Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine o và rhodamine b trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt Tiếng Anh AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức Association Official Analytical Chemists HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng ca

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh

MSSV: 40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths Huỳnh Thị Nhàn

Ths Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh

MSSV: 40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths Huỳnh Thị Nhàn

Ths Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô Huỳnh Thị Nhàn vì đã giao cho em đề tài nghiên cứu này Cảm ơn cô vì đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt thời gian nghiên cứu

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng, thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bữu Đăng, cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, cô Phạm Thị Thảo Uyên

và cô Văn Thị Cẩm Duyên đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận

Và em cũng không quên gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Hồng Vân, thầy Huỳnh Lời, thầy Lê Văn Huấn và Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được sử dụng trang thiết bị, máy móc cần thiết phục vụ đề tài này và cũng hết lòng hướng dẫn, giúp

đỡ em

Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn Đặc biệt, cảm ơn bạn Nguyễn Thanh Thơi đã đồng hành cùng em trong quá trình thực hiện đề tài

Một lần nữa em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy em trong bốn năm qua

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả mọi người Kính chúc thầy cô, tất cả bạn bè và gia đình thật nhiều sức khỏe

TP Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018 Sinh viên

Phan Thị Ngọc Trinh

XÁC NHẬN CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Chủ tịch Hội đồng

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Auramine O 3

1.1.1 Khái quát chung 3

1.1.2 Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 3

1.1.3 Độc tính 4

1.2 Rhodamine B 4

1.2.1 Khái quát chung 4

1.2.2 Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 4

1.2.3 Độc tính 5

1.3 Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước 5

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8

1.4.1 Định nghĩa 8

1.4.2 Nguyên tắc của các quá trình sắc ký 8

1.4.3 Phân loại sắc ký hấp phụ 9

1.4.4 Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký 10

1.4.5 Hệ thống HPLC 15

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 18

2.1 Hóa chất và dụng cụ 18

2.1.1 Hóa chất 18

2.1.2 Dụng cụ - thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Các bước tiến hành sắc ký 20

2.3.1 Chuẩn bị dung môi 20

2.3.2 Chuẩn bị mẫu đo 20

2.3.3 Cách vận hành thiết bị 21

2.4 Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký 22

2.4.1 Khoảng bước sóng của detector 22

2.4.2 Tối ưu hóa pha động 22

2.5 Thẩm định phương pháp 26

2.5.1 Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 26

2.5.2 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 27

2.5.3 Xác định độ lặp lại của phép đo 28

2.6 Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu 29

2.6.1 Lấy mẫu 29

2.6.2 Xử lý sơ bộ mẫu phân tích 30

2.7 Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị 30

2.7.1 Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE) 30

2.7.2 Khảo sát thể tích dung dịch chiết 32

2.7.3 Xác định hệ số thu hồi của quy trình 33

2.7.4 Tính chọn lọc của quy trình 33

2.8 Phân tích một số mẫu gia vị 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký 34

3.1.1 Chọn khoảng bước sóng cho detector 34

3.1.2 Tối ưu hóa pha động 34

3.2 Thẩm định phương pháp 46

3.2.1 Xây dựng đường chuẩn 46

3.2.3 Xác định LOD, LOQ 48

3.2.4 Xác định độ lặp lại của phương pháp 50

3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị 50

3.3.1 Khảo sát giai đoạn SPE 50

3.3.2 Khảo sát thể tích dung dịch chiết 53

3.3.3 Tính chọn lọc của quy trình 54

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Đề xuất 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định AO và RB 5

Bảng 2.1 Danh mục dung môi 18

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất 18

Bảng 2.3 Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu 19

Bảng 2.4 Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB 27

Bảng 2.5 Thông tin về các mẫu gia vị phân tích 29

Bảng 3.1 Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong MeOH và ACN 34

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB 37

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB 38

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB 39

Bảng 3.5 Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng 40

Bảng 3.6 Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu 41

Bảng 3.7 Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2) 42

Bảng 3.8 So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN 43

Bảng 3.9 Chương trình pha động tối ưu 45

Bảng 3.10 Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân tích HPLC 46

Bảng 3.11 Kết quả xác định LOD 48

Bảng 3.12 Kết quả xác định LOQ 49

Bảng 3.13 Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak 50

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE 51

Bảng 3.15 Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát 52

Bảng 3.16 Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE 52

Bảng 3.17 Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 1 53

Bảng 3.18 Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 2 54

Bảng 4.1 Thành phần pha động 56

Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn của AO và RB 56

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của AO 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của RB 4

