Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc thực vật (kèm ppt báo cáo)

Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc thực vật (kèm ppt báo cáo)

ra nhiều nhiều loại cây trồng, vật nuôi mang nhiều đặc tính vượt trội hơn các giốngtruyền thống cả về năng suất và phẩm chất.

Một mặt dân số thế giới đang ngày càng tăng nhanh, mặt khác con người có yêucầu ngày càng cao về thực phẩm, vì vậy những tiến bộ vượt bậc này đã mang lại lợiích to lớn về kinh tế cho các nước phát triển và sản xuất đủ lương thực cho các nướcnghèo góp phần đảm bảo an ninh lương thực trên thế giới

Trong đề tài này tôi giới thiệu phương pháp và kỹ thuật di truyển tạo ra một sốloại cây chuyển gen được ứng dụng trong thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam

Tôi xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Thúy Hương đã giúp đỡ tôi rất nhiều

trong quá trình hoàn thành đề tài này

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

CHƯƠNG 1:LỊCH SỬ RA ĐỜI VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC PHẨM CHUYỂN GEN 1

1.1 Giới thiệu: 1

1.2 Lịch sử ra đời : 1

1.3 Tình hình phát triển thực phẩm chuyển gen trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.3.1 Tình hình thế giới 3

1.3.2 Tình hình ở Việt Nam: 5

CHƯƠNG 2:THỰC PHẨM CHUYỂN GEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT 7

2.1 Định nghĩa 7

2.2 Những đặc tính mới của thực phẩm chuyển gen 7

2.2.1 Tăng tính kháng và thích nghi với môi trường 7

2.2.2 Nâng cao chất lượng sản phẩm: 11

2.3 Phương pháp chung và kỹ thuật cơ bản 13

2.3.1 Phương pháp chung 13

2.3.2 Kỹ thuật cơ bản: 14

2.4 Phương pháp kiểm tra và xác định thực phẩm chuyển gen 28

2.4.1 Phương pháp kiểm tra dựa vào DNA: 29

2.4.2 Phương pháp kiểm tra dựa vào protein: 35

CHƯƠNG 3: AN TOÀN SINH HỌC ĐỐI VỚI THỰC PHẨM CHUYỂN GEN 39

3.1 Các quy định đối với thực phẩm chuyển gen 39

3.1.3 Quy định về ghi nhãn cho thực phẩm chuyển gen: 42

3.2 Các nhà khoa học, thực phẩm chuyển gen và người tiêu dùng 47

CHƯƠNG 4: MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN 52

4.1 Golden rice (gạo vàng) – Thực phẩm chuyển gen của tương lai 52

4.1.1 Vitamin A ( Retinol, Axerotol, Xeroptol, Xerophtalmie) 52

4.1.1.1 Giới thiệu 52

4.1.2 Gạo vàng 1 55

4.1.3 Gạo vàng 2 57

4.2 Chuyển gen Anti – ACO giữ hoa lâu tàn và gen CryIA(c) kháng sâu vào cây hoa cúc [2] 59

4.2.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây hoa cúc 59

4.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 60 4.3 Chuyển gen cryIA(b,c) kháng sâu vào cây lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens[2] 63

4.3.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa 63

4.3.2 Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A tumefaciens và chọn lọc bằng mannose 65

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 69

Tài liệu tham khảo 70

Bảng 1.1 Diện tích cây trồng CNSH năm 2007 trên thế giới 4 Bảng 2.1 Hoạt tính của một số enzyme DNA polymerase chịu nhiệt khác nhau 33 Bảng 3.1 Ví dụ về sản phẩm công nghệ sinh học thực phẩm hiện nay 51

Hình 1.1 Diện tích cây trông CNSH thế giới (1996-2007) 3

Hình 2.1 Đu đủ biến đổi gen có khả năng kháng virus gây bệnh đốm vòng 10

Hình 2.2 Vi khuẩn A.tumefaciens 15

Hình2.3 Khối u ở thực vật do A.tumefaciens 15

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của opine (octopin, nopalin) 15

Hình 2.5 Sơ đồ gen của Ti-plasmid trong 16

Hình 2.6 Các bước biến nạp T-DNA vào kí chủ 18

Hình 2.7 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp trên nguyên tắc Ti-plasmid 20

Hình 2.8 Quá trình tạo cây chuyển gen nhờ A.tumefaciens 20

Hình 2.9 Súng bắn gen (hãng Biorad) 21

Hình 2.10: Sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen 22

Hình 2.11: Qui trình chuyển gen bằng súng bắn gen 23

Hình 2.12 Tế bào trần 24

Hình 2.13 Lớp phospholipid kép của màng sinh chất 25

Hình 2.14 Cuvette nhựa có điện cực 26

Hình 2.15 Máy xung gen (Gene pulser) (Hãng Biorad) 26

Hình 2.16 Sơ đồ cơ bản của máy xung điện 26

Hình 2.17 Sơ đồ minh họa plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất 27

Hình 2.18 Vi tiêm gen ngoại lai vào nhân của protoplast 28

Hình 2.19 Các bước tiến hành phương pháp Southern blot 30

Hình 2.20 Sự hình thành nút cài tóc do mồi chứa trình tự đối xứng bậc hai 32

Hình 2.21 Sự bổ sung giữa hai mồi tạo nên primer dimer 32

Hình 2.22 Ba giai đoạn trong một chu kì của phản ứng PCR 34

Hình 2.23 Quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kì phản ứng PCR 34

Hình 2.24 Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân 35

Hình 2.25 Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot 36

Hình 4.3 Ba vectơ dùng trong chuyển gen tạo β – carotene vào nội nhũ gạo 56

Hình 4.4 Quá trình tổng hợp β – carotene trong gạo vàng 57

Hình 4.5 Cấu trúc DNA dùng trong gạo vàng 2 58

Hình 4.6 A: gạo thường; B: gạo vàng 1; C: gạo vàng 2 58

Hình 4.7 Giống hoa cúc nghiên cứu chuyển gen 60

Hình 4.8 Cấu trúc plasmit pART27 mang gen Bt ( cryIA (c)) 61

Hình 4.9 Sơ đồ vecto pUBB - Man 66

Hình 4.10 Sơ đồ vecto pUBC - Man 66

CHƯƠNG 1:LỊCH SỬ RA ĐỜI VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC PHẨM CHUYỂN GEN

