaenanthe,

Eleutheroglossum, Callista, Ceratobium, Stachyobium…

Do quá đa đạng nên Dendrobium tập trung thành hai dạng chính [5]:

- Dạng đứng (Dendrobium loại phalaenopsis): thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm,

có nhiều hoa Thành phố Hồ Chí Minh trồng rất nhiều loại này như: Nhất điểm hồng,

Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia,…

- Dạng thòng (Dendrobium loại nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi núi cao

như Đà Lạt, Lâm Đồng, …; lá nhạt màu hơn so với dạng thân đứng, lá rụng khi thời

tiết lạnh Có nhiều loài Dendrobium dạng thòng như Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp

Theo một cách phân loại khác, lan Dendrobium được chia ra thành 5 nhóm:

- Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm và hoa thì thường mọc ở gần

ngọn như Dendrobium antennatum, Dendrobium phalaenopsis…

- Nhóm thứ hai, lá thường rụng vào mùa đông và hoa thường mọc ở gần đốt trên

thân cây như Dendrobium anosmum, Dendrobium wardianum…

- Nhóm thứ ba hay còn gọi là nhóm Callista, khi ra hoa thì hoa rủ xuống phía

dưới như Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium farmeri…

- Nhóm thứ tư là nhóm Latoura với chùm hoa mọc thẳng đứng như Dendrobium

atroviolaceum, Dendrobium spectabile…

- Nhóm thứ năm là nhóm Formosae có đặc điểm là trên thân và lá cây có lông

màu đen và hoa thường là màu trắng như Dendrobium draconis, Dendrobium

formosum…

Phạm Hoàng Hộ (2003) phân loại giống lan Dendrobium gồm 13 nhóm:

Bolbidium, Callista, Apoum, Strongyle, Gastridium, Conostalix, Rhopalanthe, Formosae, Pedilonum, Dendrobium, Breviflores, Dischophyllum, Stachyobium

- Nhóm Callista gồm có: D chrysotosum (Kim điệp), D densiflorum Wall

(Thủy Tiên), D farmari Paxt (Thủy tiên trắng vàng), D lindleyi Steudel (Vẩy rồng),

D thrysiflorum Reichb (Thủy tiên vàng)…

- Nhóm Dendrobium g ồm có: D anosmum Lindl (Giả hạc), D fimbriatum Hook.f (Long nhãn), D heterocarpumi Lindl (Nh ất điểm hoàng), D primulinum Lindl (Long tu), D moschatum (Buch-Ham) (Thái bình) …[8]

Chính vì sự đa dạng về chủng loại mà nhóm lan này có điều kiện sinh thái rất đa

dạng, có loài hoa chỉ mọc ở vùng lạnh, có loài lại chỉ sống ở vùng có không khí nóng, cũng có loài chỉ chịu được nhiệt độ vừa phải, nhưng có một số loài lại rất dễ chịu là điều kiện khí hậu nào cũng sống được

Dendrobium có thể nhân nhanh giống bằng phương pháp chiết nhánh thông thường Vì nó là loại lan đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ Tại những mắt ngủ này

sẽ đâm chồi và cho ra một cây con mới Hoa của Dendrobium có thể mọc từ thân

thành từng chùm hay chỉ mọc một hoa duy nhất Có một số loài Dendrobium trước khi

ra hoa sẽ rụng hết lá Đặc biệt hơn các giống lan khác, các chồi hoa của lan

Dendrobium không những mọc trên các giả hành mới, tại các giả hành cũ cũng có thể

mọc hoa, vì thế một cây Dendrobium có thể cho ra nhiều cành hoa Mặt khác, hoa

Dendrobium thường rất lâu tàn, thường là từ 2 đến hơn 3 tháng, có loài hoa có thể nở

suốt quanh năm như Dendrobium caesar Alba, Dendrobium caesar latin Tuy nhiên,

có loài cũng sớm nở tối tàn như Thạch hộc (Dendrobium crulllenatum)

Dendrobium cũng là giống rất đa dạng về màu sắc và kiểu dáng Chính vì thế,

người Việt Nam dùng những hình tượng khác nhau để tượng trưng cho một số loài

Dendrobium nào đó: một con chim bồ câu trắng (lan Bạch câu), một loài hạc lẻ loi (lan

Giả hạc), hay một đàn bướm vàng bay trong gió (lan Kim điệp) …[11]

1.1.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium

Dendrobium không có một hình dạng chung nhất về hoa và dạng cây do số lượng quá lớn và phân bố rộng rãi Các loài thuộc chi Dendrobium đều có bộ phận sinh

dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, quả [5]

- Một số loài có thân lá kém phát triển, thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ

chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [5]

- Rễ lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ

cây sẽ bị mục nát, cây sẽ chết [2]

1.1.4.2 Thân

- Dendrobium thuộc nhóm đa thân (nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ

- Ở một số loài Dendrobium, lá chỉ có ở các mầm non, có giả hành là đoạn thân

phình to giống như củ không có lá, là nơi dự trữ năng lượng

- Gỉả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng

cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm

chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ

để tránh sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [5]

- Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [2]

- Một số loài ở xứ lạnh, giả hành chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên không có màu xanh nhưng phía trên có mang lá [2]

1.1.4.3 Lá

- Dendrobium là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá

- Lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân do lá có tận cùng là 1 cuống hay thuôn dài

xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng [5]

- Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại mọng nước

nạc, dai có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây Phiến lá

trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy Có những loài trút lá vào mùa khô hạn, sau đó cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [2]

D pendulum D simondii Gagnep D hercoglossum

Hình 1.3 Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, quả và hạt ở chi lan Dendrobium

[32, 33, 34, 39]

1.1.4.4 Hoa

- Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá

- Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên

ngọn

- Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi

ra hoa Thời gian ra hoa là đầu mùa mưa hay đầu tết

- Khi đủ dinh dưỡng, Dendrobium cho hoa thành chùm, phát hoa dài và thời

gian ra hoa trung bình 1 – 2 tháng [5]

1.1.4.5 Qu ả và hạt

- Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc Quả có dạng dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Một số loài khi quả chin không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả đã mục nát [2]