Hình 1.3 Sơ đồ sự tương tác trong cột sắc ký 9

Hình 1.4 Thời gian lưu trong HPLC [6] 10

Hình 1.5 Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] 14

Hình 1.6 Các thiết bị trong hệ thống HPLC 15

Hình 2.1 Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) 23

Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) 24

Hình 2.3 Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 25

Hình 2.4 Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 25

Hình 2.5 Cách xác định S/N [4] 27

Hình 2.6 Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn 30

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị 32

Hình 3.1 Sắc đồ của chương trình 5 35

Hình 3.2 Sắc đồ của chương trình 6 35

Hình 3.3 Sắc đồ của chương trình 7 36

Hình 3.4 Sắc đồ của chương trình 8 36

Hình 3.5 Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0) 37

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH 38

Hình 3.7 Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) 38

Hình 3.8 Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03% 39

Hình 3.9 Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút 40

Hình 3.10 Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút 40

Hình 3.11 Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút 40

Hình 3.12 Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút 41

Hình 3.13 Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO 47

Hình 3.14 Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB 47

Hình 3.15 Sắc đồ xác định LOD của AO và RB 48

Hình 3.16 Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB 49

Hình 3.17 Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm 55

Hình 3.18 Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương

55

Hình 4.1 Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu 57

KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt (Tiếng Anh)

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association

Official Analytical Chemists)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) IARC Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency

for Research on Cancer)

LC50 Nồng độ hóa chất cho các thí nghiệm hít phải trong không khí

có thể tiêu diệt 50% các động vật thử nghiệm trong một thời gian nhất định (Lethal Concentration, 50%)

LD50 Lượng chất độc hoặc phóng xạ cần thiết để tiêu diệt 50% số

lượng sinh vật thử nghiệm sau một khoảng thời gian nhất định (Lethal Dose, 50%)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

PAD, DAD Detector mảng diot quang (Photo Array Diode Detector)

RP Pha đảo (Reversed Phase)

SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

và được xếp vào nhóm chất có khả năng gây ung thư Hiện nay, AO và RB chỉ còn sản xuất ở các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ,…)

Trong một vài năm trở lại đây, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam nổi cộm với vấn đề bột gia vị, thực phẩm nhiễm phẩm màu độc hại Cụ thể, AO từng bị phát hiện trong một số loại thực phẩm như thịt gà, măng chua, dưa cải chua; RB cũng bị phát hiện trong hạt dưa, ớt bột,… Mặc dù, AO và RB là hai chất cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị nhưng vẫn được thêm vào, điều này thật đáng lo ngại

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các phòng kiểm nghiệm

đã được trang bị các kỹ thuật hiện đại để phân tích và xác định hàm lượng của các phẩm màu công nghiệp đã sử dụng trái phép trong sản xuất, nhằm kiểm soát chất lượng thực phẩm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong số những phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay HPLC có nhiều ưu điểm như: phân tích nhanh chóng, xác định đồng thời được nhiều chất, ít tốn mẫu, thao tác đơn giản… Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, đã có những công trình nghiên cứu xác định RB trong thực phẩm, gia vị bằng phương pháp HPLC [1],[8]; xác định AO trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp HPLC [5] Qua đó, chúng tôi thấy rằng chưa có những nghiên cứu về quy trình xác định đồng thời AO và RB trong bột gia vị

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến” với mong muốn

đề xuất quy trình phân tích hiệu quả, phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm với hai mục tiêu:

- Xây dựng được quy trình xác định đồng thời AO và RB bằng phương pháp HPLC kết nối detector tử ngoại khả kiến

- Áp dụng quy trình này để xác định đồng thời AO và RB trong mẫu gia vị

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Auramine O

1.1.1 Khái quát chung

Auramine O (dạng muối hydrochloride) thuộc nhóm thuốc nhuộm diphenylmethane [22] AO được sử dụng làm chất nhuộm màu cho giấy và mực, ở mức

độ thấp hơn đối với hàng dệt và da AO đã được phát hiện trong các mẫu thực phẩm từ

