Nghiên cứu thành phần hóa học cao ethyl acetate của cây ruột gà bò spermacoce exilis, họ cà phê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY RUỘT GÀ BÒ SPERMACOCE EXILIS, HỌ CÀ PHÊ Huỳnh Qu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CAO ETHYL ACETATE

CỦA CÂY RUỘT GÀ BÒ SPERMACOCE EXILIS,

HỌ CÀ PHÊ

Huỳnh Quang Khải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CAO ETHYL ACETATE

CỦA CÂY RUỘT GÀ BÒ SPERMACOCE EXILIS,

: K40.201.034

Em xin cảm ơn quý Thầy Cô khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm thành phố HồChí Minh, các Thầy Cô đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và truyền thụ cho em nhữngkiến thức khoa học quý báu trong quá trình em học tại trường.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh cao học khóa 26, anh Nguyễn Thành Đạt học viêncao học đã hết lòng chỉ bảo và hỗ trợ em một cách tận tình nhất

Mình xin cảm ơn các bạn cùng làm việc tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên đãtận tình trao đ럘i những kinh nghiệm, giúp đỡ và động viên trong suốt quá trình thực hiệnkhóa luận

Cuối cùng, lời biết ơn gửi đến gia đình luôn là điểm tựa vững chắc để con có thểtoàn tâm toàn ý hoàn thành tốt khóa luận này

oỤ Ụ

CRM N

MỤC ỤC

DANH MỤC CÁC TỪ V ẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BANG

DANH MUC CAC S ĐÔ

DANH MUC CAC H NH

DANH MUC CAC PHU UC

MỞ ĐẦU 1

CHƯ NG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm thực vật của cây: 3

1.1.1 Mô tả chung: 3

1.1.2 Vùng phân bố: 3

1.2 Các nghiên cứu về hoạt tính 4

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 6

CHƯ NG 2 THỰC NGH ỆM 13

2.1 Hoá chất, thiết bị, phương pháp 13

2.1.1 Hoá chất 13

2.1.2 Thiết bị 13

2.1.3 Phương pháp tiến hành 13

2.2 Nguyên liệu 14

2.3 Điều chế các loại cao 14

2.4 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong cao ethyl acetate 15

2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate 15

2.4.2 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn EA1 16

2.4.3 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn EA1.1 16

CHƯ NG 3 KẾT QUR VÀ THRO UẬN 19

3.1 Khảo sát cấu trúc hợp chất KR1 19

3.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất KR2 21

3.3 Khảo sát cấu trúc hợp chất KR3 23

KẾT UẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26

TÀ ỆU THAM KHRO 27

DA H oỤ Á TỪ V ẾT TẮT

Ac Acetone

AcOH Acetic acid

C Chloroform

COSY Correlation Spectroscopy

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HR-ES -MS High Resolution-ElectroSpray onization-Mass Spectrometry

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

DA H oỤ Á R m

Bảng 1.1 Thành phần hóa học một số thực vật cùng chi Spermacoce 6

Bảng 2.1 Kết quả sắc kí cột trên cao ethyl acetate 16

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn EA1 17

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn EA1.1 17

Bảng 3.1 Dữ liệu ph럘 NMR của hợp chất KR1 và 5,7-dimethoxyflavone 21

Bảng 3.2 Dữ liệu ph럘 NMR của hợp chất KR2 23

Bảng 3.3 Dữ liệu ph럘 NMR của hợp chất KR3 và scopoletin 25

DA H oỤ Á 롸

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao từ cây Ruột gà bò 15

Sơ đồ 2.2 Qui trình phân lập một số hợp chất hữu cơ trong cao ethyl acetate 18

DA H oỤ Á H밸 H

Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của hợp chất KR1 20Hình 3.2 Một số tương quan HMBC của hợp chất KR2 22Hình 3.3 Một số tương quan HMBC của hợp chất KR3 24

oỞ ẦU

1 ý do chọn đề tài

Ngày nay, sự phát triển của khoa học kỹ thuật là rất mạnh, các nhà hóa học đã t럘nghợp được nhiều loại hợp chất chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau Tuy nhiên, những loạithuốc này thường rất đắt và một số chúng có tác dụng phụ Chính vì thế, nhiều người cókhuynh hướng quay về với nền y học c럘 truyền, sử dụng dược thảo làm thuốc trị bệnh.Nước ta thuộc vùng nhiệt đới gió mùa, có nguồn thực vật đa dạng và phong phú là một