1.1 Giới thiệu:

Dân số thế giới ngày càng tăng nhanh, đặc biệt là ở các nước nghèo Vì vậy,yêu cầu đặt ra là cần phải sản xuất đủ về lương thực để đảm bảo cuộc sống Cây trồngtruyền thống không giải quyết được vấn đề này Do đó, ngành công nghệ gen dựa trênnhững thành tựu khoa học đã tạo ra sinh vật chuyển gen (GMO: GeneticallyModified Organism) (cây trồng, vât nuôi,… ) năng xuất cao, đảm bảo an ninhlương thực và đa dạng sản phẩm thực phẩm phục vụ cuộc sống của con người

Mặt khác, thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật chuyển gen (hay gọi tắt là thựcphẩm chuyển gen) với sự đa dạng và nhiều đặc tính tốt như: cà chua chuyển chínchậm có thể bảo quản được lâu hơn, cà chua chuyển gen có khả năng tạo ra mộtlượng folate đáp nhu cầu của cơ thể người …đáp ứng nhu cầu ngày càng cao củakhách hàng, đem lại lợi ích lớn cho các nước phát triển

Bên cạnh đó, thực phẩm chuyển gen đem lại hy vọng cho các nước đang phát

triển: lúa chuyển gen Bt có khả năng kháng các loại sâu bệnh, giảm chi phí chăm

sóc, nông sản chuyển gen chịu hạn…

Như vậy, không chỉ mang lại lợi ích trước mắt cho con người, công nghệgen còn đem lại lợi ích lâu dài: có các cây trồng, vật nuôi và các loại thực phẩmchuyển gen đáp ứng nhu cầu, con người sẽ giảm bớt việc khai thác nguồn độngthực vật tự nhiên, giảm bớt việc đưa các chất độc hại vào đất, nước, không khí …góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường, bảo vệ thiên nhiên

1.2 Lịch sử ra đời :

Có rất nhiều nghiên cứu về chuyển gen động thực vật với mục đích tạo cácsản phẩm thực phẩm dùng cho người Nhưng do các điều kiện khách quan cũng nhưchủ quan, tính cho đến hiện nay trên thị trường hầu hết các thực phẩm chuyển gen

tạp và cơ chế điều hòa biểu hiện gen chặt chẽ Ở đây ta chỉ xét đến thực phẩmchuyển gen có nguồn gốc từ thực vật.

Năm 1984, biến nạp vào tế bào trần (protoplast) thực vật được thựchiện Thành tế bào thực vật được phân giải bằng enzyme tạo ra tế bào trần Sau đónhờ polyethylene glycol (PEG) hoặc xung điện (electroporation) cảm ứng mà đoạnDNA ngoại lai được đưa vào tế bào trần (chuyển gen chịu lạnh vào khoai tây –McDaniel, 1984)

Năm 1987, phương pháp biến nạp phi sinh học được sử dụng Ở đây, tế bàothực vật được bắn phá bằng các hạt vàng hoặc wolfram bọc DNA ngoại lai Nhờphương pháp này mà sự biến nạp đã thành công đã ở các cây một lá mầm quantrọng như lúa, ngô và lúa mỳ

Năm 1989, không những đã thành công trong việc chuyển các gen mãhóa các kháng thể vào thực vật, mà người ta còn tạo nên các sản phẩm gen này nhưmong muốn Kết quả này đã mở ra một khả năng hoàn toàn mới mẽ cho việc sảnxuất vaccine và cả khả năng chống bệnh ở thực vật

Năm 1994, sản phẩm thực phẩm chuyển gen đầu tiên được bán ở Mỹ Đó

là cà chua FlavrSavr™ mang gen chín chậm lần đầu tiên được sản xuất hàng loạt.Cũng trong những năm này các nhà khoa học Nhật và Mỹ đã cùng nghiên cứuchuyển đổi gen từ cây bắp sang cây lúa nhằm cải tiến cơ chế quang hợp Các nghiêncứu ban đầu làm tăng năng suất lúa 20%

Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu cây lúa theo ba hướng:

Chuyển khả năng tạo nốt sần từ cây họ đậu sang cây lúa

Đưa vi khuẩn cố định đạm vào cây lúa

Chuyển gen cố định đạm vào cây lúa

Ngoài ra, các hướng nghiên cứu về kháng bệnh của cây lúa cũng đang được các nhàkhoa học ở viện lúa quốc tế IRRI nghiên cứu và đạt được những thành công nhất định

gen như ngô, lúa, khoai tây, đậu tương chuyển gen Bt kháng sâu bệnh, đậu tương

chuyển gen có hàm lượng chất béo không no cao … [3]

1.3 Tình hình phát triển thực phẩm chuyển gen trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình thế giới

Hình 1.1 Diện tích cây trông CNSH thế giới (1996-2007) [16]

Từ năm 1996 đến năm 2007, sau 12 năm được đưa vào canh tác đại trà, manglại lợi ích ổn định và bền vững, cây trồng chuyển gen đang được trồng ngày càngnhiều trên toàn thế giới và tiếp tục được mở rộng Năm 2007 diện tích đất canh táccây công nghệ sinh học lên tới 114.3 triệu ha Cây trồng công nghệ sinh học đã manglại nhiều lợi ích về kinh tế và môi trường cho nông dân ở cả các nước công nghiệpcũng như các nước đang phát triển, hàng triệu người nông dân nghèo được hưởngnhững lợi ích từ những phúc lợi xã hội và nhân đạo, góp phần giúp họ xóa bỏ nghèođói

Bảng 1.1 Diện tích cây trồng CNSH năm 2007 trên thế giới [16]

Thứ

tự Nước Diện tích(triệu ha) Cây trồng công nghệsinh học Cây trồng công nghệ sinh họccó thể dùng trong thực phẩm

1 USA* 57.7 canola, bí, đu đủ, cỏ alfalfaĐậu tương, ngô, bông, cải Đậu tương, ngô,bí, đu đủ

3 Brazil* 15.0 Đậu tương, bông Đậu tương

4 Canada* 7.0 Cải canola, ngô, đậu tương Ngô, đậu tương

5 India* 6.2 Bông

6 China* 3.8 Bông, cà chua, cây dương,thuốc lá, đu đủ, hạt tiêu Cà chua, đu đủ, hạt tiêu

7 Paraguay* 2.6 Đậu tương Đậu tương

8 Africa*South 1.8 Ngô, đậu tương, bông Ngô, đậu tương

9 Uruguay* 0.5 Đậu tương, ngô Ngô, đậu tương

10 Philippines* 0.3 Ngô Ngô

11 Australia* 0.1 Bông

13 Mexico* 0.1 Bông, đậu tương Bông, đậu tương

14 Colombia <0.1 Bông, cẩm chướng

15 Chile <0.1 Ngô, đậu tương, cải canola Ngô, đậu tương

16 France <0.1 Ngô Ngô

17 Honduras <0.1 Ngô Ngô

18 RepublicCzech <0.1 Ngô Ngô

19 Portugal <0.1 Ngô Ngô

20 Germany <0.1 Ngô Ngô

21 Slovakia <0.1 Ngô Ngô

22 Romania <0.1 Ngô Ngô

23 Poland <0.1 Ngô Ngô

(*): 13 nước được coi là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 ha trở lên.

