Trichoderma reesei- tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose

Trichoderma reesei- tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose

HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề liên quan và cung cấp một số tài liệu có ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án.

Tất cả các thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đồ án

Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc

Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành!

Mục Lục

Mục Lục ii

Danh Mục Hình v

Lời Mở Đầu vii

I Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei 1

1 Lịch sử phát hiện 1

2 Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei 2

2.1 Vị trí phân loại 2

2.2 Đặc điểm hình thái 3

3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 5

3.1 Đặc điểm sinh thái 5

3.2 Môi trường sống 5

3.3 Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh 6

3.4 Môi trường nhân sinh khối 6

4 Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma 6

5 Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 7

5.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng 7

5.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 9

5.3 Trong lĩnh vực khác 9

II Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei: 11

1 Cellulose: 11

1.1 Cấu trúc: 11

1.2 Nguồn gốc: 12

2 Cellulase: 15

2.1 Cấu trúc: 15

2.2 Phân loại: 19

2.3 Cơ chế hoạt động: 20

2.4 Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei : 22

1.3 Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách

nhân bản và biểu hiện gen khác loài : 38

1.3.1 Plasmids 39

1.3.2 Kết quả 40

II Phương pháp cổ điển: 42

2.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái T.reesei và việc sản xuất enzyme cellulase 42

2.1.1 Sự phát triển của hệ sợi nấm 45

2.2 Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase 48

2.3 Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase 50

2.4 Ảnh hưởng của sục khí và không sục khí đến khả năng sản xuất cellulase ở T.reesei RUT C30 51

PHẦN 3: KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 53

Danh Mục Bảng Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm 2

Bảng 1 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật 14

Bảng 1 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9] 19 Bảng 1 4: Tóm tắt các loại enzymee có mặt trong T.reesei [8, 11] 23 Bảng 1 5: Tóm tắt các gen qui định cellulase ở nấm T.reesei 28

Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ALK02221 và bởi chủng đã biến đổi

ALK03760, ALK03862, ALK03761 31 Bảng 2 2: Sản xuất cellulase bởi chủng ALKO2221 và chủng ALKO3797, ALKO3798, ALKO3873 34 Bảng 2 3: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ VTT-79125 và các chủng đột biến sản xuất lượng lớn EGI 37 Bảng 2 4: Các primer để khuếch đại gen egl 20-50 kDa và cbh 50kDa của M.albomyces bằng phương pháp PCR 39 Bảng 2 5: Sản xuất cellulase bởi chủng M albomyces ALKO4237, chủng chủ

Trichoderma ALKO3620 (egl2) và chủng T.reesei biến đổi sao chép cel45A, cel7A và cel7B thay thế gen cbh1 hay egl1 41 Bảng 2 6: So sánh sản lượng tế bào thu được trong nuôi cấy liên tục của nấm T.reesei 52

Danh M c Hình ục Hình

Hình 1 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử 5 Hình 1 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium 7 Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở công ty Điền Trang 8

Hình 1 7: Cấu trúc của phân tử cellulose 12 Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật 13 Hinh 1 9: Cấu trúc không gian 3 chiều của enzyme cellulase (Ngân hàng dữ liệu protein, cấu trúc 1JS4) 15

Hinh 1 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase 17Hinh 1 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose trong sản xuất protein tái tổ hợp [7] 18Hinh 1 12: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [10] 22

Hình 1 13: vùng xúc tác của các enzyme 24 Hình 1 14: Cơ chế enzym thủy phân cellulose Hai cellobiohydrolases (CBH) tấn công vào vùng cellulose tinh thể ở chuỗi kết thúc và endoglucanases (EG) ở giữa khu của cellulose Các vòng tròn đầy, ký hiệu là R, đại diện cho vùng kết thúc giảm và các vòng tròn mở, ký hiệu NR, đại diện cho vùng kết thúc không giảm C là vùng cellulose kết tinh[ Teeri, 1997 ] 26

Hinh 2 1: Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [ Kelly và Hynes, 1985 ] 29 Hình 2 2: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi 30 Hinh 2 3: Plasmid pALK546 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHII 32