- Hạt rất nhiều, li ti, không chứa chứa chất dinh dưỡng Hạt chỉ cấu tạo bởi một

lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng, để được nảy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết [2]

1.2 C ác loài Đăng lan trong nghiên cứu

1.2.1 Hoàng phi h ạc ( Dendrobium signatum Rchb f 1884)

các đốt, thơm và lâu tàn Nở vào mùa xuân-hạ

Phân bố: Sơn La, Lai Châu, Thừa Thiên-Huế, Tây Nguyên, Lâm Đồng, Nam Cát

Tiên

1.2.2 Đại Ý Thảo (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher)

Phong lan có thân thòng, mảnh, suông, dài đến 90cm Lá xếp 2 dãy, có phiến thon

nhọn, 5 gân chánh Phát hoa 1-3, tim tím, hường hay trắng, môi vàng; cánh hoa dài đến 3,5cm, môi xoan, dài 3cm, giữa có 3 gân màu vàng rất lợt

Phân bố: Sa Pa, Phú Khánh, Đà Lạt, Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Malaysia

1.2.3 Hoàng th ảo Thái Bình (Dendrobium pulchellum Roxb ex Lindl.)

Phong lan có thân hình trụ dài đến 1-2m; có sọc dọc đỏ Lá có phiến dài 10-15cm, hẹp

ở hai đầu, rộng 2-3cm ở giữa Chùm ngoài nách lá, dài 10-20cm; hoa to, rộng 6-8cm, hường hay vàng vàng, môi có dạng bầu dục có 2 bớt đỏ, xoan, rìa lông, đầu lõm, cột cao 6mm

Phân bố: Quảng Trị, Nepal, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Lào

1.2.4 Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.)

Phong lan có thân mảnh, đứng hay thòng, hình trụ, dài đến 45cm Lá có phiến thon, hình giáo, dài 8-10cm, rộng vào 2cm, chẻ 2 ở đầu, dễ rụng Hoa hường, tim tím dợt,

rộng 6cm; môi xoan rộng, có 3 thùy, bìa có răng mịn và ria long, gần như trắng, có đốm vàng và tím ở đáy; cột có nắp tía Thân không lá lúc phát hoa

Phân bố: Lâm Đồng, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

1.2.5 Gi ả hạc xuân di linh tím (Dendrobium anosmum var alba)

Thân thòng dài đến 1,2m lá có phiến mỏng, xếp 2 dãy, dài 10-18cm, rộng 2-3cm; bẹ mau rách Hoa to, ửng hường, với môi có tâm có sọc tía, cánh hoa nhọn, cao 3-4 cm, môi có long nằm, xoan rộng, đầu tà, cột co 8mm

Phân bố: Vinh, Đaklak, Lâm Đồng, Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Lào, Thái Lan, Indonesia, Tân Ghi Nê

1.2.6 Xương cá (Dendrobium aloifolium (Bl.) Rchb f.)

Phong lan có thân cao đến 40cm, có lá ở phần giữa Lá trong mặt phẳng, dẹp, hình dao găm, dài 2,5cm Phần trên của thân hình chữ chi, có lá teo Mang hoa trắng, nhỏ, cao 4-5mm, một ô mỗi mắt; cánh hoa và lá đài dảnh, môi hẹp dài 3,5mm, đầu có 2 thùy tròn

Lan sống phụ, mọc bụi nhỏ, cao 40cm, hình trụ ở gốc Lá ở giữa, dạng tam giác xếp trên một mặt phẳng, dài 2-3cm, rộng 0,8-1cm Đỉnh thân gãy khúc mang hoa nhỏ màu

trắng ở mỗi đốt Cánh môi ở đỉnh có 2 thùy tròn

Phân bố: Đà Lạt, Định Quán, Nam Cát Tiên, Tây Ninh, Thái Lan, Mianma, Malaysia, Indonesia

1.2.7 Th ập nhất hoa (Dendrobium aduncum Wall Ex Lindl.)

Phong lan có thân thòng dài 60cm, hình trụ suông, hơi chữ chi Lá có phiến thon hẹp, dài 7-8cm, rộng đến 2cm Chùm ở phần không lá, mang ít hoa, hoa tim tím hay hường

lợt, rộng 3,5cm; phiến hoa dài 2 cm môi cao 1,2cm, 3 thùy, thùy chót nhọn, có một lồi hình liềm và một sóng giữa

Lan sống phụ, thân buông xuống, hình trụ gãy khúc, dài 60cm Lá hình giải nhọn, dài 7-8cm, rộng 1-2cm Cụm hoa trên thân không lá, có 1-5 hoa Hoa màu hồng hay tím

nhạt, rộng 3,5cm, cánh môi 3 thùy, thùy giữa nhọn

Phân bố: Đà Lạt, Đồng Nai, Tam Đảo, Gia Lai, Kontum, Bhutan, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

1.2.8 Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rchb.f.)

Căn hành bò, thân cao 5-15cm, lóng rộng 10-15mm, có rãnh rọc Lá 1-2; phiến thon

nhọn, to 4-7x1-1,5cm Phát hoa thưa, trúc mành; hoa 2-4, vàng; cọng và noãn sào dài 1,5-3cm, lá đài giữa 9x5,5mm; cánh hoa cạnh 12x7mm, môi bầu dục tròn, to vào 17mm, vàng có bớt vàng đậm, móng (cựa) ngắn

Phân bố: Buôn Mê Thuột, Lâm Đồng, Thuận Hải, Ấn Độ, Mianma, Lào, Thái Lan, Trung Quốc

1.2.9 Hoàng th ảo Ngọc Thạch (Dendrobium crystallinum Rchb f.)

Phong lan thành bụi, thân màu vàng tươi lúc khô, dài 30-50cm Lá hình giải thuôn có phiến cứng, dài 7-12cm, rộng 1-1,5cm Hoa từng cặp trên một u, màu trắng, chót tía hay hơi hồng; cánh hoa dài 3cm, rộng 1cm; môi tròn, bìa nguyên, có bớt to vàng ở

giữa; cột có nắp hình chùy

Phân bố: Quảng Trị, Gia Lai Công Tum, Bảo Lộc, Đà Lạt, Lào, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