Năm 2007, đã có 23 quốc gia canh tác cây trồng công nghệ sinh học, bao gồm

12 nước đang phát triển và 11 nước công nghiệp

Đáng chú ý là 8 nước đầu tiên trong danh sách trên, mỗi nước đều có diện tíchtrồng cây công nghệ sinh học trên 1 triệu ha

Năm 2007, Hoa Kỳ, Argentina, Brazil, Canada, Ấn Độ, Trung Quốc tiếp tục làcác nước đưa cây trồng công nghệ sinh học vào canh tác nhiều nhất Hoa Kỳ vẫn dẫnđầu thế giới với 57.7 triệu ha (chiếm 50% diện tích đất trồng cây công nghệsinh học trên thế giới)

Đậu tương công nghệ sinh học tiếp tục là cây trồng chủ đạo trong năm 2007,chiếm diện tích 58.6 triệu ha (chiếm 57% diện tích đất trồng cây công nghệ sinh học),tiếp theo là diện tích trồng ngô (35.2 triệu ha, chiếm 25%), bông (15 triệu ha, chiếm

trên toàn cầu).

Trong số các cây trồng công nghệ sinh học được đưa vào thương mại hóa từnăm 1996 đến năm 2007 tính trạng kháng thuốc diệt cỏ vẫn là tính trạng nổi trội

Trong 12 năm vừa qua, các nhà khoa học đã nỗ lực tạo ra giống cây trồng mangtính chống chịu tốt hơn đối với các yếu tố sinh học gây ra bởi côn trùng cỏ dại và bệnhcây Với diện tích canh tác không đổi, sản lượng gia tăng ổn định sẽ giúp đảm bảo đadạng sinh học, ngăn chặn nạn đốt phá rừng làm đất trồng trọt

Tới đây, khả năng chịu hạn, chịu mặn của cây trồng sẽ có trong khoảng 5 nămnữa Công nghệ sinh học cũng giúp tạo ra các thực phẩm giàu dinh dưỡng hơn, nhưdầu omega-3 hay gạo vàng giàu vitamin A dự kiến sẽ được cấp phép vào năm 2012

Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các loại cây như sắn,khoai lang, cây lúa miến và rau cũng sẽ giúp đa dạng hoá và cân bằng chương trìnhphát triển cây trồng công nghệ sinh học để đáp ứng mục tiêu xóa đói giảm nghèo [16]

1.3.2 Tình hình ở Việt Nam:

Về kỹ thuật công nghệ gen, Việt Nam ta còn rất non trẻ chỉ mới bắt đầunghiên cứu trong những năm gần đây chủ yếu trên đối tượng là thực vật Các câytrồng chuyển gen ở nước ta chỉ nằm trong khuôn khổ nghiên cứu và gieo trồng thửnghiệm trong các phòng thí nghiệm Sau đây là một số nghiên cứu đã được Việt Namtiến hành:

Tạo một số dòng lúa mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và nghiên cứu sự di

truyền của gen này đến thế hệ thứ hai (Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM)

Một số kết quả nghiên cứu về chuyển gen kháng sâu Bt vào hai giống lúa

thơm bằng phương pháp bắn gen (Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, Viện lúa quốctế)

Tạo cây lúa chuyển gen nàng hương chợ đào kháng cao đối với sâu đục thân

bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Viện Sinh

học nhiệt đới, TP.HCM, Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế - IRRI, Philippines)

Tạo giống lúa biến đổi gen giàu vi chất dinh dưỡng (Viện Lúa Đồng BằngSông Cửu Long)

tumefaciens (Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM) [28].

Trong tương lai, Việt Nam có thể sẽ đưa cây trồng công nghệ sinh học vàocanh tác trong 1 hoặc 2 năm tới Đây là điều đáng mừng cho nền nông nghiệp nướcta

CHƯƠNG 2:THỰC PHẨM CHUYỂN GEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT

2.1 Định nghĩa

Sinh vật biến đổi gen (GMO - Genetically Modified Organism) (bao gồm độngvật, thực vật và vi sinh vật) là một trong những nhóm sản phẩm chính của công nghệsinh học hiện đại, được con người tạo ra nhờ sử dụng các kỹ thuật phân tử để đưagen mới vào bộ gen của sinh vật nhận Quá trình chỉnh sửa này chỉ diễn ra trênphạm vi một vài gen Vì vậy, thuật ngữ sinh vật biến đổi gen còn được gọi sinh vậtbiến đổi di truyền hay sinh vật sửa đổi gen hoặc sinh vật công nghệ sinh học [2].Thực phẩm chuyển gen (GMF - Genetically Modified Food) là thực phẩm đượctạo ra từ các sinh vật biến đổi gen hay có chứa thành tố của chúng [2]

2.2 Những đặc tính mới của thực phẩm chuyển gen

2.2.1 Tăng tính kháng và thích nghi với môi trường

2.2.1.1 Kháng thuốc diệt cỏ

Trong sản xuất nông nghiệp có tính chuyên môn hóa cao thì việc sử dụng các loạithuốc diệt cỏ dại là điều rất cần thiết nhằm đảm bảo năng suất cây trồng Tuy nhiên,việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và đang gây ra các hậu quảnghiêm trọng đối với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người Gần đây, người

ta đã tổng hợp được một số hợp chất chỉ tồn tại trong tự nhiên một thời gian ngắn nênlàm giảm ảnh hưởng của thuốc đối với quần thể sinh vật trong đất, nhưng lại tiêu diệttoàn bộ cây cối Các hợp chất này được gọi là thuốc diệt cỏ không chọn lọc Các câytrồng được chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ không chọn lọc này có khả năng sống sótkhi bị phun xịt Nhờ vậy, ta có thể tiếp hành phun xịt các loại thuốc này (với liềulượng cho phép) để diệt cỏ mà không lo ngại ảnh hưởng đến cây trồng Hai loại thuốcdiệt cỏ không chọn lọc thường sử dụng là: - Glyphosate (Round upR): Làm ngừnghoạt động enzyme EPSP synthase (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synythase)

và qua đó kìm hãm sự tổng hợp các amino acid thơm Enzyme này không có ởngười và động vật nên Glyphosate không gây độc cho người

