Sản xuất và bảo quản rượu vang nếp than quy mô xưởng thực nghiệm sử dụng enzyme và nấm men thuần chủng

Sản xuất và bảo quản rượu vang nếp than quy mô xưởng thực nghiệm sử dụng enzyme và nấm men thuần chủng

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2009

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Ts Lý Nguyễn Bình Phạm Thị Thu Vân

MSSV: 2051695

Lớp: CNTP K31

Luận văn ñính kèm sau ñây, với tựa ñề tài “Sản xuất và bảo quản rượu vang nếp than quy mô xưởng thực nghiệm sử sụng enzyme và nấm men thuần chủng”, do Phạm Thị

Thu Vân thực hiện và báo cáo ñã ñược hội ñồng chấm luận văn thông qua

Ts Lý Nguyễn Bình

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Chủ tịch hội ñồng

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm vừa qua, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn ñến toàn thể quý Thầy Cô của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm thuộc Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng - Trường ðại học Cần Thơ ñã tận tình giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể em hoàn thành ñược ñề tài luận văn của mình

Nhân ñây, ñặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến thầy Lý Nguyễn Bình, thầy ñã hướng dẫn và chỉ dạy tận tình giúp em hoàn thành ñề tài và tích lũy ñược những vốn kiến thức hữu ích về chuyên ngành trong suốt thời gian vừa qua

Em xin gửi lời cảm ơn ñến cán bộ phòng thí nghiệm và tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K31 ñã nhiệt tình giúp ñỡ, ñóng góp ý kiến và tạo ñiều kiện tốt cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Cuối lời em xin kính chúc quý Thầy Cô dồi dào sức khỏe Chúc các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K31 bảo vệ thành công luận văn tốt nghiệp của mình Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Thu Vân

TÓM LƯỢC SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN RƯỢU VANG NẾP THAN QUY MÔ XƯỞNG THỰC

NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG

Tối ưu hóa nồng ñộ enzyme glucoamylase và tỉ lệ nấm men sử dụng trong quá trình sản xuất, theo dõi sự thay ñổi của sản phẩm trong thời gian bảo quản ở quy mô xưởng thực nghiệm Nồng ñộ enzyme glucoamylase tối ưu thực hiện quá trình ñường hóa là 0,5% hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường ñạt ñược lần lượt là 19,165% và 20,5% Tỉ lệ nấm men thích hợp cho lên men là 0,1% và thời gian lên men chính 5 ngày Quá trình bảo quản sản phẩm ở ñiều kiện phòng thí nghiệm cho thấy ít có sự biến ñổi so với sản phẩm sau lên men

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH HÌNH vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 NGUYÊN LIỆU 2

2.1.1 Gạo nếp than 2

2.1.2 Enzyme amylase 4

2.1.2.1 Sơ lược về enzyme amylase 4

2.1.2.2 Tính chất của enzyme amylase 5

2.1.2.3 Hoạt ñộng của amylase 5

2.1.2.4 Cơ chất của amylase 6

2.1.2.5 Phân loại enzyme Amylase 6

2.1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 10

2.2 QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP THAN 12

2.2.1 Quy trình sản xuất chung 12

2.2.2 Thuyết minh quy trình 13

2.3 CÁC QUÁ TRÌNH XẢY RA CHỦ YẾU TRONG SẢN XUẤT RƯỢU 13

2.3.1 Quá trình dịch hóa 13

2.3.1.1 Cơ sở lý luận 13

2.3.1.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình dịch hóa 13

2.3.2 Quá trình ñường hóa 14

2.3.2.1 Cơ sở lý luận 14

2.3.2.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình ñường hóa 14

2.3.3 Quá trình lên men rượu 14

2.3.3.1 Khái quát về quá trình lên men rượu 14

2.3.3.2 Cơ chế của quá trình lên men 14

2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men 15

2.3.3.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men 16

2.4 SẮC TỐ ANTHOCYANIN TRONG RƯỢU VANG NẾP THAN 18

2.4.1 Cấu tạo của anthocyanin 18

2.4.2 Tính chất của anthocyannin 19

2.5 VI SINH VẬT TRONG RƯỢU 19

2.5.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic 20

2.5.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic 20

2.5.2.1 Sinh thái khuẩn lactic 20

2.5.2.2 Hoạt ñộng của vi khuẩn lactic 21

2.5.2.3 Kết quả hoạt ñộng của khuẩn lactic lên men malolactic và các bệnh rượu 21

CHƯƠNG III – PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23

3.1 PHƯƠNG TIỆN 23

3.1.1 Nguyên liệu 23

3.1.2 Hóa chất sử dụng 23

3.1.3 Trang thiết bị 23

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) ñến hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường trong quá trình ñường hóa 23

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men ñến thời gian lên men chính và chất lượng rượu sau quá trình lên men 24

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát một số thay ñổi trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm 26

CHƯƠNG IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) ñến hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường trong quá trình ñường hóa 28

4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men ñến thời gian lên men chính và chất lượng rượu sau quá trình lên men 29

4.3 Một số thay ñổi trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm 31

CHƯƠNG V – KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 ðề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần hóa học của gạo nếp than 3

Bảng 2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men 11

Bảng 3 Hàm lượng ñường khử và 0Bx của dịch ñường ứng với các nồng ñộ enzyme glucoamylase sử dụng 28

Bảng 4 Nồng ñộ rượu của sản phẩm theo tỉ lệ nấm men và ngày lên men 30

Bảng 5 ðộ trong của sản phẩm rượu theo tỉ lệ nấm men 30

Bảng 6 Hàm lượng acid và ester của sản phẩm rượu theo tỉ lệ nấm men 31

Bảng 7 Kết quả theo dõi sự biến ñổi về pH, ñộ Brix, ñộ cồn và ñường khử của sản phẩm trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm ở quy mô xưởng thực nghiệm 34

Bảng 8 Kết quả theo dõi hàm lượng tạp chất trong quá trình bảo quản sản phẩm ở quy mô xưởng thực nghiệm 35