1.2.10 Hoàng th ảo vôi (Dendrobium cretaceum Lindl (D polyanthum Lindl.))

Phong lan có giả hành hình thoi màu nâu tím, có rãnh, trên đó là thân mảnh ít nhánh, dài 20-40cm Lá hình giáo, thuôn ở gốc, nhọn ở đỉnh,có phiến bầu dục, có đốm nâu đỏ, dài 7-8cm, rộng 1-2cm Hoa to, trắng, có sọc đỏ; phiến hoa dài 2,5-3cm, môi có 3 sọc vàng, thùy 3, cạn

Phân bố: Định Quán, Biên Hòa, Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan

1.3 Mã v ạch DNA và ứng dụng trong nhận diện loài

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ

và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về đặc điểm hình thái sinh học giữa hai hay nhiều cá thể Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài

Ngày nay, những trở ngại trong việc phân loại này tồn tại ngay trong nhiều nhà

hệ thống học, sinh thái học và tiến hóa đa dạng sinh học Vì vậy, việc nhận diện chính xác bất cứ mẫu động, thực vật nào một cách nhanh chóng và tin cậy là một vấn

đề thực tế được quan tâm Đó cũng là lý do chính để phát triển một phương pháp mới

để phát hiện nhanh bất cứ loài nào dựa trên giải trình tự DNA từ mẫu mô của sinh vật Được gọi là “xác định mã vạch DNA” - trình tự của chuỗi DNA được tiêu chuẩn hóa thành các chuỗi ngắn có kích thước từ 400 – 800 bp Trên lý thuyết, chúng có thể dễ dàng tách ra và đặc trưng cho hầu hết các loài trên địa cầu Bằng cách khai thác những

tiến bộ của di truyền học phân tử, công nghệ trình tự nucleotide và tin sinh học Mã

vạch DNA cho phép nhận diện một cách nhanh chóng và chính xác những giống loài

đã biết và lấy thông tin từ chúng Đây cũng là tiềm năng cho việc thúc đẩy sự khám phá hàng ngàn loài khác Mã vạch DNA là công cụ chính đối với các nhà phân loại

học trong việc lưu trữ và quản lý những dữ liệu về sự phong phú và những biến đổi trong sinh giới

Định nghĩa đơn giản nhất của mã vạch DNA là một hoặc nhiều trình tự gen được lấy từ mẫu gen đã được chuẩn hóa của bộ gen, dùng để xác định loài Năm 2003, Paul Herbert và các đồng nghiệp đã đề xuất đầu tiên việc sử dụng những trình tự thu

gọn cho mục đích xác định nhanh chóng và chính xác “vị trí phân loại của loài” thông qua tất cả các dạng sống từ động vật cho đến thực vật…và trên những mẫu mô nhỏ

Việc phổ biến thông tin về mã vạch DNA được ứng dụng để nhận dạng các loài và được áp dụng đầu tiên trên động vật Tuy nhiên, tiêu chuẩn thiết lập mã vạch DNA cho

thực vật không được hội đồng các nhà thực vật học chấp nhận cho đến 6 năm sau khi tài liệu đầu tiên về mã vạch DNA trên động vật được công bố [16, 18, 27, 25]

1.3.1 Các gen được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA

Ở thực vật, DNA nhân, lục lạp và ti thể đều được sử dụng trong phân tích định danh phân tử Các gen ti thể có chỉ số đa dạng thấp giữa trình tự các loài; sự đa dạng

của vùng mã hóa CO1 giữa các họ thực vật đã được ghi nhận là chỉ vài cặp base trên đoạn trình tự dài khoảng 1.4 kb nên không thể sử dụng để làm DNA barcode cho thực

vật

Nói chung, trong các tế bào, bộ gen ti thể tiến hóa với tốc độ chậm nhất, bộ gen

của lục lạp với tốc độ nhanh hơn và hệ gen nhân với tốc độ nhanh nhất (Wolfe, Li và

cộng sự 1987; Gaut 1998) Vì lý do này, các trình tự gen cpDNA (ví dụ rbcL, atpB,

matK và ndhF) đã được sử dụng rộng rãi ở cấp độ phổ quát (Chase và cộng sự 1993;

Qiu và cộng sự 1999; Soltis và cộng sự 1999), trong khi các trình tự không mã hóa

như intron (ví dụ rpL16, rpoC1, rpS16, trnL, trnK) và nhiễm sắc thể liên kết (ví dụ

trnT-trnL, trnL-trnF, atpB-rbcL, psbA-trnH) được sử dụng thường xuyên hơn ở các

mức phân loại thấp hơn (Taberlet và cộng sự 1991; Sang và cộng sự 1997a; Small và

cộng sự 1998).[36]

Các gen cpDNA tham gia trong việc phân tích phân loại thực vật như: 16S,

rbcL, atp β, ndhF, intron trnL và matK trải rộng từ bộ cho đến mức dưới loài Vùng

16S phù hợp ở mức bộ, trong khi rbcL, atpβ và ndhF phù hợp từ mức bộ đến mức loài Vùng intron trnL, spacer trnL-trnF và matK có thể áp dụng trong một biên độ rộng từ

bộ cho tới dưới loài Vùng atpβ-rbcL có thể được sử dụng từ mức chi đến mức dưới

Tóm lại, vùng ITS trong nhân có khả năng phân định loài rất cao nên nhiều nghiên cứu trước đây vẫn sử dụng vùng gen này làm marker cho DNA barcode Tuy nhiên vùng ITS là vùng phổ quát có ở hầu hết các sinh vật kể cả nấm, vi khuẩn nên

việc giải trình tự dễ bị nhiễm, vùng này hiện nay được khuyến cáo là phải sử dụng kết

hợp với các marker khác Đặc biệt các gen trong lục lạp lại được lựa chọn làm marker nhiều hơn cả vì tính chất di truyền theo dòng mẹ nên không có hiện tượng tái tổ hợp,