Phosphinotricin (PPT) còn gọi là Basta: PPT có cấu trúc tương tự glutamine,

có tác dụng ngăn cản sự hoạt động của enzyme glutamine synthase ở cả thực vật bậtcao lẫn vi khuẩn, sự bất hoạt enzyme này dẫn đến sự tích tụ NH3 gây độc [3]

Ưu điểm của hai loại thuốc diệt cỏ này là phân giải rất nhanh trong đất thànhnhững chất không hại Thời gian bán hủy của Basta trong đất chỉ 10 ngày và RoundupR từ 3 đến 60 ngày

Để sản xuất cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần những genkháng mã hóa cho protein, những protein này hoặc làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, hoặcthay đổi vị trí tác động của thuốc trong tế bào, làm thuốc không còn gây hại Tínhkháng không chọn lọc được sử dụng đối với nhiều cây trồng biến đổi gen, như câybông, khoai tây, ngô, đậu tương, thuốc lá và lúa mì

Kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo là đặc điểm thường được sử dụng nhiều nhất chođến nay ở thực vật biến đổi gen Điều này có nhiều nguyên nhân:

Thứ nhất là tạo ra thực vật biến đổi gen loại này tương đối đơn giản

Thứ hai, cỏ dại là một vấn đề lớn nhất trong nông nghiệp, đã làm giảm năng

suất từ 10-15% [15].

2.2.1.2 Kháng côn trùng gây hại

Các tổn thất trước thu hoạch gây ra bởi các loại sâu phá hoại là mộttrong các nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất cây trồng, đặc biệt là ở cácnước nhiệt đới có nhiệt độ cao, Nồng độ lớn, thích hợp cho sự phát triển sâu bệnhnhư ở nước ta Ở đây đề cập đến một loại toxin tự nhiên, được tạo ra trong vi

khuẩn Bacillus thuringensis và chỉ gây hại ở một số loài côn trùng nhất định, không hại đối với các động vật khác và con người B thuringensis là một vi khuẩn đất, thuộc loại gram dương, có khả năng tạo bào tử B thuringensis có khả năng tạo 4 loại độc tố

trong quá trình phát triển của chúng:

Ngoại độc tố α (α-exotoxin)

Ngoại độc tố β (β-exotoxin) hay còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt

Nội độc tố δ (δ-endotoxin) hay còn gọi là tinh thể độc

Độc tố tan trong nước [4]

Ở đây, người ta quan tâm đến δ-endotoxin Đây là loại độc tố dạng tinh thể

được tạo ra trong cơ thể B thuringensis khi bắt đầu tạo bào tử Tinh thể này có bản

chất là protein, chiếm khoảng 30% toàn bộ khối lượng tế bào Người ta xem tinh thểđộc như tiền độc tố (protoxin) Nó chỉ trở thành độc tố thực sự khi có mặt trongruột của một số côn trùng Tinh thể độc thuộc loại bền nhiệt, gây hủy hoạiđường tiêu hóa của sâu gây hại Khi đường ruột bị tê liệt bởi tinh thể độc, tế bàothượng bì bị biến đổi Tinh thể độc thường làm chết các ấu trùng thuộc bộ cánh vảy.không gây độc cho người và động vật

Khi tinh thể vào đường ruột của côn trùng có hai yếu tố tạo ra tính độcvới côn trùng:

pH của đường ruột côn trùng: pH ở ruột giữa và ruột trước nằm trong vùng

pH kiềm (>8.9) Khi pH ở giá trị này, tinh thể bị vỡ và gây nhiễm độc máu của côntrùng

Một số côn trùng tạo ra protease trong đường ruột, các enzyme này chuyểntiền độc tố của tinh thể thành độc tố [4]

Với các chủng B thuringensis khác nhau tạo ra các loại δ-endotoxin khác

nhau có tác dụng gây độc với các loài côn trùng cụ thể khác nhau Với cây

trồng chuyển gen kháng côn trùng gây hại, gen tạo độc tố của B thuringensis (sau

khi được biến đổi phù hợp với thực vật) được chuyển sang cho cây trồng Gen nàyđược đưa vào các cây trồng khác nhau như bông, ngô, khoai tây và cà chua chuyển

gen đang được sản xuất thương mại biểu hiện độc tố của Βtt để tạo ra tính kháng

đối với các côn trùng loại nhai-nghiền (chewing insects) Việc chuyển gen mã hóađộc tố δ-endotoxin cho cây trồng đem lại lợi ích rất lớn cho nông nghiệp, ngườinông dân không cần phải tốn công phun xịt thuốc trừ sâu định kỳ (giảm chi phi vềmặt này), năng suất tăng, giảm lượng thuốc trừ sâu ngấm vào đất

2.2.1.3 Kháng virus gây bệnh:

Để tạo thực vật chuyển gen kháng virus, phương pháp hay dùng vàđược chứng minh là phương pháp thành công nhất là bảo vệ gián tiếp bằng lớp vỏprotein Người ta nhận thấy rằng, virus ôn hòa khi xâm nhiễm vào thực vật sẽ tạo ramột lượng vỏ protein nhiều hơn nhu cầu và ở trạng thái tự do, không hạn chế bởi

bộ gen RNA của virus Vỏ protein ở trạng thái tự do và không giới hạn này đã ức

chế sự bọc vỏ các RNA của virus xâm nhập vào sau Vì vậy sự biểu hiện, sao chép

và phát triển các triệu chứng bệnh của virus RNA bị ức chế Lợi dụng điều này cácnhà khoa học đã chuyển các gen mã hóa cho protein vỏ của virus RNA vào cây trồng

để tạo ra các protein vỏ tương ứng ức chế sự phát triển và biểu hiện bệnh của cácvirus độc Ví dụ: cây đu đủ được chuyển gen mã hóa cho protein của virus đốm vòng

có khả năng kháng loại virus này [3]

