Xác định kiểu gen, các đột biến kháng thuốc của virus viêm gan b trên bệnh nhân tại tp hồ chí minh

HỒ CHÍ MINH Vũ Thị Ngọc Hà XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP... HỒ CHÍ MINH Vũ Thị Ngọc Hà XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Vũ Thị Ngọc Hà

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Vũ Thị Ngọc Hà

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CAO MINH NGA

Thành phố Hồ Chí Minh – 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin đảm bảo sự chính xác và trung thực trong công trình nghiên cứu khoa học của cá nhân tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn hoàn toàn khách quan và chưa được tác giả nào công bố trên bất kì một công trình khoa học nào khác

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện của các cấp lãnh đạo, đồng nghiệp, người thân và bạn bè

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến :

PGS.TS Cao Minh Nga, cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

TS Cao Hữu Nghĩa, BS Trần Tôn, ThS Nguyễn Đức Trúc cùng các anh chị trong phòng HIV- Khoa LAM- Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại Viện Pasteur

Quý thầy cô giảng dạy lớp Vi sinh vật học khóa 23, quý thầy cô Phòng Sau đại học, quý thầy cô Khoa Sinh học đã nhiệt tình tổ chức, giảng dạy, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi

Ban Giám hiệu và các đồng nghiệp trong tổ Sinh học trường THPT Hiệp Bình- Quận Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để tôi có thể học tập và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè trong lớp Vi sinh vật học Khóa

23 đã góp ý, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tp Hồ Chí Minh, Ngày 18/03/2015

Học viên

Vũ Thị Ngọc Hà

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục các bảng

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan B 5

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu 7

1.2 Phân loại và đặc điểm sinh học 9

1.2.1 Phân loại 9

1.2.2 Các dạng cấu trúc 9

1.2.3 Thành phần cấu trúc kháng nguyên 10

1.2.4 Cấu trúc bộ gen HBV 11

1.2.5 Các kiểu gen của HBV 15

1.2.6 Quá trình nhân bản của HBV 16

1.3 Tình hình nhiễm HBV và dịch tễ học 18

1.3.1 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam 18

1.3.2 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B 19

1.4 Đặc điểm sinh bệnh học 21

1.4.1 Con đường lây nhiễm 21

1.4.2 Triệu chứng lâm sàng 24

1.5 Biện pháp phòng ngừa và điều trị 25

1.5.1 Biện pháp phòng ngừa 25

1.5.2 Điều trị 28

1.6 Các biến thể của virus viêm gan B 34

1.6.1 Khía cạnh sinh thái học vi sinh vật của các biến thể HBV 34

1.6.2 Những đột biến đã được nghiên cứu 35

1.6.3 Các vùng gen đột biến có ý nghĩa trong lâm sàng 35

1.6.4 Một số ghi nhận về tình trạng kháng thuốc 36

1.7 Cơ sở phân tử và ý nghĩa của hiện tượng đột biến gen 37

1.7.1 Cơ sở phân tử 37

1.7.2 Ý nghĩa của đột biến trên lâm sàng 39

1.8 Kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 41

1.8.1 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng để nghiên cứu 41

1.8.2 Kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong đề tài 41

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Bệnh phẩm và quy trình nghiên cứu 42

2.2 Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.1 Thu thập thông tin bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm 43

2.2.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện HBsAg trong huyết thanh 44

2.2.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA 45

2.2.4 Phương pháp real-time PCR 46

2.2.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 50

2.2.6 Điện di dung dịch PCR: 53

2.2.7 Tinh sạch sản phẩm PCR 57

2.2.8 Phản ứng PCR sequencing 58

2.2.9 Tủa sản phẩm PCR sequencing 59

2.3 Giải trình tự 61

Chương 3 KẾT QUẢ 64

3.1 Thông tin và các kết quả xét nghiệm của bệnh nhân 64

3.1.1 Thông tin cá nhân 64

3.1.2 Hàm lượng DNA HBV 64

3.1.3 Xác định genotype và tình trạng kháng thuốc 65

3.2 Phân tích kết quả 71

3.2.1 Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân 71

3.2.2 Sự phân bố genotype theo hàm lượng DNA 72

3.2.3 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo giới tính bệnh nhân 72

3.2.4 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo hàm lượng DNA 73

3.2.5 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo genotype 74

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

4.1 Kết luận 77

4.2 Kiến nghị 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADV: Adeforvir dipivoxil

ALT : Alamine aminotransferase

cccDNA: covalently closed cicular DNA

DNA: Deoxyribonucleic acid

HBV: Hepatitis B virus- virus gây viêm gan siêu vi B

HBsAg: Hepatitis B Surface Antigen – Kháng nguyên bề mặt virus gây viêm gan B

HBcAg: Hepatitis B Core Antigen – Kháng nguyên lõi virus gây viêm gan B

HBeAg: Hepatitis B Early Antigen – Kháng nguyên lõi virus gây viêm gan B

HCV: Hepatitis C virus- virus gây viêm gan siêu vi B

LAM: Lamivudine

mRNA: RNA thông tin

NER: nucleotide excision repair

ORF: Open Reading Frame

PCR: Polymerase Chain Reaction

pgRNA: pregenomic RNA

RNA: Ribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Kỹ thuật sinh học phân tử 41

Bảng 2.1 Hóa chất PCR1 51

Bảng 2.2 Hóa chất PCR2 52

Bảng 2.3 Quy trình PCR 53

Bảng 3.1 Tỉ lệ tải lượng HBV DNA 65

Bảng 3.2 Tỉ lệ genotype 68

Bảng 3.3 Sự phân bố genotype theo hàm lượng DNA 72

Bảng 3.4 Tình trạng kháng thuốc theo hàm lượng DNA 73

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ nhiễm HBV theo giới tính 64

Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ kháng thuốc của HBV 71

Biểu đồ 3.3 Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân 72

Biểu đồ 3.4 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo giới tính 73

Biểu đồ 3.5 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo Genotype 74

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng cấu trúc HBV 10

Hình 1.2 Cấu trúc các loại kháng nguyên 11

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gen HBV 14

Hình 1.4 Sự phân bố kiểu gen HBV trên thế giới 15

Hình 1.5 Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào chủ 17

Hình 1.6 Bản đồ phân tán virus Viêm gan B 20

Hình 1.7 Công thức hóa học của LAM 31

Hình 1.8 Cơ chế tác động của LAM 32

Hình 1.9 Cấu tạo của ADV 33

Hình 1.10 Cơ chế tác động của ADV 34

Hình 2.1 Đường chuẩn xây dựng từ các nồng độ DNA standard đã biết 49

Hình 2.2 Kết quả real-time HBV trên các DNA standard, mẫu chứng âm và mẫu dương tính với HBV 50

Hình 2.3 Thang DNA 100bp 56

Hình 2.4 Thang DNA 1 kb 57

Hình 3.1 Kết quả giải trình tự HBV genotype B hoang dại 66

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự HBV genotype B đột biến 67

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Viêm gan đang là vấn đề sức khỏe được cả thế giới quan tâm Hiện có 6 loại virus viêm gan, đó là virus A, B, C, D, E và G; trong đó virus HBV và HCV là nguy hiểm nhất Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), thế giới có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B và 200 triệu người nhiễm virus viêm gan C

HBV là một loại virus thuộc họ Hepdnavirus, có khả năng gây các bệnh viêm gan, hoại tử gan cấp hoặc mạn tính, xơ gan và đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào gan HBV

có con đường lây nhiễm giống HIV (lây truyền bằng đường máu, đường mẹ sang con, qua đường tình dục không an toàn hoặc tiếp xúc với các dịch tiết qua các vết xước…) nhưng khả năng lây nhiễm gấp 100 lần so với HIV HBV là một yếu tố gây ung thư đứng thứ 2 sau thuốc lá, là nguyên nhân gây ra 60- 80% trường hợp ung thư gan nguyên phát và 50% trường hợp xơ gan [59]

Tỉ lệ nhiễm HBV thay đổi theo từng vùng địa lí khác nhau: hơn 8% dân số Châu Phi và Châu Á, 2-7% ở Nam Âu và Đông Âu, khoảng 2% ở Tây Âu, Bắc Mỹ và Châu

Úc [18] Theo công bố của Chủ tịch Hội Gan Mật Việt Nam tại Hội nghị Gan Mật toàn quốc khai mạc ngày 28/9/2013, có khoảng 20 triệu người Việt Nam nhiễm virus viêm gan, trong đó có khoảng 12-16 triệu người bị nhiễm viêm gan B (khoảng 5 triệu người

bị viêm gan mãn tính, xơ gan, ung thư gan) Như vậy, nước ta nằm trong vùng lưu hành cao với 8-15% dân số đang nhiễm HBV và khoảng 47,6% dân số đã từng tiếp xúc với HBV

Để phòng bệnh viêm gan do HBV gây ra, hiện đã có vacxin phòng bệnh cho trẻ

em và người có nguy cơ lây nhiễm cao Thuốc kháng virus để điều trị viêm gan B mạn tính cũng được nghiên cứu và đưa vào sử dụng rộng rãi như thuốc chích interferon, thuốc uống thuộc nhóm L- Nucleoside, nhóm Acyclic Phosphonate, nhóm vòng Cyclopantatane/Pentene Hiện có ba nhóm thuốc kháng HBV (antiviral drugs) dạng uống đang được sử dụng phổ biến để điều trị viêm gan virus B mạn là: (1) nhóm L- Nucleoside gồm Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Emtricitabine (FTC) và Clevudine (L- FMAU); (2) nhóm Acyclic Phosphonate gồm: Adeforvir dipivoxil (ADV)

và Tenofovir (TDF); (3) nhóm vòng Cyclopantatane/Pentene gồm Entecavir (EBV),

Abacavir/ Cabovir (ABC) Các thuốc này có tác dụng ức chế enzyme reverse polymerase- enzyme xúc tác cho sự sao chép ngược từ mRNA thành DNA của HBV làm giảm sự nhân lên của HBV, từ đó làm giảm một cách có ý nghĩa biến chứng xơ gan, ung thư biểu mô tế bào gan và nguy cơ tử vong của bệnh nhân Tuy nhiên, việc điều trị trong một thời gian dài với các thuốc này có thể làm xuất hiện các đột biến kháng thuốc (HBV antiviral drug resistance mutations) trên gen P của HBV, làm mất tác dụng của thuốc, dẫn đến điều trị thất bại và làm bệnh gan tiếp tục phát triển [19]

Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế kỹ 20 đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của vi rút viêm gan B, và từ đó một dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype Chín kiểu gen của HBV đã được xác định (Từ A đến I) dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ trình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau Tuy nhiên sự phân loại các HBV genotype có thể chỉ cần dựa trên trình tự chuỗi (sequence) của một đoạn gen nào đó của HBV như trên một phần trình tự chuỗi của gen pre-S, S Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định HBV genotype như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch enzyme (Enzyme-linked Immunoassay) và Real –time PCR Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên phương pháp giải trình tự chuỗi có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên cạnh việc xác định được trình tự chuỗi các nucleotides trong bộ gen của HBV để từ đó so sánh với thư viện gen và xác định được HBV genotype mà còn dựa vào kết quả giải trình tự này chúng ta có thể xác định được một số dạng đột biến kháng thuốc của HBV

để từ đó có phác đồ điều trị tối ưu [23]

Xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc là rất cần thiết đối với bệnh nhân

đã và đang điều trị Viêm gan siêu vi B bằng thuốc uống Tuy nhiên, đối với bệnh nhân nhiễm HBV chưa từng điều trị thì xét nghiệm này chưa được quan tâm Vì vậy, chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN

KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP.HỒ CHÍ

MINH”

2 Mục tiêu của nghiên cứu là

1 Xác định genotype HBV trên bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B chưa điều trị

thuốc kháng virus

2 Mô tả sự phân bố genotype HBV theo giới tính, lứa tuổi, số lượng HBV- DNA

3 Khảo sát kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân chưa từng điều trị thuốc kháng virus

3 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân sinh sống ở các tỉnh thành thuộc miền Đông Nam Bộ chưa từng khám

và điều trị thuốc kháng virus, tới khám ở bệnh viện Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh

từ tháng 1/2014 đến tháng 6/2014

4 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với HBV

- Thu thập thông tin tương ứng với mẫu bệnh phẩm

- Tách chiết HBV DNA bằng phương pháp tủa

- Xác định tải lượng HBV DNA bằng phương pháp real- time PCR

- Xác định kiểu gen và tính kháng thuốc của virus viêm gan B trong máu bệnh nhân bằng kỹ thuật giải trình tự, thực hiện trên hệ thống máy giải trình tự CEQ 8000 của hãng Beckman Coulter

- Ghi nhận kết quả và xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 20.0

5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

Tuy việc phòng ngừa và điều trị Viêm gan do virus đã và đang được quan tâm nhưng Việt Nam vẫn là nước thuộc vùng lưu hành dịch bệnh Viêm gan virus B cao trên thế giới Việc điều trị thuốc kháng virus trong thời gian dài làm xuất hiện các quần thể virus kháng thuốc trong cộng đồng Các bác sĩ thường theo dõi và đề nghị bệnh nhân làm xét nghiệm kiểm tra tình trạng kháng thuốc của virus để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp nhất cho bệnh nhân đang điều trị nhưng đối với bệnh nhân tới khám lần đầu thì điều này chưa được quan tâm Do vậy, chúng tôi thực hiện khảo sát kiểu gen và tỉ lệ đột biến đối với bệnh nhân mắc viêm gan B chưa từng điều trị thuốc kháng virus với mục đích tìm hiểu khả năng lây truyền của quần thể virus viêm gan B trong cộng đồng

6 Bố cục của đề tài

Mở đầu

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3 Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan B

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Viêm gan (Hepatitis) là tổn thương tại gan với sự có mặt của các tế bào bị viêm trong mô gan Vàng da là một trong những triệu chứng phổ biến nhất của viêm gan Vì vậy, lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan chính là lịch sử nghiên cứu bệnh vàng da Bệnh

ở gan cũng có nhiều nguyên nhân, trong đó tác nhân virus là chủ yếu Viêm gan virus thường gặp do các virus có tính hướng gan như HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, gây

Năm 1885, Virchow đã mô tả bệnh gan là bệnh “vàng da xuất tiết” (catarrhal) Nguyên nhân của bệnh là chất nhầy dính làm tắc đường mật, do vi khuẩn gây viêm ở chỗ nối đường mật – tá tràng Quan niệm này của Virchow gây ảnh hưởng đến nửa đầu thế kỷ XX (Thế chiến thứ II)

Năm 1908, McDonald cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là do virus

Năm 1919, Lindstedl đã đặt ra thuật ngữ VG cho bệnh vàng da xuất tiết và đã phân biệt hai dạng VG dịch tễ và VG huyết thanh

Năm 1943 – 1946, các nghiên cứu ở Anh và Mỹ cho rằng VRVG hiện diện cả trong huyết thanh của những người khỏe mạnh bình thường và không vàng da Nhưng chỉ đến Thế chiến thứ II, các trận dịch VG trên toàn thế giới mới đưa đến nhận thức tổng quát về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết

Năm 1947, MacCallum và Bauer đưa ra thuật ngữ viêm gan truyền nhiễm qua đường phân miệng là viêm gan A và viêm gan B cho viêm gan liên quan đến huyết thanh Khái niệm này được Ủy ban của Tổ chức Y tế Thế Giới về VGVR chấp thuận

Năm 1963, Blumberg và Alter, khi nghiên cứu về sự đa hình của các protein bằng thử nghiệm khuyếch tán trên gel đã phát hiện trong huyết thanh của thổ dân Australia bị bệnh bạch cầu một loại protein mới

Năm 1965, protein này được gọi là kháng nguyên Australia Sau khi khám phá

ra kháng nguyên Australia trong huyết thanh, Blumberg và cộng sự nhận xét rằng kháng nguyên này hiện diện với nồng độ cao ở bệnh nhân ung thư máu và ở các trẻ bị bệnh Down

Năm 1968, các nhà nghiên cứu khác, nhất là Prince, Okochi và Murakami, đã xác định kháng nguyên Australia chỉ được tìm thấy trong huyết thanh người nhiễm VRVGB, từ đó VRVGB mới được nhận biết và xác lập đặc điểm

Từ năm 1942-1967, việc nghiên cứu thực nghiệm viêm gan trên chính cơ thể con người (Đức và Mỹ) đã bị nhiều người phê phán do vấn đề y đức Nhưng cũng nhờ đó

mà các đặc điểm dịch tễ, bệnh sử và phòng ngừa của VG A và VGB được hiểu biết rõ hơn

Năm 1970, khi quan sát trên kính hiển vi điện tử Dane phát hiện ra hạt tương tự virus (gọi là hạt Dane) mang trên bề mặt kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân Hạt tử Dane chính là HBV hoàn chỉnh và kháng nguyên Australia là kháng nguyên bề mặt của VR, gọi là HBsAg

Năm 1972, Magnus và Espmark lần đầu tiên mô tả HBeAg- kháng nguyên liên quan tới khả năng lây nhiễm

Năm 1973, Kaplan phát hiện DNA polymerase nội sinh trong vỏ ngoài của các hạt Dane

Năm 1979, Robinson đã dùng DNA polymerase này để nhân dòng HBV DNA

và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần Ông cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao chép trong môi trường nuôi cấy mô Từ đó, xác định được nét độc đáo trong bộ gen HBV: Các khung đọc gối lên nhau, phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu DNA [2]

Năm 1983, Mullis K.B đã tìm ra phản ứng trùng hợp chuỗi polymerase (PCR) Đây là phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao của một chuỗi mã nhất định Sự khuếch đại virus bằng PCR giúp phát hiện trực tiếp và nhanh

HBV DNA trong huyết thanh, tế bào và các mô, hơn là phát hiện nhiễm HBV qua đáp ứng miễn dịch ký chủ đối với kháng nguyên virus [11] Nhờ phát minh này mà việc nghiên cứu sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh bệnh học, chẩn đoán, điều trị và dự phòng của HBV diễn ra dễ dàng hơn

1.1.2 Tình hình nghiên cứu

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên bản đồ phân tán của bệnh VGB, Châu Á và Châu Phi là vùng lưu hành nội dịch cao.Viêm gan virus B đã và đang là vấn đề sức khỏe được quan tâm trên toàn thế giới do tỉ lệ nhiễm bệnh cao và biến chứng nguy hiểm như gây xơ gan, ung thư gan

Sự phân bố của genotype là tùy thuộc vào địa dư Ở khu vực Đông Nam Á, kiểu gen B và C là chủ yếu Genotype của HBV liên quan khá nhiều đến tiến triển bệnh, đột biến và kháng thuốc Nhiều nghiên cứu đã cho thấy genotype C có dự hậu kém, đáp ứng kém với thuốc kháng virus nguy cơ đột biến core promoter cao và nguy cơ ung thư gan cao hơn genotype B [8] Theo một nghiên cứu thực hiện ở Nhật Bản trên bệnh nhân viêm gan mạn thì những người nhiễm kiểu gen B có sự tiến triển sang xơ gan chậm hơn kiểu gen C [47]