ưu thế rất lớn đối với các nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên

Chi Spermacoce, họ Cà phê (Rubiaceae), có khoảng 280 loài Một số loài cây thuộc chi Spermacoce đã được sử dụng trong y học c럘 truyền của nhiều nước ở châu Á,

Châu Âu để chữa trị các bệnh viêm nhiễm, điều trị sốt rét[8]…

Các nghiên cứu hóa – dược cho thấy chi Spermacoce chứa rất nhiều loại hợp chất

hữu cơ có hoạt tính sinh học hấp dẫn như triterpene, steroid, flavonoid, iridoid, alkaloid,

Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu được thực hiện trên cây Ruột gà bò Spermacoce exilis nên

em tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học cao ethyl acetate của cây

ruột gà bò spermacoce exilis, họ Cà phê ”.

2 oục đích nghiên cứu

Khảo sát thành phần hóa học của cây Ruột gà bò nhằm làm sáng tỏ thành phần hóahọc của cây và làm tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực tế cuộc sống

3 hiệm vụ nghiên cứu

Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất hữu cơ có trong cao chiếtethylacetate

4 ối tượng khảo sát

Cây Ruột gà bò Spermacoce exilis ( O.Williams) C.D.Adams ex W.C.Burger & C.M.Taylor, họ Cà phê (Rubiaceae) được thu hái tại xã ong An, TP Mỹ Tho, tỉnh Tiền

Giang vào tháng 12 năm 2016 và được định danh bởi TS Đặng Văn Sơn – Viện Sinh họcnhiệt đới TPHCM, số 85 Trần Quốc Toản Quận 3 TP.HCM

Cây được lưu trữ làm tiêu bản tại khoa Hóa Hữu Cơ trường ĐH Khoa học Tự nhiên

5 hương pháp nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp chiết xuất để điều chế cao

- Sử dụng phương pháp sắc ký, kết tinh lại để phân lập một số hợp chất có trong cao

- Xác định cấu trúc các hợp chất đã cô lập bằng các phương pháp ph럘 nghiệm:

1H-NMR,13C-NMR, HSQC, HMBC,…

HƯ m 1 TỔ m QUA

1.1 ặc điểm thực vật của cây:

Tên thông thường: Ruột gà bò

Thuộc họ Cà phê (Rubiaceae)

Tên khoa học: Spermacoce exilis ( O.Williams) C.D.Adams ex W.C.Burger &

C.M.Taylor

Tên gọi khác: Borreria repens DC., Borreria setidens Miq.Bold. [1]

Hình 1.1 Cây Spermacoce exilis

1.1.1 oô tả chung:

Cây bò rồi đứng, hay đứng có chiều cao trung bình 5 – 20 cm, thân có 4 cánh thấp,

có lông mịn á có phiến xoan hay thon, to 0.8 – 1.5 x 1 – 1.3 cm, không có lông, mỏng;cuống dài 3 – 4 (10) mm, lá bẹ có tơ dài Chụm ở nách lá; hoa trắng; vành có ống rấtngắn, cao 2 – 3 mm Nang nở làm hai mảnh, hột 2 [1]

1.2 ác nghiên cứu về hoạt tính

Ở châu Âu và châu Mỹ, cây Spermacoce exilis được dùng để chữa đau đầu, sốt.[8]

Các nghiên cứu về hoạt tính trước đây trên cây này cho thấy cao methanol của

Spermacoce exilis có tác dụng bắt gốc tự do DPPH ở nồng độ 370 mg/m và ức chế

91.16% sự tạo thành NO.[7]

Do các nghiên cứu về hoạt tính trên cây Ruột gà bò (Spermacoce exilis) còn rất ít

nên em xin trình bày dược tính trên một số loài cùng chi:

 Tác dụng kháng khuẩn

♦ Nghiên cứu trên loài S articularis (B Articularis)

Cao ethyl acetate và ethanol của phần trên mặt đất (được thửnghiệm ở nồng độ 2000 mg/đĩa) cho thấy có tác dụng kháng mạnh các vi

khuẩn như: Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Salmonella typhi, Shigella paratyphi, Pseudomonas aeruginosa , Shigella aureus và Vibrio cholera với đường kính vòng vô khuẩn 6 – 20 mm Trong đó hoạt chất cô

lập được trong S articularis là 6-metyl-5-cyclodecen-1-ol có hoạt tính

mạnh nhất chống lại các chủng vi khuẩn trên với đường kính vòng vôkhuẩn từ 15 – 20 mm.[8]

♦ Nghiên cứu trên loài S eupatorioides (B eupatorioides)

Dịch chiết nước của rễ có tác dụng kháng khuẩn Salmonella typhi

( C5010.1 mg/m ) và Escherichia coli ( C5062.5 mg/m ).[8]

♦ Nghiên cứu trên loài S ocymoides (B ocymoides)

Dịch chiết nước từ lá thể hiện khả năng kháng các vi khuẩn Proteus

mirabilis, P aeruginosa và Neisseria gonorrhoeae.[8]

♦ Nghiên cứu trên loài S verticillata (B verticillata)

Dịch chiết methanol của rễ cây có tác dụng kháng khuẩn

P aeruginosa.[8]

Tinh dầu ở phần trên mặt đất của cây cho thấy có tác dụng chống

lại một số vi sinh vật như S aureus, N gonorhoea, E coli, C albicans

(M C 12.5 – 31.3 mg/m ).[6]

♦ Nghiên cứu trên loài S hispida (B hispida)

Dịch chiết ethanol toàn cây có tác dụng kháng vi khuẩn E coli rất

mạnh với đường kính vòng vô khuẩn 20 mm.[11]

Dịch chiết methanol toàn cây có tác dụng kháng vi khuẩn Bacillus

subtilis, Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, P aeruginosa, E coli,

và Klebsiella pneumonia với M C 250 mg/m [8]

 Tác dụng kháng viêm

♦ Nghiên cứu trên loài S articularis (B articularis)

Dịch chiết ether, chloroform, ethyl acetate và benzene có tác dụngkháng viêm ở chuột với kết quả lần lượt là 27.14%; 55.26%; 53.93%;74.5% và 53.5%, khi thử nghiệm ở chuột với liều lượng là 150 mg/kg thềtrọng.[8]

♦ Nghiên cứu trên loài S hispida (B hispida)

Dịch methanol của toàn bộ thân cây có tác dụng kháng viêm ởchuột với liều lượng thử nghiệm 100 và 200 mg/kg thể trọng chuột.[8]

 Tác dụng kháng nấm

Tác dụng kháng nấm được nghiên cứu trên loài S articularis

(B articularis) Dịch chiết ethyl acetate (37 – 45%) và ethanol (34.5

-50%.) của phần trên mặt đất có tác dụng kháng nấm Aspergillus niger,

Aspergillus ustus, Aspergillus ochraceus, và Candida albican.[8]

 Tác dụng chống máu nhiễm mỡ

Tác dụng chống mau nhiễm mỡ được nghiên cứu trên loài S.

hispida(B hispida) Dịch chiết methanol toàn cây có tác dụng làm giảm

đáng kể nồng độ lipid và lipoprotein trong huyết tương và mô (gan, tim,động mạch chủ ở chuột).[8]

 Tác dụng chống oxy hóa

♦ Nghiên cứu trên loài S articularis (B articularis)

Cao methanol toàn cây có tác dụng chống oxy hóa khi thử nghiệmvới DPPH (65 mg/m ) và ức chế 77.3 % sự tạo thành NO.[7]

♦ Nghiên cứu trên loài S hispida (B hispida )

Cao methanol toàn cây có khả năng chống oxy hóa khi thử nghiệmbằng phương pháp ABTS (3.91 mmol), bằng phương pháp DPPH (2.73mmol) và bằng thử nghiệm FRAP (0.92 µmol).[10]