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Gạo nếp than 2

Hình 2 Cấu tạo của hạt nếp 3

Hình 3 Công thức cấu tạo của amylose 3

Hình 4 Công thức cấu tạo của amylopectin 4

Hình 5 Cơ chế cắt liên kết α -1,4 và α -1,6-glycosid của amylase 6

Hình 6 Cơ chế tác ñộng của α -amylase lên tinh bột 8

Hình 7 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 10

Hình 8 Công thức cấu tạo của anthocyanidin 19

Hình 9 Mẫu phân tích hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường sau quá trình ñường hóa 28

Hình 10 Mẫu phân tích sản phẩm theo tỉ lệ nấm men 29

Hình 11 Máy nghiền búa 32

Hình 12 Nếp than 32

Hình 13 ðường hóa dịch ñường 32

Hình 14 Bã nếp 32

Hình 15 Dịch ñường lên men 32

Hình 16 Dụng cụ lên men rượu 32

Hình 17 Sản phẩm rượu nếp than 33

Hình 18 ðồ thị biểu diễn ñộ trong của sản phẩm trong quá trình bảo quản theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm 35

Hình 19 ðồ thị biểu diễn hàm lượng tạp chất sinh ra theo thời gian bảo quản ở quy mô xưởng thực nghiệm 36

Hình 20 Sản phẩm rượu vang nếp than 37

Hình 21 Quy trình sản xuất ñề nghị 38

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ

Như chúng ta ñã biết, rượu là một loại thức uống mang hương vị truyền thống của nền văn hóa ẩm thực Việt Nam Ngày xưa, rượu thường dùng trong những dịp lễ tết, cúng ñình, giổ chạp và cho ñến nay với sự phát triển không ngừng của xã hội, rượu ñã ñược sử dụng phổ biến hơn Trong các buổi tiệc, dù là tiệc vui hay buồn, tiệc lớn hay nhỏ cũng không thể thiếu ñược loại thức uống này

Chính vì tính phổ biến ñó của rượu, ngày nay các nhà chế biến ñã tiến hành nghiên cứu và chế biến ra hàng loạt các mặt hàng rượu với nhiều hương vị khác nhau như ngoài rượu ñế

và các loại rượu có ñộ cồn cao còn có mặt hàng rượu vang, là loại rượu ñược chế biến theo kiểu lên men và không qua chưng cất Loại rượu này ñược sản xuất chủ yếu từ trái cây và ngày nay nó còn ñược sản xuất ra từ các loại ngũ cốc như là gạo nếp Rượu vang hiện nay

có nhiều mặt hàng khác nhau như: rượu vang nếp than, rượu vang chuối xiêm, rượu vang nho, rượu vang khóm…Mỗi loại rượu vang thì ñều có hương vị, màu sắc, mùi thơm ñặc trưng của loại nguyên liệu sản xuất ra nó

Với ñề tài này, tôi tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang nếp than bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng nhằm rút ngắn ñược thời gian chế biến sản phẩm

mà vẫn cho ra loại sản phẩm rượu thơm ngon và thu hút ñược người tiêu dùng bởi chất lượng của nó, ñồng thời theo dõi một số thay ñổi trong quá trình bảo quản sản phẩm rượu ở quy mô xưởng thực nghiệm

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

ðề tài ñược thực hiện dựa trên Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ khóa 12-2008 của Nguyễn Thị

Giang Thanh - chuyên ngành Công nghệ Sinh học nhưng nghiên cứu ở quy mô xưởng thực nghiệm Do ở quy mô lớn nên sẽ có sự khảo sát lại một số chỉ tiêu trong quá trình sản xuất

và một số thay ñổi của sản phẩm trong quá trình bảo quản Mục tiêu nghiên cứu cụ thể của

ñề tài như sau:

- Tối ưu hóa nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) sử dụng cho quá trình ñường hóa dịch nếp than

- Tối ưu hóa tỉ lệ nấm men trong quá trình lên men rượu

- Theo dõi một số thay ñổi trong quá trình bảo quản sản phẩm như sự thay ñổi về ñộ rượu,

ñộ trong của sản phẩm, lượng tạp chất sinh ra trong quá trình sản xuất và bảo quản sản

phẩm

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Gạo nếp than

Hình 1 Gạo nếp than

Gạo nếp than là một loại gạo ñặc biệt ñược trồng nhiều ở Nam bộ Vì thế rượu nếp than

ñược sản xuất chủ yếu ở Nam bộ Gạo nếp than gồm 4 loại:

ñược chia thành 2 loại:

- Nếp than ñen huyền

- Nếp than hồng ñỏ

Các sắc tố của nếp than dễ tan trong nước, vì thế sản phẩm rượu mang màu sắc ñặc trưng của loại gạo nguyên liệu Màu của nếp than là màu của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô ñịnh hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay ñổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay ñổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường: pH thấp anthocyanin thường có màu ñỏ, trở thành không màu ở

pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa

Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng thành phần hoá học của các loại nếp than không khác nhiều Thành phần hóa học của nếp than cho ở Bảng 1

Bảng 1 Thành phần hóa học của gạo nếp than

(Nguyễn Thị Hiền và cộng sự, 2004)

Về cấu tạo của hạt nếp than: nếp than cũng là một trong những loại lúa ñược trồng ở nước

ta, lúa gạo thì có rất nhiều loại nhưng về mặt cấu tạo thì ña số các loại lúa gạo ñiều có cấu tạo giống nhau và cụ thể như sau

Hình 2 Cấu tạo của hạt nếp

Trong cấu tạo của hạt nếp thì nội nhũ là chiếm ưu thế gần như là toàn bộ hạt nếp, nội nhũ

có thành phần chủ yếu là tinh bột, tinh bột bên trong hạt nếp than có hai dạng là: amylose chiếm 0,3 % và amylopectin chiếm 99,7 % (Bùi ðức Hợi và cộng sự, 2007)

+ Amylose

Hình 3 Công thức cấu tạo của amylose

Amylose thường ở dạng kết tinh có lớp hydrate bao quanh xen kẻ với các amylose kết tinh không có lớp hydrate Phân tử amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh, mỗi

Amylose trong hạt tinh bột, trong dung dịch hoặc ở trạng thái thoái hóa có cấu tạo mạch thẳng ñơn giản, khi thêm tác nhân kết tủa vào mới có hình xoắn ốc

