Biểu tượng trong bộ ba tác phẩm xứ tuyết, ngàn cánh hạc, cố đô của yasunari kawabata

Tính cấp thiết của đề tài Nhựa tổng hợp có nguồn gốc từ dầu mỏ đang được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các sản phẩm nhựa phục vụ con người.. Với mong muốn tìm ra một phương pháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN HOÀNG DŨNG

TS CHUNG ANH DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào

Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thị Lệ Quyên

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn của tôi, TS Trần Hoàng Dũng

và TS Chung Anh Dũng – những người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đồng các cấp đã đọc và góp ý cho luận văn của tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths Huỳnh Văn Hiếu, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, bộ môn công nghệ sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP HCM , Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam và Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này

Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thị Lệ Quyên

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cám ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Công nghệ lên men 3

1.1.1 Khái quát về quá trình lên men 3

1.1.2 Phương pháp lên men 3

1.2 Nhựa phân hủy sinh học 5

1.3 Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 6

1.3.1 Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB 6

1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp PHB 8

1.3.3 Vi sinh vật sản xuất PHB 9

1.3.4 Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB 11

1.3.5 Phương hướng cải thiện sản xuất PHB 12

1.3.6 Tách và thu hồi PHB 15

1.3.7 Ứng dụng của PHB 17

1.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Địa điểm – Thời gian thực hiện 20

2.2 Vật liệu 20

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.3 Bố trí thí nghiệm 23

2.3.1 Kiểm tra một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn 23

2.3.2 Khảo sát một số điều kiện thích hợp để lên men R eutropha tạo PHB 23

2.3.3 Thí nghiệm lên men theo mẻ R eutropha để tạo PHB 25

2.4 Phương pháp phân tích thí nghiệm 26

2.4.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 26

2.4.2 Kiểm tra hoạt tính tạo PHB của R eutropha bằng phương pháp nhuộm SBB 26

2.4.3 Xác định khối lượng khô tế bào 27

2.4.4 Xác định PHB trong tế bào bằng phương pháp nhuộm huỳng quang 27

2.4.5 Tách chiết PHB bằng sodium hypochlorite và chloroform 27

2.4.6 Định lượng PHB bằng phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại 28

2.4.7 Phương pháp xử lí số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống vi khuẩn 30

3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn PHB 31

3.3 Kết quả khảo sát một số điều kiện thích hợp để lên men R eutropha tạo PHB 32

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mật rỉ 32

3.3.2 Kết quả khảo sát nguồn nitrogen thích hợp 35

3.3.3 Kết quả khảo sát nồng độ nitrogen thích hợp 37

3.3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu 39

3.4 Kết quả lên men theo mẻ R eutropha để tạo PHB 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Chú giải

CoA Coenzyme A

cs cộng sựPHA PolyhydroxyalkanoatePHB Poly–β–hydroxybutyrate

rpm Revolutions per minute (số vòng mỗi

phút)SBB Sudan Black B

UV UltraViolet

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh các đặc tính hóa lí của PHB và PP 7

Bảng 1.2 Thành phần của mật rỉ mía và mật rỉ củ cải đường 14

Bảng 1.3 Một số phương pháp thu hồi PHB 16

Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích 21

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.1 Tương quan giữa hàm lượng PHB chuẩn và giá trị OD235 31

Bảng 3.2 Kết quả lượng sinh khối khô tế bào thu được sau 96 giờ lên men 43

Bảng 3.3 Kết quả đo OD235 xác định hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu trúc tổng quát của PHB 6

Hình 1.2 Cơ chế sinh tổng hợp PHB 9

Hình 2.1 Thiết bị lên men 150 mL 22

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp xử lí mật rỉ đường 24

Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp tách PHB bằng NaClO và chloroform 28

Hình 2.4 Sơ đồ phương pháp định lượng PHB 29

Hình 3.1 Khuẩn lạc R eutropha và hình dạng tế bào R eutropha 30

Hình 3.2 Kết quả nhuộm Sudan Black B 30

Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan quan tuyến tính giữa hàm lượng PHB và giá trị OD235 31

Hình 3.4 Hệ thống lên men R eutropha 150 mL 32

Hình 3.5 Đồ thị thể hiện sự thay đổi sinh khối tế bào theo thời gian dưới ảnh hưởng của các nồng độ mật rỉ khác nhau 33

Hình 3.6 Đồ thị thể hiện hàm lượng PHB trong tế bào ở các nồng độ mật rỉ khác nhau 34

Hình 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên sự sinh trưởng của tế bào 35

Hình 3.8 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau đến hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào 36

Hình 3.9 Đồ thị biễu diễn sự sinh trưởng của vi khuẩn ở những môi trường có nồng độ nitrogen khác nhau 37

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào ở các nồng độ nitrogen khác nhau 38

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sinh khối khô tế bào ở các môi trường có độ pH khác nhau 39

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào ở các môi trường có độ pH khác nhau 40

Hình 3.13 Bình chứa môi trường lên men 41

Hình 3.14 Hệ thống lên men BioFlo 110 41

Hình 3.15 Kết quả nhuộm Nile blue A 42

Hình 3.17 Sản phẩm PHB thu được từ 30 mg sinh khối vi khuẩn 43

Hình 3.18 Dung dịch H2SO4 đậm đặc chứa sản phẩm PHB 43

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nhựa tổng hợp có nguồn gốc từ dầu mỏ đang được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các sản phẩm nhựa phục vụ con người Khi thải ra môi trường, các sản phẩm này cần đến hàng ngàn năm mới phân hủy được, không những vậy, quá trình phân hủy chúng còn tạo ra các sản phẩm thứ cấp độc hại Hậu quả là môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng Bên cạnh đó, sự khai thác quá mức của con người cũng đang khiến nguồn tài nguyên dầu mỏ cạn kiệt dần Trước tình hình trên, việc cần thiết là phải tìm

ra các nguồn vật liệu mới thân thiện với môi trường để thay thế

Hiện đang có những nghiên cứu tập trung vào việc sản xuất nhựa phân hủy sinh học từ các vật liệu có nguồn gốc thiên nhiên Đáng chú ý là việc sản xuất poly–β–hydroxybutyrate (PHB) từ các vi sinh vật PHB thuộc nhóm polyhydroxyalkanoates (PHAs) được tổng hợp tự nhiên trong tế bào chất của một số loài vi khuẩn Đây là các polyester có tính chất tương tự nhựa tổng hợp Nhờ đặc tính dẻo, đàn hồi, chịu nhiệt cao, dễ bị phân hủy hoàn toàn bởi các vi sinh vật mà không sản sinh độc tố, PHB đang được xem như một nguồn thay thế lí tưởng cho nhựa tổng hợp PHB đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực từ y học, nông nghiệp cho đến công nghiệp Tuy nhiên cho đến nay, các sản phẩm từ PHB vẫn chưa được sản xuất và sử dụng rộng rãi do việc sản xuất PHB đòi hỏi đầu tư chi phí cao khiến giá thành các sản phẩm có nguồn gốc PHB đắt đỏ