cấu trúc gen bền vững và số lượng lục lạp nhiều nên số lượng bộ DNA thu được cũng nhiều DNA lục lạp là DNA sợi đôi, có chiều dài trong khoảng 35 - 217 kb tùy loài

thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài khoảng 115 - 165 kb Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 – 10000 bản sao cpDNA Trong khi các gen mã hóa có khả năng phân biệt ở mức độ loài trở lên, thì các vùng không mã hóa lại có độ biến thiên cao hơn nên cho phép phân định ở mức độ dưới loài Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng là sự tích luỹ các đột biến theo thời gian, do vậy

sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hoá giữa các loài Cho tới nay, nhiều nghiên cứu tìm

kiếm DNA barcode cho thực vật đã được tiến hành nhưng vẫn chưa có mã vạch nào là

có khả năng nhận diện hầu hết các loài một cách hiệu quả tương tự như vùng CO1 cho động vật Hơn thế, thực vật thường thay đổi nhanh chóng cấu trúc bộ gen ti thể của chúng Vì thế các nghiên cứu tìm kiếm vẫn còn tiếp tục và còn được đề nghị là kết hợp nhiều đoạn trình tự với nhau để làm các DNA barcode ở thực vật

Kết quả tổng kết trong 60 ấn phẩm xuất bản từ 2010 – 2013, về các vùng trình tự

được đề nghị để làm DNA barcode cho thực vật, có tổng cộng 17 trình tự (matK, rbcL, ITS, ITS2, psbA-trnH, atpF-atpH, ycf5, psbKI, psbM, trnD, rps16, coxI, nad1, trnL-F,

rpoB, rpoC1, atpF-atpH, rps16) Trong đó, vùng ITS xuất hiện (26 tài liệu tham khảo),

psbA-trnH (21 tài li ệu tham khảo), matK (19 tài liệu tham khảo) và rbcL (14 tài liệu

tham khảo) Vùng gen tiếp tục sử dụng cho mã vạch là ITS2 (9 tài liệu tham khảo),

rpoC1 (6 tài li ệu tham khảo), rpoB (4 tài liệu tham khảo) và trnL-F (3 tài liệu tham

khảo) [21]

Trong nghiên cứu của Kress và cộng sự (2005), hai vùng gen được đề xuất là ứng viên tiềm năng cho ứng dụng mã vạch DNA ở thực vật có hoa, đó là vùng ITS (internal transcribed spacer region) ở nhân và vùng giữa các gen trnH-psbA ở plastid

Vùng ITS là vùng trình tự được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về phát sinh loài ở thực vật và nó thể hiện sự đa dạng cao giữa các loài Trong khi đó, vùng trnH-

psbA mặc dù khá ngắn (khoảng 450 bp) nhưng lại là vùng plastid biến hóa nhất ở thực

vật hạt kín và nó dễ dàng được khuếch đại ở hầu hết thực vật ở cạn Nghiên cứu được

tiến hành dựa trên sự so sánh bộ gen plastid của tobacco và deadly nightshad và thí nghiệm trên 7 họ thực vật hạt kín có quan hệ gần với nhau và một nhóm các loài được

lấy mẫu từ thực vật địa phương gồm 50 họ thực vật gồm 99 loài thuộc 80 chi [19]

Tổ chức Kew, Royal Botanic Gadens, ở Anh, một trong các viện khoa học tiên phong và dẫn đầu về lĩnh vực khoa học thực vật và bảo tồn lớn nhất thế giới cũng đã

và đang thực hiện một dự án lớn để tìm ra DNA barcode chung cho tất cả các loài thực

vật Công trình đã tiến hành thiết kế các cặp mồi phổ quát cho hơn 100 vị trí trên genome lục lạp của thực vật Những kết quả và nhận xét cho thấy các chú ý được tập trung vào các vùng gen mã hóa, có 5 ứng cử viên được chọn làm DNA barcode cho

thực vật đó là các vùng gen matK, rpoC1, rpoB, accD và YCF5 Các nghiên cứu tiếp

theo của dự án đề nghị có sự phối hợp các gen rpoC1 + rpoB + matK hoặc rpoC1 +

matK + trnH-psbA với nhau để DNA barcoding hiệu quả hơn [23]

Tổ chức CBOL đánh giá bảy vùng gen lục lạp trên khắp bộ gen thực vật và đề

xuất một sự kết hợp của matK và rbcL như mã vạch cho thực vật (2009)

Tổ chức China Plant BOL Group đề xuất việc bổ sung vùng ITS trong nhân (Internal Transcibed Spacer) kết hợp với matK + rbcL như mã vạch cho thực vật để có

thể xác định tối đa các loài, thậm chí giúp phân định các loài có liên quan chặt chẽ (2011)

Hội thảo quốc tế lần thứ 4 về Barcode cho sự sống đề nghị sử dụng 3 locus để làm mã vạch cho thực vật matK + rbcL + psbA-trnH (2011) [21]

K ế thừa các kết quả nghiên cứu trên, đề tài quyết định chọn 2 locus để xây dựng DNA barcode cho các loài Dendrobium trong nghiên c ứu

ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn RNA không có chức năng, nằm

giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã ITS là vùng không bảo

tồn, nó nằm giữa các vùng gen rất được bảo tồn là 18S, 5.8S và 28S Để đảm bảo cho quá trình sinh tổng hợp protein diễn ra bình thường, sai sót ở các gen này luôn được

sửa chữa kịp thời Có thể nói rằng do các vùng xung quanh được bảo tồn nên vùng ITS

là vùng hứng đột biến Do vậy, vùng ITS được chọn để so sánh phân biệt các sinh vật

với nhau Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5.8S Vùng 5.8S khá bảo tồn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành Do đó các locus 5.8S có thể phục vụ như

là một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận

diện Tiện ích của vùng bảo tồn như 5.8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy [20]

Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi Mặc dù, vùng ITS thường được

sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của sinh vật; tuy nhiên, phần lớn các so sánh trên vùng này thường sử dụng để xác định các biệt hóa trong cùng một loài [23]