Amylose có trọng lượng phân tử khoảng 50000-160000 Do cấu trúc mạch thẳng amylose

có số gốc hydroxyl tự do nhiều nên dể hòa tan trong nước ấm, tuy nhiên ở dạng tinh thể không bền vững khi ñể yên tinh thể sẽ tách ra Amylose khi phản ứng với iod sẽ tạo phức màu xanh ñặc trưng ñây là ñặc ñiểm chủ yếu ñể nhận biết tinh bột khi sử dụng iod làm thuốc thử, amylose có khả năng tạo phức với một số hợp chất hữu cơ có cực và ñộ hòa tan khác nhau trong nước cũng như trong các hợp chất không cực kiểu hydrocacbua: parapin, butanol, izopropanol, acid béo (stearic, oleic), phenol,…

+ Amylopectin

Hình 4 Công thức cấu tạo của amylopectin

Amylopectin có cấu tạo vô ñịnh hình, có dạng phân nhánh Ngoài liên kết α-1,4-glucosid các phân tử glucose còn liên kết với nhau theo liên kết α-1,6-glucosid mỗi nhánh có không quá 24 gốc glucose Amylopectin có khối lượng khoảng 2 - 4.108 Do cấu trúc nhánh nên liên kết rất yếu với iod Phần liên kết ñược chủ yếu là nhánh ngoài hình thành nên những chất hấp phụ có màu tím ñỏ

Amylopectin chỉ tan ñược trong nước ở nhiệt ñộ cao tạo thành dung dịch có ñộ nhớt cao và rất bền vững Amylopectin không có khả năng tạo phức với butanol và các chất hữu cơ khác, không bị hấp thụ trên cellulose

2.1.2 Enzyme amylase

2.1.2.1 Sơ lược về enzyme amylase

Enzyme amylase là một loại enzyme có giá trị về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử còn

ñược gọi là diastase Enzyme này có cả ở thực vật và ñộng vật Amylase ñược tinh sạch từ

malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz Amylase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucosid nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Amylase của malt thủy phân lúa mạch thành disaccharide làm

cơ chất cho nấm men trong quá trình lên men

Amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những enzyme ñược ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác ñặc biệt là trong các ngành công nghệ thực phẩm ñể làm lỏng tinh bột

2.1.2.2 Tính chất của enzyme amylase

Tinh bột bị thủy phân trong suốt quá trình nẩy mầm của hạt ngũ cốc nhờ vào hoạt ñộng của các loại enzyme thủy phân mà quan trọng nhất trong số ñó là enzyme amylase Mặc dù α-amylase ñóng vai trò chủ yếu trong sự phân cắt tinh bột nhưng cần có sự phối hợp giữa α-amylase, β-amylase và một loại enzyme cắt nhánh ñể thuỷ phân hoàn toàn tinh bột

Amylase ñược chia ra làm 2 nhóm: endoamylase và exoamylase

Endoamylase: bao gồm α-amylase (EC 3.2.1.1) tham gia phân cắt mối liên kết glucosid Các enzyme thủy phân liên kết α-1,6-glucosid bao gồm isoamylase (EC 3.2.1.68) hay pullulanase (EC 3.2.1.41)

α-1,4-Exoamylase: gồm β-amylase (EC 3.2.1.2) tham gia phân cắt tinh bột ñã dịch hóa và dextrin thành maltose, glucoamylase (EC 3.2.1.3) còn gọi là amyloglucosidase tham gia phân hủy dextrin thành glucose (Nguyễn ðức Lượng, 2002)

Tốc ñộ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt ñộ, tốc ñộ polymer hoá của cơ chất Các amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt ñộ hoạt ñộng, pH tối ưu, các ñặc ñiểm thuỷ phân, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối của quá trình thuỷ phân

sẽ khác nhau

2.1.2.3 Hoạt ñộng của amylase

Enzyme amylase là nhóm enzyme tham gia thủy phân tinh bột Cơ chế chuyển hóa tinh bột bởi nhóm enzyme này ñược tóm tắt như sau:

Tinh bột

α-amylase Pullulanase Dextrin không nhánh

Dextrin + Oligosaccharide

Dextrin

β-amylase Amyloglucosidasese Glucose

maltose

Hình 5 Cơ chế cắt liên kết αααα-1,4 và αααα-1,6-glycosid của amylase

2.1.2.4 Cơ chất của amylase

Cơ chất enzyme amylase tác dụng ñó chính là tinh bột và glycogen

+Tinh bột:

Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật chủ yếu trong các loại củ (khoai lang, khoai tây ), các loại ngũ cốc, các loại hạt, và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau ñều có cấu tạo từ amylose và amylopectin Các loại tinh bột ña số có 20-30% amylose và 70-80% amylopectin Trong thực vật tinh bột ñược xem như là chất dự trữ năng lượng quan trọng

Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn hợp tinh bột bị ñun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hoá và ñược gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucosid bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức ñộ: dịch hoá và ñường hoá Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị ñường hoá thì sản phẩm là maltose

và glucose

+ Glycogen

Glycogen ñược cấu tạo từ các glucose liên kết nhau bởi liên kết α-1,4-glucosid Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucosid Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột Phân tử lượng ở trong khoảng 2-3 triệu Glycogen dễ tan trong nước Ở ñộng vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan

2.1.2.5 Phân loại enzyme Amylase

Amylsase có nhiều loại khác nhau, ở ñây ta chỉ nghiên cứu sâu vào 2 loại amylase

sử dụng chủ yếu trong thí nghiệm là α -amylase và glucoseamylase

+ α -amylase (EC 3.2.1.1)

Là enzyme có khả năng xúc tác phản ứng phân cắt liên kết α-1,4-glucosid ở dạng cơ chất

nên gọi là endoamylase hay enzyme nội bào Khi tác dụng lên tinh bột một cách ngẫu

nhiên không theo trật tự nào và giải phóng ra glucose dạng α nên ñược gọi là α-amylase