Ấn Độ, bao gồm cả đậu Hà Lan tươi và các sản phẩm đậu ở Trung Quốc Việc sản xuất

AO bị cấm ở Châu Âu và Hoa Kỳ, hiện nay chủ yếu sản xuất ở Ấn Độ và Trung Quốc [19] Bên cạnh đó, AO không có trong danh sách phụ gia thực phẩm trong quy chuẩn Việt Nam

AO thường chứa dextrin hoặc các chất pha loãng khác được thêm vào để chuẩn hóa hàm lượng thuốc nhuộm AO được sử dụng như là nguyên liệu tạo màu vàng, kết hợp với các thuốc nhuộm khác, nó tạo ra hoặc tăng cường màu xanh hoặc đỏ Năng suất lượng tử của thuốc nhuộm huỳnh quang này phụ thuộc vào độ nhớt của dung môi; trong ethanol 95% hoặc saccarose 60% thì cao gấp 87 và 10 lần so với trong nước Ngoài ra

AO còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang, khi kết hợp với thuốc nhuộm RB làm cho các vi sinh vật kháng acid phát huỳnh quang [23]

1.1.2 Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của AO

- Công thức phân tử: C17H21N3 HCl Khối lượng mol phân tử: 303,834 g/mol

- Danh pháp: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid

- Tên gọi khác: Auramine O, Basic Yellow 2, Vàng ô

- AO dạng tinh khiết là chất bột màu vàng Tan trong nước và EtOH, tan rất ít trong xylene [22] (10 mg/mL trong nước; 20 mg/mL trong EtOH; 60 mg/mL trong ethylene glycol methyl ether [19]) AO nóng chảy ở trên 250 °C Bước sóng hấp thụ cực đại là

370 nm, 432 nm Bước sóng phát xạ cực đại là 550 nm pKa: 9,8 ; 10,7 [22]

NH.HCl

1.1.3 Độc tính

Một nghiên cứu ở Anh đã báo cáo ca lâm sàng ung thư bàng quang ở công nhân

làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất AO [19] Các nhà khoa học cũng đã tiến

hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của AO trên động vật Kết quả cho thấy, AO làm tổn thương ADN trên gan, thận, tuỷ xương của chuột nhắt và chuột cống với liều

LD50 là 135 mg/kg, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp AO vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người [19]

1.2 Rhodamine B

1.2.1 Khái quát chung

Rhodamine B thuộc nhóm thuốc nhuộm xanthene RB được sử dụng làm thuốc nhuộm cho giấy, len, lụa và mỹ phẩm [24] Ngoài ra RB còn được sử dụng trong sinh học như là chất nhuộm phát huỳnh quang, thường được kết hợp với AO trong phép

nhuộm Auramine - Rhodamine để phát hiện trực khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis

(MTB) [13]

1.2.2 Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của RB

- Công thức phân tử: C28H31ClN2O3 Khối lượng mol phân tử: 479,02 g/mol

- Danh pháp:

9-(2-carboxyphenyl)-6-(diethylamino)-N,N-diethyl-3H-xanthen-3-iminium

- Tên gọi khác: Rhodamine B; Brilliant Pink B; Basic Violet 10; Tetraethylrhodamine

- RB là tinh thể màu tối có ánh xanh, ở dạng bột màu nâu đỏ Tan tốt trong MeOH, EtOH, nước (khoảng 50 g/L) Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 199°C đến 201°C Bước sóng hấp thụ cực đại:  = 542 – 554 nm [3] pKa: 3,1; 3,25 [4]

1.2.3 Độc tính

RB gây độc tính cấp theo đường miệng, số liệu thống kê cho biết LD50 ở chuột là lớn hơn 2000 mg/kg Kích thích và gây tổn thương mắt nghiêm trọng khi thử nghiệm với thỏ Khi RB kết hợp với hemoglobin trong máu hình thành methemoglobin sẽ gây các triệu chứng như: đau đầu, loạn nhịp tim, giảm huyết áp, khó thở và co thắt Nếu tích

tụ trong thời gian dài còn gây hại cho thủy sinh vật Chẳng hạn, LC50 thử nghiệm với Gambusia affinis (cá muỗi) là 10 – 100 mg/L trong 96 giờ [2]

1.3 Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước

Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định AO và RB

CPT, nền

phương pháp Trong nước

H2O (20:80, v:v)

