Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen Cytochrome b (cytb) và xác định mối quan hệ phả hệ của loài cá heo Ông Sư tại vùng biển Kiên Giang, Việt Nam.
Trang 1XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA Cytochrome b
CỦA HỆ GEN TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA
LOÀI CÁ HEO ÔNG SƯ (Orcaella brevirostris Gray, 1866)
VÙNG BIỂN KIÊN GIANG, VIỆT NAM
CÙ NGUYÊN ĐỊNH (1), NGUYỄN THỊ BÍCH NGA (2), NGUYỄN THỊ NGA (3),
TRẦN LINH THƯỚC (4), BÙI LAI (5)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Cá heo Ông Sư (Orcaella brevirostris Gray, 1866) còn có tên là cá heo
Irrawaddy, cá nược Minh Hải là một loài động vật có vú thuộc họ cá heo Delphinidae Đánh giá chung tình trạng của loài cá heo này theo Danh lục Đỏ IUCN,
cá heo Ông Sư được xếp vào bậc sẽ nguy cấp (VU - Vulnerable ) và loài này được bảo tồn ở Việt Nam theo Quyết định số 82/2008/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu về động vật biển nói chung trong đó
có loài cá heo Ông Sư vẫn còn rất ít các nghiên cứu Bên cạnh đó kết quả nghiên cứu
về đặc điểm hình thái chưa đủ để định loại chính xác và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa quần thể cá heo Ông Sư Việt Nam với các quần thể cá heo Ông Sư khác Các tư liệu nghiên cứu di truyền loài cá heo này cũng không có nhiều [2] Vì vậy, nghiên cứu về đặc điểm hình thái kết hợp với phương pháp giám định phân tử trong định loại và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa quần thể cá heo Ông Sư Việt Nam với các quần thể cá heo Ông Sư khác là cần thiết và có ý nghĩa khoa học
Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả sử dụng phương pháp sinh học phân tử
giải trình tự gen cytochrome b (cytb) và xác định mối quan hệ phả hệ của loài cá heo
Ông Sư tại vùng biển Kiên Giang, Việt Nam
2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá heo Ông Sư được nuôi dưỡng tại Câu lạc bộ cá heo Vinpearl - Nha Trang Đây là loài cá heo thu nhận tại vùng biển Kiên Giang - Việt Nam đã được thuần dưỡng Ký hiệu 02 mẫu cá heo là OBRE1-VN và OBRE2-VN
Phương pháp lấy mẫu: Lấy mẫu máu toàn phần của cá cho vào ống có chất chống đông, bảo quản trong hộp xốp có đá để vận chuyển về tách DNA tổng số
2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sử dụng bộ kit
“Qiagen Genomic DNA Extraction Kit” của hãng QIAGEN Inc (USA-Mỹ) để tách DNA tổng số
Trang 22.3 Phương pháp PCR thu nhận vùng gen đích
Gen cytochrome b của hệ gen ty thể cá heo Ông Sư được lựa chọn để thu nhận
gen bằng phương pháp PCR và giải trình tự, sau đó sử dụng chuỗi nucleotide của
gen cytochrome b đã được giải trình tự để phân tích và so sánh với các chuỗi gen đã
công bố trên Ngân hàng gen (Gen Bank)
Mồi thực hiện PCR được thiết kế dựa trên trình tự bảo tồn của gen cytochrome b
Cặp mồi được sử dụng có trình tự trong bảng 1
Bảng 1 Trình tự các mồi thu nhận gen cytochrome b
TT Tên mồi (primer) Trình tự mồi thiết kế
Gen cytochrome b có kích thước khoảng 1.200 nucleotide (base pair - bp)