Hiện nay đã có rất nhiều thuốc điều trị virus viêm gan B được chấp thuận và đưa vào sử dụng như: thuốc tiêm Interferon, thuốc uống là các chất tương tự nucleotide Tuy nhiên, thuốc uống thường được sử dụng hơn do sự tiện dụng của nó Việc điều trị virus viêm gan B bằng thuốc uống trong thời gian dài thường làm xuất hiện các quần thể virus kháng thuốc làm giảm hiệu quả của việc điều trị Tỉ lệ đột biến kháng thuốc khác nhau với từng kiểu gen, độ nhạy của kỹ thuật phát hiện và quan trọng hơn là sự tuân thủ của bệnh nhân theo phác đồ điều trị

Lamivudine được chấp thuận dùng để điều trị VGB từ năm 1998, vì vậy việc virus kháng LAM cũng được quan tâm trước tiên Theo các nghiên cứu, tỉ lệ kháng LAM tăng dần theo thời gian điều trị Như nghiên cứu của Kao năm 2000, tỉ lệ đột biến này

là 17%, 22%, 37% tương ứng với số năm điều trị là 1 năm, 2 năm và trên 3 năm [38]

Adeforvin thường được các bác sĩ lựa chọn thay thế cho LAM khi phát hiện có virus kháng ADV, sự đột biến ADV được phát hiện sau và có diễn tiến chậm hơn kháng

LAM Theo nghiên cứu của Yoon- Seon Lee trên bệnh nhân đã điều trị với LAM thì đột biến xuất hiện sau 12 tháng điều trị với tỉ lệ là 18%

Nguyen.M.H và cộng sự thực hiện nghiên cứu khảo sát những đột biến kháng thuốc trên 472 bệnh nhân chưa từng điều trị với nhóm thuốc tương tự nucleotide nhận thấy có đến 16,7% các trường hợp có đột biến rtV207M/I [44] Theo nghiên cứu của Zo”llner và cộng sự đánh giá tính kháng thuốc invitro của đột biến rtV207M/I đã kết luận rằng sự hiện diện của của đột biến rtV207M/I chiếm khoản 1% các trường hợp viêm gan virus B mạn, có thể xuất hiện trên các bệnh nhân chưa từng điều trị với LAM hoặc sau một thời gian điều trị với LAM cùng với những đột biến khác, nhưng khi thực hiện nghiên cứu để đánh giá tính kháng thuốc cuả rtV207M/I thì tác giả vẫn chưa ghi nhận vai trò nào rõ rệt của rtV207M/I, nhất là vai trò làm phục hồi khả năng sao chép của VRVGB [54]

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, Việt Nam đang là vùng lưu hành cao đối với viêm gan do virus siêu

vi B Ngoài 8 kiểu gen ( từ A  H) của HBV được phân chia dựa vào sự khác biệt của khoảng 8% bộ gen thì gần đây đã phát hiện thêm genptype I – genotype thứ 9 tại Lào

và Việt Nam Các kiểu genotype thường gặp ở Việt Nam là B và C, một số nghiên cứu

có phát hiện thêm kiểu gen A nhưng với tỉ lệ rất nhỏ (0,9% - 4% và 1,82%) [3],[11],[13]

Các nghiên cứu trong nước về đột biến kháng thuốc, tác giả thường quan tâm tới bệnh nhân đã điều trị thuốc kháng virus Như nghiên cứu của tác giả Hồ Tấn Đạt và cs (2007) về đột biến kháng Lamivudine, tỉ lệ đột biến tăng dần theo thời gian điều trị là 27,8%- 63,4%- 71,1%- 83,3% tương ứng với thời gian lần lượt là 1 năm- 2 năm-

3 năm- 4 năm [13] Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhã Đoan và cộng sự, tỉ lệ đột biến kháng LAM tương ứng với thời gian như trên là 16%- 45%- 83% [21] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhã Đoan chỉ phát hiện một trường hợp đột biến kháng ADV, không phát hiện các đột biến kháng ETV Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhã Đoan có phát hiện đột biến rtV207M chiếm tỉ lệ 8,33% trong đó có một trường hợp rtV207M xuất hiện kèm theo đột biến kháng LAM rtM204I rtL80V/I.Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về vai trò đột biến rtV207M nên các tác giả coi rtV207M là đột biến kháng thuốc không có

ý nghĩa Gần đây, theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hải Yến và cộng sự trên đối

tượng bệnh nhân mắc viêm gan mạn cũng chỉ phát hiện được đột biến rtV207M với tỉ

HBV thuộc họ Hepadnaviridae chi Orthohepadnavirus là một họ gồm nhiều virus

có tính hướng gan và bộ gen DNA mạch kép

HBV chỉ gây bệnh cho người và loài linh trưởng Người bị nhiễm là nguồn (neservoir) duy nhất của bệnh này trong thiên nhiên, không có ổ chứa quan trọng nào khác trên động vật

HBV có khả năng sống sót trong 6 tháng ở nhiệt độ phòng

HBV có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (mạn tính)

HVB là virus không gây bệnh lý tế bào nghĩa là nó không gây ra những biến đổi thoái hóa ở tế bào Tổn thương tế bào do HBV dường như chủ yếu do các phản ứng miễn dịch [18] Hệ miễn dịch thất bại trong việc chống lại HBV Cơ chế chính xác vẫn chưa rõ nhưng thực nghiệm trên chuột cho thấy rằng HBeAg từ mẹ qua nhau thai gây

ức chế sự đáp ứng miễn dịch của tế bào T đối với HBeAg và HBcAg làm cho sự phá hủy tế bào gan bị nhiễm HBV qua trung gian tế bào T không hiệu quả [59]

1.2.2 Các dạng cấu trúc

Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn nhân bản của virus, người ta tìm thấy 3 kiểu cấu trúc:

- Các tiểu thể hình cầu có đường kính 22nm, chiếm đa số

- Các trúc hình ống hoặc hình sợi có đường kính 22nm nhưng có chiều dài thay đổi, có khi dài hơn 200nm, do các tiểu thể hình cầu chồng chất lên nhau tạo thành

Hai loại tiểu thể này chính là kháng nguyên bề mặt của HBV được sản xuất dư thừa ở bào tương tế bào gan, chúng cũng mang đặc điểm như HBsAg Do cấu tạo của chúng bao gồm các protein và lipit vỏ ngoài HBsAg nhưng không chứa DNA bộ gen của virus

vì thế không gây nhiễm [5]

- Virus hoàn chỉnh (virion) hay hạt tử Dane: có dạng hình cầu nhưng ít hơn, đường kính 42nm Màng bọc ngoài chứa HBsAg và bao quanh lõi nucleocasid đường kính 28nm Tiểu thể Dane có thể bị chất tẩy không ion phá hủy để phóng thích lõi 28nm chứa

bộ gen DNA và kháng nguyên HBcAg của virus Lõi còn chứa DNA và các enzyme như DNA polymerase, proteinkinase Khi xử lý lõi virion với chất tẩy mạnh cũng phóng thích ra kháng nguyên hòa tan, gọi là HBeAg [5]

Hình 1.1 Các dạng cấu trúc HBV [63]

1.2.3 Thành phần cấu trúc kháng nguyên

- HBsAg - kháng nguyên bề mặt: Hiện diện trên màng bọc HBV, đây là bằng chứng đầu tiên của việc nhiễm HBV, do nó xuất hiện trước các bằng chứng về sinh hóa của bệnh gan HBsAg được cấu tạo gồm một quyết định kháng nguyên đặc hiệu nhóm chung (a) và hai cặp quyết định kháng nguyên tương hỗ d/y và w/r phối hợp thành bốn thứ type HBV là adw, ayw, adr, ayr Ở Việt Nam, type ayr chiếm ưu thế (60%), cũng thường gặp adr (17%) [5]

Huyết thanh của người mang virus nồng độ cao chứa một lượng khá lớn các hạt không gây nhiễm là các protein HBs dư thừa (HBsAg)- đó là các hạt hình cầu hoặc hình sợi Các hạt hình cầu có đường kính 17-25nm, chiếm đa số; chúng có dạng như là các túi nhỏ với thành dày độ 4nm và đường kính bên trong từ 10- 15nm Các hạt hình sợi

(hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20nm có chiều dài thay đổi Huyết thanh của người mang HBV với nồng độ virus thấp thường các hạt cầu HBs và các sợi HBs rất ít hoặc không có Hai cấu trúc virus phụ này không chứa HBV DNA và vì thế không gây nhiễm [2]

- HBcAg – Kháng nguyên lõi: Các hạt lõi HBV trống không, chỉ có vỏ ngoài thường được thấy trong nhân tế bào gan là nơi chúng được tổng hợp và dự trữ (một số hạt lõi có thể được tổng hợp trong bào tương) Có hai loại hạt lõi: Hạt lõi trống không chứa DNA và hạt lõi đầy có chứa DNA Tuy nhiên, không có các hạt lõi trần nào được tìm thấy ở huyết thanh của người mang HBV dung nạp miễn dịch mà không có

anti-HBc [2]

- HBeAg: Kháng nguyên này đại diện cho dạng tiết ra của HBcAg xuất hiện trong quá trình ủ bệnh, giai đoạn tiền triệu và nhiễm trùng cấp Xuất hiện sau HBsAg 2-4 tuần (khoảng 1,5 tháng sau khi nhiễm virus) Sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự lây nhiễm Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn đến tăng khả năng viêm gan B mạn tính [24] Vì hàm lượng của nó tỷ lệ thuận với lượng virus, do đó qua kháng nguyên này có thể đánh giá được mức độ nhiễm của người bệnh

Hình 1.2 Cấu trúc các loại kháng nguyên [58]