 Rửa giải bằng dung môi MeOH

HPLC – MS/MS

- Cột Agilent C18 (1,8 µm x 2,1

mm x 50 mm) và tiền cột tương ứng

- Pha động: gradient hai kênh, ACN (A) và HCOOH 0,1% (B)

- Khoảng tuyến tính: 0,5 – 50 ng/mL

- LOD: 8 µg/kg

- LOQ: 20 µg/kg

- Hệ số thu hồi: 82,4 – 109,2%

- LOD: 3,0 µg/kg (mẫu thịt); 5,0 µg/kg (mẫu thực phẩm khác)

RB trong bột

gia vị [1]

- Dung môi chiết:

hỗn hợp ACN : acetone (90:10, v:v)

Theo phương pháp phân tích trực tiếp:

- LOD: 1,00 ppb

- LOQ: 3,33 ppb Theo phương pháp đường chuẩn:

HPLC – UV/Vis

- Cột: Waters Novapark ODS (4

μm x 3,9 mm x 150 mm) với cột bảo vệ

- Pha động: gradient hai kênh, 10

mM ammonium acetate, pH = 3,6 (A) và ACN (B)

- Khoảng tuyến tính: 0,2 – 50 ppm

- Hệ số thu hồi: 84 – 92%

- Giai đoạn SPE:

50 ppm (RB)

 Rửa tạp: H2O

 Rửa giải: 3%

acetic acid - MeOH (1:1, v:v)

- Pha động: ACN – sodium acetate (20 mM, pH = 4,0; 80:20, v:v)

- LOD:

0,107 – 0,754 mg/L

- LOQ: 0,371 – 2,27 mg/L

- Hệ số thu hồi: 75 – 96,5%

 Rửa giải: MeOH

 Cô dịch chiết bằng khí nitơ

Phần còn lại tái tạo với ACN

- LOQ: 0,1 – 2,0 ppm

- Hệ số thu hồi: 71,2 – 116,9%

- Hệ số thu hồi: 73,1 – 103,3% (AO)

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời năm 1967 –

1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển

Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích cũng là phương pháp được ứng dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm [7]

1.4.1 Định nghĩa

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử CPT lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu CPT gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử CPT có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách và phân tích các chất với pha động là chất lỏng, làm việc với áp suất từ 150 – 250 bar Trong đó, pha tĩnh

có thể là chất lỏng (nó được giữ trong cột tách như một lớp màng nhờ một chất mang trơ) hoặc là chất rắn Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, pha động có thể chỉ là một dung môi nước hay dung môi hữu cơ; hỗn hợp của dung môi hữu cơ và nước… hoặc cũng có thể là dung môi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức, …[6]

Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký cột lỏng hiệu năng cao [6]

Trong kỹ thuật phân tích HPLC, tùy theo cơ chế của quá trình sắc ký trong cột tách

mà người ta chia thành: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây phân tử [6]

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.4.2 Nguyên tắc của các quá trình sắc ký

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố

hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là rây phân tử thì ta có sắc ký rây phân tử Để rửa giải CPT ra khỏi cột tách, cần một dung môi rửa giải, đó là pha động [6]

Với ba thành phần chính của hệ sắc ký: pha tĩnh, pha động, CPT; hiệu quả của sự tách sắc ký được quyết định bởi tổng của các mối tương tác: giữa CPT và pha tĩnh (F

1), giữa CPT và pha động (F

2), giữa pha tĩnh và pha động (F

3) [6].

Hình 1.3 Sơ đồ sự tương tác trong hệ sắc ký

Tổng của ba lực tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được xác định bởi ba lực F1, F2, F3 Trong đó F1và

F2giữ vai trò quyết định, còn F3là yếu tố ảnh hưởng Ở đây, F1là lực giữ CPT trên cột,

F2là lực kéo của pha động đối với CPT ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F

1 và F

2 là khác nhau Còn thành phần F3 trong một hệ sắc ký có thành phần pha động

và các điều kiện khác là không đổi thì F3 của các chất hầu như không khác nhau Vì vậy, trong một hệ sắc ký, nếu các CPT có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh thì có khả năng các CPT sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ có sự tách các CPT khỏi nhau khi đi qua cột [6]