Một trong những nguyên nhân khiến chi phí sản xuất PHB cao là do nguồn nguyên liệu cho môi trường lên men vi khuẩn tạo PHB khá đắt tiền Nhằm hạ thấp chi phí và tăng hiệu quả sản xuất PHB, đã có nhiều nghiên cứu tập trung cải tiến các chủng vi khuẩn tạo PHB cũng như tìm ra phương thức lên men và thu hồi PHB hiệu quả Với mong muốn tìm ra một phương pháp sản xuất PHB hiệu quả nhờ vi sinh vật,

sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhằm làm giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành

các sản phẩm từ PHB, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp để lên

men tạo Poly-β-hydroxybutyrate”

2 Mục tiêu

Khảo sát điều kiện thích hợp để lên men vi sinh vật tạo PHB trên cơ chất mật rỉ đường

3 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Ralstonia eutropha có khả năng sinh tổng hợp PHB

4 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu xác định một số yếu tố dinh dưỡng và điều kiện môi trường thích hợp

để vi khuẩn lên men tạo PHB

5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu xác định yếu tố dinh dưỡng bổ sung ban đầu để vi khuẩn R eutropha

tạo PHB tối ưu:

 Nghiên cứu nồng độ mật rỉ đường bổ sung ban đầu

 Nghiên cứu dạng muối nitrogen bổ sung ban đầu

 Nghiên cứu nồng độ muối nitrogen bổ sung ban đầu

 Nghiên cứu pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Ý nghĩa khoa học

Xác định một số yếu tố dinh dưỡng và điều kiện môi trường thích hợp để R

eutropha tạo PHB

Ý nghĩa thực tiễn

Sản xuất PHB từ chủng R eutropha trên cơ chất mật rỉ đường, một nguồn

nguyên liệu rẻ tiền nhằm giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản phẩm PHB

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ lên men

1.1.1 Khái quát về quá trình lên men

“Lên men” có nguồn gốc từ từ Latinh “fervere”, nghĩa là sự sôi do hoạt động của nấm men trong dịch chiết quả hoặc malt nghiền Trong hóa sinh, lên men có nghĩa là

sự tạo thành năng lượng nhờ quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ Trong công nghệ sinh học, lên men được sử dụng để chỉ việc nuôi cấy các vi sinh vật kị khí và hiếu khí

để sinh tổng hợp nên các sản phẩm mong muốn [4, 37]

Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kị khí Bắt đầu quá trình lên men, các hợp chất chứa carbohydrate được phân giải thành glucose, trải qua quá trình chuyển hóa, sản phẩm cuối cùng được tạo thành là CO2 và một số hợp chất carbon chưa được oxy hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic, ketone, … Tên sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men thường được dùng để gọi quá trình lên men ấy Chẳng hạn như quá trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic được gọi là quá trình lên men lactic [5]

Một số vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí, nhưng lại tạo ra những sản phẩm chưa được oxy hóa hoàn toàn giống quá trình trình lên men kị khí như acid acetic, ketoacid, … Quá trình này dù cũng được gọi là lên men nhưng thực chất là quá trình oxy hóa hiếu khí Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì tạo ra những sản phẩm có giá trị [5]

1.1.2 Phương pháp lên men

1.1.2.1 Lên men theo mẻ

Lên men theo mẻ là phương pháp mà trong suốt quá trình lên men, ta không bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường, cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất Trong lên men theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua các giai đoạn sinh trưởng: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong [28]

Pha lag là giai đoạn đầu, khi vi sinh vật mới được đưa vào môi trường nuôi cấy mới, sự tăng sinh tế bào xảy ra không đáng kể Lúc này, vi sinh vật bắt đầu thích ứng với môi trường mới và bắt đầu tổng hợp các chất cần cho sự sinh trưởng Các loài vi

sinh vật khác nhau có độ dài pha lag khác nhau Pha lag cũng có thể kéo dài nếu giống cấy ban đầu quá lâu hoặc đã được đông lạnh Trong sản xuất, để hệ thống lên men nhanh chóng bước vào pha tăng trường và tổng hợp sản phẩm, cần rút ngắn thời gian pha lag càng ngắn càng tốt [28]

Pha log là pha vi sinh vật sinh trưởng và phân chia mạnh Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và sản phẩm tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh vật [28]

Trong pha cân bằng, sự tăng sinh tế bào bắt đầu chậm lại, số lượng tế bào duy trì

ở mức ổn định do số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi, hoặc do tế bào ngừng phân chia dù vẫn còn hoạt động trao đổi chất Một trong những nguyên nhân khiến vi sinh vật bắt đầu chuyển sang pha cân bằng là do sự giới hạn một yếu tố dinh dưỡng nào đó

trong môi trường Đây chính là giai đoạn mà sự sinh tổng hợp PHB ở Ralstonia

eutropha diễn ra mạnh Các sản phẩm thừa tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh

vật cũng có thể làm sự tăng trưởng giảm Chẳng hạn như R eutropha có thể sản sinh

nhiều butyric và các acid hữu cơ khác trong pha tăng trưởng, điều này khiến pH môi trường giảm, làm ức chế sự sinh trưởng của tế bào [28]

Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa do sự cạn kiệt dinh dưỡng và tích lũy một số sản phẩm độc hại cho vi sinh vật, một số enzyme

phân giải tế bào Ở Ralstonia eutropha, tốc độ suy vong có thể giảm trong trường hợp

vi khuẩn sử dụng nguồn năng lượng dự trữ là PHB tích lũy trong tế bào [28]

Phương pháp này có một số ưu điểm là đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ sung thêm bất kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, giảm khả năng bị nhiễm, thu hồi sản phẩm đạt mức tối ưu, giảm chi phí sản xuất Tuy nhiên, phương pháp này cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn cơ chất cạn kiệt, giữa các mẻ nuôi phải ngắt quãng thời gian [4]