Thực hiện phản ứng PCR với DNA tổng số thu nhận làm khuôn, sử dụng cặp mồi OBREF - OBRER để nhân đoạn gen đích bằng bộ kit AccuPower®ProFi Taq PCR Premix do hãng BIONEER (Hàn Quốc) cung cấp Thành phần phản ứng PCR gồm: Khuôn DNA tổng số: 2 μl; Mồi xuôi (10pmol/μl): 2 μl; Mồi ngược (10pmol/μl): 2 μl; DMSO: 2 μl; Nước tinh khiết: 42 μl Tổng thể tích là 50 μl Chu trình nhiệt thực hiện PCR gồm: 1 chu kỳ 94 o C - 5 phút; 35 chu kỳ 94 o C - 30 giây;
52 o C - 30 giây; 68 o C - 7 phút; giai đoạn tổng hợp chuỗi: 72 o C - 10 phút; Sản phẩm được bảo quản ở 4 o C cho đến khi sử dụng
Điện di trên thạch agarose 1% để kiểm tra sản phẩm PCR và tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần phụ không mong muốn chỉ giữ lại DNA tinh khiết Tinh sạch sản phẩm bằng bộ QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc.) Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được dòng hóa vào vector tách dòng pCR2.1TOPO (hãng Invitrogen - Mỹ) để thu nhận DNA tái tổ hợp và gửi đọc
trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc)
2.4 Phương pháp giải trình tự
Cặp mồi dùng để giải trình tự DNA plasmid tái tổ hợp gồm:
- Mồi xuôi (M13F) : 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ hoặc
- Mồi ngược (M13R) : 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’
Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5’→ 3’ và dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide
và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự, phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin - sinh học
Trang 32.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Sau khi giải trình tự các chuỗi nucleotide được thu nhận và xử lý bằng các phần mềm Chromas LITE v2.01, s o sánh đối chiếu và xử lý số liệu các chuỗi từ
(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) [3]
Sử dụng chương trình MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) để xây dựng cây phả hệ Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen
cytochrome b trong hệ gen ty thể (mtDNA) của một số loài cá heo đã công bố trong
Ngân hàng gen (GenBank) Phân tích được tiến hành dựa trên thuật toán Neightbour joining (NJ) bằng phần mềm MEGA6.06 [4]
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thu nhận gen cytochrome b của các mẫu nghiên cứu
Thực hiện phản ứng PCR thu nhận đoạn DNA với cặp mồi đặc hiệu của gen
cytochrome b có độ dài dự kiến khoảng 1,2 kb (hình 1)
Hình 1 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen cytochrome b của hai mẫu cá
heo Ông Sư (ký hiệu OBRE1-VN và OBRE2-VN) trên thạch agarose 1%
Ghi chú: M: Marker Lamda cắt bằng enzyme HindIII; Đ/C(-): mẫu đối chứng âm
Kết quả ở hình 1 cho thấy hai mẫu OBRE1-VN và OBRE2-VN trong nghiên
cứu đã được tách DNA tổng số, phản ứng PCR thu nhận gen cytochrome b đã được
thực hiện thành công, sản phẩm PCR có độ dài khoảng 1,2 kb đúng với dự kiến Sản phẩm đơn băng, rõ nét với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phù hợp Các sản phẩm này được tinh sạch bằng bộ QIAquick purification (Mỹ)
Trang 43.2 Kết quả dòng hóa và giải trình tự
Sản phẩm PCR của gen cytochrome b được dòng hóa (cloning) vào vector pCR2.1TOPO của hãng Invitrogen, sau đó được chuyển nạp vào tế bào khả biến E
coli chủng DH5α-T1 Sản phẩm sau chuyển nạp được nuôi cấy trên đĩa thạch