1.4.3 Phân loại sắc ký hấp phụ

Trong sắc ký hấp phụ, quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các CPT và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo CPT ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Có hai kiểu hấp phụ:

- Sắc ký hấp phụ pha thường (Normal Phase): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực;

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reversed Phase): pha tĩnh ít hay không phân cực, pha động phân cực

Sắc ký hấp phụ được áp dụng rộng rãi, thành công để tách hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình Hiện nay, chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo là chủ yếu

1.4.4 Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký

1.4.4.1 Thời gian lưu t R , thời gian lưu thực t'R

Các CPT trong hỗn hợp mẫu, khi được nạp vào cột sắc ký sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi peak đạt giá trị cực đại Như vậy nếu gọi t

Ri là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:

t

Ri = t

o + t'Ri (1.1) Trong đó:

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế;

Hình 1.4 Thời gian lưu trong HPLC [6]

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc

ký Trong sắc ký, các chất ion thì yếu tố này thể hiện rõ nét

Giá trị thời gian lưu t'Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký Vì nó cho biết các CPT trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn Đồng thời, đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tính một chất

Trong một phép phân tích, nếu '

R

t nhỏ quá thì sự tách kém, ngược lại nếu '

R

t quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại thấp, thời gian phân tích dài Điều này kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém Để

thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên

Mặt khác, trong một hệ sắc ký còn có:

Ri i

L

t =

u (1.3) t

Ri = t

o ( 1 + k ) (1.4) 'iTrong đó ui và u

o là tốc độ tuyến tính của CPT i và của pha động (cm/s); k là hệ 'i

số dung lượng của CPT i; L là chiều dài của cột sắc ký [6]

1.4.4.2 Hệ số phân bố K i và hệ số dung lượng k'i

Quá trình tách sắc ký của các chất dựa trên cơ sở sự phân bố của CPT giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong hệ sắc ký Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của CPT i ở trong pha tĩnh và pha động:

i(SP) i

i(MP)

C

K =

C (1.5) Trong đó, Ci(SP) và C

i(MP) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động Hệ

số K

i cho biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh)

Hệ số phân bố Ki chưa nói lên được sức chứa của cột tách vì thế, người ta phải đưa thêm vào hệ số dung lượng k Hệ số dung lượng 'i k cho ta biết tỷ số khối lượng của 'iCPT i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu, ta có:

i(SP) '

i i(MP)

m

k =

m (1.6) Trong đó, mi(SP) và mi(MP) là khối lượng CPT i trong pha tĩnh và trong pha động Mối quan hệ giữa hệ số dung lượng k và hệ số phân bố K'i i thể hiện qua phương trình sau:

i(SP) '

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm

số đĩa lý thuyết N Đây là một đại lượng hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) đĩa lý thuyết là H Tất nhiên đây là lớp

có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:

- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh;

- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh;

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (CPT);

- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký;

- Độ nhớt của pha động

Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn, thì chiều cao đĩa lý thuyết H có những giá trị xác định ứng với các CPT khác nhau Chiều cao đĩa lý thuyết H và số đĩa lý thuyết N được xác định theo công thức:

Ri

WL

i

tL

i là chiều rộng đáy peak sắc ký của CPT i

Trong thực tế, số đĩa lý thuyết hiệu dụng N

ef và chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng H

ef của một cột sắc ký mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng khả năng của một cột tách

và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể

2 i ef

Ri o

WL

1.4.4.5 Độ phân giải R

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính theo công thức sau:

Nếu R càng lớn, hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký Song nếu đoạn đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết, vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn Do đó, giá trị R chỉ vừa đủ để hai chất tách khỏi nhau là được

Tuy nhiên theo kinh nghiệm, chúng ta ít khi sử dụng bốn đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa cùng một lúc là hai hoặc ba đường Khi đó, hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất để quá trình rửa giải được ổn định

(5)

(6)

1.4.5.2 Bộ phận khử khí

Mục đích sử dụng bộ khử khí là loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà pha động còn sót các bọt khí thì kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng, cụ thể như sau:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi đưa vào hệ không đúng với lý thuyết sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi;

- Trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm

sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

1.4.5.3 Bơm cao áp

Đây là bộ phận có nhiệm vụ bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký theo một chương trình phù hợp Bơm phải tạo được áp suất khoảng 150 – 250 bar và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 mL/phút Hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar Hiện tại bơm có hai pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