Hình 2 4: Kết quả Southern Blot của các chủng biến đổi 32 Hình 2 5: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi 33 Hình 2 6: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537 egl2 được nối với promoter cbh1 Đoạn NotI 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi 35 Hình 2 7: Giới hạn của plasmid pALK540 Đoạn ClaI-PvuI 11.6 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi 36 Hình 2 8: Southern blotting của chủng ALKO3530 và ALKO3574 37 Hình 2 9: Các plasmid được sử dụng cho biến đổi T.reesei ALK3620 biểu hiện gen

cel45A, cel7A, cel7B ở M.albomyces 40 Hình 2 10: sự phát triển hình thái của các sợi nấm trên các môi trường : môi trường (A), môi trường B ( B), môi trường C (C), môi trường D (D) 45 Hình 2 11: đặc điểm hình thái của sợi nấm theo thời gian trên các môi trường khác nhau Môi trường A ( ), môi trường B ( ), môi trường C ( ), môi trường D ( ) 47 Hình 2 12: ảnh hưởng của pH đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất alpha cellulose 48 Hình 2 13: ảnh hưởng của pH khác nhau đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất CTMP 49 Hình 2 14: Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase 50 Hình 2 15: Ảnh hưởng của quá trình sục khí ( ) và không sục khí ( ) trong quá trình lên men 51

Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, cókhoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra Đây cũng làloại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải, ) Ở

nhiên dồi dào Thêm vào đó, nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn phụphẩm nông nghiệp phong phú và đa dạng

Enzym Cellulase là một phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulosethông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid trong cellulose tạo ra sản phẩmglucose cung cấp cho công nghiệp lên men Nguồn thu enzym cellulase lớn nhấthiện nay là vi sinh vật Trong đó, vi nấm Trichoderma là nguồn thu enzymecellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao

Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một

số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose Để từ đó, giải quyết đượcnhững vấn đề “nóng” ở Việt Nam và trên thế giới

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1. Lịch sử phát hiện

Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết

là Trichoderma viride Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân

loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác.Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượngcác trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương Chương

trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã số QM 6a là loài

nấm phân hủy cellulose ở khu vực này Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến

khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei

để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T Reese, tác giả làm việc tạiviện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài vềsinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của

chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó Nhờ những công trình

đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và

khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60 Cùng

thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài

Trichoderma Việc nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng

dụng về phân giải cellulose của chúng Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về

Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học

trong nông nghiệp Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà

khoa học trên thế giới [Theo Christian P Kubicek và Gary E Harman].

dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào dướingành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một

số Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại

Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm

Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS ( CBS Course of

Giới: FungiNgành: AscomycotaLớp: AscomycetesBộ: HypocrealesHọ: HypocreaceaeGiống: TrichodermaLoài: Trichoderma reesei

2.2 Đặc điểm hình thái

Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trongchứa chất nguyên sinh có thể lưu động Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạnnhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-

10 µm)

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuốinhóm phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu,liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử cùa Trichoderma, cómàu xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài,bào tử luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn

Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone) Lúcsợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm Dưới phần này thành tế bàodày lên và không sinh trưởng thêm được nữa Màng nguyên sinh chất thường bám sátvào thành tế bào Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hayxoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome) Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều lỗthủng Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế bào phía sau

Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein)

Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ nhưng

về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía đỉnh ngọn sợinấm Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis) hoặc bịtan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật khác sinh ra.Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạonên một màng dày hình thành những bào tử áo (chlamydospore) Loại bào tử này có thểgiúp sợi nấm tồn tại được qua những điều kiện môi trường khắc nghiệt Trường hợp nàyrất giống với các bào tử nội sinh (endospore)

Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môitrường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều- mycelia), sau 3-5ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony) Vào giai đoạncuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn tyvới nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đếntoàn bộ hệ sợi nấm

Hình 1 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử

( nguồn bởi G.B.Sharples)

3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

3.1 Đặc điểm sinh thái

T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau

4 ngày nuôi cấy ở 200C Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 250C-300C, chậm ở 350

C-370C Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ

và ở mép bất thường Trong khi ở 370C, bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy

3.2 Môi trường sống

Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm Hầu hết chúng là vi sinh vật hoạisinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác Trichoderma rất ít tìm thấythực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật chúng có mặt khắp mọi nơi trừnhững vĩ độ cực Nam và cực Bắc Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm

Trichoderma

3.3 Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh

Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids,trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid

Trichoderma có khả năng sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon, emodin

3.4 Môi trường nhân sinh khối

Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulosenhư: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia…

4. Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma

[nguồn TS Dương Hoa Xô - TT CNSH Tp Hồ Chí Minh]

Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạtđộng" khác nhau, chúng có thể sử dụng:

Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tác nhân

gây bệnh

Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng,

không gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" môi

trường trước các vi sinh vật khác

Ký sinh: tức giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trong loài

nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng

Hình 1 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium

[(Nguồn: DienTrang Biolab)]

5 Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

5.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng Bảo vệ thực vật: một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma được

quan tâm nhiều nhất là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một sốnấm gây bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều loại Trichoderma khác đểkiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác Kết quả các loại Trichoderma kiểm soát hiệuquả các nấm gây bệnh Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụngrất rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam Phânhữu cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có tác dụngrất tốt trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm

Phytophthora palmirova gây ra Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do

một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii …

Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất

ở công ty Điền Trang.