1.1.2.2 Lên men theo mẻ có bổ sung (lên men fed-batch)

Trong hệ thống lên men này, môi trường mới được bổ sung liên tục theo giai đoạn vào bình nuôi nhưng không loại bỏ dịch nuôi khỏi bình cho đến khi kết thúc quá trình lên men Phương pháp này có ưu điểm là giữ được các điều kiện trong quá trình

nuôi cấy, tránh được việc cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và hạn chế ảnh hưởng của các sản phẩm độc trong môi trường [4]

1.1.2.3 Lên men liên tục

Môi trường được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra dịch lên men để thu nhận sản phẩm theo từng giai đoạn đã định trước Lên men liên tục có ưu điểm là làm cho tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật cao, thu được lượng sinh khối cao, tiết kiệm do không có thời gian chết và tối ưu dễ dàng điều kiện nuôi cấy bằng cách thêm chất dự trữ hoặc thay đổi các thông số Tuy nhiên, phương pháp này cũng

có một số nhược điểm như dễ bị tạp nhiễm, dễ xảy ra hiện tượng đột biến, … [4] Đối với quá trình lên men gồm hai giai đoạn là tăng trưởng và sinh tổng hợp PHB như ở

R eutropha, lên men liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng lên men theo mẻ

hay lên men theo mẻ có bổ sung do tế bào luôn ở trạng thái pha log [28]

1.2 Nhựa phân hủy sinh học

Sự cạn kiệt dần nguồn tài nguyên dầu mỏ cùng với những quan ngại về môi trường đã tạo nên một áp lực thúc đẩy việc phát triển vật liệu nhựa mới không có nguồn gốc từ dầu mỏ, vừa bền, vừa thân thiện với môi trường Những vật liệu này được gọi là nhựa sinh học, nhựa xanh, nhựa phân hủy sinh học hay nhựa sinh thái Nhựa phân hủy sinh học, vốn được xem như là một giải pháp xử lí rác thải nhựa, phải

là loại vật liệu có thể phân hủy hoàn toàn, không gây ô nhiễm và có giá cả hợp lí Một

số loại nhựa sinh học đang được quan tâm hiện nay là hồ dẻo (TPS), polylactide (PLA), polymalate (PMA) và polyhydroxyalkanoate (PHA)[34] Trong số đó, PLA được sử dụng phổ biến So với PHA thì PLA có giá thành thấp hơn Tuy nhiên nó cũng mang một số nhược điểm như giòn, độ kết tinh thấp, chịu nhiệt kém Bên cạnh đó, dù acid lactic có thể được sản xuất bằng cách lên men công nghiệp, nhưng vẫn cần phải trải qua quá trình polymer hóa hóa học mới tạo được PLA Quá trình này khiến qui trình sản xuất phức tạp hơn và tiêu tốn thời gian Chính những nhược điểm đó đã làm hạn chế ứng dụng của PLA và thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm những loại nhựa phân hủy sinh học khác [42]

Hiện nay, loại nhựa phân hủy sinh học được nhiều người quan tâm là PHA PHA

có một vai trò quan trọng bởi PHA được sản xuất từ các vi sinh vật và do đó, có thể

được phân hủy hoàn toàn thành những hợp chất vô hại PHA không gây ô nhiễm vì không cần chất xúc tác hay phụ gia để thúc đẩy quá trình phân hủy Các loài vi khuẩn

có khả năng phân hủy loại nhựa này hiện diện ở khắp nơi từ đất, nước, phân đến cống rác PHA được phân hủy hoàn toàn thành carbon dioxide và nước trong môi trường hiếu khí Trong điều kiện yếm khí, sự phân hủy PHA có thể tạo nên methane sử dụng làm nhiên liệu Chính tính thích ứng sinh học cũng như tiềm năng sản xuất PHA từ những nguồn nguyên liệu rẻ tiền đã thu hút sự quan tâm toàn cầu [34]

1.3 Poly-β-hydroxybutyrate (PHB)

Polyhydroxybutyrate (PHB) là loại polymer sinh học thuộc nhóm PHA Nó được

phát hiện trong Bacillus megaterium vào năm 1926 bởi nhà khoa học người Pháp

Lemoige [34]

1.3.1 Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB

PHB là polyester được tế bào tích lũy dưới dạng thể vùi lipid Thành phần thể vùi PHB gồm khoảng 97 – 98% PHB, 2% protein và 0,5% lipid [41]

Với công thức hóa học (C4H6O2)n , cấu trúc phân tử PHB được thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.1.Công thức cấu trúc tổng quát của PHB [15]

PHB có một số đặc tính lí hóa sau:

- Khối lượng phân tử 100 000 – 800 000 Da

- PHB không tan trong nước và có sức chống chịu tương đối với các phản ứng thủy phân Đây chính là điểm khác biệt của PHB so với các loại nhựa phân hủy sinh học khác, hầu hết tan trong nước hoặc nhạy độ ẩm

- PHB không bị phá vỡ cấu trúc bởi tia UV nhưng rất dễ bị hủy bởi acid hoặc base và dễ tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, methylene chloride, …

- Khả năng khuếch tán oxygen tương đối kém Nhờ tính chất này mà các sản phẩm bao bì đựng thực phẩm làm từ PHB có thể hạn chế sự oxygen hóa gây hỏng thực phẩm

- Tính tương thích sinh học cao nên rất thích hợp để ứng dụng trong y học

- Không độc

- Có khả năng chịu lực căng khoảng 40 Mpa, tương đương với polypropylene Nhanh chóng bị phân hủy trong tự nhiên và thân thiện với môi trường, PHB đang được quan tâm như một loại vật liệu mới thay thế cho các loại nhựa từ dầu mỏ như polyetylene (PE), polypropylene (PP),… bởi PHB mang những đặc tính tương tự như các loại nhựa truyền thống Bảng 1.1 cho thấy PHB dù cứng và dễ gãy hơn nhưng trong hầu hết các đặc tính khác thì loại polymer này tốt hơn hoặc tương đương với PP

Trọng lượng phân tử (Daltons) (x 105)

Nhiệt độ thủy tinh hóa (oC)

40

6 – 8 Mạnh Yếu

Có

171 – 186

65 –70 2,2 – 7 -15 0,905 – 0,940 1,7

39

400 Yếu Mạnh Không

Mặc dù mang nhiều đặc tính tốt, PHB vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do giá thành sản phẩm từ PHB cao gấp 15 lần các sản phẩm nhựa tổng hợp Để việc sử dụng PHB trở nên phổ biến, cần phải có những giải pháp làm giảm giá thành sản phẩm như tối ưu hóa quá trình lên mên tạo PHB, sử dụng môi trường rẻ tiền và tìm ra phương pháp thu hồi PHB hiệu quả Trong quá trình sản xuất PHB, chi phí nguyên liệu cho môi trường lên men chiếm đến khoảng 40% tổng chi phí sản xuất Do đó, sử dụng những nguồn carbon rẻ tiền làm nguyên liệu cho lên men là rất cần thiết nhằm làm giảm giá thành sản xuất PHB [42]