Dịch chiết ether dầu hỏa, ethyl acetate và methanol toàn cây có tácdụng kháng oxy hóa khi thử nghiệm bằng phương pháp FRAP với C50lầnlượt là 970, 180 và 65 mg/m [8]

 Tác dụng chống khối u

Tác dụng chống khối u được nghiên cứu trên loài S pusilla

(B pusilla) Cao ethanol nước (1:1) có tác dụng chống tế bào euk-P388 ở

liều 115 mg/kg.[8]

 Tác dụng bảo vệ gan

Tác dụng bảo vệ gan được nghiên cứu trên loài S articularis (B.

articularis) Dịch chiết nước có tác dụng bảo vệ gan không bị gây độc bởi

tác nhân paracetamol.[8]

1.3 ác nghiên cứu về thành phần hóa học

Năm 2010 Neoh Bee Keat và các cộng sự [9] đã cô lập được từ Spermacoce exilis

được 4 hợp chất: stigmasterol (44), ursolic acid (45), benzo[g]isoquinoline-5,10-dione (65) và hexadecanoic acid (66).

Do các nghiên cứu về thành phần hóa học trên cây Ruột gà bò còn ít nên em xintrình bày thành phần hóa học của một số cây cùng chi

ảng 1.1 Thành phần hóa học một số thực vật cùng chi Spermacoce[8]

oài permacoce

(Borreria) Thành phần hóa học

Ký hiệu

S capitata

(B capitata)

BorrecarpineBorrecoxineBorrelineDehydroborrecapine

(4)

(5)

(-)-EmetinesoborreverineSpermacoceineVerticillatine AVerticillatine BAsperulosideAsperulosidic acidBorreriageninDaphyllosideDeacetylasperulosideDeacetylasperulosidic acidFeretoside

6’-O-(2-glyceryl)scandoside methyl ester

Methyl deacetylasperulosidateCampesterol

CariophylleneGuiaene

β-Sitosterol

Ursolic acidUrsolic acid methyl esterUvaol

6α-Hydroxyadoxoside Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside

Kaempferol 3-O-rutinoside Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside

Quercetin 3-O-α- -rhamnopyranosyl-(1→6)-β-Dgalactopyranoside

(Z)-3-Hexenyl O-α- -rhamnopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranoside

-Phenyethyl O-α- -arabinopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranoside

-Phenyethyl O-β-D-glucopyranoside

Phenyethyl O-α-

β-Sitosterol

Ursolic acidHexacosan-1-olinoleic acidStearic acid

ridoid

teroid

ác hợp chất khác

mhi chú

 Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254, Merck.

 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: ethanol, hexane, chloroform,ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất

 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên sắc kí lớp mỏng: sử dụng

H2SO420%

2.1.2 Thiết bị

 Các cột thủy tinh dùng trong sắc kí

 Bếp đun cách thuỷ

 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu

 Máy cô quay chân không Heildolph-Đức

 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

 Cân điện tử

2.1.3 hương pháp tiến hành

hương pháp phân lập các hợp chất

 Sử dụng phương pháp ngâm dầm để điều chế cao ban đầu

 Dùng phương pháp chiết lỏng – lỏng để điều chế các cao phân đoạn

 Dùng các phương pháp sắc ký bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel để côlập và tinh chế một số hợp chất trong các cao phân đoạn

 Phát hiện vết chất trên sắc ký lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng

254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%, hơ nóng bảnmỏng

hương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

 Cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết cô lập từ cây Ruột gà bò được xácđịnh bằng các phương pháp ph럘 Ph럘 cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR(500MHz) , 13C-NMR (125 MHz), HSQC, HMBC) được ghi trên máy BrukerAvance 500 tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tựnhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh và tại Viện Hóa họcthuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Số 18 Hoàng QuốcViệt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội Ph럘 HR-ES -MS đo tại phòng thí nghiệm Phântích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5,Tp.Hồ Chí Minh

2.2 guyên liệu

Đối tượng nghiên cứu trong khóa luận là toàn bộ cây Ruột gà bò

Cây được thu hái tại xã ong An, TP Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang vào tháng 12 năm2016

