Thu thập nguồn gene và tổ chức dữ liệu gene 2

Thu thập nguồn gene và tổ chức dữ liệu gene

Hình 1.6: Sao chép và dịch mã

Trong 64 codon, ta có thể kể:

 Ba codon UAA, UAG, UGA là các “codons non sens”, không đƣợc dịch thành amino acid; chúng là dấu hiệu chấm dứt sự đọc, nên còn đƣợc gọi là “codon stop”

 61 codon còn lại mã hóa 20 amino acid Trừ Met và Trp chỉ đƣợc mã hóa bởi 1 codon, các amino acid khác đƣợc mã hóa bởi nhiều codon Nhƣ vậy có nhiều codon cùng nghĩa

Hình 1.7: Mã di truyền của nhân (các codon của mRNA)

I.1.3.3 Ba đặc tính quan trọng của mã di truyền

 Phổ biến (universal): Mã di truyền cơ bản giống nhau cho mọi sinh vật (động vật, thực vật, vi khuẩn hay virus) Chính vì thế từ điển mã di truyền ra đời là bằng chứng thuyết phục về nguồn gốc tiến hóa chung của sinh vật

 Suy biến (degenerate): nhiều codon mã hóa cho một amino acid Trong phần lớn các trường hợp, các bộ ba mã hóa cho một amino acid chỉ khác nhau ở base thứ ba, thí dụ: UUU và UUC (Phe), CAA và CAG (Gln)…

 Không gối nhau: Mã di truyền được đọc tuần tự từ “bộ ba” này đến “bộ ba”

kế tiếp, liên tục trong một chuỗi, từ điểm khởi đầu cho đến kết thúc

a) Giả thuyết về base “dao động”

*Thế nào là base “dao động”

Mã di truyền chung (có tính phổ biến) là điều hết sức lý thú để hiểu về sinh vật Tuy nhiên, Sanger (1980) đã đặt lại vấn đề, vì có vài codon khác biệt trong ti thể Và

vì Met và Trp được mã hóa bởi hai codon thay vì một

Hình 1.8: Mã di truyền ty thể người

Sau phát hiện này, người ta còn thấy những codon khác ở nấm men,

Paramecium,…Thí dụ UAA của mRNA tế bào chất của Paramecium không phải là

codon Stop, mà là Gln

Mã di truyền có 61 codon mã hóa cho 20 amino acid Do đó ta có thể nghĩ rằng

có 61 tRNA (qui tắc bổ sung codon-anticodon) Tuy nhiên, thực tế một mRNA nhận biết nhiều codon mã hóa cho cùng một amino acid Nói cách khác không cần phải có

đủ 61 tRNA để vận chuyển acid amin trong quá trình dịch mã (nhưng một tRNA không bao giờ nhận biết hai amino acid khác nhau)

Theo giả thuyết base “dao động” (Crick, 1966), hai nucleotide đầu tiên của một codon (mRNA) bổ sung một cách nghiêm chỉnh với anticodon của t-RNA, nhưng base thứ ba của codon bắt cặp với base thứ nhất của anticodon theo cách tương đối lỏng lẻo

b) Ích lợi của tính suy biến mã di truyền và base “dao động”

Có ba điều lợi chính:

 Sự suy biến mã di truyền tạo nên một hệ thống bảo vệ đối với các đột biến có thể sinh ra, sự thay đổi base thứ ba thường không gây hậu quả, vì codon đột biến không làm thay đổi tRNA

 Các nối wobble cho phép tế bào tiết kiệm vật chất và năng lượng: không cần 61 tRNA để nhận biết 61 codon

 Cầu nối yếu hơn giữa base thứ nhất của anticodon và base thứ base của codon giúp các tRNA phân ly dễ hơn, và do đó sự tổng hợp protein nhanh hơn

Hình 1.9: Các kiểu wobble trong tế bào chất (ở các hữu nhũ)