1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp PHB

Ở Ralstonia eutropha, sự tổng hợp PHB nội bào diễn ra trong điều kiện môi

trường dinh dưỡng có nồng độ carbon thích hợp và bị hạn chế một yếu tố dinh dưỡng khác như nitrogen, phosphate, oxygen hòa tan hay một số yếu tố khoáng như magnesium, sắt, …[22]

Con đường sinh tổng hợp PHB được thực hiện qua ba bước với sự xúc tác của các enzyme β-ketothiolase, acetoacetyl-CoA reductase và PHB synthase

Đầu tiên, β-ketothiolase xúc tác phản ứng trùng ngưng hai acetyl-CoA thành acetoacetyl-CoA Sau đó, acetoacetyl-CoA reductase xúc tác khử acetoacetyl-CoA thành β-hydroxybutyryl-CoA, quá trình này cần có NADPH Cuối cùng, β-hydroxybutyryl-CoA được polymer hóa thành PHB với sự tham gia của PHB synthase, đồng thời giải phóng coenzyme-A (Hình 1.3) [10], [34], [36]

Trong điều kiện cân bằng dinh dưỡng, quá trình sinh tổng hợp PHB bị ức chế Điều này được gây ra bởi nồng độ coenzyme-A tự do giải phóng từ chu trình Krebs cao, ức chế enzyme β-ketothiolase Môi trường dinh dưỡng bị hạn chế một yếu tố dinh dưỡng thiết yếu làm xuất hiện sự hình thành NADH Lượng NADH cao làm ức chế sự tổng hợp citrate, dẫn đến sự ôxi hóa acetyl-CoA trong chu trình Krebs xảy ra chậm, acetyl-CoA được tích lũy lại Khi nồng độ NADH và acetyl-CoA cao, trong tế bào bắt đầu quá trình sinh tổng hợp PHB [11]

Hình 1.2 Cơ chế sinh tổng hợp PHB [10]

1.3.3 Vi sinh vật sản xuất PHB

Trong tự nhiên, có nhiều loài vi sinh vật có khả năng tạo ra một lượng PHB chiếm 30 – 80% khối lượng khô tế bào Mặc dù PHB có thể được tổng hợp hóa học sử dụng β-butyrate hoặc β-hydroxybutyric acid làm monomer, nhưng qui trình điều khiển khó khăn và giá thành sản xuất cao đã khiến việc sản xuất PHB theo con đường tổng hợp hóa học trở nên không thể thực hiện được Trong khi đó, sinh tổng hợp PHB nhờ các vi sinh vật lại mang nhiều thuận lợi bởi qui trình sản xuất đòi hỏi điều kiện đơn giản hơn Lên men sản xuất PHB sử dụng vi sinh vật đang là hướng đi đáng chú ý [42]

Dựa trên yêu cầu về điều kiện nuôi cấy để tạo PHB, có thể phân các vi khuẩn

thành hai nhóm Nhóm thứ nhất gồm những loài vi khuẩn như R eutropha,

Pseudomonas olevorans, cần điều kiện sinh trưởng mất cân bằng để tổng hợp PHB

Chúng sẽ tổng hợp và tích lũy PHB khi môi trường giàu carbon và giới hạn một yếu

dinh dưỡng thiết yếu khác (nitrogen, oxygen, ) Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn sản xuất PHB mà không đòi hỏi phải giới hạn dinh dưỡng Điển hình trong nhóm này

là Alcaligenes latus [22]

Trong số các chủng vi sinh vật có khả năng tạo PHB, hai chủng vi khuẩn phổ

biến là Ralstonia eutropha và Alcaligenes latus

a Ralstonia eutropha

R eutropha (trước đây là Alcaligene eutrophus) là vi khuẩn Gram âm, dạng hình

que, không hình thành bào tử, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ tối ưu 30 C [42]

Hệ thống phân loại: Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria Lớp: Betaproteobacteria Bộ: Burkholderiales Họ: Burkholderiaceae Chi: Cupriavidus/Ralstonia

Loài: Ralstonia eutropha

R eutropha là chủng vi khuẩn sản xuất PHB hiệu quả nhờ khả năng sử dụng

được nhiều nguồn carbon khác nhau như glucose, fructose, acetic acid, thực vật, dầu thực vật, … để tích lũy PHB với hàm lượng có thể lên đến 80% khối lượng tế bào [11] Vi khuẩn có thể sản sinh PHB trong điều kiện môi trường có mặt nguồn carbon song song với sự thiếu hụt một nhân tố sinh trưởng thiết yếu khác Do đó, qui trình sản xuất PHB thường trải qua hai bước, mở đầu là sự tăng nhanh sinh khối tế bào, theo sau

là bước sản xuất PHB [42]

b Alcaligenes latus

A latus là vi khuẩn Gram âm, sống hiếu khí bắt buộc, sinh trưởng trong nhiệt độ

tối ưu khoảng 35 C A latus có thể tích lũy PHB trong tế bào sử dụng nguồn carbon

là sucrose và không cần sự giới hạn của bất kì yếu tố dinh dưỡng nào [42]

c Một số chủng vi khuẩn khác

Pseudogenes oleovorans có thể sản xuất lượng PHB khá cao (149 g/L) khi được

nuôi cấy theo mẻ có bổ sung hoàn toàn tự động Tuy nhiên, để đạt được nồng độ PHB

trên, cần phải trải qua 170 giờ nuôi cấy Điều đó đã làm giảm hiệu suất sản xuất PHB (0,88 g/giờ) [42]

Kim và cộng sự đã nghiên cứu sự sản xuất PHB ở Escherichia coli tái tổ hợp mang gen quy định tổng hợp PHB của R eutropha (1992) Nghiên cứu cho thấy E

coli tái tổ hợp có thể tích lũy lượng PHB đến 80 – 90% khối lượng khô tế bào

Một số chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHB gồm: Ralstonia eutropha,

Alcaligenes latus, Pseudogenes oleovorans, Chromobacterium violaceum, Methylobacterium sp., Protomonas extorquens, Pseudomonas sp., Bacillus megaterium, Azotobacter vinelandil, Comamonas testosteroni [25, 31]