Enzyme α-amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ tinh bột mà còn phân huỷ cả hạt

tinh bột nguyên vẹn chưa xử lý nhưng với tốc ñộ rất chậm

Sự thuỷ phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai ñoạn Giai ñoạn ñầu chỉ một số

liên kết trong cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin, ñộ nhớt hồ tinh bột

giảm nhanh (gọi là giai ñoạn dịch hóa cả amylose và amylopectin ñều bị dịch hóa nhanh)

Sau ñó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục cho ra các tetra, trimaltose không cho màu với

iod Các chất này bị thủy phân rất chậm cho tới di và monosaccharide Dưới tác dụng của

α-amylase, amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose Sau ñó

các chất này bị phân cắt nên chuỗi bị ngắt dần và tạo thành maltotetraose, maltotriose,

maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thuỷ phân amylase là 13%

glucose và 87% maltose

Tác dụng của α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylase không

phân cắt ñược liên kết α-1,6-glucosid ở mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có

tác dụng lên sản phẩm lâu thì sản phẩm cuối ngoài ñường glucose, maltose còn có các

dextrin phân tử thấp và isomaltose

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ chuyển hóa thành maltose, maltosetriose,

maltosetetraose và một số dextrin phân tử thấp (không cho màu với iod) Tuy nhiên thường

α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp và maltose

Các giai ñoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột bởi α-amylase

Các giai ñoạn dextrin hoá

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

Giai ñoạn ñường hoá

Dextrin tetra-và trimaltose
di- và monosaccharide

Amylose oligosaccharide
polyglucose
maltosetetraose

maltosetriose
maltose

Khả năng dextrin hoá của α-amylase rất cao do ñó người ta còn gọi α-amylase là amylase

dextrin hoá hay amylase dịch hoá

α-amylase

α-amylase

α-amylase

Hình 6 Cơ chế tác ñộng của αααα-amylase lên tinh bột

Một số ñặc tính của enzyme α-amylase:

- Enzyme từ các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau

- Enzyme α-amylase có ít methionine và khoảng 7-10 gốc cystine

- Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylase có tinh acid và có tinh chất của globuline

- ðiểm ñẳng diện nằm trong vùng pH 4,2-5,7 Khối lượng phận tử của α-amylase khoảng 45-59 KDa

- Mỗi phân tử α-amylase ñều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn ñịnh cấu trúc bậc 3 của enzyme duy trì hoạt ñộng của enzyme Do ñó, Ca2+ còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi

bị tác ñộng bởi các tác nhân gây biến tính và tác ñộng của enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt ñộ hơn các amylase khác ðặc tính này có liên quan ñến hàm lượng Ca2+ trong phân tử Tất cả các amylase ñều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như

Cu2+, Ag+, Hg2+ Chỉ trong trường hợp ứng dụng α-amylase của mầm (malt) mới cần thêm ion Ca2+ ñể hoạt hóa enzyme Vì ở ñây ion Ca2+ liên kết với phân tử men không bền vững

- ðiều kiện hoạt ñộng của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau

ðộ bền với acid của α-amylase malt kém hơn so với của α-amylase nấm mốc ðộ bền của α-amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ và pH Tuy nhiên so với các loại amylase khác thì ñộ bền với nhiệt ñộ α-amylase cao hơn Ở 00

C và pH 3,6, α-amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính, α-amylase nấm mốc và malt hoạt ñộng tốt nhất ở nhiệt ñộ 58-600

C Do ñó, trong sản xuất rượu, người ta thường dùng malt ñể ñường hóa cơ chất ở nhiệt ñộ 60-650C

Amylose

Amylopectin

Trong ñề tài nghiên cứu này ta sử dụng enzyme α-amylase dưới dạng chế phẩm enzyme từ

vi sinh vật với tên gọi cụ thể là Termamyl 120L, loại chế phẩm này có những ñặc tính như sau:

Loại enzyme chịu nhiệt ñộ cao (95-1050C)

Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glucosid từ ñầu không khử của mạch polymer, tạo thành

ñường β-maltose Sự thủy phân sẽ không xảy ra hoàn toàn ñối với amylopectin Phản ứng

sẽ dừng ở ñiểm phân nhánh

+ Glucoamylase (EC 3.2.1.3, γ-amylase hay amyloglucosidase)

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucosid Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lược từng phân tử glucose ra khỏi ñầu không khử của mạch ñể tạo glucose Glucoamylase là ezyme ngoại bào Ngoài liên kết α-1,4 và α-1,6-glucosid, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3-glucosid

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các amylase khác Các polysaccharide có nhánh như amylopectin, glycogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân rất nhanh ða số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5-5,5 và nhiệt

ñộ 500C Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không

ñược bảo vệ bởi Ca2+

Với ñề tài nghiên cứu này ta sử dụng enzyme glucoamylase dưới dạng chế phẩm enzyme

từ vi sinh vật với tên gọi cụ thể là AMG 300L

Xúc tác thủy phân liên kết α-1,6-glucosid của pullulan và amylopectin tạo thành maltriose

và polysaccharide mạch thẳng Mặc dù isoamylase và pullunase có cùng kiểu cắt ñứt mạch amylopectin những tính chọn lọc của chúng là khác nhau, isoamylase chủ yếu cắt ñứt liên kết α-1,6-glucosid nối những mạch dài còn pullunase cắt ñứt nối những mạch ngắn hơn

2.1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hình 7 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men có cấu tạo ñơn bào, sinh sản bằng cách nảy

chồi, khi gặp ñiều kiện không thuận lợi thì sinh bào tử Về sinh dưỡng: nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con ñường hấp thu có chọn lọc trên bề mặt của tế bào, sau ñó khuếch tán vào bên trong

Tế bào nấm men có hình elip, kích thướt của tế bào nấm men khoảng 8-15µm ðây là loại nấm men có khả năng lên men nổi, tế bào nấm men lơ lửng trong dịch lên men và tập trung nhiều ở vùng bề mặt, quá trình lên men tạo nhiều bọt khí, nấm men sẽ bám trên bọt khí,

ñến một lúc nào ñó bọt khí bị vở ra và do sự chênh lệch về khối lượng riêng nên nấm men

sẽ chìm xuống dưới khi ñó nấm men tiếp xúc nhiều với cơ chất tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình lên men

