Thao tác kỹ thuật trên saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

Thao tác kỹ thuật trên saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊN MEN RƢỢU

SVTH: TRẦN TRƯỜNG LUÂN

TP HCM, 07/2010

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự chân thành, tôi xin gởi lời cảm ơn đến:

 Thạc sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công Nghệ Sinh Học-Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã tận tình hướng dẫn và chia sẽ kinh nghiệm qúy báu, luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án chuyên ngành

 Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt những kiến thức

bổ ích giúp tôi có những bước đi rõ ràng để hoàn thành đề tài

 Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùng chia sẽ, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài 1

1.2.Mục đích nghiên cứu 1

1.3.Nhiệm vụ của đề tài 2

1.4.Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 2: TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG 4

KHÁI QUÁT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VÀ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 4

2.1.Khái quát chung về công nghệ sản xuất rượu vang 4

2.1.1.Lịch sử sản xuất rượu vang 4

2.1.2.Sơ đồ quy trình công nghệ sản suất rượu vang trắng và vang đỏ: 5

2.1.3 Một số công đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang 6

2.1.4 Nguyên liệu sản xuất rượu vang 8

2.2.Tổng quan nấm men 8

2.2.1 Tăng trưởng ,dinh dưỡng 9

2.2.2 Sinh thái 10

2.2.3 Sinh sản: 10

2.2.4 Ứng dụng: 10

2.3 Nấm men Saccharomyces Cerevisiae 11

2.3.1 Đặc điểm sinh thái, thành phần cấu tạo, sinh trưởng và phát triển ở Saccharomyces cerevisiae 11

2.3.2 Một số chủng Saccharomyces: 18

2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu 20

2.5.Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rượu 24

2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ : 24

2.5.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men và tác động của các acid lên sự thay đổi pH 27

2.5.3 Ảnh hưởng của SO2: 31

2.5.4 Ảnh hưởng nguồn Carbon 33

2.5.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ: 34

2.5.6 Ảnh hưởng của nồng độ đường ( ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu) 35

2.5.7 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae 36

2.5.8 Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng 38

2.5.9 Ảnh hưởng của sục khí 38

CHƯƠNG 3: TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT 40

TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN GEN HSP26 VÀ YHR087W LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 40

3.1 Tổng quan về HSP26 và YHR087W và giá trị thực tiễn đối với quá trình lên men rượu 40

3.1.1 Tổng quan và chức năng HSP26,ý nghĩa đối với quá trình lên men rượu 40

3.1.2 Tổng quan và chức năng YHR087W,ý nghĩa đối với quá trình lên men rượu 43

3.1.3 Cơ chế biểu hiện của HSP26 và phương pháp nghiên cứu trên HSP26 và YHR087W 44

3.1.4 Phương pháp nghiên cứu trên gen HSP26 và YHR087W 45

3.2 Kết quả của thao tác gen tác động lên mức độ biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W 47

3.2.1.Minh chứng sự biểu hiện của HSP26 dưới các điều kiện tác động nhiệt 47

3.2.2 Ảnh hưởng của việc đưa gen HSP26 và YHR087W thành một plasmid multicopy dưới sự kiểm soát của promoter của chúng 49

3.2.3 Hiệu quả của việc đưa gen HSP26 và YHR087W vào một centromeric plasmid dưới sự kiểm soát của promoter nó 50

3.2.4 Ảnh hưởng của sự thay thế promoter HSP26 hoặc YHR087W bằng promoter của gen SPI1 52

3.2.5 Ảnh hưởng của thay thế các promoter YHR087W bởi promoter của gen PGK1 bởi một trong những bản sao di truyền của nó 53

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 54

4.1.Bàn luận 54

4.2 Hướng phát triển 55

4.2.1 Phát triển dựa trên các phương pháp kiểm soát tối ưu điều kiện lên men 55

4.2.2 Phát triển dựa trên việc cải tiến hệ gen của chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae 56

Tài liệu tham khảo: 57

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

TCA: TriCarboxylic Acid cycle (chu trình acid citric)

EMP: Embden-Meyerhof Pathway (chu trình chuyển hóa Glucose thành pyruvate) Chaperone: khả năng gấp cuộn của protein trước điều kiện tác động nhiệt

sHSPs: small Heat Shock Proteins : Nhóm gen chịu điều kiện shock nhiệt

Marker: gen hoặc 1 đoạn DNA với 1 điểm nhận biết trên Nhiễm sắc thể dùng để định danh các tế bào