1.3.4 Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB

PHB đã được đưa vào sản xuất từ cuối những năm 1950 Khi đó, Baptist và Werber thuộc công ty W.R Grace (Mỹ) là những người tiên phong mở đường cho việc sản xuất PHB thương mại Tuy nhiên, do không thể thu hút được sự quan tâm chú ý cộng với hiệu suất sản xuất thấp, việc sản xuất PHB đã phải ngừng lại Một thời gian dài người ta đã không còn quan tâm đến việc sản xuất PHB thương mại cho đến giữa những năm bảy mươi, khủng hoảng dầu đã thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các loại nhựa thay thế Trong những năm 1980, một công ty Úc là Chemie Linz AG hợp tác với

Petrochemia Dnubia (PCD) sản xuất PHB từ A latus trên cơ chất sucrose Năm 1993,

tiến sĩ Hangii được PCD trao lại công nghệ sản xuất PHB và chủng vi khuẩn Một năm sau, ông bắt đầu sản xuất PHB dưới tên thương mại là Biomer [34]

Hầu hết các loại nhựa phân hủy sinh học không thể cạnh tranh giá cả với nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ Jaquel và cộng sự đã biên soạn một bài viết về giá thành của nhiều loại PHA thương mại khác nhau Năm 2003, các sản phẩm Biomer, Biocycle, Biogreen, Biopol và Nodax có giá từ 10 đến 20 € một kilogam Đến năm 2010, giá thành các sản phẩm này giảm còn 2,20 – 5,0 € một kilogam Giá thành sản phẩm cao

là do giá nguyên liệu thô cao, chi phí thực hiện qui trình sản xuất cao và sản lượng thu được thấp Vì vậy điều cần thiết lúc này là phải tìm ra những giải pháp giúp hạ giá thành sản xuất PHB [34]

1.3.5 Phương hướng cải thiện sản xuất PHB

Hiện nay, các nghiên cứu đang chủ yếu tập trung vào việc hạ giá thành sản xuất PHB bằng một số phương pháp như sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, sử dụng những chủng vi khuẩn có hiệu suất sản xuất PHB cao, áp dụng qui trình lên men tốt hơn và có phương pháp thu hồi PHB hiệu quả hơn

1.3.5.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn sản xuất PHB thích hợp

Lựa chọn chủng vi khuẩn tổng hợp PHB lý tưởng là công việc mang tính quyết định trong qui trình sản xuất PHB Để xác định một vi khuẩn là phù hợp với sản xuất PHB quy mô lớn, có thể dựa vào một số yếu tố như khả năng tế bào sử dụng nguồn carbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng, tốc độ tổng hợp PHB và lượng PHB tối đa tích lũy trong tế bào Trong đó, các yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất tạo PHB, bao gồm tốc độ sinh trưởng, tốc độ tổng hợp PHB và lượng PHB tối đa tích lũy trong tế bào cần phải càng cao càng tốt Không nên chọn những vi sinh vật mà bên cạnh việc sản xuất PHB còn tạo polysaccharide ngoại bào bởi nguồn carbon không được chúng tận dụng hết cho quá trình sinh tổng hợp PHB Mặt khác, như đã trình bày ở trên, vi khuẩn tổng hợp PHB gồm hai nhóm nên khi lựa chọn chủng vi khuẩn, cần chú ý điểm này để có phương pháp lên men phù hợp [34]

Hiện, đang có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật mới, cải thiện năng suất tạo PHB Gây đột biến tạo chủng vi sinh vật đã được thực hiện nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới Tại Việt Nam, Phạm Thanh Hà và cộng sự (2008) đã gây đột

biến A lactus VN1 bằng tia UV, năng suất tạo PHB ở chủng đột biến cải thiện được

40% so với chủng dại [7] Các vi sinh vật chuyển gen cũng được sử dụng trong sản xuất PHB Một số nghiên cứu đã đưa được gen qui định sinh tổng hợp PHB của một số chủng vi khuẩn vào tế bào vi khuẩn tái tổ hợp, làm tăng năng suất tạo PHB Phổ biến

nhất là E coli tái tổ hợp mang gen qui định sinh tổng hợp PHB của R eutropha [24]

1.3.5.2 Tối ưu hóa các điều kiện môi trường lên men sản xuất PHB

Sự thay đổi các điều kiện môi trường khi lên men sản xuất PHB có thể có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả sản xuất PHB Do đó, cần tìm được những thông số về thành phần dinh dưỡng, điều kiện lí, hóa thích hợp để quá trình lên men tạo PHB đạt hiệu quả cao nhất

1.3.5.3 Thay thế nguồn cơ chất trong sản xuất PHB vi sinh

Trong quá trình sản xuất, chi phí nguyên liệu thô mà đặc biệt là nguồn carbon có ảnh hưởng rất lớn đến tổng chi phí thành phẩm PHB được tích lũy trong điều kiện hiếu khí, do đó vi khuẩn sử dụng một lượng lớn carbon cho hô hấp tế bào Kết quả là chỉ chưa tới 50% lượng carbon được dùng để tạo PHB Bên cạnh đó, việc sử dụng nguồn carbon đắt tiền như glucose càng khiến chi phí sản xuất PHB thêm đắt đỏ Hiện nay những nguyên liệu thô rẻ tiền, dễ tìm như rác thải nông nghiệp và công nghiệp đang được xem là nguồn cơ chất carbon tiềm năng Sử dụng các sản phẩm thải này không chỉ là giải pháp làm giảm giá thành sản xuất PHB mà còn giúp giảm bớt gánh nặng loại bỏ rác thải [3, 34]

1.3.5.3.1 Sản xuất PHB sử dụng rác thải nông nghiệp và xác thực vật

Rác thải nông nghiệp đang xem là một nguồn nguyên liệu cung cấp cho quá trình

sản xuất PHB ở một số loài vi sinh vật Chẳng hạn như Cupriavidus necator có thể

tích lũy PHB khi được bổ sung nguồn carbon và nitrogen là sản phẩm thủy phân lúa

mì và cao nấm men Trong môi trường có cám lúa mì được thủy phân nhờ enzyme của

Aspergillus oryzae NM1, Halomonas boliviensis LC1 có khả năng tích lũy lượng PHB

khoảng 34% khối lượng khô tế bào [34]

Có 60% xác thực vật chứa lignocellulose, nguồn tài nguyên này vô cùng dồi dào trên trái đất Tuy nhiên, nguồn vật liệu này cần phải được xử lí trước khi cung cấp cho quá trình lên men vi sinh [34]