Bảng 2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại ñường như: glucose, saccarose,

fructose, rafinose, galactose Chúng có khả năng lên men ở nhiệt ñộ cao (36-400C), chúng

có khả năng chịu ñược ñộ acid ðặc biệt chúng có khả năng chịu ñược thuốc sát trùng

Na2SiF6 với nồng ñộ 0,02%-0,025% ðặc ñiểm này rất thuận lợi khi lên men có sử dụng thuốc sát trùng ðặc ñiểm quan trọng hơn hết của loại nấm men này là khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn với lượng ñường trong dung dịch từ 12-18% có khi cao tới hơn 22%, nhiệt ñộ lên men thích hợp là 28-320C và thời gian lên men ngắn

2.2 QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP THAN

2.2.1 Quy trình sản xuất chung

Pha nước (tỉ lệ 1 nếp: 4 nước) Gạo nếp than nghiền mịn

Dịch hóa (sử dụng enzyme α-amylase)

ðường hóa (sử dụng enzyme glucoamylase)

Sản phẩm

2.2.2 Thuyết minh quy trình

- Nếp than nghiền mịn cho tinh bột dễ dàng tiếp xúc với enzyme, bổ sung nước vào theo tỉ

lệ 1 nếp: 4 nước ñể hòa tan tinh bột

- Dịch hóa bằng enzyme α-amylase trong 30 phút làm cho dịch cháo loãng ra do tinh bột bị

α-amylase phân cắt thành những dextrin mạch ngắn với tốc ñộ rất nhanh

- Sau ñó tiến hành ñường hóa dịch nếp bằng enzyme glucoamylase trong 30 phút khi ñó tinh bột trở thành những phân tử glucose và glucose chính là cơ chất nấm men có thể sử dụng ñể lên men thành rượu

- Sau khi ñường hóa xong lọc bỏ bả nếp, thu dịch trong do bả nếp có nhiều chất xơ sẽ ngăn cản quá trình lên men của nấm men Tiếp theo ta ñiều chỉnh ñộ Brix, pH của dung dịch thích hợp cho lên men (ñộ Bx=22o, pH 4,5-5,0) bằng ñường saccharose và acid citric ñể chuẩn bị cho lên men

- Thanh trùng dịch ñường ở 80-850C trong 30 phút ñể hạn chế những vi sinh vật gây lên men tạp trong dịch lên men, và sau ñó ñể nhiệt ñộ dịch ñường giảm xuống còn 30-330C ta tiến hành bổ sung nấm men vào thực hiện quá trình lên men rượu

- Sau khi kết thúc quá trình lên men chính tiến hành chiết rượu và lên men phụ, thời gian lên men phụ này làm cho sản phẩm ñược ổn ñịnh về ñộ rượu, ñộ trong, mùi vị ñồng thời khi có sự bổ sung acid sorbic vào ñể giữ màu của sản phẩm và làm cho sản phẩm ổn ñịnh

và ít bị biến ñổi trong thời gian bảo quản do loại acid này có tính xác trùng mạnh ñối với nấm men và nấm mốc

2.3 CÁC QUÁ TRÌNH XẢY RA CHỦ YẾU TRONG SẢN XUẤT RƯỢU

2.3.1 Quá trình dịch hóa

2.3.1.1 Cơ sở lý luận

Tinh bột của các loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn,…có lớp màng bền vững bảo vệ nó khỏi bị men amylase tác dụng Mặt khác, ở trạng thái bình thường tinh bột không ở trạng thái hòa tan nên sự tác dụng của men amylase lên nó rất yếu Muốn tăng cường quá trình

ñường hóa cần phải phá vở cấu trúc tế bào chuyển tinh bột về trạng thái hòa tan và ñến lúc

ñó enzyme α-amylase ñã ñược bổ sung vào sẽ hoạt ñộng phân cắt những hạt tinh bột thành

dextrin mạch ngắn và một lượng nhỏ ñường glucose tạo thuận lợi cho quá trình ñường hóa

2.3.1.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình dịch hóa

Qua nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng, khi ñun tinh bột với nước lên tới 400C, hạt tinh bột bắt ñầu trương nở Nếu tiếp tục tăng nhiệt ñộ, thể tích của hạt tinh bột tiếp tục tăng, mối liên kết giữa các phần tử của hạt tinh bột yếu dần và tới một lúc nào ñó thì các phần tử tinh bột ñược tan ra trong dung dịch Hiện tượng tan ra của tinh bột này gọi là hiện tượng

hồ hóa Khi tinh bột bị hồ hóa thì enzyme α-amylase hoạt ñộng và phân cắt tinh bột thành những mạch ngắn làm dịch cháo loãng ra

2.3.2 Quá trình ñường hóa

2.3.2.1 Cơ sở lý luận

Trong quá trình sản xuất rượu, tế bào nấm men không có khả năng chuyển hóa tinh bột, hồ tinh bột thành rượu Chúng chỉ có khả năng sử dụng ñường, chuyển ñường thành rượu Vì vậy sau khi dịch hóa, dịch tinh bột cần ñược chuyển thành ñường trước khi lên men Về lý thuyết, sự chuyển tinh bột thành ñường có thể xảy ra nhờ sự xúc tác của các chất hóa học (acid, bazơ) hoặc men amylase Trong sản xuất rượu, người ta chỉ sử dụng enzyme amylase ñể ñường hóa

2.3.2.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình ñường hóa

Sau khi dịch hóa tinh bột chủ yếu bị biến ñổi thành những dextrin mạch ngắn và một phần glucose khi ở vào thời ñiểm thích hợp cho glucoamylase hoạt ñộng thì các enzyme này sẽ tiến hành phân cắt dextrin và tạo ra sản phẩm chủ yếu là ñường glucose ñể chuẩn bị cho quá trình lên men

2.3.3 Quá trình lên men rượu

2.3.3.1 Khái quát về quá trình lên men rượu

Lên men rượu là một quá trình trao ñổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (ñược sinh ra từ sự trao ñổi chất ñể duy trì sự sống của nấm men) Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí

- Lên men yếm khí: là sự phân hủy ñường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, len men rượu, butylic…

- Lên men hiếu khí: là sự phân hủy ñường có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men acid acetic, citric…