1.2.4 Cấu trúc bộ gen HBV

HBV có bộ gen DNA dạng vòng mạch kép không hoàn chỉnh, kích thước

khoảng 3.2kb Trong số những virus có bệ gen là DNA thì HBV là virus duy nhất có

sự nhân bản thông qua quá trình phiên mã ngược [1]

DNA bộ gen HBV bao gồm hai chuỗi có chiều dài khác nhau:

- Chuỗi dài có cực tích âm (-) có chiều dài 3.2 kb là mạch mã hóa cho tất cả protein của HBV Mạch này có các đầu tận cùng 5’ và 3’xác định

- Chuỗi ngắn cực tích dương (+): chiều dài thay đổi từ 50 -100 % chiều dài bộ gen, đây là mạch không hoàn chỉnh và đầu 5’ xác định nhưng đầu 3’ thay đổi

Cấu trúc vòng của DNA được bảo đảm nhờ sự ghép nối của vùng liên kết nằm giữa hai vùng trình tự lặp lại trực tiếp dài 11 cặp bazơ là DR1 và DR2; trong đó DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA (-) và hiện diện ở đoạn dư của đầu 3’, còn DR2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA (+) Hai trình tự này có vai trò trong việc khởi phát quá trình tổng hợp các chuỗi DNA tương ứng

Bộ gen HBV bao gồm 4 khung đọc mở (ORF- Open Reading Frame) S,P,C và X

là các vùng mã hóa để tổng hợp các protein của virus Các ORF này gối chồng lên nhau:

P là ORF dài nhất, ORF S nằm hoàn toàn trong phạm vi ORF P còn ORF C và X thì gối lên ORF P một phần Bên cạnh đó HBV mã hóa nhiều hơn một protein từ một khung đọc mở bằng cách dùng các codon AUG bên trong khung đọc có chức năng như các điểm khởi đầu phụ cho sự sinh tổng hợp protein, do đó các protein lồng vào nhau với các đầu tận cùng amino khác nhau và một đầu tận cùng cacboxyl chung được tổng hợp Chính nhờ những đặc tính trên mà HBV tuy có kích thước bộ gen nhỏ nhưng có khả năng tổng hợp ra nhiều loại protein khác nhau [1]

- Vùng S (surface- bề mặt) [58]

Gồm ba vùng Pre S1, Pre S2 và S mã hóa cho ba loại protein của HBsAg Vùng

S và pre S2 có chiều dài cố định trong khi đó vùng pre S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng type khác nhau

Vùng S mã hóa cho protein nhỏ chứa 226 amino acid có vị trí gắn glucose Đây

là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số, vùng này có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên của HBsAg và tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên này mà người ta phân biệt ra các phân type khác nhau

Vùng S và pre S2 mã hóa cho protein trung bình chứa 281 amino acid có vị trí gắn glucose Protein trung bình chiếm khoảng 5-10% trong các virion và các hạt có kích thước 22 nm

Vùng S, preS1 và preS2 mã hóa cho protein lớn chứa 389- 400 amino acid, không

có vị trí gắn glucose Protein này chiếm khoảng 20% trong vỏ bọc của virion và các cấu trúc dạng ống nhưng chỉ chiếm 1-2% trong các protein của hạt 22 nm

- Vùng C (core- lõi)

Vùng này mã hóa cho protein nucleocapsid quan trọng trong quá trình đóng gói của virus Ở đầu 5’ của gen C có 2 codon khởi đầu cho quá trình đọc mã Trình tự nucleotide giữa 2 codon này được gọi là vùng pre –C (precore)

Nếu quá trình dịch mã bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 sẽ tổng hợp nên HBeAg (17,5 kD) Các nucleotide đầu tiên của vùng pre -C sẽ mã hóa cho việc tổng hợp nên một đoạn peptid tín hiệu gồm 19 amino acid Peptid này giúp cho HBeAg được bài tiết thông qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng thời giúp cho kháng nguyên này được hòa tan trong huyết thanh Vì vậy, HBeAg được gọi là kháng nguyên hòa tan

Sự hiện diện của HBeAg có liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân lên của virus

Nếu quá trình dịch mã bắt đầu từ codon AUG thứ 2 ở vị trí 1901 và đi suốt đoạn gen C sẽ tổng hợp nên kháng nguyên HBcAg (21kD) HBcAg không có đoạn peptid tín hiệu cho nên không được bài tiết ra khỏi tế bào gan, vì vậy HBcAg không bao giờ hiện diện trong huyết thanh

Một số trường hợp xảy ra đột biến ở đoạn pre C tại vị trí 1896 G-A tạo nên một trình tự TAG là codon kết thúc, codon này làm chấm dứt quá trình dịch mã của vùng pre – C, cho nên sự tổng hợp HBeAg không được thực hiện được mặc dù quá trình nhân lên của virus vẫn thực hiện được [58]

 Vùng đầu tiên, ở đầu N tận cùng của polymenase mã hóa cho phần protein liên quan đến đầu tận cùng 5’ của mạch âm của DNA virus được gọi là Primase có vai trò khởi phát quá trình tổng hợp DNA mạch âm của virus

 Vùng kế tiếp là vùng “khoảng trống” hay đoạn đệm có trình tự rất thay đổi, nằm gối lên vùng pre S1 và pre S2 của gen S có lẽ giúp biểu hiện các protein bề mặt trung bình và lớn

 Vùng kế tiếp là vùng có hoạt tính DNA polymerase và enzyme phiên mã ngược Vùng này có một trình tự các aa tương đối hằng định YMDD (tyrosine- methionine- aspartate- aspartate) là vị trí xúc tác của enzyme phiên mã ngược, vì vậy khi có đột biến xảy ra làm thay đổi vùng YMDD này sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme phiên mã ngược từ đó ảnh hưởng đến quá trình nhân bản của virus

 Vùng sau cùng (ở đầu C tận cùng) là vùng của enzyme Rnase H (Ribonuclease H)

có chức năng làm thoái biến khuôn RNA trong lúc tổng hợp sợi DNA (-)

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gen HBV [61]

- Vùng X [15]

Là vùng có kích thước nhỏ nhất, mã hóa cho một polypeptid có khoảng 145 –

154 amino acid tùy theo từng phân type Protein X hay HBx do gen X mã hóa có nhiều chức năng khác nhau:

 Thực hiện photphoryl hóa và có hoạt tính kinase

 Tương tác với bộ máy phiên mã

 Tham gia vào việc truyền tín hiệu

 Điều hòa chu trình tế bào

 Chuyển dạng tế bào gan thành tế bào ung thư HBx có thể gắn vào protein p53

để ngăn cản p53 sửa chữa DNA sai hỏng theo cơ chế cắt bỏ nucleotide (NER- nucleotide excision repair) Hay gắn vào protein liên kết TFIIH làm thay đổi hoạt tính helicaza để ngăn cản sửa chữa DNA theo cơ chế NER

Virus HBV type D không có vùng X [5]

1.2.5 Các kiểu gen của HBV

VRVGB được phân loại làm 9 kiểu gen (genotype) từ A đến I Mỗi kiểu gen của VRVGB (trừ E và G) lại có thể được phân chia thành các phân type (sub-genotype) Kiểu gen A phổ biển ở Bắc Mỹ, Bắc và Tây Âu, Ấn Độ, cận Sahara châu Phi và một số khu vực ở Nam Mỹ Kiểu gen B và C phổ biến ở châu Á Kiểu gen D hay gặp ờ vùng Địa Trung Hải, Đông Âu cho dù có thể gặp ở những nơi khác trên thế giới Kiểu gen F hay gặp ở Nam Mỹ Kiểu gen G được tìm thấy ở Pháp, Đức, Trung Mỹ, Mêhicô, Mỹ Gần đây kiểu gen H đựợc tìm thấy ở Trung Mỹ [21]

Hình 1.4 Sự phân bố kiểu gen HBV trên thế giới [67]

Người ta nhận thấy các kiểu gen của VRVGB có thể liên quan đến một số thể đột biến: Đột biến tiền nhân và đột biến tại vùng gen khởi động tổng hợp protein nhân

Do đó chúng có thể đưa đến sự khác nhau về diễn tiến lâm sàng cũng như về tỷ lệ viêm gan tối cấp giữa các nhóm kiểu gen khác nhau Kiểu gen B, đặc biệt phân type Bj có liên quan đến viêm gan tối cấp nhiều hơn kiểu gen C hoặc kiểu gen A [30]

Từ những năm đầu của thế kỷ 21, các nghiên cứu về kiểu gen của VRVGB mới được thực hiện tại Việt Nam Những nghiên cứu của các tác giả Việt Nam thực hiện trong ngòai nước đều cho thấy kiếu gen chủ yểu là kiểu gen B và C Các kiểu gen A hoặc kiểu gen hỗn hợp B+ C cũng được tìm thấy nhưng rất ít Những kết quả thu được cho thấy các kiểu gen có ý nghĩa lâm sàng rất quan trọng trong việc tiên lượng diễn tiến của bệnh VGB Ở những người nhiễm VRVGB mạn tính không triệu chứng và viêm gan B mạn tính không có biến chứng thì kiểu gen B chiếm đa số (78,3%), trong khi ở những bệnh nhân xơ gan và ung thư gan thì kiểu gen C nổi trội [8]

1.2.6 Quá trình nhân bản của HBV

Trong quá trình nhân bản của HBV có giai đoạn sao chép ngược từ RNA tạo nên một DNA mới nhờ hoạt tính của enzyme phiên mã ngược (RT- Reverse Transcriptase) của HBV polymerase Đây là một polymerase phức tạp và đa chức năng tuy nhiên lại không có khả năng sửa sai, vì vậy HBV có tỷ lệ đột biến rất cao [1]