Hình 2.1 Đu đủ biến đổi gen có khả năng kháng virus gây bệnh đốm vòng

2.2.2 Nâng cao chất lượng sản phẩm:

2.2.2.1 Carbohydrate và acid béo:

Carbohydrate đóng vai trò quan trọng và có nhiều chức năng đối với thực vật vàcon người Người ta có thể thay đổi thành phần carbohydrate của thực vật bằng việcbiểu hiện những gen mới hoặc bất hoạt những gen hiện có

Ví dụ: người ta đã thành công trong việc chuyển gen mã hóa cho RNA antisensecủa enzyme tổng hợp các hạt tinh bột dưới sự điều khiển của promoter 35sRNA (enzyme tổng hợp amylose) Khoai tây được tạo ra bằng cách này chỉ chứaamylopectin mà không có amylose [3]

Acid béo gồm một chuỗi carbon dài với đầu cuối là nhóm carboxyl Acid béokhác nhau về độ dài của chuỗi carbon và độ bão hòa Những đặc điểm này ảnhhưởng đến đặc tính hóa học của acid béo Có thể thay đổi chất béo theo hai hướngsau:

Thứ nhất là thay đổi tỷ lệ acid béo bão hòa và chưa bão hòa

Thứ hai là tạo ra những acid béo có mạch carbon dài, chưa bão hòa, vì chúngđược coi là thực phẩm có giá trị

Ví dụ: một gen mã hóa cho enzyme thioesterase được đưa vào cây cải dầu, đãtăng hàm lượng lauric acid (CH3(CH2)10COO-), thuận lợi cho việc sản xuất bơ [15]

2.2.2.2 Hàm lượng protein và amino acid không thay thế

Hàm lượng protein và thành phần amino acid thay đổi rất nhiều trong thựcphẩm thực vật và thường thiếu các amino acid không thay thế như lysine,methionine, threonine và tryptophan… Trong tương lai điều này sẽ được giải quyếtbằng việc tạo các dòng cây đậu tương hoặc ngô mang gen mã hóa cho protein giàunhững amino acid này.Một trong những thành công đầu tiên là tạo dòng ngôbiến đổi gen có cân bằng amino acid tốt hơn (hàm lượng protein cao hơn) có tên

là Opaquez, có hàm lượng lysine cao hơn (tăng 20% so với đối chứng) [15]

2.2.2.3 Vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng

Thực vật là nguồn cung cấp vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vilượng (trừ vitamin B12 và D) Các thực vật khác nhau có lượng vitamin và chấtkhoáng khác nhau

Tuy nhiên gạo là lương thực chính cho con người nhưng hầu như khôngchứa vitamin A Nếu chỉ sử dụng gạo trong các bữa ăn mà không thêm các loại thức

ăn có chứa vitamin A sẽ dẫn đến các bệnh về mắt do thiếu vitamin A Vì vậy mộtdòng lúa chuyển gen đã ra đời đáp ứng cho nhu cầu này, đó là dòng lúa tạo ranhững hạt gạo màu vàng được gọi là “gạo vàng – Golden rice” Dòng lúa này đãđược chuyển gen mã hóa cho β- carotene – một tiền chất của vitamine A Gen nàyđược biểu hiện ở nội nhũ vì vậy tiền vitamin A không bị mất đi khi xay xát Nộinhũ bây giờ có màu vàng là do β-carotene 300g gạo này chứa đủ lượng β-carotene,đáp ứng nhu cầu hàng ngày của con người

Ngoài ra, còn có những dòng lúa chuyển gen giàu vitamine E, sắt để đáp ứngnhu cầu về vitamine và khoáng chất cho con người [24].

2.2.2.4 Tăng khả năng bảo quản và hương vị

Một ví dụ về khả năng này đó là cây cà chua Đặc điểm tự nhiên của cà chua làchín rữa để giải phóng hạt Trong quá trình này cây sản sinh ra enzyme phân giảithành tế bào, làm cho quả chín Trong các enzyme có polygalacturonase Bằngphương pháp tạo dòng gen (antisense-polygalacturonase) enzyme này không đượctổng hợp và nhờ vậy mà cà chua giữ được lâu hơn Tuy nhiên, sau đó cà chua sẽchín do còn có những enzyme khác phân giải thành tế bào Loại cà chua này trên thịtrường được gọi với tên là Flavr Savr Ưu điểm đối với người sản xuất là thu hoạchđơn giản và bảo quản được lâu hơn và đối với người tiêu dùng là chất lượng tốthơn Những thành phần khác, ví dụ như vitamin, theo phân tích cho đến nay là khôngthay đổi [24]

2.2.2.5 Vaccine thực phẩm

Gần đây, các nhà khoa học đã coi cây trồng như một nguồn cung cấpcác loại vaccine phòng bệnh, bởi vì những loại vaccine thông thường đòi hỏi phảiđược lưu giữ trong môi trường lạnh, điều vô cùng khó khăn ở những nơi xa xôi củacác nước đang phát triển Một nghiên cứu gần đây đã công bố một bước đột phátrong lĩnh vực sản xuất vaccine từ thực vật, đó là loại khoai tây chuyển gen chứavaccine ngừa viêm gan B Loại khoai tây này có khả năng kháng virus viêm gan Bbằng cách tạo ra kháng nguyên virus Các nhà nghiên cứu hy vọng rằng khi ăn loạikhoai tây này, chất kháng nguyên sẽ gây ra một phản ứng miễn dịch nhẹ trong cơthể người Từ đó, cơ thể người sẽ tạo ra chất miễn dịch cá thể đối với bệnh lây nhiễm

Các cây khác nhau có phản ứng khác nhau với sự xâm nhập của một genngoại lai.

Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năngthu nhận gen biến nạp vào genome

Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen,từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan

Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai Vì thế, cho đến nay

chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus

và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng xung điện, siêu âm và

Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi

mà nó được đưa vào

Các bước cơ bản của quá trình chuyển gen:

Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm

Phân lập gen (dùng phương pháp PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từthư viện genomic DNA)

Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp

Biến nạp vào E coli.