Hình 1.4 Cấu trúc vùng ITS của Dendrobium

Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys

(UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 codon nằm trong intron của gen

trn K và dường như chưa rõ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để

xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có

trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen marker quan trọng để giúp phân loại

thực vật Gen matK (MaturaseK): cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề xuất

làm DNA barcoding cho nhóm thực vật có hoa Kết quả sử dụng gen matK cho phân

loại đã thu được sự tương đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap

từ 92 – 100% [20]

1.3.2 Các công trình xây d ựng mã vạch DNA cho họ Lan

Ngay sau khi khái niệm mã vạch DNA ra đời, nhiều công trình trên thế giới đã

tập trung vào việc thiết lập bộ dữ liệu DNA cho sinh vật bản địa Hoa Lan đã nhanh chóng là một đối tượng được các nhà khoa học quan tâm do những đặc tính độc đáo về

mặt sinh học và giá trị về mặt kinh tế, y học… của chúng Họ hoa lan là một họ thực

vật được đánh giá là rất khó để nhận diện, định danh đặc biệt là thời kỳ chúng chưa ra hoa Nhiều loài chỉ khác với loài lân cận ở một điểm hình thái rất nhỏ và tinh tế, do

vậy rất khó để nhận diện chúng bằng phương pháp hình thái thông thường Hơn nữa,

do Orchidaceae rất dễ lai tạo cả ngoài thiên nhiên lẫn trong nhà trồng, nên có rất nhiều

dạng trung gian hoặc các biến dị; điều đó dẫn đến việc phân loại chúng ở mức chi và loài cực kỳ khó khăn Do vậy, khi kỹ thuật phân loại bằng trình tự DNA ra đời, nó nhanh chóng trở thành công cụ hữu dụng trong việc định danh các loài, nhất là lan Có

thể kể ra vài công trình tiêu biểu trên thế giới về hướng nghiên cứu này như:

Theo báo cáo của Ding và cộng sự 2002, Dendrobium officinale có thể được

nhận diện nhờ trình tự vùng ITS Nghiên cứu tiến hành giải trình tự vùng ITS của 5

loài Dendrobium trong đó có Dendrobium officinale và 4 loài khác có hình thái tương

tự Vùng ITS sau khi xử lý có chiều dài 644bp gồm 235bp ITS1, 163bp 5,8S và 264bp ITS2 Khi so sánh 5 trình tự ITS của 5 loài thì Dendrobium officinale có thể dễ dàng

được phân biệt với 4 loài còn lại ở 11 vị trí (7 trong ITS1, 1 trong 5,8S, 3 trong ITS2) Theo nhóm tác giả, ITS có thể được dùng để nhận dạng phân tử các giống

Dendrobium officinale.[14]

Nhóm tác giả Đài Loan, Wen-Li và cộng sự 2009, sử dụng trình tự vùng matK

ở lục lạp để phân tích mối quan hệ di truyền của các loài Dendrobium Kết quả cho

thấy các trình tự matK của các loài nghiên cứu tương đồng ở mức độ cao

(91,1-99,7%), nhóm kết luận rằng trình tự gen matK rất bảo thủ ở chi Dendrobium [28]

Trên đối tượng Dendrobium, nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina và cộng sự,

2010) lại sử dụng trình tự gen matK và rbcL để phân định loài đồng thời nghiên cứu

sự phát sinh chủng loài của nhóm Dendrobium dùng trong y học: Dendrobium

fimbriatum, D moniliforme, D nobile, D pulchellum, và D tosaense.[12]

Theo kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại của 20 loài

Dendrobium của Chiang và cộng sự 2012, vùng ITS1 và ITS2 có mức độ đa dạng cao hơn nhiều so với vùng 5,8S rDNA Chiều dài vùng ITS của 20 loài trong nghiên cứu

nằm trong khoảng 636 đến 653 bp, mức độ phân biệt 75,7% đến 99,1% Phân tích phát sinh loài từ vùng trình tự này cho phép phân định 5 loài Dendrobium có giá trị dược

liệu và có chung hình thái ngoài [13]

Một công trình mang tính tổng kết về mã vạch DNA cho Dendrobium công bố

đầu năm 2012 do nhóm tác giả Ấn Độ (Singh và cộng sự, 2012) Theo đó, các tác giả

đã giải trình tự cho 6 locus trong đó 5 nằm trong lục lạp là matK, rbcL, rpoB, rpoC1,

trnH-psbA và ITS nằm trong nhân của 36 loài Dendrobium [23]

Sharma và cộng sự (2012) đã giải trình tự gen ITS nằm trong nhân của 10 loài

địa lan Cymbidium thu thập từ vùng Đông Bắc của Ấn Độ để phân tích định danh dưới

loài và quan hệ phát sinh chủng loài của chúng [22]

Công trình mới đây sử dụng mã vạch DNA để phân định loài Cymbidium ở

Thái Lan (Siripiyasing và cộng sự, 2012) bằng các trình tự gen rpoB, rpoC1, matK, và vùng trnH-psbA cho thấy khoảng cách di truyền giữa các loài rất cao và phép phân

định các loài Cymbidium aloifolium, C atropurpureum, C bicolor, C chloranthum, C

dayanum, C devonianum, C ensifolium, C finlaysonianum, C haematodes, C insigne, C lancifolium, C lowianum, C mastersii, C munronianum, C rectum, C roseum, C sinense, C tigrinum và C tracyanum rất tốt [24]

Một nhóm tác giả Hàn Quốc (Kim và cộng sự 2014) đã nghiên cứu xây dựng

mã vạch cho phong lan tại Hàn Quốc Nhóm này đã phân tích 647 trình tự của các vùng DNA lục lạp rbcL, matK, atpF-atpH, psbK-psbI và trnH-psbA của 89 loài phong

lan và 4 loài đối chứng để phát triển một mã vạch DNA hiệu quả cho Orchidaceae tại Hàn Quốc Mức độ phân giải loài cho từng mã vạch riêng lẻ dao động từ 60,5% (rbcL) đến 83,5% (trnH-psbA) Mức độ phân giải loài đã được tăng cường đáng kể khi kết

hợp năm mã vạch này với nhau Trong số 26 khả năng kết hợp có thể có của 5 vùng, 6

sự kết hợp cho kết quả phân giải loài cao nhất (98,8%) Trong đó, sự kết hợp của

atpF-atpH + psbK-psbI + trnH-psbA, với trình tự DNA ngắn nhất, là lựa chọn tốt nhất cho

mã vạch của các loài phong lan Hàn Quốc [17]