Quá trình nhân bản của HBV gồm nhiều giai đoạn:

- Xâm nhập vào tế bào gan

Quá trình nhân bản của HBV bắt đầu bằng việc virus gắn các protein bề mặt lớn vào các thụ thể trên bề mặt tế bào gan Sau đó màng virus sẽ dung hợp với màng tế bào chủ, phần nucleocapsid của virus sẽ được phóng thích vào tế bào chất của tế bào ký chủ theo cơ chế nhập bào rồi di chuyển tới màng nhân và HBV DNA được đưa vào nhân

- Sửa chữa bộ gen và tạo cccDNA (covalently closed cicular DNA – DNA vòng đóng xoắn đồng hóa trị)

Khi HBV DNA được đưa vào trong nhân tế bào ký chủ, mạch ngắn của HBV DNA sẽ được tổng hợp thêm để bổ sung chiều dài nhờ enzyme polymerase của virus và DNA bộ gen của virus trở thành dạng mạch đôi hoàn chỉnh Dưới tác dụng của enzyme

tế bào chủ, các đầu cuối của hai mạch HBV DNA được nối lại với nhau nhờ các liên kết đồng hóa trị tạo nên dạng cccDNA vòng khép kín với hai mạch bằng nhau HBV có thể hiện diện lâu dài trong tế bào ký chủ dưới dạng cccDNA và đây được coi là nguồn dự trữ virus Virus sẽ hoạt động trở lại nếu ngưng các thuốc chống virus cccDNA có vai trò làm khuôn mẫu cho sự phiên mã của pg RNA (sự phiên mã ngược thành DNA bộ gen) và các mRNA (sự dịch mã thành các protein của virus) [35]

Hình 1.5 Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào chủ [64]

- Tổng hợp pgRNA và các mRNA khác

Các pgRNA (3.5kb) được phiên mã từ khuôn cccDNA dưới tác dụng của RNA polymenase của tế bào gan PgRNA chứa đựng toàn bộ thông tin di truyền của virus và

sẽ là khuôn để tổng hợp mạch (-) của bộ gen virus

Trong giai đoạn tổng hợp pgRNA thì các mRNA với kích thước khác nhau (2,4kb; 2,1kb; 0,5kb) cũng được tổng hợp Các mRNA này sẽ được dịch mã thành các protein của virus trong đó DNA polymerase, protein lõi C và pre C, poly peptide X, protein bề mặt S và protein kinase Protein lõi C tạo thành nucleocapsid, còn protein pre

C được vận chuyển đến màng nội chất, từ đó được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyên tiến lõi HBeAg

PgRNA cùng với HBV polymerase tạo thành lõi trong tế bào chất Protein vỏ ngoài S gắn vào màng lipit của màng nội chất để sau đó nucleocapsid này nảy chồi trên mạng nội chất để biến thành vỏ ngoài của virus [58]

- Tổng hợp DNA chuỗi dài (-) và (+)

HBV polymerase là một protein đa chức năng gồm các vùng có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc vào DNA và RNA, hoạt tính Rnase H

Bên trong nucleocapsid mới đang được hình thành, dưới tác dụng phiên mã ngược của HBV polymerase, sợi DNA chuỗi (-) sẽ được tổng hợp từ khuôn pgRNA Không giống như sự phiên mã ngược ở các retrovirus, phản ứng phiên mã ngược của HBV không cần mồi mà chính bản thân polymerase của virus sẽ đóng vai trò là chất mồi Enzyme polymerase này sẽ tương tác với tín hiệu epsilon ở đầu 5’ của pgRNA và nhập thêm trình tự đầu tiên GTAA Phức hợp này sẽ di chuyển đến vùng DR1 ở đầu 3’ của sợi pgRNA và tiếp tục nối dài ra thêm để tổng hợp nên sợi DNA (-) Trong lúc đang tổng hợp nên sợi DNA (-), pgRNA sẽ thoái biến dẫn nhờ chức năng Rnase H của DNA polymerase

DNA mạch (-) lại làm khuôn tổng hợp mạch (+), và quá trình này bắt đầu tại trình tự DR2 của chuỗi (-) Quá trình sao chép được tiếp tục nhờ sự đóng vòng của sợi DNA thông qua hiện tượng lai giữa hai mạch Khi phần vỏ ngoài bao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của DNA polymerase, cho nên sự tổng hợp của mạch (+) thường không hoàn toàn, vì vậy mạch (+) sẽ ngắn hơn mạch (-)

- Lắp ráp các cấu phần và phóng thích các virion trong lúc sợi DNA (+) đang được tổng hợp

Phần capsid của virus sẽ được lắp ghép thêm phần vỏ bọc và đến hệ thống lưới nội chất để phóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng virion theo cơ chế nảy chồi Một

số nucleocapsid có thể trở lại nhân tế bào gan để vào chu trình nhân bản mới Chính việc vào lại chu trình nhân bản mới sẽ góp phần duy trì sự tồn tại của dạng cccDNA trong tế bào gan [35]

1.3 Tình hình nhiễm HBV và dịch tễ học

1.3.1 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam

Nhiễm HBV là một bệnh thường gặp nhất trên thế giới gây VG mạn ở người VGB mạn tính có thể dẫn đến xơ gan và chết do suy gan; đây là nguyên nhân chính của ung thư tế bào gan trên thế giới

1.3.1.1 Thế giới

Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế giới, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45

triệu người chết vì xơ gan Ngày nay, dù đã có các vacxin hiệu quả chống lại VGB, nhưng vẫn còn khoảng 1,2 triệu người chết vì HBV hàng năm trên toàn thế giới Đến năm 2000, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [7]

Tỷ lệ người mang HBsAg thay đổi khác nhau trên thế giới từ 0,1% đến 0,2% ở Anh, Mỹ và Scandinavia; đến hơn 3% ở Hy Lạp và miền Nam nước Ý và có thể lên đến 10% - 11% hoặc hơn nữa ở Châu Phi và vùng Đông Nam Á Người mang HBsAg có thể có tỷ lệ rất cao trong vài cộng đồng sống biệt lập như người Eskimo Alaska và người dân bản xứ Australia

HBV lưu hành trên toàn thế giới Người ta ước tính trên thế giới có hơn 50 triệu người nhiễm HBV mới xảy ra hàng năm [7]

1.3.1.2 Việt Nam

Theo công bố của Chủ tịch Hội Gan Mật Việt Nam tại Hội nghị Gan Mật toàn quốc khai mạc ngày 28/9/2013, khoảng 20 triệu người Việt Nam nhiễm virus viêm gan, trong đó có khoảng 12-16 triệu người bị nhiễm viêm gan B (khoảng 5 triệu người bị viêm gan mãn tính, xơ gan, ung thư gan) Như vậy, nước ta nằm trong vùng lưu hành cao với 8-15% dân số đang nhiễm HBV và khoảng 47,6% dân số đã từng tiếp xúc với HBV Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận Ở Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về VGB, mức nhiễm HBV của Việt Nam trong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên, Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996…) cho thấy nước ta là nước

có dịch HBV địa phương cao [7]

1.3.2 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B

Căn cứ vào tần suất nhiễm HBV, tỷ lệ nhiễm virus toàn bộ, độ tuổi nhiễm virus

và cách truyền bệnh chủ yếu, người ta chia thành 3 khu vực với 3 mức độ lưu hành rõ rệt: vùng nội dịch lưu hành cao, vùng nội dịch lưu hành trung bình và vùng nội dịch lưu hành thấp

Hơn phân nửa dân cư trên thế giới đã từng nhiễm HBV, dù tần suất chính xác khó dự đoán và rất khác nhau giữa các khu vực Người ta đã tính có 45% dân số sống trong vùng dịch lưu hành cao, 43% trong vùng dịch trung bình và 12% trong vùng dịch lưu hành thấp [7]

1.3.2.1 Vùng nội dịch lưu hành cao

Trong vùng dịch lưu hành cao có ≥ 8% người nhiễm HBV mạn và trong huyết thanh của đa số người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm virus trước đó Những vùng này gồm đa số các nước châu Á, trong đó có Việt Nam (trừ Nhật Bản và Ấn Độ), châu Phi, hầu hết vùng Trung Đông, vùng châu thổ Amazon Nam Mỹ, hầu hết các nhóm quần đảo Thái Bình Dương và một số dân địa phương khác như người Eskimo, thổ dân châu

Úc và dân Maori Trong các vùng dịch lưu hành như Đông Á, vùng Sahara Hạ ở châu Phi và lưu vực sông Amazon, tỷ lệ người mang HBV từ 8% đến 25% và tần suất anti-HBs từ 60-85% Vì thế, phơi nhiễm HBV trong các vùng dịch lưu hành cao có thể đạt đến 100% [7]

Hình 1.6 Bản đồ phân tán virus Viêm gan B [60]

1.3.2.2 Vùng nội dịch lưu hành trung bình

Trong vùng dịch lưu hành trung bình, tần suất của người nhiễm HBV mạn từ 2-7% và 20-50% người lớn đã từng nhiễm HBV Những vùng này gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, miền Tây Á, Nhật, Đông Nam châu Âu và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sống trung bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20-60% Tần suất anti-HBs hoặc anti-HBc ở những người HBsAg(-) có nguy cơ trung bình hơi thấp và hầu hết các phơi nhiễm xảy ra ở trẻ con Những vùng này bao gồm 43% dân số toàn cầu [7]

1.3.2.3 Vùng nội dịch lưu hành thấp

Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từng nhiễm virus dưới 20% Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand Tần suất của HBsAg từ dưới 0,1% ở Bắc Âu và 1% đến 5% ở Nam châu Âu

Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật và Dự phòng Mỹ (CDC) ước tính ở Mỹ có 140000 đến 320000 người mới nhiễm HBV mỗi năm Nhiễm HBV mới gây ra 8400 đến 19000 trường hợp nhập viện hàng năm và 140 đến 320 người chết vì viêm gan kịch phát Ở

Mỹ, có từ 1 đến 1,25 triệu người mang HBV mạn tính, nhiều người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [2]

1.4 Đặc điểm sinh bệnh học

1.4.1 Con đường lây nhiễm

Nguồn hoặc ổ chứa HBV người chính là con người Không có ổ chứa quan trọng nào khác trên động vật Một vài bề mặt dụng cụ như kim tiêm, bàn chải đánh răng, dao cạo râu, đồ chơi, dụng cụ y tế… có thể là trung gian truyền nhiễm HBV từ người sang người

Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong VGVR B là lây qua đường ngoài tiêu hoá

Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong các dịch tiết của bệnh nhân đã nhiễm có nồng độ siêu vi B rất cao và khi bệnh nhân tiếp xúc thường xuyên với các yếu

tố nguy cơ trong một thời gian dài Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mạn tính thường không có triệu chứng và họ không hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những người xung quanh [2]

Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây nhiễm chính

- Lây truyền qua đường ngoài tiêu hoá do tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu (dịch nhiễm virus) Đây là con đường lây nhiễm thường gặp nhất, cả ở vùng dịch lưu hành cao và thấp Việc sàng lọc máu hoặc các chế phẩm máu để loại HBsAg và không dùng dung môi là huyết thanh cho vacxin hầu như đã loại bỏ nguyên nhân này ở các nước phát triển Tuy nhiên, các bệnh nhân nhận các yếu tố đông máu đậm đặc vẫn còn nguy cơ nhiễm virus do HBsAg ở mức độ thấp, không phát hiện được Trong những quốc gia mà máu chưa được sàng lọc HBsAg hoặc sàng lọc không đúng mức, nguy cơ

nhiễm HBV còn cao [2]

Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận Ngoài ra bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hoá, châm cứu, xỏ lỗ tai, xăm mình, chữa răng

và nhất là những người nghiện ma túy sử dụng chung kim tiêm

- Lây truyền qua đường sinh dục [2]

Đây là con đường truyền nhiễm HBV đã được chứng minh và thường gặp ở các nước phát triển nhất là trong nhóm đồng tính luyến ái Tuy nhiên, con đường lây này không quan trọng bằng con đường lây do phơi nhiễm với máu và dịch cơ thể ở các nước dịch lưu hành cao và trung bình

Trong các nghiên cứu về mại dâm, những người tiếp xúc sinh lý với người mang HBV mạn và những người chăm sóc ở các cơ sở điều trị bệnh truyền theo đường sinh dục có tần suất của các dấu ấn nhiễm HBV cao hơn 3-5 lần trong cộng đồng Trong nhóm này cũng như trong cộng đồng dân cư Mỹ, nguy cơ nhiễm HBV thường tỷ lệ thuận với số lượng bạn tình và với tình trạng nhiễm giang mai trước đó Sự kết hợp chặt chẽ với giang mai có thể do tính chất gây loét của giang mai, giúp nhiễm HBV hiệu quả hơn HBV cũng có thể là dấu ấn chỉ điểm cho những bệnh loét đường sinh dục mạn tính khác, hoặc cho việc tiếp xúc tình dục với người có nguy cơ cao

- Lây truyền từ mẹ sang con (truyền nhiễm chu sinh) [2]

HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sinh hơn là lúc lây qua nhau thai Mức

độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tuỳ thuộc vào hai yếu tố: Mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở mẹ

Ở Đài Loan, người ta đã ước tính 40-50% người mang HBsAg mạn nhiễm tiên phát trong thời kỳ chu sinh, chỉ có 5-10% có thể nhiễm trong bào thai, những trẻ khác

có thể nhiễm vào lúc sổ nhau do phơi nhiễm với máu người mẹ nhiễm virus Vì vậy, việc cần thiết phải tiêm chủng bằng vacxin và có thể cả globulin miễn dịch viêm gan B (HBIG) ngay sau khi bé chào đời

Trẻ sinh ra từ người mẹ có HBsAg (+), HBeAg (+) có 60-80% nguy cơ nhiễm HBV phát triển trong 9 tháng sau khi sinh và 90% trong số đó trở thành người mang

HBV tồn tại Các trẻ sinh ra do người mẹ mang HBeAg (-), nguy cơ nhiễm trong năm đầu sau sinh thấp hơn (2-15%) Truyền nhiễm HBV chu sinh thay đổi theo đặc tính lưu hành và tần số HBeAg (+) ở những người mẹ mang HBV

Trên thế giới, truyền nhiễm chu sinh góp phần quan trọng (15-40%) vào số lượng người mang HBV trong cộng đồng

- Các đường lây truyền khác [2]

Nhiễm HBV ở trẻ em: Nhiều trẻ không nhiễm HBV vào thời kỳ chu sinh, sẽ bị nhiễm vào vài tháng đầu sau sinh, có lẽ do tiếp xúc chặt chẽ với mẹ hoặc anh chị em bị nhiễm virus

Vai trò của nước bọt: Nước bọt là một đường truyền nhiễm HBV cần được nghiên cứu, có thể gây nhiễm do những tiếp xúc thân mật không phải tình dục Khảo sát trên hắc tinh tinh cho thấy, nước bọt có thể gây nhiễm nếu có dây máu nhiễm HBV Nhưng không truyền nhiễm khi niêm mạc đường tiêu hóa không bị tổn thương và nước bọt nhiễm HBV được phun khí dung vào mũi, khi uống nước có nhiễm HBV, hay khi chải răng Tuy nhiên, truyền nhiễm có thể xảy ra qua vết cắn hoặc qua cơm được mớm từ người mẹ nhiễm virus

Nhiễm virus qua đường miệng: HBV không lây nhiễm qua đường phân miệng vì thế phân người không thể là nguồn lây nhiễm HBV trong cộng đồng Gây nhiễm sau khi uống một lượng HBV đã được chứng minh liều lượng virus cần cho việc gây nhiễm thành công qua đường uống cao hơn qua đường máu; nhưng sự gây nhiễm qua đường uống không xảy ra qua đường tiêu hóa, mà qua những tổn thương nhỏ thường có trong niêm mạc miệng

Vai trò của tinh dịch và dịch tiết âm đạo: Tinh dịch và dịch tiết âm đạo chứa nồng

độ virus bằng hoặc có phần cao hơn với nồng độ virus trong nước bọt và giữ một vai trò quan trọng trong truyền nhiễm HBV

Đường lây nhiễm qua da: Các yếu tố nguy cơ nhiễm virus là rệp hoặc ve bét trên giường của trẻ, muỗi truyền sốt rét, các tổn thương da, xỏ lỗ tai, cắt bao quy đầu… Tai nạn kim tiêm truyền HBV qua da trực tiếp có thể xảy ra với kim nhiễm máu và các sản phẩm của máu hoặc xảy ra khi thẩm tách máu, xăm mình, châm cứu…; những vật liệu gây nhiễm tiếp xúc với da hở, hoặc niêm mạc mắt… Vì sức đề kháng của HBV khá cao

và ổn định, có thể lây nhiễm do tiếp xúc với niêm mạc hoặc da bị thương tổn như bàn chải đánh răng, chai sữa, đồ chơi, các dụng cụ ăn, dao cạo râu hoặc các bộ dụng cụ trong bệnh viện như máy hô hấp nhân tạo, nội soi, đồ thủy tinh trong phòng thí nghiệm…

1.4.2 Triệu chứng lâm sàng

1.4.2.1 Dấu hiệu lâm sàng

VGB có thể chia làm nhiều loại, mỗi dạng có triệu chứng riêng

- Viêm gan cấp [1]

10% trường hợp có triệu chứng lâm sàng

Đối với trẻ em hiếm xảy ra viêm gan cấp

Đối với người lớn 25% người nhiễm VRVGB có dấu hiệu lâm sàng: Bệnh nhân thấy mệt mỏi, đau nhức tứ chi, sốt nhẹ, buồn nôn, ăn mất ngon, đau vùng hạ sườn phải, nước tiểu màu vàng sậm hoặc nâu, chứng vàng mắt hoặc vàng da có thể xuất hiện

- Viêm gan mạn [1]

Trong đa số người lớn bị VGB cấp, HBsAg huyết thanh biến mất sau 3-4 tháng, nhưng khoảng 8-10% bệnh nhân vẫn còn HBsAg sau 6 tháng và trở thành người mang HBsAg mạn Tuy nhiên ở trẻ em, có đến 90% trường hợp nhiễm virus chu sinh hoặc trong 5 năm đầu sẽ trở thành người mang virus mạn tính và ít có khả năng phục hồi tự nhiên

Biểu hiện lâm sàng: Gan to, bàn tay ửng đỏ, khi bị biến chứng xơ gan có thể bị ứ nước trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh mạch tỏa lớn từ rốn, nam vú lớn như vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ

1.4.2.2 Dấu hiệu cận lâm sàng

Dấu hiệu cận lâm sàng đặc biệt dấu ấn đặc hiệu trong huyết thanh:

- HBsAg có thể được phát hiện trong hầu hết bệnh nhân bị VGB cấp HBsAg là một hạt protein không gây nhiễm, đường kính 22 nm có thể thấy được bằng kính hiển

vi điện tử Nồng độ HBsAg tăng cao nhất vào lúc ALT huyết thanh tăng cao trong một thời gian ngắn Sau đó, HBsAg ít có liên hệ với mức độ trầm trọng của bệnh cảnh lâm sàng Tuy nhiên nó có thể tương quan ngược với mức độ tổn thương tế bào gan Ví dụ nồng độ HBsAg cao nhất gặp ở bệnh nhân bị ức chế miễn dịch, thấp hơn ở bệnh nhân VGB mạn và thấp nhất ở bệnh nhân VGB tối cấp Những quan sát này cho thấy rằng

trong bệnh nhân VGB mức độ tổn thương tế bào gan và bệnh cảnh lâm sàng có thể liên quan đến đáp ứng miễn dịch với VGB hơn là với số lượng HBsAg lưu hành trong máu Tuy nhiên ở bệnh nhân có miễn dịch đầy đủ, có sự tương quan giữa các dấu chỉ điểm của sự nhân đôi virus với tổn thương gan

- HBeAg là dấu chỉ điểm của mức độ gây nhiễm và sự nhân đôi virus HBeAg thường được tìm thấy ở giai đoạn sớm của bệnh VGB cấp HBeAg không có ý nghĩa về mặt chẩn đoán khi đã có HBsAg (+) Tuy HBeAg khác với HBsAg về mặt miễn dịch nhưng có nhiều mối liên quan giữa 2 kháng nguyên này Ở người có HBeAg (+) thì hiệu giá HBs cao hơn người có HBeAg (-) Những trường hợp VGB cấp có HBeAg kéo dài rất dễ chuyển sang VGB mạn Trong trường hợp xảy ra đột biến tiền lõi (precore mutation) HBeAg không được tổng hợp nhưng sự nhân đôi của virus vẫn diễn ra Điều này được chứng minh bằng sự hiện diện HBV DNA trong huyết thanh bệnh nhân Ngoài các chỉ điểm huyết thanh thì các dấu ấn cận lâm sàng không đặc hiệu cũng có ý nghĩa quan trọng trong chuẩn đoán tình trạng của bệnh VGB như tran samiuase huyết thanh

- Alamine aminotransferase (ALT) hay serum glutamic pyruvic transaninase (SGOT)

ALT tăng lên ngay từ thời kỳ ủ bệnh và tăng nhanh hơn bilirubia Tuy nhiên mức

độ tăng ALT không tương quan với độ trầm trọng của tổn thương gan ALT tăng cao đến 400-4000 UI hoặc hơn nữa trong thời kỳ vàng da và giảm dần trong thời kỳ hồi phục Sau hai tuần đầu, đa số bệnh nhân VGB cấp có lượng ALT giảm xuống nhanh chóng và trở về bình thường trong 6 tuần [1]

1.5 Biện pháp phòng ngừa và điều trị

1.5.1 Biện pháp phòng ngừa

1.5.1.1 Các biện pháp phòng bệnh chung

Thực hiện tốt an toàn truyền máu và các sản phẩm của máu để giảm nguy cơ hệ thống cung cấp máu có chứa các mầm bệnh như HBV Người cho máu phải được khám sức khỏe định kỳ, làm các xét nghiệm huyết thanh học sàng lọc VRVGB Những người

có tiền sử vàng da hoặc xét nghiệm HBsAg dương tính không được cho máu Hạn chế

sự lây truyền HBV trong bệnh viện bằng cách sử dụng bơm kim tiêm một lần, tiệt trùng dụng cụ y tể, thực hành mũi tiêm an toàn Khi đeo khuyên tai, xăm mình, châm cứu phải

sử dụng kim tiêm mới đã được khử trùng Tránh tiếp xúc trực tiếp với máu và dịch cơ thể Xử lý tốt chất thải bệnh viện để hạn chế nguồn lây nhiễm cho cộng đồng Thầy thuốc phải sử dụng các dụng cụ bảo hộ lao động khi khám chữa bệnh Tuyên truyền cho thanh thiếu niên thực hiện hành vi tình dục an toàn [49],[68],[69]

1.5.1.2 Các biện pháp phòng bệnh đặc hiệu

Các biện pháp dự phòng chung chủ yếu phòng lây nhiễm VRVGB cho các đối tượng có nguy cơ cao Tuy nhiên, để có thể dự phòng rộng rãi và lâu dài cho cả cộng đồng thì các biện pháp phòng bệnh đặc hiệu như tiêm phòng vắcxin và huyết thanh kháng VGB là hết sức cần thiết

- Miễn dịch thụ động

Việc phát hiện kháng thể anti-HBs có thể bảo vệ các cá thể bị nhiễm VRVGB cấp hoặc mạn nếu kháng thể được sử dụng sớm ngay sau khi phơi nhiễm dẫn đến việc phát triển các globulin miễn dịch (Ig) đặc hiệu chứa anti- HBs nồng độ cao (HBIg) HBIg được sản xuất từ huyết thanh chứa anti-HBs nồng độ cao Đó là huyết thanh của những người có nhiễm VRVGB tự nhiên trong quá khứ nhưng đã qua khỏi, không trở thành người mang HbsAg Hiệu quả bảo vệ của HBIg có ngay sau khi tiêm nhưng chỉ kéo dài 3-6 tháng HBIg được sử dụng qua đường tiêm bắp, vị trí tiêm cơ delta ở người lớn và mặt trước bên đùi cho trẻ sơ sinh Nếu lượng thuốc tiêm trên 2ml với trẻ em, trên 5ml đối với người lớn có thể chia nhỏ để tiêm ở nhũng vị trí khác nhau HBIg được chỉ định trong những trường hợp sau :

Tạo miễn dịch thụ động với viêm gan B trên đối tượng chưa tiêm phòng, hoặc mới tiêm phòng một mũi vắc xin nhưng bị phơi nhiễm VGB do xước da, kim đâm, cắn, Trẻ em tiêm 200 UI cho trẻ 0-4 tuổi, 300 UI cho trẻ 5-9 tuổi, người lớn tối thiếu

500 UI, phụ thuộc vào mức độ phơi nhiễm Tốt nhất trong vòng 24-72 giờ nhưng có thể tới 1 tuần sau phơi nhiễm Liều thứ hai tiêm sau 1 tháng Việc sử dụng đồng thời HBIg

và vắc xin VGB làm tăng hiệu quả bảo vệ sau phơi nhiễm [55]

Trên bệnh nhân lọc máu, liều dùng 8-12UI/kg tối đa 500 UI Dùng 2 tháng/ lần cho tới khi có đáp ứng miễn dịch bảo vệ sau tiêm phòng

Ở trẻ sinh ra từ mẹ mang HBsAg, đặc biệt trẻ sinh ra từ các bà mẹ HBeAg/HBsAg(+) Tiêm sau đẻ càng sớm càng tốt, trong vòng 24 giờ đầu sau sinh

Liều lượng 30-100 Ul/kg Mũi vắc xin VGB đầu tiên có thể tiêm cùng ngày với HBIg nhưng ở vị trí khác Việc tiêm HBIg lúc sinh cung cấp kháng thể đủ mạnh cho đến lúc đáp ứng miễn dịch đối với vắcxin xảy ra [55]

Không đáp ứng với vắcxin sau tiêm phòng (anti-HBs <10UI/ml), có nguy cơ bị nhiễm VGB Liều lượng 500 UI đối với người lớn và 8UI/kg đối với trẻ em Cứ hai tháng tiêm một lần tới khi có đáp ứng miễn dịch bảo vệ sau tiêm phòng

Quan hệ tình dục với người viêm gan B cấp trong vòng 1 tuần

Quan hệ tình dục không an toàn với người VGB mạn mới được chẩn đoán trong vòng 1 tuần

Trên những bệnh nhân sau ghép gan để chống tái nhiễm VRVGB

 Vắcxin VGB thế hệ thứ nhất

Được điều chế từ huyết tương người lành mang HBsAg mạn tính, vắcxin VGB

có nguồn gốc huyết tương được nghiên cứu đầu tiên ở Pháp và Mỹ và được đưa vào sử dụng rộng rãi từ những năm 1981-1982 Để đạt được độ an toàn cao các hạt HBsAg sẽ được làm tinh khiết và bất hoạt Hiện nay, xu hướng các nước ít dùng loại vắcxin này

vì sự điều chế phụ thuộc vào nguồn cung cấp huyết tương (người lành mang HBsAg), hơn nữa do tâm lý lo ngại có thể mắc các bệnh lây truyền qua đường máu Một số loại vắcxin thế hệ thứ nhất gồm Hepavax B, HB Vaccine, Hepaccine-B [56]

 Vắcxin VGB thế hệ thứ hai

Được nghiên cứu từ cuối thập niên 70 Năm 1986 được sản xuất lần đầu tiên tại

Mỹ Đây là loại vắcxin tái tố hợp DNA bằng cách biểu thị đoạn gen S mã hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg trên các tế bào nấm men, hoặc các tế bào sinh vật của loài có vú

để khởi động quá trình tổng hợp HBsAg Nấm men được dùng nhiều nhất là Saccharomyces cerevisiae Tế bào loài có vú được sử dụng trong qui trình sản xuất vắcxin là tế bào buồng trứng chuột đất vàng Trung Quốc (CHO- Chinese Hamster Ovary) Vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất từ nấm men gồm: Engerix B, Recombivax HB, HB-VAX DNA, Shanvac-B, sản xuất từ tế bào động vật có vú như Gen Hevac B [57]