I.1.4 Cấu trúc căn bản của một gene eukaryote

Chiều dài và cấu trúc một gene rất thay đổi Gene là các trình tự DNA đƣợc sao chép, các trình tự này có thể ở trên sợi này hay sợi kia của phân tử DNA Geneome là toàn bộ các gene và các trình tự không mã hóa của một cá thể

(A)

(B)

Hình 1.10: Các trình tự đƣợc sao chép của DNA (gene)

(A) sự sao chép của một sợi DNA (B) sự không liên tục của gene Gene eukaryote không liên tục, mà bao gồm:

 Các exon là các trình tự mang thông tin di truyền sẽ đƣợc biểu hiện

 Các intron là các trình tự nằm xen kẽ với các phần mang thông tin di truyền, đƣợc sao chép nhƣng không đƣợc dịch

 Gene ở phần lớn prokaryote có phần ghi mã liên tục, không có intron

I.2 Cơ sở sinh học về chuyển gene

Hình thức cơ bản nhất trong cải biến di truyền (Genetic transformation) là đƣa những gene chuyển (transgenes) vào trong sinh vật bằng cách nào đó mà các gene này

có thể đƣợc biểu hiện Kỹ thuật này còn đƣợc gọi là kỹ thuật di truyền

Mục tiêu cuối cùng của kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật DNA tái tổ hợp là sự biểu hiện bền vững và có thể di truyền của tính trạng mới trong bộ phận hay cơ thể khác Điều này đạt đƣợc thông qua cấu trúc vector mang gene chuyển Plasmid, retrovirus (RNA virus) và bacteriophage là các vector quan trọng đặc biệt trong chuyển thông tin

di truyền Trong quá trình chuyển gene, kỹ thuật di truyền cắt và sắp xếp lại các đoạn DNA tạo ra cấu trúc gene chuyển chèn vào vector

Hình 1.11: Cắt DNA Plasmid sử dụng enzyme cắt giới hạn

Hình 1.12: Gắn gene chuyển vào vector (Plasmid)

Hebert Boyer và Stanley Cohen đã đạt đƣợc thành tựu chuyển gene đầu tiên vào năm 1973, khi đó họ đã tạo ra gene với các phần DNA từ vi khuẩn và lƣỡng cƣ, biểu hiện gene kháng kháng sinh Với sự thành công trong việc sử dụng enzyme và vector, các nhà khoa học này đã tiên phong trong việc sử dụng kỹ thuật di truyền và chuyển thông tin di truyền Nghiên cứu của họ đã đặt nền móng cho nhiều công việc ngày nay trong công nghệ sinh học

I.2.1 Các vấn đề chủ yếu trong việc cải biến di truyền

Thuật ngữ genetically modified thường xuyên được dùng để mô tả những sinh

vật được chuyển gene hay được biến đổi di truyền Khoa học của kỹ thuật di truyền được phát triển với mục tiêu xây dựng các gene phục vụ cho chuyển gene Hệ thống chuyển gene gồm ba vấn đề chính:

 Kỹ thuật đưa DNA lạ vào tế bào đích

 Tế bào hay mô bền vững với điều kiện chuyển gene

 Các phương pháp cho phép xác định và chọn lọc tế bào hay bộ phận chuyển gene

Một trong những giới hạn của cải thiện di truyền truyền thống là sự không hòa hợp giữa các loài

Ví dụ: Đậu là loài giàu amino acid chứa sunfur Tuy nhiên đậu lại thiếu lysine Mặt khác lúa giàu lysine nhưng thiếu amino acid chứa sunfur Vì không thể lai giữa hai loài này với nhau, vì thế người trồng trọt truyền thống không thể phát triển loại đậu mới giàu lysine hay lúa giàu thành phần amino acid chứa sunfur

Chuyển gene cho phép trao đổi các gene giữa các sinh vật mà không hòa hợp giới tính Với kỹ thuật di truyền và chuyển gene có thể cho phép ta chuyển gene giữa vi khuẩn, động vật, thực vật và virus