Nhóm tác giả Trung Quốc (Feng và cộng sự, 2015) sử dụng trình tự vùng ITS2

để làm barcode và phân tích phát sinh chủng loài của nhóm Dendrobium dùng làm

dược liệu, có nguy cơ tuyệt chủng và có hình thái ngoài giống nhau đặc biệt ở giai

đoạn chưa ra hoa Kết quả phân tích 43 mẫu ITS2 của Dendrobium và sử dụng trình tự

này của 64 loài Dendrobium để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy vùng ITS2 không

chỉ hiệu quả khi được dùng làm barcode để xác định các loài Dendrobium mà còn có

tiềm năng dùng để phân tích phát sinh loài của chi Dendrobium [15]

Theo Xu và cộng sự 2015, Dendrobium là một trong những chi lớn nhất của

thực vật có hoa, có nhiều vai trò quan trọng trong nghề làm vườn, y học cũng như bảo

tồn đa dạng sinh học; tuy nhiên, đây cũng là một nhóm khá khó khăn để xác định loài Nhóm tác giả này đã phân tích 1698 trình tự của 184 loài Dendrobium chủ yếu thu

nhận tại các vùng đất liền châu Á, đánh giá và kết luận 5 marker – mã vạch duy nhất

(ITS, ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA) có thể dễ dàng khuếch đại và giải trình tự,

barcode do sự kết hợp giữa ITS và matK là mã vạch tối ưu dựa trên tất cả các phương pháp đánh giá Nghiên cứu này cũng đề nghị giới thiệu sự kết hợp ITS + matK như là

mã vạch cho nhóm thực vật có hoa [29]

Trong nước

Việt Nam nằm trong vùng Đông Nam Á thuộc khu vực nhiệt đới gió mùa, nóng

và ẩm rất thuận lợi cho hệ thực vật phát triển Họ Lan ở Việt Nam là một đối tượng

cực kỳ phong phú và đặc sắc của hệ thực vật Việt Nam Trước đây, 1972 ở Việt Nam,

Phạm Hoàng Hộ cho rằng có khoảng 500 loài phân bố rộng rãi, đặc biệt khu vực rừng núi Tây Nguyên và Cao Nguyên trung phần Năm 1988, Trần Hợp đã thống kê sơ bộ

gồm khoảng 126 chi và 36 loài, trong đó có nhiều loài mới trong hệ thực vật toàn cầu

và còn rất nhiều loài chưa được biết đến Dendrobium (Lan Hoàng Thảo, Đăng Lan) là

một loài lớn với hơn 1,200 giống, đứng thứ hai trong gia đình hoa lan về số lượng

giống và cũng đứng thứ hai trong các loài lan được nuôi trồng nhiều nhất chỉ sau

Cattleya Đây cũng là nhóm hoa lan đa dạng có hoa đẹp với nhiều màu sắc và hương thơm

Họ hoa Lan là một họ thực vật được đánh giá là rất khó để nhận diện, định danh đặc biệt là thời kỳ chúng chưa ra hoa Nhiều loài chỉ khác với loài lân cận ở một điểm hình thái rất nhỏ và tinh tế, do vậy rất khó để nhận diện chúng bằng phương pháp hình thái thông thường Hơn nữa, do Orchidaceae rất dễ lai tạo cả ngoài thiên nhiên lẫn

trong nhà trồng, nên có rất nhiều dạng trung gian hoặc các biến dị điều đó dẫn đến việc phân loại chúng ở mức chi và loài cực kỳ khó khăn Do vậy, khi kỹ thuật mã vạch DNA ra đời, nó nhanh chóng trở thành công cụ hữu dụng trong việc định danh các loài, nhất là loài Lan Cùng với đó, các nghiên cứu về đa dạng và nền tảng di truyền bên trong loài và giữa các quần thể là điều rất cần thiết để tạo lập cơ sở dữ liệu về các đặc điểm hình thái và mức phân tử của các loài Lan bản địa

Ở Việt Nam cũng có một số công trình về hướng nghiên cứu này như:

Năm 2012, nhóm tác giả Trần Hoàng Dũng, Trần Lệ Trúc Hà, Vũ Thị Huyền Trang, Trần Duy Qúy đã thành công khi sử dụng mã vạch DNA từ đoạn trình tự ITS

để nhận diện các biến chủng của loài Hương Thảo Trầm Rừng - Dendrobium parashii

– một loài lan rất quý do chúng có mùi hương trầm rất đặc trưng [10]

Hiện nay, tác giả Vũ Thị Huyền Trang cũng đang triển khai nghiên cứu mã

vạch DNA cho các loài lan Hài Paphiopedilum của họ Orchidacea ở Việt Nam

Đề tài luận án tiến sỹ của tác giả Trần Duy Dương bảo vệ năm 2015 sử dụng

chỉ thị ITS để nhận dạng một số nguồn gen Hoàng thảo bản địa quý của Việt Nam

phục vụ công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ liệu cho xây dựng mã vạch DNA Nghiên cứu

giải trình tự và sử dụng vùng ITS của 32 mẫu lan Hoàng Thảo ở Việt Nam để làm cơ

sở nhận diện ở mức loài và dưới loài cho các mẫu vậy này (có 27 mẫu đã được định danh chính xác) Trình tự ITS một lần nữa cho thấy chúng là một mã vạch DNA phổ quát trong việc phân định loài và ở mức dưới loài cho nhóm thực vật có hoa.[9]

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là 30 mẫu (10 loài) lan Dendrobium thu tại vườn lan thuộc

Trung tâm Công nghệ Sinh học tp.HCM, Vườn lan Phú Nhuận, Vườn lan Bình Chánh

Bảng 2.1 Ký hiệu, tên loài và tên khoa học của 10 loài Dendrobium trong nghiên cứu