1.3.5.3.2 Sản xuất PHB sử dụng chất thải công nghiệp

Nhiều loại chất thải công nghiệp như mật rỉ rất giàu carbon Chúng đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm như acid lactid, ethanol, enzyme, Một số loại chất hiện đang được nghiên cứu và sử dụng để sản xuất PHB

a Mật rỉ

Mật rỉ là chất thải phổ biến của ngành công nghiệp đường Trong mật rỉ có chứa nguồn carbon chính là sucrose, vài loại đường khác và một số nhân tố kích thích sinh trưởng như vitamin và biotin Thành phần hóa học trong mật rỉ rất khó dự đoán Nó phụ thuộc vào các điều kiện như thổ nhưỡng, thời tiết, giống mía, giai đoạn thu hoạch cũng như qui trình sản xuất tại mỗi nhà máy [22]

Hiện nay, hai loại mật rỉ được sử dụng phổ biến trong sản xuất PHB là mật rỉ mía

và mật rỉ củ cải đường

Bảng 1.2 Thành phần của mật rỉ mía và mật rỉ củ cải đường (Nguồn: Curtin,

1893; Chen và Chou, 1993; Godbole, 2002)

Thành phần (%) Mật rỉ mía Mật rỉ củ cải đường

Người ta đã thực hiện sản xuất PHB trong môi trường có chứa nước sữa, sử dụng

E coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp PHB của R eutropha Khi được nuôi cấy theo mẻ

có bổ sung dùng nước sữa làm chất dinh dưỡng, E coli tái tổ hợp có thể tạo được 69

g/L PHB [15, 34]

c Chất thải có chứa tinh bột

Chất thải từ công nghiệp chế biến thức ăn nhanh được xem là nguồn dinh dưỡng

lý tưởng nhờ hàm lượng chất hữu cơ mà chúng chứa Tinh bột và các dẫn xuất của nó hiện diện trong nước thải từ các ngành công nghiệp dệt, giấy, lên men, nước giải khát

và thực phẩm Những loại nước thải này có thể được chuyển hóa thành PHB thông qua

quá trình thủy phân và polymer hóa R eutropha có khả năng sử dụng nước thải khoai

tây đã được thủy phân bằng mầm lúa mạch để sản xuất một lượng PHB chiếm 76,9% khối lượng khô tế bào Một số nhà nghiên cứu đã cố gắng khai thác khả năng tạo amylase của một số loài vi khuẩn để sản xuất PHB trực tiếp từ tinh bột Chẳng hạn như

Azotobacter chroococcum có thể tích lũy PHB khi sinh trưởng trong môi trường dinh

dưỡng có bổ sung tinh bột hòa tan [34]

d Pha glycerol lỏng từ ngành sản xuất nhiên liệu sinh học

Methylobacterium rhodesanium và R eutropha có thể tổng hợp PHB, sử dụng

nguồn carbon và nitrogen lần lượt là glycerol và casein peptone Những vi sinh vật

khác như Paracoccus denitrifican cũng có khả năng sử dụng glycerol tinh khiết hoặc

glycerol thu được khi sản xuất nhiên liệu sinh học từ hạt nho làm cơ chất carbon để sản xuất PHB [34]

1.3.6 Tách và thu hồi PHB

Sự thành công của việc sản xuất PHB quy mô lớn không chỉ phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu rẻ tiền hay qui trình lên men hiệu quả mà còn chịu ảnh hưởng lớn bởi phương pháp thu hồi PHB thích hợp

Việc tách PHB ra khỏi sinh khối tế bào và tinh sạch chúng là việc làm khó khăn bởi cả phân tử PHB và sinh khối tế bào đều là pha rắn Thu hồi PHB có thể được thực hiện theo hai hướng là hòa tan PHB hoặc phân hủy phần sinh khối tế bào không phải

là PHB Theo hướng thứ nhất, chỉ có PHB được hòa tan trong một dung môi hữu cơ thích hợp Ở hướng còn lại, phần sinh khối tế bào không phải là PHB sẽ được các tác nhân hóa học tiêu hóa và hòa tan Khi thu hồi PHB, người ta chú ý ba yếu tố là độ tinh sạch, hàm lượng và kích thước phân tử PHB Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về thu

hồi PHB trên Alcaligenes và E coli tái tổ hợp Do sự khác nhau về vách tế bào, thành

phần cấu tạo tế bào cũng như điều kiện để tạo PHB mà phương pháp thu hồi PHB ở

các loài vi khuẩn cũng khác nhau [18, 19] Bảng 1.3 giới thiệu một số phương pháp thu hồi PHB đang được áp dụng trên thế giới

Bảng 1.3 Một số phương pháp thu hồi PHB

Phương pháp Ưu điểm Hạn chế

- Chi phí thu hồi cao

Dùng NaClO - PHB thu được có độ tinh sạch

cao - Gây phân hủy polymer

Dùng NaClO và

chloroform

- PHB thu được có độ tinh sạch cao

- Ít gây phân hủy polymer

- Cần lượng lớn dung môi

Dùng chất hoạt

động bề mặt

- Xử lí mật độ tế bào cao

- Không gây phân hủy polymer

- Chi phí thu hồi thấp

- Độ tinh sạch của PHB thấp

Dùng enzyme - Hiệu quả thu hồi cao - Chi phí thu hồi cao

Xử lí cơ học - Không sử dụng chất hóa học

- Cần trải qua nhiều bước

- Khó thực hiện với sinh khối tế bào ít

[19]

1.3.6.1 Tách chiết PHB bằng dung môi

Dung môi có hai tác động là làm thay đổi tính thấm của màng tế bào và giải phóng PHB Đến nay, nhiều loại dung môi đã được thử nghiệm, gồm các dung môi như chloroform, 1,2-dichloroethane, methylene chloride, chloroethane, chloropropane, tetrahydrofuran methyl cyanide, tetrahydrofuran ethyl cyanide, acetic anhydridemethylene chloride, [19]

Tách chiết PHB bằng dung môi giúp thu được PHB với độ tinh sạch cao nhưng không đem lại hiệu suất thu hồi cao Dung môi cũng làm phá hủy hình thái tự nhiên của phân tử PHB và do dó làm mất đi một số ứng dụng của PHB, như để sản xuất các

cấu trúc sợi chắc khỏe Tuy nhiên, so với một số phương pháp thu hồi khác, dung môi không làm phân hủy PHB Nó cũng rất có ích trong ứng dụng y học bởi có thể loại bỏ endotoxin trong vi khuẩn Gram âm Một vấn đề khác mà phương pháp sử dụng dung môi phải đối mặt là nó có hại cho người thao tác và ảnh hưởng đến môi trường Chính

vì hạn chế này mà tách chiết bằng dung môi dù được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm những lại rất ít được áp dụng trong các qui trình sản xuất quy mô lớn [19]