Mẫu cây được TS Đặng Văn Sơn – Viện Sinh học nhiệt đới, số 85 Trần Quốc Toản,

Quận 3, TP.HCM, định danh tên khoa học là Spermacoce exilis ( O.Williams)

C.D.Adams ex W.C.Burger & C.M.Taylor, họ Cà phê (Rubiaceae)

Cây tươi được rửa sạch và đem phơi khô trong mát Sau đó, được sấy khô ở 60oC,thu được 10.5 kg cây khô

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồixay thành bột mịn Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất

2.3 iều chế các loại cao

Cây Ruột gà bò được phơi khô và xay thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng khôngđ럘i (6,8g) Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâmdầm, lọc và cô quay dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (351.2 g)

Cao ethanol thô được chiết lỏng - lỏng lần lượt với dung môi n-hexane, ethyl acetate,

n-butanol thu được cao hexane (86.1 g), cao ethyl acetate (100.5 g), cao n-butanol (70.5 g)

và cao còn lại (94.1 g) Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao từ cây Ruột gà bò

2.4 hân lập một số hợp chất hữu cơ trong cao ethyl acetate

2.4.1 ắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Cao ethyl acetate (100.5 g) được sắc ký cột silica gel, giải ly với hệ dung môi

ây Ruột gà bò tươi (112,5 kg)

ột cây khô (10,5 kg)

- Ngâm dầm với ethanol

- ọc, cô quay, thu hồi dung môi

ã khô ao ethanol thô (351,2 g)

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi n-hexane

- ọc, cô quay, thu hồi dung môi

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate

- ọc, cô quay, thu hồi dung môi

ao còn lại (94.1 g)

ao n-butanol (70,5 g)

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi n-butanol

- ọc, cô quay, thu hồi dung môi

Dịch chiết còn lại

ao ethyl acetate (100,5 g)

ao n-hexane (86.1 g) Dịch chiết còn lại

Phơi khô, xay nhuyễn

lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng sắc ký lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc ký lớpmỏng giống nhau được gom chung thành một đoạn Kết quả thu được ba phân đoạn kýhiệuEA1–3 được ghi trong bảng 2.1.

ảng 2.1 Kết quả sắc kí cột trên cao ethyl acetate

TT hân

đoạn Dung môi giải ly

Khối lượng (g)

ắc kí lớp mỏng mhi chú

1 EA1 H – EA (50 : 50) 27.6 hiều vết Khảo sát

2 EA2 H – EA (20 : 80) 33.8 Nhiều vết Chưa khảo sát

3 EA3 EA 100%

EA – Me (90 : 10) 24.8 Nhiều vết Chưa khảo sát

Ghi chú: H: hexane, EA: ethyl acetate.

2.4.2 hân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn EA1

Phân đoạn EA1 (27.6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel, giải ly với hệ dung

môi n-hexane – ethyl acetate – methanol có độ phân cực tăng dần (50:50:0; 30:70:0;

10:90:0; 0:100:0; 0:90:10) Kết quả các sắc ký cột thu được năm phân đoạn ký hiệu

EA1.1 – 1.5.

2.4.3 hân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn EA1.1

Phân đoạn EA1.1 (7.5 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel, giải ly với hệ dung

môi n-hexane – ethyl acetate độ phân cực tăng dần Kết quả sắc ký cột thu được bốn phân

đoạn ký hiệuEA1.1.1 – 1.1.4.

Phân đoạnEA1.1.1 (1.5 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel nhiều lần, giải ly với

hệ dung môi chloroform (100), thu được hợp chất ký hiệu làKR1 (8.1 mg).

Phân đoạnEA1.1.2 (1.6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel nhiều lần, giải ly với

hệ dung môi chloroform – methanol (98 : 2), thu được hợp chất ký hiệu làKR2 (9.2 mg).

Phân đoạnEA1.1.3 (2.2 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel nhiều lần, giải ly với

hệ dung môi chloroform – methanol (95 : 5), thu được hợp chất ký hiệu làKR3 (7.2 mg).