50 tháng; về lâu dài sẽ có từ 19-57% mất HBsAg ở những người đáp ứng; các chỉ số mạnh nhất đối với đáp ứng điều trị là ALT > 150U/L, HBV DNA < 200pg/ml, thời gian

nhiễm virus ngắn; và cuối cùng INF làm thay đổi hậu quả xấu của bệnh gan mạn Tuy nhiên, các kết quả trên là của bệnh nhân da trắng VGB mạn có nhiều đặc thù rất khác biệt với bệnh nhân người châu Á INF cũng có những bất lợi sau: chỉ dùng được ở một

số bệnh nhân (INF có tác dụng thấp trên bệnh nhân nhiễm virus chu sinh, ALT thấp, bệnh nhân có biến dị HBeAg (-)); dung nạp kém (thường có các tác dụng phụ gây khó chịu, đôi khi có tác dụng phụ nguy hiểm, làm nặng hơn tình trạng xơ gan, VGB mất bù); bệnh nhân khó chấp nhận do thuốc cần phải tiêm và đắt tiền

Chính vì thế, nhiều nhà khoa học cố gắng tìm các liệu pháp thay thế Nhiều tác nhân tương tự nucleotide có hoạt tính kháng virus mạnh không độc đang là các liệu pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các bệnh nhân vì lý do nào đó không dùng INF để điều trị VGB mạn [4]

- Thuốc tăng cường miễn dịch không INF

Tăng cường các tế bào miễn dịch chống nhiễm tế bào T và sản xuất INF tự nhiên trong cơ thể Bao gồm: Theradigm, Thymosin α-1 (Zadaxin), vacxin HBV DNA, vacxin preS1-S2, Hepagen, EHT899, HBV antigen, BayHep B, Nabi-HB, Anti-Hepatitis B [4]

- Các chất tương tự như nucleoside

Nucleoside là thành phần cấu tạo chủ yếu của các chuỗi RNA và DNA Những chất tương tự nucleoside là những chất đồng phân có cấu trúc hóa học tương tự như nucleoside tự nhiên và chính vì thế, có thể tham dự vào một số quá trình liên quan đến nucleoside Phần lớn các cấu trúc nucleoside tự nhiên đều là có dạng đồng phân quang học quay phải, trong khi các chất tương tự nucleoside có dạng đồng phân quang học quay trái có hoạt tính mạnh nhưng lại rất ít độc tính [4]

Các chất tương tự nucleotide sử dụng điều trị cho bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chia làm 3 nhóm:

 Nhóm I: L-Nucleotide gồm lamivudine (3TC), emtricitabine (FTC), telbivudine (L-dT) và clevudine (L-FMAU)

 Nhóm II: acyclic phosphonate gồm adefovir (PMEA), tenofovir (PMPA) và cidofovir (HPMPC)

 Nhóm III: cyclopentane (pentene) ring gồm entercavir và abacavir (carbovir)

1.5.2.2 Cơ chế tác động chung của các chất tương tự nucleotide

Các chất tương tự như nucleodide phải trải qua quá trình phosphoryl hóa và sau

đó vào trong phân tử DNA của virus, ức chế polymerase bằng cách cạnh tranh trực tiếp với chất nền tự nhiên (Deoxyademosine triphosphate) và làm kết thúc chuỗi DNA của virus Các nucleotide liên kết với nhau qua cầu nối phosphodiester được thành lập giữa nhóm 3’-hydroxyl trên phân tử đường và nhóm 5’- phosphate của nucleotide kế tiếp, tiếp tục như thế, chuỗi DNA nối dài ra Các dideoxynucleoside dưới dạng triphosphate

có khả năng gắn kết cạnh tranh với các nucleoside nội sinh trên chuỗi DNA do có cấu trúc tương tự Tuy nhiên, các chất tương tự nucleoside này chỉ có đầu 5’ mà không có đầu 3’-hydroxyl, nên khi nó gắn vào chuỗi DNA sẽ ngăn trở các nucleoside nội sinh kế tiếp không gắn kết được Quá trình tổng hợp DNA bị kết thúc nửa chừng và chuỗi DNA virus không thành lập được [10]

1.5.2.3 Một số loại thuốc tương tự nucleotide điều trị VGB phổ biến

- Lamivudine (LAM)

Hiện nay việc điều trị viêm gan B bằng lamivudine là phổ biến Thuốc này đã được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ chấp thuận năm 1998, có trên thị trường Việt Nam vào tháng 6/2000 [27] Lamivudine được xem là thuốc điều trị hiệu quả bệnh viêm gan siêu vi B, là thuốc kháng virus được thế giới công nhận đầu tiên Lamivudine (2’3’ dideoxy-3’ thiacytidine) là chất tương tự của nucleoside dideoxy cytidine trong tự nhiên, có tác dụng ức chế enzyme phiên mã ngược virus từ đó ức chế mạnh sự nhân đôi của virus cụ Hơn thế, LAM là một chất ở dạng đồng phân quang học quay trái (enantionmer) của 2’, 3’ di deoxy – 3’ thiacytidine, nên nó có tính ái lực mạnh với các emzyme kinase của tế bào giúp cho quá trình photphoryl hóa được tốt hơn, và lại nó ít nhạy cảm với các enzyme deaminase của tế bào do đó thuốc ở dạng photphoryl hóa có hoạt tính sẽ được tích tụ lâu hơn Ngoài ra, khi gắn kết vào DNA của virus, thuốc lại ít nhạy cảm với enzyme exonuclease của tế bào nên làm cho thuốc gắn vào chuỗi DNA virus được bền chặt hơn Chính nhờ những đặc tính này mà LAM có hoạt tính kháng virus mạnh mà ít độc tính [27],[33]

Hình 1.7 Công thức hóa học của LAM [65]

Nhiều thí nghiệm cũng đã chứng minh rằng LAM là một thuốc an toàn có khả năng kháng siêu vi nhanh và mạnh đồng thời làm gia tăng phản ứng chuyển đổi huyết thanh HBeAg/ anti- HBeAg Như những nghiên cứu ban đầu cho thấy, với liều dùng từ

100 đến 300mg, LAM làm giảm nhanh nồng độ DNA HBV trong huyết thanh 100% bệnh nhân sẽ có HBV DNA (-) sau vài tuần điều trị và với thời gian điều trị từ 3-6 tháng, thuốc không ghi nhận có độc tính Một nghiên cứu khác ở Trung Quốc, sau 1 năm điều trị bằng LAM với liều 100mg, 98% làm giảm HBV DNA, 72% bệnh nhân có men gan trở về bình thường và phản ứng chuyển huyết thanh anti- HBeAg (+) là 16% Thêm vào

đó, 56% bệnh nhân có cải thiện về mặt mô học và làm giảm quá trình xơ gan Một nghiên cứu đa trung tâm được tiến hành ở Hoa Kỳ đã thu được kết quả tương tự như kết quả nghiên cứu ở Châu Á Sử dựng LAM với liều 100mg mỗi ngày trong vòng một năm đã tạo được phản ứng chuyển đổi huyết thanh HBeAg là 17% và tỷ lệ mất HBeAg là 32% Thêm vào đó LAM cũng làm cải thiện mô học của gan ít nhất là 50% trường hợp Ngoài

ra còn nhiều bằng chứng khác cho thấy việc điều trị LAM có hiệu quả trên đa số bệnh nhân có chống chỉ định với IFN, bệnh nhân không đáp ứng với IFN, những bệnh nhân nhiễm VR VG vào thời kỳ sơ sinh và bệnh nhân suy giảm miễn dịch Vì vậy, cho đến nay LAM là chất tương tư nucleotide đầu tiên được dùng trong các thí nghiệm lâm sàng với thời gian dài cho các bệnh nhân VGB mạn tính và nó cũng là thuốc duy nhất được FDA chấp thuận về chỉ định này [33] Cơ chế tác dụng của lamivudine: Lamivudine ức chế HBV polymerase trong quá trình kết thúc sự tổng hợp DNA bộ gen của virus Khi vào bên trong tế bào, lamivudine được phosphoryl hóa thành dạng có hoạt tính là lamivudine tri-phosphat Trong khi virus sao chép DNA bộ gen của chính nó, lamivudine tri-phosphat cạnh tranh với nucleotide tự nhiên, tham gia vào chuỗi DNA

đang hình thành của virus và ngăn cản sự kết hợp mới của các nucleotide khác do mất

vị trí liên kết, chuỗi DNA sẽ ngưng kéo dài [27] Tuy nhiên, lamivudine không phá hủy DNA của virus Mặt khác, lamivudine chỉ ức chế quá trình tổng hợp DNA, hoàn toàn không ức chế quá trình tổng hợp các protein của virus Như một hệ quả tất yếu là sự giảm nồng độ DNA kéo theo sự giảm tổng hợp các protein của virus Vì vậy, khi điều trị bằng lamivudine, thường thì nồng độ HBV DNA giảm trước, nồng độ HBeAg và men ALT giảm sau [22]

Hình 1.8 Cơ chế tác động của LAM [65]

- Adeforvir dipovoxil (ADV)

ADV trước đây gọi là Bis – POM PMEA với tên thương mại là preneon và hepsera ADV là một tiền chất diester của Adeforvir Adefovir là chất tương tự nucleoside phosphonate mạch hở với chức năng ức chế DNA polymerase bằng cách kết thúc sự tạo chuỗi Adeforvir là thuốc uống thứ hai được cho phép để điều trị VGB vào năm 2002, nó có khả năng chống lại cả hai tác nhân HBV hoang dại lẫn HBV đề kháng được với LAM Các hướng dẫn sử dụng hiện nay khuyên dùng liều uống 10mg mỗi ngày Tuy nhiên nên giảm liều dùng đối với những bệnh nhân suy thận [29] Dựa trên nghiên cứu ban đầu, thuốc tỏ ra có kết quả hữu hiệu và tính an toàn cao Số liệu từ thử nghiệm lâm sàng của giai đoạn II cho thấy ADV làm giảm HBV DNA hơn 1log10 sau

4 tuần điều trị, giảm hơn 4log10 sau 12 tuần điều trị Ở bệnh nhân nhiễm HBV nguyên