1.3.6.2 Tách bằng sodium hypochlorite (NaClO)

Trong vệc tách PHB, sử dụng NaClO nhằm phá vỡ các thành phần tế bào không phải là PHB Bằng phương pháp này, Hahn và cộng sự (1995) đã thu được một lượng

PHB có độ tinh sạch cao ở R eutropha là 86% và ở E coli là 93% Tuy nhiên, NaClO

cũng gây phân hủy PHB, làm giảm đến 50% khối lượng phân tử PHB Để khắc phục hạn chế này, có thể sử dụng các chất tiền xử lí bề mặt (như Trixton-X100, sodium dodecyl sulfate - SDS) khi tách chiết PHB bằng NaClO Các chất này giúp phá hủy lớp đôi phospholipid trên màng tế bào và tách riêng các hạt PHB ra khỏi các thành phần khác trong tế bào, đồng thời làm biến tính hoặc hòa tan các protein góp phần gây phá

vỡ cấu trúc tế bào, tạo tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết [19]

1.3.6.3 Tách chiết bằng sodium hypochlorite và chloroform

Đây là phương pháp nhằm tận dụng ưu điểm của hai phương pháp đã trình bày ở trên Bằng cách sử dụng một hỗn hợp gồm dung dịch NaClO và chloroform, mẫu tách chiết được chia thành ba pha, pha trên cùng là pha NaClO, pha giữa gồm những tế bào chưa bị phá vỡ và các thành phần tế bào không phải là PHB, pha dưới cùng chính là pha chloroform hòa tan PHB PHB sau đó sẽ được thu hồi bằng cách cho kết tủa trong một chất không phải là dung môi và lọc [19]

Phương pháp này giúp hạn chế đáng kế việc phân hủy PHB Chloroform ngay lập tức hòa tan PHB khi chất này được giải phóng khỏi tế bào nhờ xử lí NaClO, vì vậy nó bảo vệ PHB khỏi bị phân hủy

1.3.7 Ứng dụng của PHB

1.3.7.1 Trong lĩnh vực y học

Sản phẩm của quá trình phân hủy PHB, (D)-3-hydroxybutiric acid là hợp chất trung gian của nhiều chu trình trao đổi chất trong cơ thể sinh vật bậc cao Do đó, PHB

có thể được cấy vào cơ thể sinh vật mà không gây phản ứng đào thải Nhờ tính tương thích sinh học cao mà PHB được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học, có thể dùng làm vật liệu y sinh, dược phẩm, vỏ bọc thuốc, chỉ tự tiêu, khớp nối trong điều trị gãy xương, vá mạng mạch máu, … mà không gây độc cho cơ thể [34]

1.3.7.2 Trong lĩnh vực nông nghiệp

PHB được phân hủy hoàn toàn nhờ hệ vi sinh vật đất Vì vậy, PHB có thể được dùng để sản xuất chất mang thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, phân bón; bọc chứa hạt giống; túi ươm, Người nông dân khi sử dụng những vật liệu này sẽ không cần thu gom rác thải sau mỗi vụ thu hoạch [34]

1.3.7.3 Trong lĩnh vực công nghiệp

Do mang nhiều đặc tính tương tự nhựa tổng hợp nên PHB được xem là vật liệu lí tưởng để thay thế cho các loại nhựa tổng hợp trong công nghiệp sản xuất bao gói, vật liệu che phủ, giúp giảm thiểu rác thải, hạn chế gây ô nhiễm môi trường [34]

1.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Nghiên cứu ngoài nước

1995, Hahn và cộng sự công bố kết quả nghiên một số phương pháp thu hồi PHB

được tổng hợp từ R eutropha và E coli tái tổ hợp Theo đó, phương pháp xử lí với NaClO và chloroform đạt hiệu quả cao hơn những phương pháp khác đối với R

eutropha [18]

1995, khi nghiên cứu ảnh hưởng của muối ammonium và mật rỉ đường đối với sự

sinh trưởng và sản xuất PHB của R eutropha, Beaulieu và cộng sự nhận thấy sự sinh

trưởng và sản sinh PHB của vi khuẩn đạt cao nhất khi sử dụng muối ammonium sulphate, tuy nhiên, nồng độ NH4+ trong khoảng 0,5 đến 1,5 g/L không tạo khác biệt nhiều trong kết quả Sử dụng mật rỉ đường với nồng độ 0,3% làm nguồn carbon bổ sung cho kết quả cao hơn những nồng độ mật rỉ khác [12]

2001, Du và cộng sự tiến hành nuôi cấy liên tục R eutropha trên hệ thống nuôi

cấy hai giai đoạn để sản xuất PHB Kết quả cho thấy trong giai đoạn đầu, khi môi trường giàu nitrogen, vi khuẩn sinh trưởng nhanh nhưng sự sinh tổng hợp PHB trong

vi khuẩn diễn ra chậm Ở giai đoạn hai, trong môi trường bị giới hạn nitrogen, sinh tổng hợp PHB diễn ra mạnh [16]

2005, Chandrashekharaialh tiến hành phân lập và sàng lọc một số chủng vi khuẩn

sản xuất PHB, tối ưu hóa một số môi trường có khả năng nâng cao sản lượng PHB và

sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền hơn để sản xuất PHB nhằm giảm chi phí sản xuất [14]

2009, khi áp dụng hai phương pháp nuôi cấy mẻ và nuôi cấy mẻ hai giai đoạn

trên đối tượng vi khuẩn R eutropha ATCC 17697 và A lactus ATCC 29712 để sản

xuất PHB, El-sayed và cộng sự nhận thấy ở sự sinh trưởng của R eutropha ATCC

17697 cũng như hiệu quả tạo PHB đạt cao nhất (lần lượt là 6,21 g/L và 0,37 g/L) nếu

dùng glucose làm cơ chất carbon [8, 9]

2011, Suwannasing và cộng sự lên men theo mẻ R eutropha và A lactus trên cơ

chất nước mía đường Kết quả cho thấy R eutropha sinh trưởng tốt hơn A lactus, hiệu

quả sản xuất PHB của R eutropha cao nhất ở nồng độ nước mía 50 g/L [38]