Lên men rượu, bia ñều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men Nấm men chuyển hóa ñường thành rượu etylic và CO2 Nguời ta còn gọi lên men là quá trình cồn hóa, rượu hóa Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai ñoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)

- Thời kỳ lên men chuyển ñường thành rượu và CO2: giai ñoạn này, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình ñể thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao ñổi chất ñể duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2

2.3.3.2 Cơ chế của quá trình lên men

ðể lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất ñịnh Tùy theo

phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải ñạt ñược >100 triệu tế bào trong 1 ml dung dịch lên men Do

mạnh ðuờng lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên

ñược hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau ñó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế

bào nấm men, rượu và CO2 sẽ ñược tạo thành

Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường, CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn Ở áp suất 800mmHg, nhiệt ñộ

25 – 300C là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng ñạt ñược trạng thái bão hòa Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, ñến lúc nào ñó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt Khi ñến bề mặt, do có sự thay ñổi ñột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài Lúc này do khối lượng riêng của nấm men ñủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên

tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái ñộng, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường ñiều này làm cho quá trình trao ñổi chất diễn ra nhanh hơn, khi ñó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang ñiện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men ñiều ảnh hưởng ñến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng

ñến quá trình lên men

2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men: Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng

ñến quá trình lên men rượu như sau:

+ Nồng ñộ ñường

Nấm men chỉ có khả năng lên men ñường thành rượu trong khoảng nồng ñộ thích hợp từ

10 – 22%, nồng ñộ ñường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng ñộ ñường 30 – 35%, nồng ñộ ñường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men + Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

ðể thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộng sống của nấm men, cụ thể nấm men

Saccharomyces cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu Nấm men chủng XII

phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 30 – 330C nhiệt ñộ tối ña là 380C, tối thiểu là 50C Nấm men

ñược nuôi cấy ở nhiệt ñộ thấp hơn nhiệt ñộ tối ưu ở 17–220C có năng lực lên men rất lớn

ðối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu ñược giới hạn nhiệt ñộ khá rộng từ 1-450C Nếu nhịêt ñộ quá 500C nấm men sẽ chết

+ Ảnh hưởng của acid (pH)

Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2-8 nhưng thích hợp nhất là 4,5 Vi khuẩn bắt ñầu phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển Vì vậy, trong lên men rượu ñể ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện

4-thuần hoá) với ñộ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng ñiều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng Khi pH 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển ðể tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người

ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh ñến trung tâm hoạt ñộng của nấm men

+ Ảnh hưởng của nồng ñộ rượu

Nồng ñộ rượu sinh ra có ảnh hưởng ñến tốc ñộ và khả năng phát triển của nấm men Nồng

ñộ rượu ảnh hưởng ñến tốc ñộ phát triển riêng của nấm men còn phù thuộc vào thời gian,

số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, ñiều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng ñộ rượu ban ñầu 1% chưa có ảnh hưởng ñến tốc ñộ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4–6% ñã có ảnh hưởng xấu

+ Ảnh hưởng của oxy

Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc Trong ñiều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men ñường tạo thành rượu và CO2, còn trong ñiều kiện ñầy ñủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa ñường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2 Oxy là thành phần không thể thiếu ñược ở giai ñoạn phát triển sinh khối Tuy nhiên, nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai ñoạn chế biến còn lại Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối

Trong giai ñoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm rất dễ

bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển

2.3.3.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men

+ Sự tạo thành acid

Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyrovic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid latic Acid acetic có thể ñược tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic trong

ñó 1 phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai sẽ bị khử:

CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH

Acid lactic ñược tạo bởi pyrovat dehydronase theo phản ứng:

CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD

Hoặc

Acid citric theo Laphon ựược tạo từ aldehyde acetic Phản ứng ựược biểu diễn tổng quát như sau:

9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH

Acid succinic ựược tạo thành có thể theo hai con ựường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic:

2CH3-COOH + CH3CHO = COOHCH2CH2COOH + C2H5OH

Hoặc ựược tạo thành do deamin acid glutamic Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic ựược biểu diễn như sau:

C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O

= COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2 Glycerin và aldehyde ựều là sản phẩm trung gian của lên men rượu Trong ựiều kiện lên men nhằm mục ựắch chỉ thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 Ờ 5,2 Với ựiều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 Ờ 0,45% dịch giấm chắn, tương ứng tiêu tốn ựường 2 Ờ 3% so với lượng ựưa vào Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng ựường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và ựường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu ựạt 11,9%

Lên men ựường xảy ra theo phương trình:

2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH

+ Sự tạo thành rượu bậc cao

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng ựược tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai Các alcol này tuy ắt nhưng nếu lẫn vào rượu etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu ựến chất lượng sản phẩm đó là các alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylicẦ Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 Ờ 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu Các alcol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men

sử dụng nitơ của các acid amin Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao ựược ựơn giản theo phản ứng:

R-CH(NH2)-COOH + H2O = RCH2OH + NH3 + CO2

Như vậy việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến ựổi của acid amin xảy ra trong ựiều kiện yếm khắ chỉ có thể ựồng thời với lên men rượu, sự tạo thành alcol cao phân

tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau ựó mất CO2 và cuối cùng aldehyde bị khử

ựể tạo ra alcol Bằng con ựường tương tự, nhiều acid amin cũng ựược tạo thành như valin

và isoleucinẦchúng là tiền ựề ựể tạo ra các alcol bậc cao sau này Thực ra quá trình amin hoá acid pyrovic xãy ra rất phức tạp, qua nhiều giai ựoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau Acid acetic tạo thành có hoạt tắnh cao lại tác ựộng cho các quá trình khác tiếp theo

+ Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác

Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid

và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau ñể tạo ra những ester tương ứng Phương trình tổng quát:

ñể tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin ðường pentose bị mất ba

phân tử nước tạo thành fufurol

Sự tạo thành aldehyde

Là sản phẩm của quá trình trao ñổi chất ở nấm men và cũng có thể ñược tạo thành qua con

ñường oxy hóa các loại rượu chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde

Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố Chúng thay ñổi theo nhiệt ñộ, pH, mức ñộ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu

2.4 SẮC TỐ ANTHOCYANIN TRONG RƯỢU VANG NẾP THAN

2.4.1 Cấu tạo của anthocyanin

Anthocyanin là sắc tố tan trong nước, rất phổ biến trong thực vật, có màu ñỏ, xanh da trời, màu do sự phối hợp giữa ñỏ và xanh (thành màu tím), có trong trái cây, hoa, và những mô thực vật ðây là chất màu có rộng rãi trong thực vật ở khắp nơi trên thế giới Anthocyanin

là glycosid của các anthocyanidin với monosaccharide, di và trisaccharide Anthocyanidin

ít tan trong nước hơn anthocyanin và không thấy tự do trong tự nhiên Anthocyanin là các dẫn xuất polyhydroxy và methoxy của flavylium Trong thực phẩm có 6 anthocyanidin phổ biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), nó khác nhau

do ñộ hydroxyl và methoxyl hóa vòng B

Hình 8 Công thức cấu tạo của anthocyanidin

2.4.2 Tính chất của anthocyannin

Màu của anthocyanin ñược xác ñịnh bởi cấu trúc hóa học và môi trường bên ngoài Có thể hai anthocyanin khác nhau cho màu giống nhau hay hai anthocyanin giống nhau lại cho màu khác nhau

Khi tăng số nhóm hydroxyl vào phân tử sẽ làm cho nó chuyển từ màu ñỏ sang màu xanh (blue) Khi thay nhóm hydroxyl bằng nhóm methoxyl sẽ làm ngược lại khuynh hướng ñổi màu pH thấp anthocyanin thường có màu ñỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa Sự biến ñổi dạng anthocyanin theo pH:

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến anthocyanin

+ Nhiệt ñộ: khi tăng nhiệt ñộ sẽ dẫn ñến sự thay ñổi ñộ hấp thu cực ñại, màu của anthocyanin cũng giảm khi gia tăng nhiệt ñộ

+ pH: pH quá cao hoặc quá thấp sẽ dẫn ñến sự thoái hóa màu anthocyanin, hiệu quả của chất màu này ñạt cực ñại ở pH 3,5

+ Thời gian bảo quản và ánh sáng: tăng thời gian bảo quản thì chất màu anthocyanin giảm

và khi bảo quản ở các ñiều kiện môi trường khác nhau cũng ảnh hưởng ñến sắc tố anthocyanin Thời gian bảo quản và chiếu sáng trực tiếp ảnh hưởng lên sự ổn ñịnh của anthocyanin Các nhà nghiên cứu ñã cho rằng giữ mẫu ngoài ánh sáng thì nồng ñộ của chất màu giảm mạnh hơn trong tối

+ Các yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng ñến màu anthocyanin như nồng ñộ của các chất màu kết hợp với anthocyanin, tỉ lệ tương ñối trong hỗn hợp các anthocyanin, ảnh hưởng của các sắc tố khác như carotenoid, chlorophyll

2.5 VI SINH VẬT TRONG RƯỢU

Vi khuẩn có thể phát triển trong rượu là vi khuẩn acid acetic và acid lactic và 2 loại này ñòi hỏi cần phải có oxy Vi khuẩn acetic cần có oxi ñể phát triển và chuyển thành giấm trong khi vi khuẩn acid lactic phát triển tốt trong ñiều kiện hàm lượng oxy thấp Trong nước quả, ngoài nấm men còn có nhiều loại vi khuẩn, vi khuẩn khó nghiên cứu hơn men vì kích thước nhỏ hơn men nhiều Chỉ gần ñây nhờ có kính hiển vi ñiện tử mới biết rõ thêm về cấu

khuẩn thì tác ñộng ñến nhiều thành phần của nước quả hay của rượu, chuyển thành các chất có hại như vi khuẩn xêrin làm cho rượu có vị chua, vị ñắng, có mùi hôi …

2.5.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic

Rượu vang ñể tiếp xúc rộng rãi với không khí chỉ sau vài tuần bị một màng trắng bao phủ

ñó là màng giấm Khuẩn giấm biến cồn êtylic thành acid acetic, do ñó rượu vang có mùi

giấm Một phần nhỏ acid acetic lại hợp với cồn êtylic thành một este, ethyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi etyl acetate

ñể ñánh giá rượu co bị chua giấm hay không

Khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc các nhân tố sau ñây:

- Số lượng khuẩn ban ñầu, do ñó phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh ñể giảm lượng này và rất khó loại hoàn toàn

- Nhiệt ñộ ảnh hưởng lớn, thí dụ lượng acid acetic hình thành ở 280C cao gấp ñôi ở 230C

- ðộ pH cũng ảnh hưởng lớn, rượu càng chua khuẩn giấm càng khó sinh sản, thí dụ dưới

pH 3,2 rất ít khi thấy xuất hiện khuẩn giấm

Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt ñộng của men giấm nên mặc dù có khuẩn nhưng không nhất thiết rượu vang nào cũng bị bệnh chua giấm

2.5.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic

2.5.2.1 Sinh thái khuẩn lactic

Loại vi khuẩn này có thể hiện diện ở bất cứ nơi ñâu như trên nguyên liệu, trong xưởng rượu trên các dụng cụ chế rượu cũng có Không phải tất cả các vi khuẩn này ñều có thể tồn tại: một số không thể sinh sản ñược vì pH quá thấp, có ñộ cồn tăng lên dần thì vi khuẩn bị

sau này gây lên men malôlactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng ñược dần dần với ñiều kiện môi trường có cồn chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh Cần chú ý là trong quá trình lên men, ñiều kiện không thuận cho vi khuẩn lactic tăng dần, nhất là khi người ta cho thêm các nấm men với số lượng lớn Tế bào nấm men ñông hơn, thích hợp với cồn, với pH thấp hơn nên chiếm hết thức ăn của vi khuẩn, và khi cho thêm