Episomal plasmid: Chứa điểm khởi đầu sao chép, cần thiết cho quá trình phiên mã của gen nằm trong plasmid

Centromeric plasmid: Chứa centromere đóng vai trò trong quá trình nhân đôi, phân chia của gen trong plasmid

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang trắng và vang đỏ[8] 5

Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida, C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31] 9

Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi [31] 11

Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S cerevisiae cố định dưới kính hiển vi điện tử)[26] 11

Hình 2.3.3: Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [8] 15

Hình 2.3.4: Quá trình sinh trưởng của tế bào chồi con nấm men[8] 16

Hình 2.3.5: Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở nấm men (Sharma,1998) 17

Hình 2.3.6: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces cerevisiae (Sharma, 1998) 18

Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [1] 21

Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hóa glucose thành ethanol [31] 22

Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào[28] 24

Hình 2.5.2: Sự sinh trưởng của nấm men S cerevisiea S228C trong môi trường YPD [19] 27

Hình 2.5.3: Những sự thay đổi trong mức độ lên men tối đa [10] 28

Hình 2.5.4: Những minh chứng của cho sự thay đổi pH trong quá trình lên men[10] 30 Hình 2.5.5: Một số acid có mặt trong nội bào trong suốt quá trình lên men của hèm nho ở 25oC [10] 30

Hình 2.5.6: Sự thay đổi pH tại các nồng độ acid hữu cơ khác nhau [10] 31

Hình 2.5.7: Ảnh hưởng của SO2 lên ethanol và acetaldehyde [9] 32

Hình 2.5.8: Ảnh hưởng của SO2 lên acid malic và acid lactic [9] 33

Hình 2.5.9: Sự giảm glucose, ethanol, và nồng độ glycerol cũng như là sự phát triển của nấm men dưới những điều kiện khác nhau về nồng độ glucose [12] 37 Hình 3.1.1: Cấu trúc của HSP26 [23] 41 Hình 3.1.3: Mô hình cấu trúc không gian của gen HSP26 [24] 42 Hình 3.1.4: Vị trí, kích thước của YHR087W trên Nhiễm sắc thể VIII của nấm men

S.cerevisiae[30,31] 43

Hình 3.1.5: Cấu trúc không gian của YHR087W [30] 44 Hình 3.1.6: Mẫu thể hiện cơ chế của chaperone dưới sự kiểm soát nhiệt độ của sHsp [25] 45 Hình 3.1.7: Cơ chế nhân số lượng bản sao của gen HSP26 [22] 46 Hình 3.1.8: Sơ đồ sự hình thành các chủng ICV16 (ICV27)-PPGK1-YHR087W [22] 47 Hình.3.2.1: Hsp26 biểu hiện trong các chủng khác nhau trước và sau khi sốc nhiệt [17] 48 Hình 3.2.2: Ảnh hưởng của việc gắn gen HSP26 và YHR087W vào plasmid YEp352 trên gen biểu hiện và kháng stress [22] 49 Hình 3.2.3 : Tác động của việc gắn HSP26 và YHR087W vào centromeric plasmid pRS316 lên chung ICV27 biểu hiện gen, stress thẩm thấu và khả năng lên men [22] 51 Hình 3.2.4: Sự thay thế thích hợp promoter của gen HSP26 và YHR087W trên chủng ICV16 và ICV27 bằng promoter SPI1 [22] 52 Hình 3.2.5: Sự thay thế thích hợp promoter của HSP26 và YHR087W bằng PGK1 trên

cả hai chủng ICV16 và ICV27 [22] 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô[8]

12

Bảng 2.2: Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[8] 12

Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1] 19

Bảng 2.4: Tác động điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28] 25

Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rượu trên chủng Saccharomyces cerevisiae 26

Bảng 2.6: Thông số động lực học và pH kết thúc quá trình lên men với những pH ban đầu khác nhau trong môi trường có sự thiếu hụt hoặc hiện diện của acid tartaric 29

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của một số acid lên sự sự sinh trưởng của nấm men 30

Bảng 2.8: Các thông số đánh giá trong quá trình lên men với thành phần môi trường lên men chứa 20% glucose và các nguồn Nito ban đầu khác nhau[20] 35