1.4.5.4 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với thể tích của vòng mẫu là 5 – 100 μL Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler)

1.4.5.5 Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Các kết quả thực nghiệm về HPLC đều chỉ ra rằng, các hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ và đồng đều luôn cho hiệu quả tách sắc ký cao và ổn định Chính vì thế mà hiện nay, hầu hết người ta chỉ dùng hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ hơn 10 µm, phổ biến là đường kính hạt từ 5 – 7 µm cho mục đích phân tích và từ 15 – 25 µm cho mục đích sản xuất (sắc ký điều chế) [6] Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt

1.4.5.6 Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của CPT

A = k.C (1.14) Trong đó: A là cường độ tín hiệu đo được

C là nồng độ CPT

k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Hiện nay, người ta chế tạo các loại detector khác nhau cho kỹ thuật HPLC, cụ thể

đã có các loại:

- Detector phổ hấp thụ phân tử (UV, UV/Vis hay PDA);

- Detector phổ huỳnh quang;

- Detector phổ phát xạ nguyên tử;

- Detector phổ hấp thụ nguyên tử;

- Detector khối phổ;

- Detector điện hóa đo dòng và cực phổ;

- Detector đo chiết suất;

- Detector đo độ dẫn điện;

- Detector đo hiệu ứng nhiệt [6]

1.4.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu

Bộ phận này được dùng để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao, … Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính

có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, độ phân giải, đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD%…

1.4.5.8 Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu, người phân tích có thể in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất và dụng cụ

2.1.1 Hóa chất

2.1.1.1 Chất chuẩn

- Auramine O: dạng rắn, độ tinh khiết 85%, Sigma-Aldrich USA

- Rhodamine B: dạng rắn, độ tinh khiết 95%, Sigma-Aldrich India

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn và hòa tan trong MeOH tinh khiết, được bảo quản trong tủ lạnh Các dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng MeOH từ dung dịch chuẩn gốc

2.1.1.2 Dung môi – hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục dung môi

STT Tên dung

Hàm lượng nguyên trạng (%)

1 Methanol Merk KGaA - Đức

Lapscan

Dùng cho HPLC

98-100%

3 Acid

phosphoric

Scharlau, Scharlab S.L – Spain

Dùng cho HPLC

Dùng cho phân tích

25-28%

2.1.2 Dụng cụ - thiết bị

2.1.2.1 Thiết bị

Bảng 2.3 Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu

1 Hệ HPLC / PDA 2996 Separations

ZORBAX Eclipse XDB-C18

Perkin Elmer

10 Bộ chiết pha rắn

12 – Port Vacuum Manifold

Agilent

2.1.2.2 Một số dụng cụ khác

- Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh các loại

- Micropipet: 10-100μL, 100-1000μL, 1000-5000μL

- Vial (1,5 mL, 10 mL); ống ly tâm (50 mL); phễu chiết (250 mL)

- Ống nhỏ giọt, bình tia, giấy parafin, giấy nhôm, màng bọc thực phẩm, đầu lọc 0,2 µm PTFE, rây tiêu chuẩn Ø = 200 mm đường kính lỗ 0,5 mm

2.2 Nội dung nghiên cứu

Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

- Tối ưu hoá các thông số trong chương trình sắc ký để phân tách chất chuẩn AO

2.3.1 Chuẩn bị dung môi

Các dung môi là loại tinh khiết dành cho HPLC Các hóa chất dùng cũng phải là

loại tinh khiết phân tích

- Kiểm tra các chai đựng dung môi và các chai đựng dung môi để rửa: kênh A

(MeOH), kênh B (H2O), kênh C (ACN), kênh D (dung dịch acid hay đệm, hoặc là hỗn hợp dung môi), chai rửa kim (MeOH) và chai rửa seal (MeOH 10 - 20%)

- Lọc tất cả dung môi sử dụng màng lọc cellulose acetate hoặc cellulose nitrate 0,45 μm (tốt nhất là 0,2 μm ) Nếu là hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước (hoặc dung dịch đệm) thì lọc qua màng lọc polyamide hay nilon Dung môi hữu cơ thì lọc qua màng lọc teflon, riêng ACN và MeOH nguyên chai không cần lọc