Tách chiết DNA plasmid

Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khácnhau

Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc

Tái sinh cây biến nạp

Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánhgiá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử

nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật

riêng lẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh

2.3.2 Kỹ thuật cơ bản :

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, ta có thể chia thànhhai nhóm phương pháp chính: chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn hoặc virus; chuyểngen trực tiếp bằng các hóa chất và dụng cụ không qua sinh vật làm trung gian

2.3.2.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

Nguyên tắc:

Phương này đưa DNA vào tế bào thực vật qua trung gian của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens (đây là loại được dùng phổ biến) Sau khi xâm nhiễm,

chúng gắn một đoạn DNA (T-DNA) vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫnđến rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u

Vi khuẩn A.tumefaciens là vi khuẩn gram âm trong đất mang độc tính A.tumefaciens và một số loài họ hàng có khả năng chuyển một phần nhỏ DNA của nó

vào tế bào thực vật (nhiều loại thực vật hạt kín hai lá mầm và ở một số ítthực vật một lá mầm) và qua đó kích thích tạo khối u (gọi là crown-gal) Nhữngkhối u này là không gian sống của vi khuẩn

Hình 2.2 Vi khuẩn A.tumefaciens[23]. Hình2.3 Khối u ở thực vật do

A.tumefaciens [23]

Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong nhữngkhối u này Những opine phổ biến nhất là nopalin và octopin Về hóa học opine lànhững sản phẩm ngưng tụ của một amino acid với một cetoacid hoặc một amino acid

với đường Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate, còn nopalinđược tạo nên từ arginine và α-cetoglutaraldehyd.

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của opine (octopin, nopalin)

Việc gây ra khối u và tổng hợp opine liên quan với sự có mặt của một loại plasmid

có kích thước lớn là Ti-plasmid trong tế bào vi khuẩn A tumefaciens.

a) Ti-plasmid của A tumefaciens

Ti-plasmid (tumor inducing – plasmid cảm ứng tạo khối u) được tìm thấy

trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-800 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 300C Qua nghiêncứu cho thấy trong Ti- plasmid có hai vùng quan trọng là: vùng T-DNA

(transferred DNA) và vùng gây độc (virulence – vir gen) liên quan đến sự hình thành khối u, sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium Ngoài ra,

còn có vùng đóng vai trò phân giải opine (vùng T-DNA có khả năng tổng hợp loạiopine nào thì vùng này có khả năng phân giải opine đó để cung cấp năng lượng cho tếbào vi khuẩn)

Hình 2.5 Sơ đồ gen của Ti-plasmid trong

vi khuẩn A tumefaciens [27]

T-DNA: là một phần của Ti-plasmid (vùng T-DNA này có kích thước khoảng

12-24 kb), được chuyển vào thực vật (transfer-DNA) Trên đó định vị những gen mãhóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen tạo khối u Trong Ti-plasmid, T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, vai trái và vai phải (LB: left border vàRB: right border) Các vai này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biếtcho việc cắt T-DNA [3]

Vai trái 5’ -GNCAGGATATATATNNNNNNGTNANN- 3’

Vai phải 5’ -GGCAGGATATATATNNNNNNGTAAAN- 3’

(Trình tự chung của vai trái và vai phải của T-DNA trên Ti-plasmid N

là một nucleotide bất kỳ trong 4 nucleotide Trình tự này có thể không giống nhau ởcác chủng vi khuẩn) Mặc dù vai trái cũng chứa đoạn lập lại 25 bp tương tự vaiphải, nhưng những nghiên cứu cho thấy vùng này không tham gia vào quá trình biếnnạp [8]

Vùng vir: nằm ngoài vùng T-DNA (độ dài khoảng 25 kb), có khoảng 25 gen

được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir F, vir

G Những gen vir này giữ các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tếbào thực vật, cắt bỏ đoạn, chuyển gen và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập củaT-DNA vào tế bào ký chủ Trong đó, vir A, B, D, G cần thiết cho việc tạo khối u; vir

C, E ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen trên biên độ ký chủ [3].

b) Cơ chế biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ

Để xảy ra quá trình biến nạp tế bào thực vật phải bị thương Vì lúc này tế bàothực vật tiết ra các hợp chất làm tín hiệu cảm ứng cho vi khuẩn tấn công và xâm nhập.Các hợp chất cảm ứng được chia làm hai loại:

Các monoccharide: tạo ra sự hấp dẫn trên một quãng đường dài đối với

những chủng vi khuẩn Agrobacterium độc và không độc đến vị trí vết thương ở rễ.

Dạng tiền phenol và các chất trung gian của sự sinh tổng hợp lignin có vai trò rấtđặc biệt Ở nồng độ thấp (<10-7M đối với acetosyngone) các phenolic này hoạt động

như chất lôi kéo chuyên biệt chỉ đối với chủng Agrobacterium độc Sản phẩm của vir

A và vir G làm trung gian cho sự lôi kéo theo các hóa chất này Tuy nhiên ở nồng độcao hơn thì các hợp chất phenolic cùng loại này có vai trò những chất cảm ứng chuyênbiệt sự điều hòa gen vir thông qua dấu hiệu kép (vir A và G) của cơ chế tải nạp tương

tự với các hệ thống điều hòa của các loài vi khuẩn khác [3]

Quá trình biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ gồm 10 bước như sau:

(1) Vi khuẩn nhận ra và tấn công vào tế bào ký chủ

(2) Các hợp chất cảm ứng của tế bào ký chủ tiết ra cảm ứng với sản phẩmcủa hệ thống tín hiệu kép (vir A và G)

(3) Vùng gen vir được hoạt hóa.

(4) Bản sao của T-DNA được tạo ra dưới sự có mặt phức hợp protein của

vir D1,D2

(5) Bản sao này kết hợp với protein của vir D2, tạo thành phức hợp T-DNAprotein và với một số protein của các vir khác đi vào tế bào chất của tế bào kýchủ thông qua kênh vir B/D4T4SS

(6) Phức hợp này lại kết hợp với sản phẩm của vir E, rồi đi vào tế bào chấtcủa tế bào ký chủ Protein của vir D2 và sản phẩm của vir E gắn với bản sao T-DNA

có tác dụng bảo vệ sợi T-DNA không bị phân cắt bởi các enzyme exonuclease

(7) Phức hợp T-DNA protein đi vào nhân tế bào ký chủ

(8) Khi đã vào trong nhân, T-DNA xác định điểm để xen vào

(9) T-DNA tách ra khỏi các protein bảo vệ

(10) T-DNA gắn vào bộ gen của tế bào ký chủ một cách ngẫu nhiên

Hình 2.6 Các bước biến nạp T-DNA vào kí chủ [12]

c) Ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen thực vật Trên thực tế, A tumefaciens chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho

rằng chúng chỉ có thể biến nạp T-DNA vào bộ gen của cây hai lá mầm Gần đây,

nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn Agrobacterium, các cây một lá

mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác việc chuyển gen của

Agrobacterium ở cây một lá mầm

Mặc dù, Ti-plasmid của A.tumefaciens là vectơ tự nhiên nhưng chúng lại có

nhược điểm so với vectơ nhân dòng:

Sự sản xuất phytohormon của tế bào thực vật chuyển gen (được nuôi cấytrong môi trường) ngăn cản chúng tái sinh thành cây trưởng thành hoàn chỉnh vàkhỏe mạnh.