Bảng 2.9: Tác động của glucose lên một số yếu tố trong quá trình lên men[12] 36

Bảng 3.1: Vị trí , thành phần nucleotide và acid amin cấu tạo của HSP26 [29] 41

Bảng 3.2: Vị trí, thành phần nucleotide, acid amin cấu tạo YHR087W [30] 43

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài

Các cuộc cách mạng sinh học phân tử đã mang lại những ý nghĩa mới lạ, tiến bộ

với các ứng dụng vào lên men và lưu trữ rượu Những nghiên cứu trên một số chủng

nấm men đã cung cấp những thông tin về môi trường nuôi cấy và mật độ vi sinh vật

có trong rượu Đồng thời cho thấy môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào phương pháp

sinh học phân tử điều này trở thành những thông tin có giá trị trong công nghệ sản xuất

rượu Những đoạn gen có giá trị cung cấp những cơ hội hiểu biết và khai thác ứng

dụng vi sinh trong sản xuất rượu cũng như là tìm ra chìa khóa của các nhân tố gen đây

là cơ sở phát triển giá trị thương phẩm hoặc hạ giá thành của rượu[8]

Những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử đã thay đổi quan điểm của các nhà

khoa học về việc đánh giá hệ vi sinh có trong rượu.Tạo nên cái nhìn mới về tính phức

tạp trong các phản ứng chuyển đổi từ các loại trái cây đến rượu vang mang đậm mùi vị

đặc trưng [8]

Công nghệ sản xuất rượu đã và đang là một công nghệ chuyên nghiệp lâu đời ở

nhiều nước trên thế giới Phương pháp truyền thống là dựa vào kinh nghiệm và kỹ

thuật thủ công Nhưng ngày nay, những thiết bị tự động hoá đang dần thay thế và đồng

thời kiểm soát được chất lượng cũng như cải thiện được vấn đề vệ sinh trong quá trình

sản xuất

Rượu đại diện cho lịch sử ,nền văn hóa của một dân tộc Ngày này người dùng

không chỉ quan tâm đến sự đa dạng của các loại rượu mà còn về chất lượng của sản

phẩm.Do đó việc cải thiện những kỹ thuật lên men trong quá trình sản xuất là yếu tố

quan mà nhà sản xuất hướng đến [1]

Việc cải thiện chất lượng,khả năng sinh tổng hợp lượng,loại bỏ chất độc hại,bổ

sung tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong rượu là những yêu cầu cấp thiết đối với

công nghệ sản xuất rượu hiện nay[1]

1.2.Mục đích nghiên cứu

Việc tối ưu quá trình lên men tạo ra hàm lượng ethanol cao trở thành một yếu tố

quan trọng trong kỹ thuật hiện đại Đã có rất nhiều nghiên cứu về những thay đổi kỹ

thuật trong quá trình lên men như pH, nhiệt độ, nồng độ đường…Hiện nay với những

kỹ thuật tiên tiến về sinh học phân tử các nhà nghiên cứu đã không chỉ thay đổi những

yếu tố kỹ thuật truyền thống như trên mà còn tác động đến bộ gen của chủng vi sinh sử

dụng lên men rượu thông qua những kỹ thuật di truyền

Nghiên cứu này chỉ ra hướng đi quan trong trong công nghiệp sản xuất rượu hiện

nay Đầu tiên là sự tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng lên quá trình lên men của

Saccharomyces cerevisiae đã giúp chất lượng rượu ngày càng trở nên hoàn hảo,

không những về chất lượng rượu mà còn tận dụng tối đa được nguồn nguyên liệu, tăng

khả năng đáp ứng của nấm men dưới các điều kiện stress nhằm tạo ra lượng ethanol là

lớn nhất trong quá trình lên men rượu

Bên cạnh đó, nghiên cứu này mở ra một hướng đi mới trong công nghệ sản xuất

rượu.Thay đổi xu hướng tác động kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men, thay

vào đó là tác động lên hệ gen của chủng vi sinh Những tác động kỹ thuật ảnh hưởng

tới giá trị cảm quan, chất lượng của rượu vang thành phẩm và thao tác kỹ thuật gen

trên 2 gen HSP26 và YHR087W nằm trong hệ gen của Saccharomyces cerevisiae đã

tăng lượng ethanol lên đến 10% so với thông thường Điều này đã chứng minh tầm

quan trọng của những thao tác kỹ thuật gen lên quá trình tối ưu lượng ethanol sinh ra

cũng như là chất lượng rượu thành phẩm

1.3.Nhiệm vụ của đề tài

Tổng quan về chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae giống nấm men được

ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men rượu hiện nay Làm rõ những đặc điểm

sinh lý,di truyền,hệ gen các yếu tố tác động

Nghiên cứu các ảnh hưởng kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men rượu bao

gồm:pH ,nhiệt độ, hàm lượng đường,độ thẩm thấu, lượng ethanol sinh ra…Từ đó có

thể ứng dụng sản xuất để có chất lượng rượu phù hợp

Nghiên cứu kỹ thuật gen thao tác trên gen HSP26 và YHR087W của

Saccharomyces cerevisiae Cơ chế hoạt động sinh tổng hợp trong quá trình lên men

Thao tác kỹ thuật nâng cao hàm lượng ethanol Đánh giá kết quả mang lại qua các

nghiên cứu trên thế giới

1.4.Ý nghĩa thực tiễn

Những tác động kỹ thuật trong quá trình lên men rượu đã nâng cao chất lượng

rượu thành phẩm Đồng thời, giảm thiểu chi phí cho quá trình sản xuất, mang lại hiệu

quả kinh tế và giá trị lợi nhuận cho nhà sản xuất Ngoài những thay đổi về tác động kỹ

thuật truyền thống thường dùng có thể dùng những thao tác trên kỹ thuật di truyền để

tạo ra những giống nấm men có khả năng tạo ra lượng ethanol lớn hơn so với chủng

thông thường

Thông qua những tác động lên chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm

giúp tạo nên một cơ sở dữ liệu về những điều kiện tác động kỹ thuật, về hệ gen và khả

năng thích ứng các yêu cầu trong công nghiệp sản xuất rượu của nấm men Cũng như,

tìm cách giải quyết những khó khăn trong việc loại bỏ các độc tố, hợp chất hữu cơ,

acid hữu cơ có thể gây hại hoặc ảnh hưởng đến chất lượng rượu trong quá trình sản

xuất

CHƯƠNG 2: TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG

KHÁI QUÁT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VÀ TÁC ĐỘNG CỦA

CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU

2.1.Khái quát chung về công nghệ sản xuất rượu vang

2.1.1.Lịch sử sản xuất rượu vang

Lịch sự ra đời của rượu vang đã đồng hành cùng lịch sử nhân loại.Các nhà

khảo cổ cho rằng,rượu vang có xuất xứ từ khu vực Capcazo và Trung Đông khoảng

8000 năm về trước Các di khảo cổ tại Ai Cập cho thấy rằng rượu vang đã có mặt ở

đây từ 5000 trước công nguyên.Khoảng 2000 năm trước công nguyên sản xuất rượu

vang du nhập tới Hy Lạp và sau đó được truyền đi khắp Địa Trung Hải Vào thế kỷ

XVI ,các nhà thám hiểm Châu Âu đã mang tới Châu Mỹ Năm 1530 Người Tây

Ban Nha xâm chiếm Trung và Nam Mỹ bắt đầu trồng nho ở Mexico,Argentina…

Đến năm 1813 nghề trồng nho đã lớn mạnh ở tất cả những nơi mà thực dân Châu

Âu đặt chân tới.Tại Bắc Mỹ ,khoảng giữa thế kỷ XIX nghề trồng nho và làm rượu

thức sự mới phát triển[1,7]

Ngày nay trồng nho và sản xuất rượu vang đã trở thành một phần không thể

thiếu trong văn hóa và kinh tế nhân loại.Hằng năm có 26 tỷ lít rượu vang được sản

xuất ra[1]