- Siêu âm tất cả các bình dung môi ở các kênh A, B, C, D để đuổi khí trong khoảng

10 - 15 phút cho mỗi bình, khi siêu âm phải mở nắp bình Sau đó, đặt các bình đúng vị trí quy định và để các đầu lọc luôn cắm ngập trong dung môi

2.3.2 Chuẩn bị mẫu đo

Mẫu chuẩn: pha dung dịch chuẩn có thành phần CPT giống như mẫu thử trong

cùng dung môi Nồng độ các thành phần CPT trong dung dịch chuẩn tương đương như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng

tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần

Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng quy trình đã khảo sát và tối ưu hóa Đảm bảo

các yêu cầu sau:

- Dung môi hòa tan CPT phải tương thích với pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu;

- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết …;

- Phải lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm;

- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột Nồng độ CPT cao quá có thể gây ra nghẽn cột

Đặc biệt cột sắc ký phải được rửa theo quy định sau mỗi lần chạy sắc ký

Ví dụ: - Sắc ký pha thường: rửa bằng MeOH; không rửa bằng nước

- Sắc ký pha đảo: khi chạy pha động thành phần chứa muối thì phải rửa nước trước cho sạch

7) Xử lý kết quả

8) Tắt hệ thống

9) Ghi nhật ký sử dụng máy

2.4 Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký

2.4.1 Khoảng bước sóng của detector

Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối

detector PDA, vì thế việc xác định khoảng bước sóng của detector là cần thiết Trước khi tiến hành định tính và định lượng AO và RB trên máy HPLC thì phải xác định được bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của AO và RB Dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch để xác định bước sóng ứng với cực đại hấp thụ

AO và RB là các hợp chất có màu, nên có thể tiến hành khảo sát phổ hấp thụ quang trong vùng khả kiến trên máy Lambda 25 UV/Vis Spectrometor ở phòng Phân tích Trung tâm 1 Dung dịch đo là chuẩn đơn AO, chuẩn đơn RB và chuẩn hỗn hợp (AO

và RB) với:

Nồng độ CPT 2,0 ppm đối với mỗi chất

Dung môi 100% MeOH; 100% ACN

Khoảng quét phổ 300 – 600 nm

2.4.2 Tối ưu hóa pha động

Pha động là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả tách trong kỹ thuật phân tích HPLC Để tìm được điều kiện tối ưu cho pha động, chúng tôi tiến hành thay đổi từng yếu tố và khảo sát theo thứ tự sau:

1 – Khảo sát dung môi pha động

2 – Khảo sát chương trình hóa dung môi

3 – Khảo sát pH của pha động

4 – Khảo sát tốc độ dòng

5 – Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu

2.4.2.1 Khảo sát dung môi pha động

Trong sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), pha động là hệ dung môi phân cực, đó

là những dung môi hữu cơ tan tốt trong nước và trong nhiều trường hợp nước cũng là một thành phần của pha động Hệ pha động được sử dụng nhiều như MeOH, ACN hay hỗn hợp MeOH với nước, ACN với nước hoặc có thêm chất đệm pH,…[3] Vì vậy việc lựa chọn dung môi phù hợp sẽ là một trong những yếu tố mang lại hiệu quả cho quá trình tách sắc ký Đối với mẫu đơn giản, pha động gồm hỗn hợp MeOH/nước có tỷ lệ thể tích thường chọn là 80/20 [4]

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành so sánh hiệu quả tách sắc ký giữa dung môi MeOH và ACN Và hệ pha động sử dụng là dung môi hữu cơ (MeOH hoặc ACN) kết hợp thêm nước để tạo hệ pha động phân cực hơn Chúng tôi tiến hành

so sánh hiệu quả tách của hệ MeOH/H2O và ACN/H2O trong hai trường hợp: thành phần pha động giữ cố định (đẳng dòng) và thành phần pha động thay đổi (gradient)

Tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm AO nồng độ 5,0 ppm và RB nồng độ 5,0 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau:

- Thời gian phân tích: 40 phút

 Chương trình 1: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v)

 Chương trình 2: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v)

 Chương trình 3: ACN: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v)

 Chương trình 4: ACN: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v)

* Chế độ rửa giải gradient:

Hình 2.1 Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH 3 COOH pH = 3,6)