Công cụ cơ bản trong chuyển gene là enzyme cắt giới hạn, được dùng để cắt DNA tại những vị trí đặc biệt, và các enzyme ligase mà xúc tác cho việc nối các đoạn DNA Sử dụng đúng enzyme cắt giới hạn có thể cắt được DNA plasmid vòng của vi khuẩn thành dạng thẳng Dùng ligase có thể gắn thêm đoạn DNA khác chứa gene quan tâm vào plasmid bị cắt Plasmid mới có thể được đưa vào vi khuẩn thông qua quá trình gọi là “xung điện” (electroporation), vi khuẩn có thể được dùng để chuyển gene chuyển vào (sinh vật đích) Nếu plasmid DNA được tích hợp vào trong genome của sinh vật nhận và gene chuyển được biểu hiện, cá thể đó được xem như đã được chuyển gene (transgenic)

I.2.2 Các phương pháp chuyển gene

Có nhiều phương pháp chuyển gene, nhưng bốn phương pháp đạt kết quả cao

nhất là: Chuyển gene thông qua Agrobacterium, bắn gene, vi tiêm, và chuyển trực tiếp

Mỗi phương pháp có ưu và nhược riêng và được sử dụng trong những trường hợp đặc

biệt Ở thời điểm này không có một phương pháp nào phù hợp cho tất cả các trường hợp

Chuyển gene thông qua Agrobacterium

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả năng nhận ra vết thương trên thực

vật, kích thích việc chuyển plasmid vi khuẩn vào thực vật Plasmid có khả năng tích hợp vào DNA tế bào chủ gây ra sự tăng trưởng không kiểm soát ở thực vật hình thành

bướu Khả năng này của A tumefaciens làm nó có vai trò quan trọng trong giai đoạn

sớm của chuyển gene

A tumefaciens là vector đầu tiên được dùng để chuyển gene lạ vào tế bào thực

vật, được dùng cho cả thực vật hai lá mầm và thực vật một lá mầm Một loại vi khuẩn

đất khác Agrobacterium rhizogenees, kích thích tạo rễ thứ cấp sau khi nhiễm cũng đã

được dùng cho chuyển gene thực vật

Cơ bản của phương pháp này dựa vào plasmid vi khuẩn có khả năng tích hợp

bộ gene cây chủ Phần quan trọng của plasmid là vùng đảm nhận trách nhiệm cho việc chuyển gene vào trong bộ gene thực vật Phần này gọi là DNA chuyển (T-DNA), và phần DNA này là phần chủ yếu gây tăng trưởng bướu của thực vật nhiễm Vùng này nằm giữa vai phải và vai trái của plasmid cho phép vi khuẩn chuyển gene mới vào trong thực vật nhận

Hình 1.13: Plasmid dùng trong chuyển gene đậu nành

Chuyển gene nhờ vi khuẩn A tumefaciens thường là sử dụng đĩa lá Đĩa lá có đường kýnh khoảng 6 mm được nuôi cấy trên đĩa môi trường chứa A tumefaciens

mang plasmid chứa gene chuyển Sau khoảng thời gian ủ khoảng một tháng trong môi

trường nuôi cấy mô, chồi bắt đầu phát triển trên đĩa lá Thông qua các phương pháp chọn lọc, chồi chuyển gene được xác định và được tái tạo thành cây hoàn chỉnh

Hình 1.14: Chuyển gene thông qua môi trường Agrobacterium tumefaciens

Bắn gene (biolistics)

Phương pháp bắn gene sớm được sử dụng nhiều ngay sau khi ra đời để chuyển gene vào cây ngũ cốc Phương pháp này dựa trên sự bắn các vi hạt (tungsten hoặc vàng) bọc DNA vào mô nhờ lực đẩy của không khí, khí helium hoặc dòng điện Christou và ctv (1991) là những tác giả đầu tiên nhận được cây chuyển gene từ phôi non của một số giống lúa qua sử dụng thiết bị bắn ACCELLR Sau đó, Cao và ctv (1992) thông báo việc tạo cây chuyển gene từ tế bào huyền phù nhờ thiết bị PDS1000/