Rượu vang được làm từ các loại nho nguyên chất và được lên men một cách tự

nhiên Vì nho vốn có hai đặc tính tự nhiên là đường và men nên nước nho được ép

ra, trải qua một quy chình chế biến sẽ trở thành rượu vang.Rượu vang là một sản

phẩm của quy trình tinh xảo mà khởi đầu bằng việc quyết định thởi điểm thích hợp

nhất để hái nho.Tất cả các quy trình để làm rượu vang cơ bản đều giống nhau từ lúc

hái cho đến khi đóng chai

Nguyên lý làm rượu vang cũng rất đơn giản ,tuy nhiên việc xủ lý nho, lên men

rượu van để tạo hương vị mong muốn là cả một nghệ thuật.Trong quá trình sản xuất

các nhà nấu rượu cần đối các yếu tố giữa những mùi hương dễ chịu với những mùi

khó chịu Nồng độ rượu và acid cũng cần được điều tiết ,nếu cid vượt quá rượu sẽ

có vị chua,nếu nhiều cồn quá rượu sẽ sốc Tác nhân quan trọng nhất trong sản xuất

rượu vạng là chủng vi sinh và chất lượng nho Nguyên liệu chính sẽ quyết định

hương vị , nồng độ cồn, độ chưa, màu sắc của thành phẩm Vang trắng, nho được

nghiền dịch quả và tách khỏi lớp vỏ trước khi lên men Vang đỏ lên men cùng vỏ

Chất màu đỏ (anthocyanin)và một số chất khác từ vỏ quả được chiết tách trong quá

trình lên men và tạo thành màu đỏ cùng hương vị đặc trưng của vang đỏ Vang hồng

có màu sắc hồng nhạt đƣợc làm từ nho đỏ theo công thức của lên men vang

trắng(không lên men cùng vỏ) Lƣợng chất màu đƣợc chiết ra trong quá trình ép

quả tạo màu cho rƣợu[1,7]

2.1.2.Sơ đồ quy trình công nghệ sản suất rƣợu vang trắng và vang đỏ:

Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rƣợu vang trắng và vang đỏ[8]

2.1.3 Một số công đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang

2.1.3.1.Thời điểm gặt hái nho:

Khi nho chín thì độ acid sẽ giảm xuống và lượng đường sẽ tăng lên Thời

điểm thích hợp để gặt hái nho là vào tháng 8 đối với Vang nổ (Sparkling Wines)

vào tháng 10 đối với rượu đỏ Các nghệ nhân sẽ quyết định thời điểm gặt hái nho,

nhằm đạt lượng acid và lượng đường như mong muốn để chế biến theo khẩu vị

riêng của mình Thời điểm các trang trại gặt hái nho cũng được thể hiện rõ trên

nhãn của các loại rượu vang Để làm rượu vang nổ thì nho sẽ được hái khi độ

acid đạt khoảng 1% và 19o Brix (Brix là đơn vị đo lượng đường còn lại trên nho,

nhân đơn vị Brix với 0,55 thì sẽ được nồng độ cồn) Để làm rượu vang đỏ, nho sẽ

đựơc hái khi đạt gần được khoảng 0,8% độ acid và 22o

Brix (e có biết tại sao o,

vị của 2 loại rượu này khác nhau ntn?) Phần lớn các loại nho dùng để làm rượu

vang trắng và đỏ khi được gặt hái thì sẽ đạt khoảng 0,65% độ acid và 23o Brix

Điều kiện trên là tiêu chuẩn cơ bản để quyết định thời điểm thích hợp nhất khi

gặt hái nho Phần lớn các nghệ nhân làm rượu vang quyết định thời điểm gặt hái

nho bằng thông qua việc đánh giá màu sắc nho và nếm quả nho [1]

2.1.3.2.Quy trình chiết dịch nho:

Bước đầu tiên là lấy nước từ những quả nho Quy trình này được thực hiện

qua hệ thống Vắt và Tước cuống Hệ thống này sẽ tước các cuống từ những

chùm nho và vắt nước ra khỏi vỏ nho Nước này được gọi là nước chất lượng 1

Để làm ra vang trắng thì nước chất lượng 1 này sẽ được đưa qua hệ thống ép và

sau đó được đưa vào bồn lên men Để làm ra rượu đỏ thì nước chất lượng 1 sẽ

được đưa trực tiếp đến bồn lên men rồi sau đó đưa qua hệ thống ép

2.1.3.3.Quy trình lên men:

Phần lớn hệ thống lên men rượu trên thế giới đều sử dụng phương pháp

truyền thống Phương pháp lên men truyền thống này đã chứng minh được hiệu

quả cao và ổn định vì vậy rất ít nghệ nhân ứng dụng những phương pháp

khác.Trong quy trình lên men, có một yếu tố rất quan trọng mà các nghệ nhân

chú tâm đạt tới đó là nhiệt độ Khi lên men với nhiệt độ (7oC đến 12o C) thì

hương thơm của nho được bảo quản tuyệt đối Với nhiệt độ (25o

đến 35o C) sẽ đạt được hương vị của hoa nhiều hơn là hương vị của quả Trong quá trình lên

men để làm rượu vang trắng và vang nổ thì nhiệt độ lý tưởng nhất là 10o

C và cho vang đỏ là 30oC.Thời gian lên men keos dài từ 8-10 ngày[1,8,3]

2.1.3.4.Quy trình ép:

Hơn một nửa lượng nước ép ra từ quả nho một cách dễ dàng không cần đến

áp lực cao Phần còn lại sẽ được ép ra từ hệ thống ép Để làm rượu vang trắng

nho sẽ được ép trước sau đó đưa lên hệ thống lên men Còn rượu vang đỏ thì

ngược lại, được đưa lên hệ thống lên men trước khi đưa vào hệ thống ép.Phần bã

sẽ được đêm ép để tận thu các chất chiết còn sót lại trong quá trình lên men[1,3]

2.1.3.5.Quy trình ủ:

Để rượu đạt được sự hài hòa và ổn định của mùi vị và chất lượng thì rượu

phải được ủ nhằm làm cho khí ôxi tác động thật chậm.Rượu vang ủ lạnh sẽ phải

ủ lâu hơn rượu vang ủ ấm.Rượu vang ủ trong bồn thép lớn sẽ phải ủ lâu hơn rượu

vang để trong các bồn hoặc trong các thùng bằng gỗ Thời gian là yếu tố quan

trọng trong quy trình ủ Thông thường rượu vang được ủ trong khoảng 3 đến 6

tháng hoặc 2 đến 3 năm Nhiệt độ ủ rượu thường từ 8-18oC Trong giai đoạn này

rượu được tách bỏ cặn và châm thêm rượu vang định kỳ vào thiết bị ủ để giảm

khoảng không gian ở bề mặt lên men[3]

2.1.3.6.Quy trình lọc và làm mịn:

Để đạt được mầu tinh khiết cho rượu ở giai đoạn cuối cần đưa hệ thống lọc

và làm mịn vào dây chuyền sản xuất.Hệ thống lọc sẽ làm cho nước nho trong

hơn Rượu sau khi được lọc sẽ được chuyển qua bồn chứa sạch khác và quy trình

lọc sẽ được thực hiện vài ba lần trong 6 tháng cho đến 3 năm trong quy trình làm

rượu vang Hệ thống làm mịn sẽ lọc được các phần tử nhỏ nhất để rượu đạt được

mầu trong suốt

2.1.3.7.Phương pháp pha trộn:

Pha trộn là một nghệ thuật tâm đắc nhất của công nghệ sản xuất rượu Pha

trộn có thể mang đến những sản phẩm có đặc thù riêng và chất lượng rất ổn định

Các nghệ nhân có thể pha trộn theo các phương thức sau đây:

- Hai hoặc nhiều giống nho chính trong cùng một nông trại nho

- Cùng một giống nho chính từ nhiều nông trại nho khác nhau

- Hai hoặc nhiều giống nho chính từ hai hoặc nhiều nông trại nho khác nhau

- Nho từ các năm gặt hái khác nhau

-Và những phương pháp khác pha trộn khác.Việc pha trộn được thực hiện vào

thời điểm giữa hai quy trình lên men và vô chai

2.1.3.8.Quy trình vô chai:

Quy trình vô chai không phức tạp nhưng đòi hỏi sự thận trọng để tránh sự

ôxy hoá Vệ sinh là yếu tố tất yếu để tránh nhiễm vi khuẩn chua và mọi vi khuẩn

khác có hại đến con người

2.1.4 Nguyên liệu sản xuất rượu vang

Nguyên liệu trong công nghiệp sản xuất rượu vang thường có khá nhiều chủng

loại khác nhau như: nho, dâu tằm, các loại trái cây…Nhưng loại phổ biến và được

sử dụng phổ biến nhất hiện nay là nho

Các loại nguyên liệu trong sản xuất cần đạt độ chín về sinh lý nhằm thu được

dịch quả có hàm lượng acid thấp,hàm lượng đường cao.Ngoài ra còn có một số chỉ

tiêu về hình dáng,đặc điểm,các chỉ tiêu về an toàn chất lượng thực phẩm nhằm

mang lại vang thương phẩm có giá trị Thành phần hóa học của nguyên liệu:

Nước: chiếm tỷ lệ rất cao trung bình 80-90% ,nước chủ yếu tồn tại ở dạng tự

do ,trong dịch tế bào ,chất nguyên sinh và gian bào.Ở màng tế bào nước liên kết với

hemicellulase và cellulase.Lượng nước phân bố không đồng đều giữa các mô

Đường :tồn tại chủ yếu ở dạng D-glucose ,D-fructose và saccharose Glucose

còn ở dạng liên kết trong phân tử của saccharose ,tinh bột ,cellulase

Ngoài hai thành phần trên, trong nho còn chứa các thành phần khác như: các

acid hữu cơ(bao gồm có malic, tartaric, citric,cetonic…), hợp chất màu(

anthocyanes và flavones), phenol, tanin, polyphenol ngưng tụ, hợp chất chứa nito…

2.2.Tổng quan nấm men

Nấm men thường có hình dạng khác nhau Thường chúng có hình cầu, hình ellip,

hình bầu dục và cả hình dài Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau

thành những sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pserdomycelium) Hình

dạng của nấm men hầu như không ổn định Nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và

phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy[2]

Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ

5-10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình của tế bào nấm men như sau: chiều dài

9-10µ, chiều rộng 2-7µ Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi

cấy, theo tuổi sinh lý[2]

Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida,

C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31]

Nấm men là sinh vật nhân chuẩn, có khoảng 1500 loài khác nhau đã được phát

hiện trên thế giới Hầu hết chúng sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi Mặc dù có một

vài loài sinh sản bằng cách phân đôi Nấm men là sinh vật đơn bào, một số loài có thể

tạo cơ thể đa bào,kích thước khác nhau tùy thuộc loài thông thường chúng có kích

thước từ 3-4µm.Có những loài có kích thước đến 40µm

Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp sản xuất bánh mì và thức uống có cồn Saccharomyces cerevisiae được dùng

trong phòng thí nghiệm và giữ vai trò quan trọng trong trong nghiên cứu vi sinh tế bào,

tìm hiểu những thông tin về tế bào để phục vụ cho những nghiên cứu của con người

Các loài nấm men, như Candida albicans là tác nhân gây bệnh và có thể gây nhiễm

trùng ở người Gần đây một số loài nấm men đã được sử dụng trong các phản ứng sinh

học tao ra nguồn nhiên liệu sinh học, sản xuất ethanol cho các ngành công nghiệp

2.2.1 Tăng trưởng ,dinh dưỡng

Nấm men là sinh vật tự dưỡng chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như là

nguồn năng lượng chính và không cần có ánh sáng mặt trời Nguồn carbon chính

được nhận chủ yếu từ các từ hexose như glucose và frutose hoặc từ disaccharide

như sucrose và maltose Một vài loài có thể chuyển hóa đường pentose, cồn và các

acid hữu cơ Nấm men phát triển tốt nhất trên môi trường pH trung tính hoặc hơi

chua Nhiệt độ phát triển của nấm men cũng hoàn toàn khác nhau Leucosporidium

frigidum phát triển ở -2đến 20°C(28-68°F) Saccharomyces telluris phát triển từ

5-35°C(41-95°F) và Candida slooffi ở 28-45 °C(82-113°F) Các tế bào có thể sống

trong điều kiện đóng băng trong ở điều kiện nhất định, với khả năng sống sót giảm

theo thời gian đóng băng

2.2.2 Sinh thái

Nấm men là rất phổ biến trong môi trường Ví dụ như nấm men xuất hiện

trong tự nhiên trên vỏ của trái cây và quả (như nho, táo hay đào), và dịch tiết từ thực

vật Một số nấm men được tìm thấy ở trong đất và côn trùng Các chức năng sinh

thái và đa dạng sinh học của nấm men là tương đối không rõ So với các vi sinh vật

