Khảo sát thành phần hóa học cây cành giao euphorbia tirucalli l thu hái ở tỉnh bình thuận

học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dược thảo có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh.. Tuy nhiên nhiều cây thuốc chỉ đ

L ỜI CẢM ƠN

B ằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn

Thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Tất cả quý thầy cô Khoa Hóa, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình

dạy dỗ, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt bốn năm qua

Các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn trong quá trình làm khóa luận

Ba, Mẹ và những người thân trong gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất giúp

em vượt qua mọi khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận này

M ỤC LỤC

L ỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO 2

1.1.1 Mô tả chung 2

1.1.2 Vùng phân bố 2

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 3

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền 3

1.2.2 Nghiên cứu về dược tính 4

1.2.3 Độc tính 4

1.2.4 Ứng dụng khác 4

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 10

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 10

2.1.1 Hóa chất 10

2.1.2 Thiết bị 10

2.2 NGUYÊN LIỆU 10

2.2.1 Thu hái nguyên liệu 10

2.2.2 Xử lí mẫu nguyên liệu 11

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 11

2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 11

2.4.1 Sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate 11

2.4.2 Sắc ký cột trên phân đoạn HA.1.(7+8) 12

2.4.3 Sắc ký cột trên phân đoạn HA.1.(7+8).2 12

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C4 13

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C3 15

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 17

4.1 KẾT LUẬN 17

4.2 ĐỀ XUẤT 17

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 18

PH Ụ LỤC

DANH M ỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

 HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây cành giao 2

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập được từ E.tirucalli 7

Hình 3.1 C ấu dạng và tương quan HMBC của G.C4 14

Hình 3.2 Công th ức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C3 16

Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate 17

 SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao 13

 BẢNG BIỂU B ảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây 4

B ảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây 6

B ảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate 11

B ảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất G.C4 14

B ảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất G.C3 16

học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dược thảo

có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh Tuy nhiên nhiều cây thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu một cách có hệ

thống, trong đó có cây cành giao

Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam Tuy nằm trong từ điển cây thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực

hiện Những nghiên cứu đi trước về Euphorbia tirucalli L cho thấy cây cành giao là loại

cây có nhiều tiềm năng

Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp

phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO [1]

Tên thông thường: Cành giao

Tên gọi khác: lục ngọc thụ, xương khô, bút chì, thanh san hô, san hô xanh, nọc rắn Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Tên khoa học: Euphorbia tirucalli L

Hình 1.1 Cây cành giao 1.1.1 Mô tả chung [1]

Cây cành giao có thể cao 4-7 m, thân có thể có đường kính bằng cổ tay, cành nhiều, mọc so le hay hơi vòng, màu xanh, gầy

Lá nhỏ, hình mác hẹp, hơi dày, rất chóng rụng, phiến lá dài 12-16 mm, rộng 2 mm Hoa tập trung ở những chỗ phân nhánh hoặc tận cùng ở đầu cành Quả nang, hơi có lông, có 3 mảnh vỏ Hạt hình trái xoan, nhẵn

1.1.2 Vùng phân b ố

Cành giao có nguồn gốc ở đảo Mangat (châu Phi) Phát hiện thấy ở Việt Nam từ năm 1970.[1]

Cây cành giao có mặt ở hầu hết các châu lục, đặc biệt các vùng có khí hậu nhiệt đới

hoặc khô như châu Phi, châu Á và Nam Mỹ Cây cành giao được xác định bởi Linnaeus vào năm 1973.[7]

1.2 CÁC NGHIÊN C ỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền

Toàn cây cành giao có vị cay, hơi chua, tính mát, hơi có độc, có tác dụng thúc sữa, sát trùng, khử phong, tiêu viêm, giải độc Dân gian thường dùng cành giao để trị đau nhức, côn trùng đốt, chấn thương…

Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đông Phi, mủ

của cành giao được sử dụng để chống liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn

cắn Ở Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng để chữa trị loét mũi, trĩ và các chỗ sưng Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng cành giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và được sử dụng như là một phương thuốc cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, bệnh phù, bệnh phong, huyết trắng, khó tiêu, vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang Duke (1983) và Van Damme (1989)

đề cập rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung thư biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn còn tranh cãi về cơ sở khoa học

về hợp chất chống ung thư của cây Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng như thuốc gây nôn và trị giang mai Ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức xương trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ Nước sắc

từ thân cây để chữa bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983) Ở Java,

mủ được sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[15]

Một số bài thuốc theo y học cổ truyền:

Chữa viêm xoang, viêm mũi dị ứng: dùng khoảng 15 đốt cành cây cành giao, cắt

nhỏ từng đoạn 5 mm, cho vào túi nilon đập nát rồi cho vào ấm có vòi với lượng nước vừa

đủ, đun sôi, dùng giấy cuộn thành ống lắp vào đầu vòi, cho vào mũi để hít hơi nước, hơi thuốc vào mũi, thỉnh thoảng hít cả vào miệng Thời gian xông 10-15 phút Xông liên tục 3-