LB-agar 1,5% có bổ sung X-gal (40 mg/ml) và Kanamycin (40 mg/ml), ủ ở 37 o C trong
18 đến 20 giờ (hình 2) Chọn lọc các khuẩn lạc trắng (đây là những khuẩn lạc có thể
mang gen cytochrome b được tái tổ hợp) nuôi cấy vào môi trường LB khoảng 20 giờ
và tiến hành tách chiết DNA plasmid, cắt kiểm tra sản phẩm DNA tái tổ hợp bằng
enzym giới hạn EcoRI và điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%
Hình 2 Hình ảnh chuyển nạp sản phẩm PCR của mẫu OBRE1-VN và OBRE2-VN
vào tế bào E coli chủng DH5α-T1
Ghi chú: trên đĩa petri các khuẩn lạc dương tính có khả năng chứa đoạn chèn (insert) sản phẩm PCR của gen cytochrome b có màu trắng Những khuẩn lạc không mang sản phẩm có màu xanh
Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp sau khi tách dòng, được chọn các clone đại diện làm nguyên liệu giải trình tự Các DNA tái tổ hợp được gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen - Seoul, Hàn Quốc
3.3 Kết quả giải trình tự và xây dựng cây phả hệ nguồn gốc
Sau khi giải trình tự nucleotide, thu nhận chuỗi gen cytochrome b, tiến hành
BLAST vào Ngân hàng gen để thu thập các chuỗi thuộc họ cá heo đã công bố so sánh với chuỗi gen của OBRE1-VN và OBRE2-VN trong nghiên cứu
Kết quả thu nhận chuỗi gen cytochrome b của hai mẫu nghiên cứu
OBRE1-VN và OBRE2-OBRE1-VN sau khi giải trình tự có kích thước là 1.140 nucleotide Gen
cytochrome b mã hóa cho protein cytochrome b gồm 379 amino acid, khởi đầu là
ATG mã hóa cho Methionin và kết thúc bằng bộ ba TGA (hình 3)
Trang 5* 20 * 40 * 60 * 80
OBRE1-VN-c : MTNIRKTHPLMKILNDAFIDLPTPSNISSWWNFGSLLGLCLITQILTGLFLAMHYTPDTSTAFSSVAHICRDVNYGWFIRYLHA : 84 OBRE2-VN-c : : 84
OBRE-KG-VN : : 84
OBRE-Laos- : : 84
OBRE-SWFSC : : 84
Ohei06-DK- : N S M : 84
Ohei08-DK- : N S M : 84
Ohei28-DK- : N S M : 84
Oorc-72-US : N L : 84
Oorc-96-US : N L : 84
Oorc-111-U : N L : 84
Oorc-129-U : N L : 84
Oorc-ENAC2 : N L : 84
Satt-z0000 : M : 84
Satt-z0002 : M : 84
Satt-z0002 : - M : 83
Satt-z0011 : M : 84
Satt-z0012 : M : 84
Satt-z0016 : - M - : 82
Satt-z0038 : M : 84
* 100 * 120 * 140 * 160
OBRE1-VN-c : NGASMFFICLYAHIGRGLYYGSYMFQETWNIGVLLLLTVMATAFVGYVLPWGQMSFWGATVITNLLSAIPYIGTTLVEWIWGGF : 168 OBRE-KG-VN : : 168
OBRE-Laos- : : 168
Ohei02-DK- : : 168
Ohei06-DK- : : 168
Ohei08-DK- : : 168
Ohei28-DK- : : 168
Oorc-72-US : V A : 168
Oorc-96-US : V A : 168
Oorc-97-US : V A : 168
Oorc-129-U : V A : 168
Oorc-ENAC2 : V A : 168
Satt-z0002 : : 168
Satt-z0002 : : 168
Satt-z0002 : : 167
Satt-z0011 : : 168
Satt-z0012 : T : 168
Satt-z0016 : - : 165
Satt-z0024 : : 168
* 180 * 200 * 220 * 240 *
OBRE1-VN-c : SVDKATLTRFFAFYFILPFIITALVIVHLLFLHETGSNNPTGIPSNMDMIPFHPYHTFKDILGALLLILVLLTLTLFTPDLLGD : 252 OBRE2-VN-c : H : 252
OBRE-KG-VN : H : 252
OBRE-Laos- : H : 252
Ohei02-DK- : H T : 252
Ohei06-DK- : H T : 252
Ohei08-DK- : H T M : 252
Ohei22-DK- : H T M : 252
Oorc-72-US : H TA I T T A A : 252
Oorc-96-US : H TA I T T A A : 252
Oorc-111-U : H TA I T T A A : 252
Oorc-129-U : H TA I T T A A : 252
Oorc-ENAC2 : H TA I T T A A : 252
Satt-z0002 : H AA Y.I T A : 252
Satt-z0002 : H AA Y.I T A : 252
Satt-z0002 : H AA Y.I T A : 251
Satt-z0011 : H AA Y.I T A : 252
Satt-z0012 : H AA Y.I T A : 252