Do đó, gen mã hóa cho enzyme tham gia tổng hợp auxin và cytokinin cần phảiđược loại bỏ khỏi Ti-plasmid

Gen mã hóa cho các enzyme tham gia tổng hợp opine không có vai trò đối với

kỹ thuật tạo thực vật chuyển gen và có thể làm giảm sức sống do tiêu hao nănglượng vào việc tổng hợp opine Do đó, các gen này phải loại bỏ khỏi plasmid

Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb) gây khó khăn trong quá trình thaotác tạo DNA tái tổ hợp Vì vậy, các đoạn DNA không cần thiết cho quá trình tạodòng và biểu hiện gen cần được loại bỏ

Ti-plasmid không sao chép trong E.coli nên việc nhân dòng plasmid tái

tổ hợp trong E.coli không thể thực hiện được Do đó, khi xây dừng vectơ

plasmid phải thêm đoạn ori của plasmid E.coli để có thể sao chép trong tế bào E.coli

[8]

Để khắc phục những nhược điểm, trên các nhà khoa học đã tạo ra vectơ tái tổ hợpdựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid Những vectơ này gồm có các thành phần sau:

Các gen chọn lọc (a selectable maker gene) như: neomycin phosphotransferase,

gen tạo khả năng kháng kanamycin của tế bào thực vật chuyển gen

Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E.coli Trình tự vai phải của vùng T-DNA: vùng này tuyệt đối cần thiết cho

quá trình chuyển gen xảy ra Một số vectơ có thể có trình tự cả hai vai

Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn

gen vào plasmid Khả năng chuyển gen tự nhiên được khai thác để chuyển gen

ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn, bằng cách nuôi mẫu

cấy trong môi trường thích hợp có chứa Agrobacterium mang vectơ tái tổ hợp cần chuyển Agrobacterium sẽ xâm nhập vào mô mẫu cấy từ các vết thương ở mép

và chuyển plasmid mang gen cần chuyển vào tế hoàn chỉnh mang gen mong muốn[2].

Hình 2.7 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp trên nguyên tắc Ti-plasmid [27]

Hình 2.8 Quá trình tạo cây chuyển gen nhờ A.tumefaciens [12].

2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

a) Chuyển gen bằng súng bắn gen

Phương pháp chuyển gen nhờ súng DNA là một kỹ thuật tương đối cònmới mẻ nhưng đã được chứng minh là có tiềm năng lớn Súng bắn gen (Gene gun)

là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiêncho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thậpniên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiêncứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA

Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990 Ðạn sử dụng cho loạisúng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA

Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạtbiolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi mộtcách đơn giản là biolistics (sự kếthợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) vàballistics (sự bắn tung))

Hình 2.9 Súng bắn gen (hãng Biorad)

Nguyên lý hoạt động

Hình 2.10: Sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen

Nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí heliumhoặc gas để gia tốc các hạt vi đạn Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không

gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không DNA ngoại lai được trộn

ở một tỉ lệ nhất định với hạt tungsten (hoặc vàng) hình cầu có đường kính rấtnhỏ khoảng 0.2 – 2µm Sau khi kết tủa DNA lên các hạt kim loại, vi đạn được làmkhô trên một đĩa kim loại mỏng 0.5 – 0.8cm Đĩa kim loại được gắn vào đầu mộtviên đạn lớn (macroprojective) vừa khít với nòng súng Viên đạn lớn được làm bằngnhựa, bông nén hay vật liệu nhẹ Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độcao ra khỏi đầu nòng, tới một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạnvẫn đi với gia tốc lớn đến đích xuyên vào tế bào Một tỉ lệ nhỏ DNA ngoại lai hòanhập với DNA của tế bào và biểu hiện [3]

Ứng dụng

Hình 2.11: Qui trình chuyển gen bằng súng bắn gen

Nhờ sử dụng kỹ thuật này, các tế bào nguyên vẹn của những loại cây

lương thực quan trọng không thể biến nạp được nhờ Agrobacterium đã được thực

hiện thành công như lúa mì, lúa mạch … Hiện nay, phương pháp chuyển gen bằngsúng bắn gen dường như kỹ thuật duy nhất đáng tin cậy để chuyển gen vào các bào

quan và chắc chắn có thể thực hiện được trên thực vật một lá mầm nếu một số điềukiện được tối ưu hóa như: kích thước vi đạn, hình dạng và hiệu bọc DNA, điềukiện môi trường mang tế bào khi bắn DNA, trạng thái sinh lý của tế đích.

Ưu điểm của phương này

Không cần phải phân hủy thành tế bào bằng enzyme

Về lý thuyết mọi tế bào và mô đều có thể được biến nạp

Không phức tạp như ở sự biến nạp A tumefaciens.

Những khó khăn của phương pháp này

Hiệu quả của phương pháp này thấp (chỉ khoảng 0,05% đỉnh sinhtrưởng đậu tương tái sinh sau khi biến nạp) vì DNA biến nạp không phải luôn luônbền vững trong DNA của nhân tế bào nên thường biểu hiện tạm thời Thường chỉmột số ít tế bào của mô được biến nạp và vì vậy không phải lúc nào cũng tái sinhđược cây thay đổi gen đồng nhất Phần lớn phải sử dụng mô phân sinh để biến nạp

b) Chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần (protoplast):

Ðể DNA có thể xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tếbào tạo protoplast Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy nhưcác tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tếbào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này.Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chếđơn giản

Để tạo nên tế bào trần, tế bào thực vật phải được đặc trong môi trường có ápsuất thẩm thấu cao, dẫn đến sự co nguyên sinh, như vậy tế bào sẽ không bị vỡ khi mấtthành tế bào Sau đó, tế bào được xử lý với hệ enzyme cellulase và pectinase để phânhủy thành tế bào Kết quả xuất hiện tế bào tròn, không có thành (Hình 2.12) Nguồnthu tế bào trần: từ tế bào lá, mô sẹo hay huyền phù tế bào