5 ngày, bệnh nặng có thể xông 7-10 ngày Cần chú ý không dùng cho phụ nữ có thai.[26]

Chữa côn trùng, ong đốt, rắn cắn, bò cạp đốt…: dùng cành cây cành giao giã nhỏ, đắp lên vết thương.[22]

Chữa mụn cơm: dùng nhựa mủ cây cành giao đắp lên mụn cơm.[26]

1.2.2 Nghiên cứu về dược tính

Cao chiết các bộ phận của cây được thử nghiệm các loại hoạt tính sinh học và dược học, được mô tả trong Bảng 1.1

B ảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây

Avelar 2011[2]

Betancur-Galvis 2002[3]Kháng ung thư và điều trị AIDS Cao chiết cây Dias 2006[4]

Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan Cao chiết cây Jyothi 2008[9]

Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại:

1.2.2 Ứng dụng khác

Nguồn năng lượng thay thế: Nhựa cây chứa hàm lượng lớn triterpenoid có 30

carbon có thể thực hiện cắt mạch để cho xăng có chỉ số octane cao.[15]

Nguồn cao su: Nhựa cây chứa nhiều terpene và resin có thể chuyển hóa thành cao su

với giá thành thấp Trong suốt chiến tranh thế giới thứ II, nhựa cây được sử dụng ở Nam Phi.[15]

Nông lâm nghiệp: Với đặc tính chống hạn cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn

hán để bảo vệ đất.[15]

1.3 CÁC NGHIÊN C ỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

Euphorbia tirucalli có chứa chất nhựa màu trắng như sữa trong toàn cây khi cắt ngang Nhựa cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khô, trong đó gồm 21-27% các hợp

chất tan trong nước, 59-63% resin và 12-14% các hợp chất như cao su.[15]

Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L

tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene, diterpene, polyphenol…(Uchida Hidenobu Y.H và cộng sự, 2009; Lin S.-J và cộng sự, 2001; Yoshida T và cộng sự, 1991).[11][18][21] Nhựa của Euphorbia tirucalli L cũng được

nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane

và tigliane (Fuerstenberger G và cộng sự, 1985; Fuerstenberger G., 1977).[5][6]

Năm 1977, Fuerstenberger G và Hecker E cô lập được 4 hợp chất mới từ mủ của

cây Euphorbia tirucalli Đó là các hợp chất 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2), 3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) và ingenol (4).[5]

Năm 2001, Lin S.-J đã cô lập được 14 hợp chất, đó là

3,3',4-tri-O-methyl-4-O-rutinosyl ellagic acid (22), gallic acid (23), 1-O-galloyl- β-D-glucoside (24),

1,2,3-tri-O-galloyl-β-D-glucoside (25), corilagin (26), pedunculagin (27), casuariin (28), quercitrin

(29), putranjivain B (30), putranjivain A (31), 3,3'-di-O-methyl gallic acid;

2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside và rutin 5-desgalloylstarchyurin.[10]

B ảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây [15]

Toàn cây Uchida và cộng sự 2010

Cycloeuphordenol (12) (triterpene) Nhựa cây Khan 2010

Cyclotirucanenol (13) (triterpene) Nhựa cây Khan và Ahmed 1988

Euphol (14) và β-amyrin (15)

(triterpenoid)

Toàn cây Uchida và cộng sự 2010

Euphorcinol (16) (pentacyclic triterpene) Vỏ thân cây Khan 1989

Tirucallin B (20) và euphorbin F (21)

(dimer)

Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991

HO O H HO

OH OH

H H

O H

HO OH

OH

H H

H

HO

H

H H

H

Campesterol (7)

HO

H H

H

HO

H H

HO

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E tirucalli

H HO

Euphorbol (17)

O O

O O

O

OH HO

OH

OH HO HO

OH OH OH

O O

OH OH

O

OH HO

OH

OH HO

OH OH OH

O

O

O O

O

O O

H

O OH

OH

OH OH OH

OH

OH HO OH HO

HO

OH

OH HO

OH

HO

O

O O O

O O

O O

O

O O O

O

O

OH OH OH

OH HO

HO

OH OH

OH OH

OH OH

OH

OH OH OH OMe

O galloyl

HOOHO

galloyl

1,2,3-tri-O-galloyl-β −D-glucoside (25)

O O OH

O galloyl HO

O HO

CO OCH2

O COO

OH HO

HO HO

HO OH

O O CO

HO H O O O O

H HO

OH OH OH

OH OH

OH

OH

OH HO

OH HO

O

OH HO HO

Quercitrin (29)

O

O O

OH HO

HO OH

O

O O

HO H

OH

HO OH HO

Putranjivain B (30)

OH HO

O O O

CO

O CH2O CO

CO

O OH O

HO

OH OH

CO

O O

OOC

OH OH OH

HO

Putranjivain A (31)

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E tirucalli (tiếp)

 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate, acetic

acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, n-butanol và nước cất

 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng vanillin/H2SO4

2.2 NGUYÊN LI ỆU

2.2.1 Thu hái nguyên li ệu

Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là thân cây cành giao Euphorbia tirucalli L được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 3 năm