SO2 vào lại thuận cho nấm men hơn là cho vi khuẩn vì nấm men chịu ñựng giỏi hơn Như vậy, lên men malôlactic bắt ñầu không muộn hơn lên men rượu, nhưng bị kìm hãm dần lại

và chỉ diễn ra thực sự vài ngày hoặc vài tuần sau khi lên men rượu xong và là kết quả của

sự thích nghi dần của một số tế bào vi khuẩn giỏi chịu ñựng

2.5.2.2 Hoạt ñộng của vi khuẩn lactic

Trong tự nhiên, lên men lactic diễn ra như nói trên: ngay những giờ ñầu sự lên men lactic bắt ñầu nhưng sau ñó ngừng lại vì vi khuẩn lactic bị cồn etylic hình thành ức chế Sau khi lên men rượu xong chỉ còn một số ít vi khuẩn, 2/3 số rượu thăm dò có khoảng trên 10000

vi khuẩn/cc trong khi phải có khoảng 1.000.000 thì acid malic mới bị phân hủy ñáng kể Sau một thời gian tiềm sinh từ vài ngày ñến vài tuần lễ, số lượng vi khuẩn lactic tăng dần, quá trình lên men malôlactic mới bắt ñầu Sau khi acid malic bị phân hủy hết thì số lượng

vi khuẩn lactic lại giảm

Các yếu tố ảnh hưởng ñến vi khuẩn lactic

- ðộ pH có ảnh hưởng lớn, pH thích hợp cho vi khuẩn lactic là 4,2-4,5, nhưng ở ñộ pH

này, vi khuẩn lactic thường là vi khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy

không phải acid malic mà là ñường, acid tatric làm hỏng rượu Nếu pH thấp 3,5-3,2 thì vi

khuẩn hoạt ñộng rất khó khăn và chỉ còn sống sót một số khuẩn cầu (Leuconostoc)

- Nhiệt ñộ tác ñộng ñến vi khuẩn cũng giống như ñối với nấm men, thích hợp nhất là vào khoảng 25-300C Tuy nhiên, nhiệt lên tới 300C khi lượng cồn etylic ñã cao thì vi khuẩn lactic có thể bị diệt Vì vậy, khi lên men malolactic giữ rượu ở 20-250C thích hợp

- Yêu cầu ñối với oxy: người ta thường cho vi khuẩn lactic yếm khí, trái với vi khuẩn giấm háo khí Thực ra vi khuẩn lactic có thể chịu ñược yếm khí nhưng nếu có oxy hòa tan trong nước thì hoạt ñộng có phần tốt hơn khi hoàn toàn yếm khí

- Yêu cầu ñối với acid amin: mỗi loài vi khuẩn có những yêu cầu nhất ñịnh ñối với từng loại acid amin; yêu cầu của vi khuẩn cầu cao hơn vi khuẩn que về mặt này

- Yêu cầu ñối với cac vitamin: cũng như nấm men, vi khuẩn cần có những vitamin nhất

ñịnh ở trong môi trường và về mặt này yêu cầu của vi khuẩn que lại cao hơn vi khuẩn cầu

Acid pantothenic và nicotinic nói chung cần thiết cho ña số vi khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic và ñôi khi thiamin (B1) hoặc cần thiết hoặc có tinh chất kích thích tùy theo loại vi khuẩn

2.5.2.3 Kết quả hoạt ñộng của khuẩn lactic lên men malolactic và các bệnh rượu

- Lên men malolactic: vi khuẩn lactic gây nên những sự thay ñổi trong rượu ña số là có hại,

thức có 2 nhóm COOH có hai chức acid: acid lactic có một nhóm COOH, một chức acid; nên khi biến acid malic thành acid lactic giảm ựộ chua ựược một nửa, rượu dịu ựi, ngoài ra acid malic có vị chua gắt, khó chịu, còn acid lactic có vị mềm hơn

Lên men malolactic không cung cấp năng lượng cho vi khuẩn lactic cho nên vi khuẩn lại phải phân hủy các thành phần khác của rượu ựể lấy năng lượng Vì vậy, không có vi khuẩn lactic nào hoàn toàn có ắch cả Thực ra người ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn lactic: một nhóm bao giờ cũng nguy hiểm vì phân hủy các thành phần khác của rượu nhiều hơn là phân hủy acid malic, một nhóm thứ hai thường chỉ quen phân hủy acid malic và là khuẩn

có ắch và chỉ có hại trong những ựiều kiện ựặc biệt

Trong quá trình chế biến rượu, khi theo dõi lên men rượu, ựồng thời cũng phải theo dõi lên men malolactic Phải phân tắch ựịnh kỳ ựều ựặn ựộ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic Khi nào hết acid malic thì gạn cặn, lọc ựể loại bớt vi khuẩn -nếu cần tiệt trùng

- Bệnh rượu vang: Chỉ có lên men malolactic là tăng chất lượng của vang, những biến ựổi khác do vi khuẩn lactic gây ra ựều có hại vì phá hủy các thành phần cơ bản của vang, làm cho vang bị bệnh

Bệnh vang dắnh (vins filants): khi rót rượu ra cốc vang không chảy ựều, lỏng như nước mà

dắnh như có hồ nếp đó là do vi khuẩn lactic nhất là loại Leuconostoc, trong những ựiều

kiện nhất ựịnh, tiết ra quanh mình một loại ựường riêng gọi là dextran Bệnh nay thường kéo theo bệnh chua tatric và bệnh vang ựắng

Bệnh chua lactic (piqure lactique): xảy ra khi trong rượu vang còn lại ựường khử, chưa

chuyển hết thành rượu đường khử bị vi khuẩn lactic phá hủy chuyển thành ựường manic

và acid bay hơi, gây một mùi chua khó chịu Là một bệnh phổ biến của rượu vang, xảy ra khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều ựường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho men ngừng hoạt ựộng nửa chừng hoặc do cấy men chưa ựủ, lượng nhiệt quá cao

Bệnh chua tatric (tourne): xảy ra khi vi khuẩn lactic phá hủy acid tatric làm cho rượu ựục,

tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt Chỉ khi pH cao hơn 3,5-3,6 mới có bệnh này vì vậy rượu cũ, rượu ngon hay bị bệnh

Bệnh ựắng: Xảy ra khi men lactic phá hủy glycerin Rượu trở thành chua, có vị ựắng do

các chất acrolêin hình thành