2 Cơ chế hoạt động chính xác của các nhân tố khác nhau chưa được biết nhưngchúng được xem như là chất làm mất tính ổn định của màng Khả năng biến nạpvào protoplast phụ thuộc vào nguồn gốc của protoplast, sự cô lập, tinh khiếtprotoplast, chất lượng và thao tác thực hiện, độ pH của môi trường biến nạp, nồng

độ của hóa chất và các ion hóa trị 2, hình dạng của DNA Sự tối ưu hóa những yếu

tố trên sẽ tạo ra được những kết quả khác nhau trên những loài thực vật khác

Phương pháp vật lý:

 Kỹ thuật xung điện:

Nguyên tắc:

Lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài vàmột đầu kị nước phía trong (Hình 2.13), nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm

cả DNA và protein, đều không có khả năng đi qua màng một cách tự do (Farabee,2001)

Hình 2.13 Lớp phospholipid kép của màng sinh chất.

Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵnước của lớp phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó saukhi bị rối loạn (Purves, 2001) Một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phầnnghìn giây) có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời (tạo ra các

lỗ thủng tạm thời), cho các phân tử phân cực (như DNA) có thể đi qua, nhưng sau

đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng Như vậy, DNA đã được tiếp nhận, DNA

đi vào trong nhân và kết hợp hoàn toàn ngẫu nhiên vào một vị trí bất kỳ trong DNAcủa tế bào thực vật

Cách tiến hành:

Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vàotrong một cuvette nhựa có điện cực

Hình 2.14 Cuvette nhựa có điện cực

Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng mộtthiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser)

Hình 2.15 Máy xung gen (Gene pulser)

(Hãng Biorad)

Hình 2.16 Sơ đồ cơ bản của máy xung điện

Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao Khicông tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào Một xung điệncần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 700 V/cm (thay đổi tùy theo kíchthước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây Xung điệnnày làm rối loạn lớp phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời

Vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ theochiều điện trường

Hình 2.17 Sơ đồ minh họa plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua

các lỗ tạm thời trên màng bào chất

Một số trở ngại khi dùng xung điện:

Tỷ lệ tế bào chuyển gen còn thấp

Sức sống tế bào giảm đột ngột khi bị sốc điện.

Việc tái sinh ở một số loài rất khó khăn

Hình 2.18 Vi tiêm gen ngoại lai vào nhân của protoplast

Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào vớihiệu quả tương đối cao Tuy nhiên do đòi hỏi phải kĩ thuật tinh vi, tỉ mỉ và cực kì chínhxác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm (có thể thực hiện 100-200 tế bào/giờ) và ngoài

ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vitiêm Các phương pháp chuyển gen trên rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài

thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực

hiện được

Về nguyên tắc bất kỳ thực vật nào cũng có thể được biến nạp bằng các phươngpháp trên Tuy nhiên, việc tạo protoplast cũng như tái sinh cây từ protoplastkhông đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường Với

phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành công vào một số loài câymột lá mầm như loài lúa Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil,1992).

2.4 Phương pháp kiểm tra và xác định thực phẩm chuyển gen

Để xác định một sản phẩm thực phẩm có phải là thực phẩm chuyển gen haykhông người ta thường dùng các phương pháp sau:

Phương pháp kiểm tra dựa vào DNA:

Phương pháp Southern blot

Phương pháp PCR

Phương pháp kiểm tra dựa vào protein:

Phương pháp Western blot

Phương pháp ELISA

2.4.1 Phương pháp kiểm tra dựa vào DNA:

2.4.1.1 Phương pháp Southern blot:

a) Nguyên tắc:

Đây là phương pháp lai trên pha rắn Một trình tự bổ sung nằm trong môitrường lỏng là một dung dịch đệm Trình tự bổ sung còn lại (thường la` trình tựđích) được cố định trên giá thể rắn Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặpnhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ(Tm: nhiệt độ nóng chảy của DNA) Cơ so của phương pháp là kỹ thuật chuyển DNA

từ gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975

b) Cách thực hiện:

Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp

Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.

Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel): ví dụ có thểnhúng nó vào trong dung dịch NaOH 0.5M, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNAsợi đơn Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai

Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai Thông thường màng lai được sửdụng là màng nitrocellulose Người ta cũng có thể sử dụng màng nylon Màngnitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm2, trong khi màngnylon có khả năng tiếp nhận 500µg DNA/cm2 Mặt khác màng nylon có khả nănggiữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn Việc chuyển DNA thường được tiến hànhbằng hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài giờ hoặc có thể dùng một thiết bị thấmchân không Nếu dùng thiết bị thấm chân không thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảngmột giờ Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên khôngthay đổi

Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu.Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò) Ðểđánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phátquang sinh học

Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạthì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu

sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dòphát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang Phương pháp Southern blotđược thiết kế để xác định sự hiện diện, kích thước, số lượng bản sao, tính đồng dạngcủa DNA trong một phức hợp

Hình 2.19 Các bước tiến hành phương pháp Southern blot [19]

4.1.2 Phương pháp PCR:

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng tổng hợp dâychuyền nhờ polymerase là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãinhất trong lĩnh vực sinh học phân tử Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vàonăm 1985 và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold SpringHarbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm

”ngược” so với chiều phiên mã của gen) [1]

b) Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR:

 DNA mẫu (DNA template)Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại Phản ứng PCRtối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốtvới DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng mẫu DNA sử dụng cókhuynh hướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao

(<100 ng) Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban đầu còn còn hạn chế được cáckhuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Lượng DNAmẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra PCR còn cho phép khuyếch đại

cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy từngphần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của ngườichết …

 Mồi (primer)Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phảnứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được khuếch đại,cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các mồinày có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược(antisens primer)

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả củaphản ứng Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:

Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gầnnhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ Thành phần nucleotide của các mồicân bằng cần tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

Kích thước thông thường là 18-25 base để quá trình lai xảy ra tốt hơn

Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khôngvới các trình lặp lại trên gen

Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữamồi “xuôi” và mồi “ngược” tạo cấu trúc primer dimer; và cũng không có những cấutrức kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của của một mồi

Trình tự này giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn Phản ứng PCRtối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb [1]