He BiolisticTM Từ đó, phương pháp này được sử dụng phổ biến để tạo cây chuyển gene Phương pháp này có thể áp dụng trên bất cứ loại mô nào có khả năng tái sinh cây, không cần sử dụng tế bào trần và loại mô đã qua giai đoạn mô sẹo lâu dài do đó giảm thiểu được sự biến dị

Hình 1.15: Súng bắn gene được dùng trong chuyển gene

Phương pháp này có nhược điểm là chi phí cao và sự tích hợp vào cây chủ rất phức tạp cho nên nhiều nhóm nghiên cứu đã giảm thiểu sử dụng phương pháp này

Vi tiêm (Microinjection)

Phương pháp này được phát triển cho chuyển gene ở động vật nhưng cũng được

mở rộng cho thực vật Mặc dù rất khó và tốn nhiều công sức, sự vi tiêm DNA cũng đã đem lại nhiều kết quả dương tính và đã được dùng nhiều trong các phòng thí nghiệm

Hình 1.16: Chuyển gene thông qua vi

Trong kỹ thuật này, ống vi mao quản được dùng để đưa DNA trực tiếp vào tế bào Mỗi tế bào chuyển phải được thao tác riêng lẽ Một thuận lợi của phương pháp này là tối ưu hóa lượng DNA được đưa vào trong tế bào đích, giúp tối ưu khả năng tích hợp Kết quả dương tính đã thu được ở các loài như bắp, lúa mì, đậu nành, thuốc

lá, lúa và trong động vật như cá hồi, gia súc và heo

Chuyển gene trực tiếp

Chuyển gene trực tiếp đã được hoàn thành sớm sau phương pháp dùng

Agrobacterium Các phương pháp này dùng tế bào trần (protoplast) là tế bào đích cho

chuyển gene Phương pháp này đơn giản là thêm một lượng lớn plasmid chuyển gene vào môi trường nuôi cấy tế bào trần, đảm bảo rằng một lượng nhỏ tế bào trần sẽ bắt được plasmid Tỷ lệ tích hợp sẽ tăng lên khi dùng thêm polyethylene glycol (PEG) hay

sử dụng xung điện Không có rào cản thực sự nào đối với phương pháp này, do đó người ta cho rằng phương pháp này được sử dụng cho hầu hết các loài Vấn đề khó khăn là tái tạo lại toàn bộ cây trồng từ tế bào trần Vì thế phương pháp này không được dùng rộng rãi như các phương pháp khác

I.2.3 Những khó khăn trong chuyển gene

Nuôi cấy mô được xác định là trở ngại lớn nhất trong sự phát triển của sản phẩm cây chuyển gene Cần thiết phải có phương pháp để tái tạo lại toàn bộ cá thể từ tế bào hay mô được chuyển gene Một trong những khó khăn đối với các nhà khoa học là tính

lặp lại của công việc thông thường chỉ được một số chứ không được cho tất cả các loài Điều này giới hạn phổ cá thể có thể được chuyển gene Trong nhiều trường hợp, phải dùng phương pháp chuyển gene chuyển thông qua phương pháp lai truyền thống Một ví dụ cho trường hợp này là chuyển gene ở lúa mì Chuyển gene ở hầu hết lúa mì thì rất khó vì gặp khó khăn trong nuôi cấy mô Giống Bobwhite không nằm trong trường hợp trên, và phương pháp chuyển gene đã được phát triển cho giống lúa mì này Khi gene đã được chuyển thành công trong Bobwhite, nó có thể chuyển sang các giống khác thông qua lai giống truyền thống