020406080100

Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH 3 COOH pH = 3,6)

2.4.2.2 Khảo sát chế độ rửa giải

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột

và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích Sau khi lựa chọn được dung môi pha động ở mục 2.4.2.1, chúng tôi thực hiện các bước khảo sát như sau:

 Khảo sát chương trình đẳng dòng

Thực hiện phân tích sắc ký với một số chương trình đẳng dòng như sau:

- Chương trình 7: MeOH và HCOOH (pH = 3,0) (80:20, v:v)

- Chương trình 8: MeOH và đệm acetate (pH = 4,2) (80:20, v:v)

 Khảo sát chương trình gradient

Lựa chọn các đoạn gradient và đặt tỷ lệ thành phần dung môi ở đầu mỗi đoạn gradient, thời gian gradient

Chương trình sắc ký dùng để khảo sát cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ cột tách, bước sóng, tốc độ dòng, thể tích vòng mẫu, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm

2.4.2.3 Khảo sát pH của pha động

Dựa vào giá trị pKa của AO và RB, để hạn chế tồn tại đồng thời nhiều dạng phân

tử AO, RB và loại bỏ sự kéo đuôi của peak AO, RB trong quá trình tách sắc ký thì nên tiến hành khảo sát với điều kiện giá trị pH < 7 Theo khuyến cáo của hãng Agilent, cột tách C18 làm việc trong khoảng pH từ 2 đến 9 nên chúng tôi chọn các acid cho chương trình dung môi pha động như sau:

020406080100

chương trình gradient pha động như đồ thị dưới đây:

Hình 2.3 Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5

Đối với các giá trị pH 2,3 và 2,6 tiến hành với tốc độ dòng 0,7 mL/phút và chương trình gradient pha động như đồ thị dưới dây:

Hình 2.4 Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6

Thực hiện phân tích sắc ký với chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 2,0 ppm, tính toán các giá trị hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải để chọn loại acid thích hợp cho pha động

020406080100

2.4.2.4 Khảo sát tốc độ dòng

Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của CPT giữa pha tĩnh và pha động Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn Tuy nhiên, nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau Vì vậy, chúng ta cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích Chúng tôi cố định các yếu tố: pha tĩnh, thể tích vòng mẫu, nhiệt độ cột, nhiệt độ buồng mẫu và bước sóng khảo sát và tiến hành khảo sát hệ sắc ký với các tốc độ dòng khác nhau: 0,6; 0,7; 0,85; 1,0 mL/phút và các điều kiện đã được tối ưu ở các mục trên

2.4.2.5 Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu

Sau khi chọn được tốc độ dòng tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu với hai mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH để thiết lập điều kiện sắc

ký tối ưu cho quá trình phân tích HPLC

2.5 Thẩm định phương pháp

2.5.1 Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của CPT nằm trong khoảng tuyến tính

Đối với mỗi chất, trong một giới hạn nhất định của nồng độ, độ lớn diện tích peak sắc ký phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của chất trong mẫu phân tích Để định lượng chính xác một chất thì nồng độ của chất đó trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính này, do đó việc xác định khoảng tuyến tính của AO và RB là hết sức quan trọng Theo tài liệu tham khảo [14], khoảng tuyến tính của AO và RB là 0,05 – 100 ppm Khoảng tuyến tính của AO và RB là khoảng nồng độ tương đối rộng khi sử dụng phương pháp HPLC Tuy nhiên, hàm lượng AO và RB trong mẫu là hàm lượng vết, vì thế việc xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ nhỏ gần với nồng độ của AO và RB trong mẫu sẽ cho kết quả chính xác hơn, đồng thời tiết kiệm hóa chất, thời gian và công sức tiến hành

Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn của AO và RB với dãy các nồng độ dung dịch chuẩn sau: 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 ppm

Bảng 2.4 Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB

Nồng độ chuẩn hỗn

hợp lấy pha (ppm)

Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp lấy pha (µL)

Thể tích dung dịch cuối (mL)

Nồng độ chuẩn hỗn hợp cuối (ppm)

2.5.2 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân

tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường

nền

Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân

tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu

trắng hay tín hiệu nền

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 lần nhiễu đường

nền, thông thường lấy S/N = 3 LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn

gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10 [9]

Hình 2.5 Cách xác định S/N [4]