Satt-z0016 : H AA Y.I T A : 249
Satt-z0038 : H AA Y.I T A : 252
260 * 280 * 300 * 320 *
OBRE1-VN-c : PDNYTPANPLSTPAHIKPEWYFLFAYAILRSIPNKLGGVLALLLSILILIFIPMLQTSKQRSMMFRPFSQLLFWTLIADLLTLT : 336 OBRE2-VN-c : : 336
OBRE-KG-VN : : 336
OBRE-Laos- : : 336
OBRE-SWFSC : : 336
Ohei06-DK- : : 336
Ohei08-DK- : : 336
Trang 6Ohei28-DK- : : 336
Oorc-96-US : V : 336
Oorc-97-US : V : 336
Oorc-111-U : V : 336
Oorc-129-U : V : 336
Satt-z0000 : V : 336
Satt-z0002 : V : 336
Satt-z0002 : V : 335
Satt-z0011 : V : 336
Satt-z0011 : V : 336
Satt-z0016 : V : 333
Satt-z0024 : V : 336
Satt-z0038 : V : 336
340 * 360 * 380
OBRE1-VN-c : WIGGQPVEHPYIIVGQLASILYFLLILVLMPTVSLIENKLLKW- : 379 OBRE2-VN-c : - : 379
OBRE-Laos- : S - : 379
OBRE-SWFSC : - : 379
Ohei02-DK- : - : 379
Ohei08-DK- : - : 379
Ohei22-DK- : - : 379
Ohei28-DK- : - : 379
Oorc-72-US : I - : 379
Oorc-97-US : I - : 379
Oorc-111-U : I - : 379
Oorc-ENAC2 : I - : 379
Satt-z0000 : AG - : 379
Satt-z0002 : AG - : 379
Satt-z0002 : AG - : 378
Satt-z0011 : AG - : 379
Satt-z0011 : AG - : 379
Satt-z0012 : AG - : 379
Satt-z0024 : AG - : 379
Satt-z0038 : AG - : 379
Hình 3 Trình tự amino acid suy diễn gen cytochrome b của OBRE1-VN và
OBRE2-VN so sánh với các chuỗi đăng ký trong Ngân hàng gen
Ký hiệu (.) là biểu thị các trình tự amino acid giống nhau Các sai khác được thể hiện bằng các chữ cái
Kết quả ở hình 3 cho thấy chuỗi gen amino acid cytochrome b trong 2 mẫu
OBRE1-VN và OBRE2-VN có sự tương đồng rất cao (99%) so với các chuỗi gen
cytochrome b đã công bố trong Ngân hàng gen là OBRE-KG-VN (số đăng ký:
JQ814471), mẫu của Indonesia OBRE-SWFSC-74697-ID (số đăng ký: JF289177)
và mẫu của Lào là OBRE-Laos (số đăng ký: AF084062) Đặc biệt trong hai mẫu OBRE1-VN và OBRE2-VN phát hiện có sự sai khác tại vị trí amino acid Y182H (Y = Tyrosine; H = Histidine) Trong đó, Tyrorine là một acid amin không cần thiết
có thể tổng hợp được trong cơ thể mà khi thiếu chúng thì cơ thể có thể bù trừ sự thiếu hụt đó nhờ các quá trình tổng hợp bên trong Còn Histidine là một acid amin cần thiết không thể thay thế được vì chúng không thể tự tổng hợp trong cơ thể hoặc tổng hợp với tốc độ không thể đáp ứng được nhu cầu của cơ thể mà chúng phải được đưa vào đầy đủ trong đạm thức ăn Về vấn đề này rất lý thú cần có thêm những nghiên cứu sâu hơn về bản chất của các amino acid và vai trò dinh dưỡng của chúng và với số lượng cỡ mẫu trong nghiên cứu cũng nhiều hơn Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả
còn thu thập thêm một số chuỗi của loài Orcaella heinsohni (Ohei), Orcinus orca
(Oorc) và Stenella attenuata (Satt) đăng ký trong GenBank thuộc họ cá heo để tham
khảo trong so sánh và phân tích trình tự nucleotide và amino acid suy diễn
Kết quả xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi cytochrome b
Trang 7của 26 mẫu (bao gồm cả hai mẫu trong nghiên cứu) được trình bày ở hình 4 Kết quả cây phả hệ cho thấy hai mẫu OBRE1-VN và OBRE2-VN nằm trong cùng nhóm cá heo Ông Sư của Việt Nam (OBRE-KG-VN), Indonesia (OBRE-SWFSC-74697-ID)
và Lào (OBRE-Laos) Như vậy, hai mẫu OBRE1-VN và OBRE2-VN đã được xác
định chính xác thuộc loài cá heo Ông Sư (Orcaella brevirostris Gray, 1866).