Với mỗi mẫu, kí hiệu mẫu sẽ là kí hiệu loài kết hợp với địa điểm thu mẫu Ví dụ:

+2TT: loài Hoàng phi hạc, thu mẫu tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM

+2PN: loài Hoàng phi hạc, thu mẫu tại Phú Nhuận

+2BC: loài Hoàng phi hạc, thu mẫu tại Bình Chánh

2.2 P hương pháp

2.2.1 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu lan

Cách chọn mẫu để nghiên cứu: chọn những cây khỏe, bẹ lớn, nhiều thân, cành hoa to, gốc cành hoa thẳng, ngọn cành uốn cong mềm mại, phát hoa có trên 1/3 số nụ hoa đã nở Rễ chắc khỏe, có nhiều rễ nhỏ màu trắng Lá mướt không bầm dập, không

STT Kí hi ệu Tên loài Tên khoa h ọc

1 2 Hoàng phi hạc D signatum Rchb.f

3 10 Thái Bình D pulchellum Roxb ex Lindl

5 15 Giả hạc xuân di linh tím D anosmum var alba

6 18 Xương cá D aloifolium (Bl.) Rchb f

7 21 Thập nhất hoa D aduncum Wall Ex Lindl

8 28 Kim điệp vàng D capillipes Rchb.f

9 35 Hoàng thảo Ngọc Thạch D crystallinum Rchb f

10 37 Hoàng thảo vôi D cretaceum Lindl

dấu hiệu có rệp, đốm đen do cháy nắng hay bị virus Khi mở, cánh hoa phải thẳng và cân đối, không ngửa ra hay cụp vào, màu sắc hoa phải tươi tắn

Mỗi mẫu thu nhận sẽ được tiến hành bảo quản lạnh sâu bằng cách chọn lá bánh

tẻ, lau sạch bằng cồn, để nơi thoáng mát, sau đó cắt từ 1-5g lá tươi cho vào ống falcon 10ml, đánh số ký hiệu (theo số hiệu quản lý mẫu của trung tâm) cẩn thận trong ống lẫn

sổ theo dõi, sau đó cho ống mẫu vật vào tủ lạnh sâu (-20oC đến -80o

C) cho các nghiên cứu về sau

2.2.2 Phương pháp phân tích hình thái

2.2.2.1 Ph ương pháp phân tích hoa theo phẫu thức ngang

2.2.2.2 Phương pháp phân tích hoa theo phẫu thức dọc

Dùng lưỡi lam chẻ đôi hoa thành 2

phần bằng nhau (hoa đối xứng)

Mẫu hoa lan

phần bầu nhụy)

Sắp xếp các cánh hoa và trụ nhụy cho

giống hoa ban đầu

Chụp hình

Hoa đối xứng qua

một mặt phẳng

Quan sát

2.2.2.3 Phương pháp mô tả hình thái thực vật

Các mẫu được mô tả thống nhất như nhau gồm các thông tin về: rễ, thân, hình

dạng lá, chóp lá, hình dạng và màu sắc lá đài lưng, hình dạng và màu sắc lá đài bên, hình dạng và màu sắc cánh hoa, hình dạng và màu sắc cánh môi, kiểu mọc phát hoa,

D/ Kiểu sắp xếp lá: (1) Xoắn; (2) Hai hàng

I1/ Lá đài lưng (trên) - Nhăn hay thẳng: (1) Nhăn; (2) Thẳng

K1/ Lá đài lưng (trên) - Có lông: (1) Có lông; (2) Không

F2/ Hình dạng lá đài bên (2 lá): (1) Hình giáo, thon dài; (2) Bầu dục, trứng

G2/ Màu sắc lá đài bên (2 lá): (1) Trắng, pha lê; (2) Hồng, trà; (3) Lục nhạt, lục sẫm; (4) Tím; (5) Vàng, cam; (6) Đỏ; (7) Nâu vàng

H2/ Đặc điểm lá đài bên: (1) Đốm tím, đỏ; (2) Đốm nâu đỏ; (3) Sọc tím; (4) Sọc nâu đỏ; (5) Sọc lục; (6) Không

I2/ Lá đài bên - Nhăn hay thẳng: (1) Nhăn; (2) Thẳng

K2/ Lá đài bên - Có lông: (1) Có; (2) Không

F3/ Hình dạng cánh hoa: (1) Hình giáo, thon dài; (2) Bầu dục, trứng

G3/ Màu sắc cánh hoa: (1) Trắng, pha lê; (2) Hồng, trà; (3) Lục nhạt, lục sẫm; (4) Tím; (5) Vàng, cam; (6) Nâu vàng

H3/ Đặc điểm cánh hoa: (1) Đốm tím, đỏ; (2) Đốm nâu đỏ; (3) Đốm lục; (4) Sọc tím; (5) Sọc nâu đỏ; (6) Không

I3/ Cánh hoa - Nhăn hay thẳng: (1) Nhăn; (2) Thẳng

K3/ Cánh hoa - Có lông: (1) Có; (2) Không

F4/ Hình dạng môi hoa: (1) Ống; (2) Trụ; (3) Phiến răng reo; (4) Phiến chia thùy;(5)

I4/ Môi hoa - Nhăn hay thẳng: (1) Nhăn; (2) Thẳng

K4/ Môi hoa - Có lông: (1) Có; (2) Không

N4/ Môi hoa - đặc điểm mép môi: (1) Răng reo (có ria, lông); (2) Trơn

M/ Kiểu mọc phát hoa: (1) Đỉnh chồi; (2) Gốc thân; (3) Nách lá

L/ Dạng phát hoa: (1) Hoa đơn; (2) Hoa chùm; (3) Nhánh hoa hoa mọc riêng lẻ,

mọc cụm; (4) Cành đối xứng; (5) Cành kép (Phan Thúc Huân, 2005)

Kết quả được ghi nhận theo bảng:

2.2.3 Tách chi ết DNA tổng số

Mẫu lan Dendrobium thu thập được sẽ được tách DNA tổng số bằng phương pháp

CTAB với một số cải tiến nhỏ [4,35]