Cải thiện năng suất cây trồng : (kích thích sự tăng trưởng của cây trồng)

Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm quabao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sựhình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường Những cơchế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gầnđây Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng giatăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) giúp khả năng hút chất dingdưỡng Ngoài ra, những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năngchịu được hạn hán

Hình 1 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T harzianum T-22 [G E Harman, Cornell University, Geneva].

5.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường

Xử lý các phế phẩm nông nghiệp:

Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngòai tác dụng sản xuất phân bónhữu cơ sinh học, hay sử dụng như một lọai thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng để

xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu

cơ rất hiệu quả Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma ) của Trung Tâm Côngnghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam

… đang được nông dân TP Hồ Chí Minh và khu vực Đồng bằng Sông Cửu long, Đôngnam bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng Việc sử dụng chếphẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương pháp thôngthường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng Người nôngdân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khảnăng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứatrong phân

Các chế phẩm của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm chứa các vi sinhvật do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma

sp và vi khuẩn Bacillus sp Những vi sinh vật trên có tác dụng phân huỷ nhanh các hợpchất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein và cellulose), gây mất mùi hôi Trước đó,chế phẩm BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùnđáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt

Hình 1 5: Một số gen biocontrol từ T harzianum đã được đưa vào cây thuốc lá để kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo lá và vào cây khoai tây để kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi G E Harman, Cornell University, Geneva].

Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzymee ngoại bào rất có hiệuquả Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzymee khácphân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thựcphẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự

6 Khả năng ứng dụng ở Việt Nam

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng BằngSông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã chothấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng BằngSông Cửu long và Đông nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả

năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma

là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan Lợi dụng đặc tính này người

ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quátrình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học cóứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa

của Công ty Anh Việt (TP Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (ĐồngNai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoannghênh và ứng dụng hiệu quả

II. Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei:

1 Cellulose:

1.1 Cấu trúc:

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích

β-D-Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằmtrong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật

Hinh 1 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu-cacbon, màu

đỏ-oxy, màu trắng-hydro [ web bách khoa toàn thư ].

Các đơn vị lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm haiđơn vị glucose Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lựcvan der Waals để tạo thành cấu trúc cao phân tử không hòa tan

Hình 1 7: Cấu trúc của phân tử cellulose

1.2 Nguồn gốc:

Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, cókhoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra Đây cũng làloại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải, ) Ởcấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phânhủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái Điều khôngmay là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng

may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ.

Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật Cellulose có nhiều trongsợi bông (95%) , sợi lanh (71%), sợi đay ( 71% ) Ngoài ra, cellulose còn có trong

gỗ, thưc vật dưới nước (tảo, rong,…),sản phẩm phụ phẩm nông nghiệp ( rơm, rạ,lõi ngô,…)

Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật

[bởi Michael W Davidson ]

Bảng 1 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật

Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng Thông

thường cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt

Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose Đơn vị chức

năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất là cellulose đến trungtâm xúc tác của cellulase Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúctác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể Một số khác lại có xuhướng liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [6]

Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trưng choenzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúccellulosome

Hinh 1 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase

A Cellulase ở nấm và một số vi khuẩn chỉ chứa 1 Trung tâm tạo liên kết vớicellulose

B Cellulase ở một số vi khuẩn chứa 2 Trung tâm tạo liên kết với cellulose

C Sơ đồ cấu trúc cellulosome (cấu trúc gồm nhiều enzyme, hoạt động ngoài tếbào)

Hinh 1 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose trong sản xuất protein tái

tổ hợp [7]

A- Sử dụng phương pháp Bioseparation để phân tách cellulose sản xuất proteintái tổ hợp (Bioseparation là quá trình tách các thành phần của hỗn hợp đi quamột cột hấp thụ để mỗi thành phần hấp thụ vào bề mặt khác nhau Quá trìnhnày được sử dụng để tinh chế các protein, các chất sinh học được sử dụngtrong sản xuất dược phẩm và thực phẩm )