Một khó khăn liên quan đến sử dụng nuôi cấy mô trong chuyển gene là các loại dòng tế bào soma Các cây trồng tạo ra trong nuôi cấy mô có tỉ lệ đột biến cao và xuất hiện những giống bất thường Điều này bởi tính nhạy cảm của tế bào trong nuôi cấy

mô Nhiều trường hợp, cây trồng nuôi cấy mô gặp vấn đề trong nuôi cấy tế bào chứ không từ sự tích hợp của gene chuyển

Các phương pháp chuyển gene gần đây hứa hẹn tạo ra cuộc cách mạng trong việc

chuyển gene vào cây trồng Một vài phương pháp đã được sử dụng trong Arabidopsis thaliana Một phương pháp là ngâm chồi trong dung dịch chứa plasmid mang gene

chuyển Một phương pháp khác, vẫn đang trong giai đoạn phát triển là chuyển gene

vào hạt thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mặc dù các phương pháp này

đã được sử dụng thành công trong Arabidopsis, nhưng vẫn chưa có công bố đối với

cây trồng Vấn đề mấu chốt của hai phương pháp này là sự chuyển gene không cần phải thực hiện tái tạo cây qua nuôi cấy mô Các phương pháp này thú vị bởi vì sự chuyển gene thực hiện trên hạt mà có thể trồng để xác định cá thể chuyển gene

I.2.4 Sản phẩm của kỹ thuật di truyền

Chuyển gene đã phát triển nhiều sản phẩm mới với nhiều tác động lên xã hội, từ thuốc tới thực phẩm với dinh dưỡng cao cấp Thành công thương mại lớn nhất của kỹ thuật di truyền là insulin trong vi khuẩn chuyển gene năm 1980 Sau đó nhiều sản phẩm khác cũng đã được công bố

Giống cây trồng được thương mại hóa đầu tiên là cà chua Flavr Savr, được phát triển bởi công ty Calgene, California Sản phẩm này được thương mại ngày 21 tháng 5 năm 1994, với hai gene mới được chuyển vào cây cà chua Gene thứ nhất là bản sao ngược của gene polygalactonurase (reverse copy of the polygalactonurase gene), mã hóa cho enzyme phá hủy cellulose Chuyển gene ở hình thức ngược, gọi là antisense,

tạo ra lượng enzyme polygalactonurase thấp Kết quả, những quả cà chua chín không mất đi sự cứng cáp của nó, bởi vì thành tế bào cà chua là cellulose không bị phân hủy nhanh chóng như cà chua thông thường Gene thứ hai được chuyển vào giống Flavr Savr mã hóa cho tính kháng với kháng sinh kanamycin Gene này được chuyển vào cây như chỉ thị (marker) cho nhận biết cây chuyển gene

Bảng sau bao gồm danh sách các cây trồng chuyển gene Các tính trạng phần lớn

là kháng thuốc trừ cỏ, kháng côn trùng, và chất lượng dinh dưỡng

Bảng 1.1: Một số loài sinh vật đã được chuyển gene

Cây khuynh diệp Thuốc lá Heo

Khoai tây Củ cải đường

I.2.5 Tiềm năng của chuyển gene

Mục đích của phát triển giống thông qua công nghệ sinh học cũng giống như cải thiện theo di truyền cổ điển Tất cả các tính trạng mong muốn được cải thiện năng suất, tăng sức sống, kháng côn trùng, và chất lượng dinh dưỡng Tuy nhiên, công nghệ sinh học còn cho phép phát triển giống với những tính trạng mà không thể phát triển qua lai giống cổ điển

Ví dụ:

Trường hợp giống lúa giàu lysine và đậu nành giàu amino acid sunfur được đề cập ở phần trên

I.2.5.1 Các chức năng mới được thêm vào trong cải biến di truyền thực vật

Thay đổi hình dạng của enzyme (Altered Forms of Enzymes)

Chuyển gene mã hóa cho enzyme có cấu trúc được bổ sung làm nó không nhạy cảm với điều kiện hóa chất và môi trường Ví dụ, gene mã hóa cho enzyme EPSP (5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase) biến đổi cấu trúc đem lại tính kháng thuốc diệt cỏ glyphosate