2012, tại hội thảo quốc tế đại học Mae Fah Luang, Marudkla và cộng sự đã báo

cáo nghiên cứu về ảnh hưởng của glucose đến sự sản xuất PHB của R eutropha Theo

đó, nồng độ glucose trong khoảng 10 g/L đến 15 g/L là nồng độ tối ưu cho sinh trưởng

và sinh tổng hợp PHB của R eutropha [30]

1.4.2 Nghiên cứu trong nước

2006, Lê Lý Thùy Trâm và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu “Thu nhận

Poly-β-hydroxybutyrate, một loại nhựa sinh học dễ phân hủy, từ vi khuẩn Methylobacterium

sp phân lập tại Việt Nam” trên tạp chí khoa học và công nghệ- Đại học Đà Nẵng

Nhóm nghiên cứu đã phân lập, tách chiết được PHB từ chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp., tạo tiền đề cho việc nghiên cứu các vật liệu thay thế polymer

truyền thống từ nguồn phân lập vi khuẩn [2, 3]

2008, Phạm Thanh Hà, Trần Đình Mấn, Yutaka Tokiwa công bố kết quả nghiên

cứu “Tạo đột biến nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp Poly-β-hydroxybutyrate của vi

khuẩn Alcaligenes latus VN1” trên tạp chí Công nghệ Sinh học Nhóm nghiên cứu đã

thành công khi dùng tác nhân vật lí tia UV để tăng năng suất sinh tổng hợp PHB của

Alcaligen latus ở Việt Nam [7]

2010, Kiều Phương Nam và cộng sự nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp để

chủng Methylobacterium radiotolerans H2T tích lũy tạo PHB, sử dụng nguồn carbon

methanol có thể kích thích tích lũy lượng PHB 50,55% khối lượng khô tế bào [1]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm – Thời gian thực hiện

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Ralstonia eutropha là chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy lượng PHB lên đến

80% khối lượng khô tế bào Hơn nữa, chúng có khả năng sử dụng các nguồn carbon rẻ tiền như mật rỉ làm cơ chất, nhờ đó, chi phí quá trình lên men tạo PHB giảm đáng kể

[40] Nhận thấy những ưu điểm này, chúng tôi chọn chủng vi khuẩn R eutropha làm

đối tượng nghiên cứu

R eutropha được cung cấp bởi Phòng Vi Sinh thuộc Viện Kĩ Thuật Công Nghệ

Cao NTT – trường đại học Nguyễn Tất Thành

2.2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.2.1.Môi trường nuôi cấy

Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm gồm:

- Môi trường 707 giữ giống và nhân sinh khối:

Pepton 5 g/L

Cao men 3 g/L

MgSO4.7H2O 1 g/L

Agar 20 g/L

- Môi trường lên men:

NaClO 282990009 MerkChloroform UN 1888 MerkMethanol AS059 Himedia

H2SO4 đậm đặc 10039-54-0 Sigma

2.2.2.3 Thiết bị

Ngoài những dụng cụ thí nghiệm cơ bản (que cấy, đèn cồn, erlen, …), các thiết bị khác được lệt kê trong bảng 2.2

Thiết bị lên men quy mô 150 mL được thiết kế tại phòng Vi sinh gồm bình erlen

250 mL, nút cao su có gắn ống dẫn khí và thoát khí, bộ thổi khí hồ cá và dây dẫn khí

có nút điều chỉnh lượng khí lưu thông (Hình 2.1)

Hình 2.1 Thiết bị lên men 150 mL

(A) Bộ thổi khí (B) Nút cao su gắn ống dẫn và thoát khí

(C) Dây dẫn khí có nút điều chỉnh lượng khí

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

LANGSHAN BIOCOTE STURDY HUY HOANG NewBrunstick

PG Instruments

Trung Quốc

Mỹ Đức Trung Quốc Đức

Đức

Mỹ Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Việt Nam

Mỹ

Mỹ

2.3 Bố trí thí nghiệm

2.3.1 Kiểm tra một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn

Kiểm tra đại thể: quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa

Kiểm tra vi thể: quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quang học

Kiểm tra hoạt tính PHB: xác định khả năng tạo PHB của chủng vi khuẩn bằng thuốc nhuộm Sundan Black B

2.3.2 Khảo sát một số điều kiện thích hợp để lên men R eutropha tạo PHB

Để tối ưu hóa môi trường lên men tạo PHB, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của bốn yếu tố là nồng độ mật rỉ, nguồn nitrogen, nồng độ nitrogen và pH môi trường đối

với sinh trưởng và sinh tổng hợp PHB ở R eutropha

Chuẩn bị mẫu tiếp giống, R eutropha được cấy vào erlen 250 mL chứa 100 mL

môi trường 707 Erlen được đặt trên máy lắc (tốc độ 150 rpm, 30 C) trong 24 giờ [9] Cấy 1 mL dịch môi trường vào trong các erlen chứa 150 mL môi trường lên men, đậy kín miệng erlen bằng nút cao su có gắn ống dẫn khí và thoát khí Môi trường lên men sử dụng nguồn carbon là mật rỉ đường mía sẽ được thay đổi các thông số về dinh dưỡng và điều kiện môi trường để tối ưu hóa quá trình sản xuất PHB

Trước khi bổ sung vào môi trường lên men, rỉ đường mía được xử lí để loại bỏ một số tạp chất Hòa tan rỉ đường với nước theo tỉ lệ 1:1 rồi chuẩn độ pH dung dịch đến 1,5 bằng H2SO4 98% Sau đó, đun sôi dung dịch trong 30 phút để thủy phân các chất bã hữu cơ Để nguội dung dịch và dùng Ca(OH)2 để chuẩn độ pH dung dịch đến 7,5 Sau đó, để yên dung dịch trong 12 giờ để lắng tủa Cuối cùng, lọc bỏ tủa và đưa đi hấp khử trùng ở 121 C trong 15 phút [26] (Hình 2.2)

Erlen đựng môi trường lên men được sục khí liên tục bằng hệ thống thổi khí với tốc độ 68 giọt khí mỗi phút Sau 24 giờ lên men, thu 1mL mẫu trong điều kiện vô trùng và phân tích để xác định khối lượng khô tế bào và khối lượng PHB thu được Mẫu được thu cách 24 giờ một lần, tiến hành thu mẫu trong 120 giờ (5 lần thu)

Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần, dùng phần mềm Excel và Minitab để xử

lí thống kê số liệu thu được