B- Sử dụng phương pháp Bioprocessing gắn thêm ligand vào để biến đổi cấutrúc của protein tái tổ hợp

C- Sử dụng enzyme để cắt protein mong muốn và thu được protein đó

II.2 Phân loại:

Ban đầu enzyme cellulase được phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân hủycellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91).Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh so vớiendoglucanase [5] Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase thành 3nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [8]

Endo-cellulase

Cellulose kết tinhCellulose vô định

hình

Cắt liên kết giữacác chuỗicellulose

Chuỗi đơn cellulose

Exo-cellulase

(cellobiohydrolase)

Chuỗi đơncelluloseCellulose kết tinh

Cắt liên kết nộichuỗi (1 vị trí cắtsau 2-4 glucose)

Tetrasaccharides,disaccharides

Cellobiase Tetrasaccharides,

disaccharides

Cắt liên kếtglycoside giữa 2glucose

Monosaccharide

Bảng 1 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9]

Endo-cellulase (E.C.3.2.1.4) hay 1,4-β-D-glucan 4 glucanohydrolase tham gia

phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose Chúng tham gia tác động mạnh đếncellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh

Exo-cellulase (E.C.32.1.91) hay 1,4-β-D glucan cellobiohydrolase cắt đầu không

khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose (tetrasaccharides, disaccharides) Enzyme

Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước:

Cellulase liên kết với cellulose thông qua trung tâm liên kết với cellulose trên enzyme (giai đoạn 1) Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất (giai đoạn 2) Hình thành phức hệ enzyme – cơ chất ( giai đoạn 3 ) Thủy phân liên kết β-glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei tiết ra β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả nghiên cứu Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ) Desorption of cellulases from the substrate or repetition

of step 4 or steps 2/3 if only the catalytic domain detaches from chain (giai đoạn 5 ) Thủy phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase Ngoài ra, sản phẩm ức chế và

sự biến đổi cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên ( giai đoạn 6 )

Hinh 1 12: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [10].

Các bước 1 – 4 để tạo thành sản phẩm cellobiose

Bước 1 — vùng xúc tác kết nối với vùng liên kết nhờ tác nhân liên kết linker

Bước 2 — xác định vị trí của chuỗi kết thúc

Bước 3 — hình thành phức hệ enzyme – cơ chất

Bước 4 — thủy phân liên kết β-glycosidic để tạo sản phẩm là cellobiose

II.4 Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei :

Nhiều loại vi nấm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy cellulose Đó là các loạinấm mùn mềm, nấm mùn nâu, nấm mùn trắng, nấm kỵ khí trong dạ dày loài ăn cỏ Các loại nấm tạo ra mùn mềm chủ yếu phân hủy polysaccharide Trong nhóm nấmnày, khả năng sinh sản các enzyme phân hủy cellulose cũng khác nhau Loài nấm có khả

năng sinh sản hàng loạt enzyme phân hủy cellulose và được nghiên cứu kỹ là T viride (reesei).

Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzyme khác nhau, có khả năng phối hợp

để phân hủy tinh thể cellulose T reesei sản sinh 5 enzyme endoglucanase, hai

exoglucanase và một cellobiase (β-glucosidase) [8, 11]

I

II

9191

CBH ICBH II

6/B7/C

Bảng 1 4: Tóm tắt các loại enzymee có mặt trong T.reesei [8, 11].

Cellulase từ T.reesei là glycoprotein trong đó saccharide liên kết với gốc asparagin

(liên kết qua N) hoặc với gốc serin và threonin (liên kết qua O) Hàm lượng đường củacellulase thay đổi từ 1 đến 10% bao gồm mannose, glucose, galactose, xylose, N-Acetylglucozamin và galactozamin Liên kết N-glycozyl tạo ra cấu hình đặc biệt ổn định cấutrúc của cellulase, nhờ đó, bảo vệ cellulase khỏi bị phân hủy protein trong quá trình tiếtenzyme Trong khi đó, liên kết O-glycozyl cấn thiết để tạo hoạt tính cellulase

Endoglucanase có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tại các điểm bất kỳ

trên mạch phân tử cellulose Nhờ đó, độ trùng hợp các phân tử giảm nhanh, đồng thời

xuất hiện thêm các nhóm khử Trong 5 loại endoglucanase tiết ra bởi T.reesei, EG I chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 5÷10% tổng số protein tiết ra khi nuôi cấy T reesei Mặc dù