2015

2.2.2 X ử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô rồi xay thành bột

mịn Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột cây 3.5 kg được trích kiệt với ethanol mỗi lần 10 lít và lặp lại hai lần theo phương pháp đun hoàn lưu trong vòng 7 giờ, lọc, cô quay thu hồi dung môi Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, thấy kết tủa xuất hiện, lọc riêng phần tủa ethanol thô (250.4 g) và phần dịch ethanol thô Et1 (290.3 g) Tiếp tục hòa phần tủa ethanol thô với ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa còn lại (149.2 g) Cao ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và

butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong Sơ đồ 2.1

2.4 CÔ L ẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 2.4.1 S ắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung

hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM)

Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn

Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate

Phân

đoạn

1 HA.1.1 (1.58 g) HA.2.1 (0.37 g) Nhiều vết Vệt dài Chưa khảo sát Chưa khảo sát

2 HA.1.2 (2.76 g) HA.2.2 (3.14 g) Vệt dài Nhi ều vết Chưa khảo sát Đã khảo sát

3 HA.1.3 (1.15 g) HA.2.3 (2.12 g) Nhiều vết Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát

4 HA.1.4 (2.48 g) HA.2.4 (4.21 g) Nhiều vết Nhiều vết Chưa khảo sát Đã khảo sát

5 HA.1.5 (2.35 g) HA.2.5 (2.69 g) Vệt dài Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát

6 HA.1.6 (2.50 g) HA.2.6 (3.15 g) Nhiều vết Nhiều vết Đã khảo sát Chưa khảo sát

8 HA.1.8 (0.24 g) HA.2.8 (0.89 g) Nhi ều vết Vệt dài Đã khảo sát Chưa khảo sát

2.4.2 S ắc kí cột silica gel trên phân đoạn HA.1.(7+8)

Phân đoạn HA.1.(7+8) cho SKLM nhiều vết nên phân đoạn HA.1.(7+8) được thực

hiện SKC silica gel với hệ dung môi rửa giải H:EA:Ac:AcOH (3:1:1:0.2) Dịch giải ly qua

cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 18 phân đoạn

(HA.1.(7+8).1-HA.1.(7+8).18), được trình bày trong Sơ đồ 2.1

2.4.3 S ắc kí cột silica gel trên phân đoạn HA.1.(7+8).2

Phân đoạn HA.1.(7+8).2 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn HA.1.(7+8).2

được thực hiện sắc ký cột qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM Những lọ cho kết

quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 10 phân

đoạn (HA.1.(7+8).2.1-HA.1.(7+8).2.10)

Phân đoạn HA.1.(7+8).2.5-7 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu cam, xuất hiện

tủa Lọc thành 2 phần tủa và dịch Lấy phần tủa cho qua SKC với hệ dung môi

H:C:EA:Ac:H2O ( 5:1:2:2:0.02) thu được hai hợp chất GC3 (6 mg) và GC4 (8 mg) có

dạng bột màu vàng Quá trình thực hiện được tóm tắt theo Sơ đồ 2.1

Đun hoàn lưu với ethanol, lọc,

cô quay thu hồi dung môi

HA.1.(7+8)

6.19 g

Sephadex LH-20 /MeOH HA1.(7+8).2.5-7

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C4

Hợp chất G.C4 thu được được từ phân đoạn HA.1.(7+8) của cao ethyl acetate với

các đặc điểm như sau:

Phổ 1H-NMR cho thấy GC4 là một flavonoid glycosid với sự hiện diện của phân

tử L- rhamnopyranosyl bao gồm tín hiệu của proton anomer tại δH 5.52 trên phổ 1

NMR, bốn proton gắn oxygen trong vùng từ 3.40 – 4.22 ppm, một tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl tại δH 0.91 (3H, d, 5.5) Tín hiệu của một cặp proton nhân thơm ghép meta

H-với nhau tại δH 6.26 và 6.46 (mỗi 1H, d, 2.0), ba proton nhân thơm ghép cặp với nhau ở

vị trí 1,2,4 tại δH 7.51 (1H, d, 2.0), δH 7.40 (1H, dd, 8.5, 2.0), δH 6.98 (1H, d, 8.0), một nhóm hydroxy kiềm nối tại δH 12.72 giúp xác định hợp chất chứa một phân tử aglycone

Phổ HMBC cho thấy tương quan của tín hiệu proton H-1” (δH 5.52) và C-3 (δC

135.9) chứng tỏ phân tử L-rhamnose được liên kết với phân tử aglycone tại C-3

Ngoài ra, phổ 13C-NMR cho thấy các tín hiệu carbon tương ứng với bảy tín hiệu carbon thơm liên kết trực tiếp với oxygen trong vùng từ 135 – 164 ppm, bảy tín hiệu carbon thơm không liên kết với oxygen, một tín hiệu của nhóm carbonyl C=O tại δC

179.4, một tín hiệu nhóm methyl tại δC 17.8 và bốn tín hiệu cacbon liên kết với oxygen

của phân tử đường L-rhamnopyranosyl