Hình 4 Cây phả hệ của OBRE1-VN và OBRE2-VN và các loài trong họ cá heo đã
được đăng ký trong Ngân hàng gen dựa trên phân tích chuỗi nucleotide gen
cytochrome b Ký hiệu ( ♦ ) là các mẫu trong nghiên cứu này
4 KẾT LUẬN
1 Sử dụng phương pháp sinh học phân tử so sánh, phân tích chuỗi nucleotide
và amino acid suy diễn của gen cytochrome b
2 Xây dựng cây phả hệ cho thấy hai mẫu OBRE1-VN và OBRE2-VN đã được xác
định thuộc về loài cá heo Ông Sư có tên khoa học là Orcaella brevirostris Gray, 1866
3 Các mẫu trong nghiên cứu có mối quan hệ phả hệ nguồn gốc gần với một số
mẫu đã công bố trong Ngân hàng gen của Việt Nam, Indonesia và Lào
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Danh mục các loài thuỷ sinh quý
hiếm có nguy cơ tuyệt chủng ở Việt Nam cần được bảo vệ, phục hồi và phát triển, Quyết định số 82/2008/QĐ-BNN, 2008
2 LeDuc R.G., Perrin W.F., Dizon A.E., Phylogenetic relationships among the
Delphinid cetaceans based on full cytochrome b sequences Mar Mamm Sci
1999, 15:619-648
OBRE1-VN-cytB(1140bp) OBRE-KG-VN-JQ814471 OBRE2-VN-cytB(1140bp) OBRE-SWFSC-74697-ID-JF289177 OBRE-Laos-AF084062 Ohei02-JF339980 Ohei06-JF339981 Ohei08-JF339978 Ohei22-JF339979 Ohei28-JF339977 Oorc-96-KR180365 Oorc-97-KR180366 Oorc-72-KR180342 Oorc-111-KR180312 Oorc-129-KR180326 Oorc-ENAC2-Spain-HQ405752 Satt-z0011921-KX857288 Satt-z0012046-KX857298 Satt-z0016255-KX857317 Satt-z0024848-KX857334 Satt-z0000973-KX857266 Satt-z0038287-KX857341 Satt-z0002879-KX857280 Satt-z0002173-KX857273 Satt-z0002203-KX857279 Satt-z0011361-KX857281
100
89 100
92
100 75
100
100 76
0.005
Trang 83 Nicholas K.B., Nicholas H.B., GeneDoc: a tool for editing and annotating
multiple sequence aglignments, Distributed by authors, 1997
4 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S., MEGA6: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0, Mol Biol Evol, 2013, 30:2725-2729
5 The IUCN Red List of Threatened Species Version 2016.3
http://www.iucnredlist.org/details/15419/0 Truy cập 5/4/2017
SUMMARY
DETERMINING THE MITOCHONDRIAL Cytochrome b GENE SEQUENCE
AND THE HEREDITARY RELATIONSHIP OF IRRAWADDY DOLPHINS
(Orcaella brevirostris Gray, 1866) IN KIEN GIANG WATERS, VIETNAM
In this study, two samples of Irrawaddy dolphins (Orcaella brevirostris Gray,
1866) in Kien Giang waters, Vietnam were collected The phylogenetic tree showed that Irrawaddy dolphins in Vietnam had a close genetic relationship to Irrawaddy dolphins in Indonesia and Laos which have been registered in the Gene Bank
This is the latest research in Vietnam about determining the mitochondrial
cytochrome b gene sequence and the hereditary relationship of Irrawaddy dolphin
(Orcaella brevirostris Gray, 1866) in Kien Giang waters This results contributed to the
conservative research and development of this valuable and rare marine mammal species
Từ khóa: Cá heo Ông Sư, phả hệ, phát sinh loài, ty thể, Orcaella brevirostris, cytochrome b, Irrawaddy dolphin, family tree, phylogenetic, mitochondria.
Nhận bài ngày 24 tháng 8 năm 2017 Hoàn thiện ngày 12 tháng 10 năm 2017
(1) Chi nhánh Phía Nam, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga
(2) Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
(3) Đại học Quốc tế Hồng Bàng
(4) Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG.HCM
(5) Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