Bước 1: Cân 0,5g mẫu lá đã được rửa sạch cho vào eppendorf 2mL

Bước 2: Thêm 500μL CTAB 2% + 2% PVP + 0,2% β – Mercaptoethanol nghiền trong

tủ hút

Bước 3: Bổ sung 4μL RNase, Vortex

Bước 4: Ủ dịch nghiền 60 phút, 65oC; ở 30 phút đầu, cứ 10 phút Vortex 1 lần

Bước 5: Li tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi

Bước 6: Bổ sung 1V Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) đảo đều 5 phút

Bước 7: Li tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi

Bước 8: Lặp lại bước 6, 7

Bước 9: Thêm 0,8V ammonium acetate 7,5M (lạnh) + 1V ethanol

Bước 10: Đảo đều, ủ đá 60 phút

Bước 11: Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa

Bước 12: Rửa tủa bằng 500μL ethanol 70%

Bước 13: Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa

Bước 14: Để khô, bổ sung 100μL TE buffer

2.2.4 Kỹ thuật PCR

Vùng trình tự ITS trong nhân được khuếch đại bằng cặp mồi ITS 1F/4R tham khảo của White và cộng sự, 1990 theo bảng 2.2 Vùng gen matK trong lục lạp được khuếch đại bằng cặp mồi matK 390F/1326R tham khảo của Cuenoud và cộng sự,

2002 Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần như sau: 12,5μL Taq DNA

pol 2x – preMix (GeneOn, Code No S113), 1μL mồi xuôi và ngược (20µM, 1F/4R, GeneOn, Code No F123), 9,5μL nước cất 2 lần khử ion (CTCP Hải Dương, Code No

02081) và 1μL DNA khuôn

Chu kì nhiệt (thực hiện trên máy Esco healthcase, Code No MTP 022112509) cho phản ứng PCR:

+ Khuếch đại vùng ITS gồm: 45 giây ở 98oC, 30 chu kỳ (biến tính 10 giây ở

98oC, bắt cặp 40 giây ở 55oC và kéo dài 40 giây ở 72oC), sau cùng là kết thúc ở 72oC trong 10 phút

+ Khuếch đại vùng matK gồm: 45 giây ở 98oC, 30 chu kỳ (biến tính 10 giây ở

98oC, bắt cặp 40 giây ở 50oC và kéo dài 40 giây ở 72oC), sau cùng là kết thúc ở 72oC trong 10 phút

Bảng 2.2 Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự mục tiêu và kích thước trình tự được khuếch đại

Tm ( o C)

Chiều dài sản phẩm khuếch đại dự kiến (bp)

ITS

800 ITS4R Ngược TCCTCCGCTTAT

2.2.5 Phương pháp điện di trên gel agarose

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, 120V, 65mA trong

20 phút, đệm TAE 0,5X Sản phẩm PCR của các mẫu sẽ được tải vào giếng cùng với một giếng chứa DNA ladder Sau điện di, các băng sáng xuất hiện dưới tác dụng của tia UV và DNA ladder sẽ được dùng làm thang đo kích thước cho các sản phẩm PCR Mỗi băng sáng sẽ biểu diễn cho các đoạn DNA có khối lượng phân tử khác nhau Hai băng sáng liên tiếp cách nhau khoảng 100bp, băng nhỏ nhất (nằm dưới cùng) có kích thước 100bp, băng lớn nhất có kích thước 1000bp (1kb) Băng DNA phải sáng rõ, đúng kích thước như trên lý thuyết thì xem như phản ứng khuếch đại thành công và có thể sử dụng sản phẩm PCR đó để giải trình tự

Nếu quang phổ điện di cho kết quả một dải băng rộng hoặc cho nhiều vạch thì chứng tỏ DNA đã bị gãy đoạn nhiều hoặc lẫn DNA với RNA Nếu quang phổ điện di cho băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy và không lẫn tạp Khi điện di, để hiện lên các băng DNA, trên bảng gel điện di có thể dùng ethidium bromid Thuốc thử này tạo liên kết nhuộm với các base nito, khi chiếu tia tử ngoại (tia UV) vào bảng gel thì các băng sáng hiện lên [1]

2.2.7 Hiệu chỉnh trình tự

2.2.7.1 Hiệu chỉnh trình tự bằng phần mềm FinchTV

Kết quả giải trình tự 2 chiều được trả về dưới các dạng file: file AB1 (.ab1) và file text Sử dụng phần mềm FinchTV mở file AB1 đối với trình tự được giải với mồi

xuôi (forward) và mồi ngược (reverse)

Trong các cửa sổ hiện ra có các sóng sắc phổ:

• Màu xanh lục: nucleotide loại A (Adenine)

• Màu xanh dương: nucleotide loại C (Cystein)

• Màu đen: nucleotide loại G (Guanine)

• Màu đỏ: nucleotide loại T (Thyamine)

Nếu kết quả giải tốt sẽ thấy các đỉnh (peak) rõ ràng, không mập mờ (unambiguous) thể hiện cho từng loài nucleotide loại A – T – G – C Sử dụng các thanh trượt X và Y để tăng hoặc giảm lần lượt chiều rộng và chiều cao của các đỉnh sóng nhìn chưa rõ Quan sát và xóa bỏ các đoạn đầu và cuối của kết quả, những đoạn

có các đỉnh sóng mập mờ

2.2.7.2 Hiệu chỉnh trình tự bằng phần mềm SeaView

Bước 1: trong cửa sổ chương trình FinchTV chọn menu ‘Edit’, chọn ‘copy in

FASTA Format’ (hoặc sử dụng tổ hợp phím nhanh Ctrl+C)

Bước 2: mở phần mềm SeaView 4.2.12, vào menu ‘Edit’ chọn “load sequence” Khi cửa sổ hiện ra, nhấn tổ hợp phím Ctrl+V để dán trình tự đã copy dưới định dạng FASTA vào Tiến hành cắt phần tên của trình tự (định dạng FASTA, ví dụ D26 – F) và chuyển vào ổ ‘Sep name’ trong cửa sổ, chọn “Add to alignment”