khác Nấm men bao gồm Candida albicans, Rubra rhodotorula, Torulopsis và

Cutaneum trichosporon được tìm thấy ở môi trường quanh con người hoặc trên vỏ

thực vật Nấm men cũng có mặt trong các thực vật đường ruột của động vật có vú

và một số loài côn trùng

2.2.3 Sinh sản:

Nấm men sinh sản vô tính hoặc hữu tính Hình thức thường gặp là sinh sản vô

tính bằng phương pháp nảy chồi Chúng gồm những chồi nhỏ,hoặc tế bào con được

hình thành từ các tế bào mẹ Tế bào mẹ tạo các nhân và truyền vật chất di truyền

qua cho các tế bào con Các chồi con tiếp tục phát triển cho đến khi tách khỏi tế bào

mẹ, hình thành tế bào mới.Một số nấm men sinh sản theo cách tách đôi thay vì tạo

chồi

2.2.4 Ứng dụng:

Nấm men được ứng dụng rộng rãi trong khá nhiều lĩnh vực Trong đó, quá

trình lên mên bằng phương pháp công nghệ sinh học tạo ra các sản phẩm đặc

trưng,chi phí thấp được quan tâm nhiều nhất

Các loại nấm men được ứng dụng vào công nghiệp sản xuất đồ uống có cồn

như bia ,rượu…Công nghệ sản xuất thực phẩm:bánh mì với khá nhiều sản phẩm đa

dạng phong phú Công nghệ sản xuất nguồn nhiên liệu (bioethanol)…Ngày nay còn

hướng đến lĩnh vực đồ uống không cồn, probiotic, thực phẩm chức năng đem lại

nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao

2.3 Nấm men Saccharomyces Cerevisiae

2.3.1 Đặc điểm sinh thái, thành phần cấu tạo, sinh trưởng và phát triển ở

Saccharomyces cerevisiae

Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng

phương pháp tạo chồi [31]

Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S cerevisiae cố định dưới kính hiển vi điện tử

( độ phóng đại: A:500X, B:1000X, C: 2000X)[26]

Saccharomyces cerevisiae thuộc:

 Bộ: Endomycetales

 Họ: Saccharomycetaceae

Saccharomyces có khoảng 40 loài (Van Der Walt, 1970) và các loài trong

giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia,

rượu Chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn

hoa Nấm men có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6 - 8 µm x 5 - 6 µm,

vỏ tế bào cấu tạo bởi carbohydrat, lipid, protein dầy khoảng 0,5 µm, màng tế bào

chất, tế bào chất và nhân đã được trình bày chung ở phần “Tế bào vi sinh vật chân

hạch”

S cerevisiae thường có cấu tạo hình elip, đường kính lớn từ 5-10nm và đường

kính nhỏ từ 1-7nm, tế bào gia tăng kích thước theo độ tuổi thể tích tế bào đơn bội là

29 mm3 và tế bào lưỡng bội là 55 mm3 Các tế bào của nấm men mang cấu trúc và

chức năng của eukaryote bậc cao, được sử dụng như là một mô hình hữu ích đại

diện cho các tế bào eukarylote Các thành phần cấu trúc và hóa học của tế bào được

được minh họa theo bảng 2.1 và bảng 2.2

Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông

khô[8]

Thành phần trong cấu trúc

Phần trăm khối lương khô

Từ những thành phần trên Rosen đã cho rằng nấm men có sự hình thành cấu

trúc của C4.02H6.5O2.11N0.43P0.03 Các phân tử carbonhydrate là thành phần cấu trúc:

thành tế bào và các hợp chất liên quan đến nguồn dinh dưỡng dự trữ, khả năng

kháng stress, như là glycogen và trehalose Khoảng 75-80% tế bào nấm men là

nước

Vách ngăn bao phủ tế bào chất (plasmalemma) chiếm khoảng 15-25% trên

tổng khối lượng tế vào Thành tế bào nấm men có cấu thay đổi tùy biến phù hợp với

các điều kiện ngoại cảnh và ở các giai đoạn khác nhau của chu kì sống Tùy theo

cấu trúc và điều kiện tăng trưởng và quá trình trao đổi chất, thành tế bào chứa

những enzyme có khả năng tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển các phân tử

vào trong tế bào chất Khoảng không gian giữa màng trong và màng ngoài

(periplasme) của thành tế bào từ 25-45A

Các tế bào S cerevisiae chứa 1 lượng chitin rất nhỏ ( khoảng 1% khối lượng

khô) tập trung nhiều nhất tại các điểm nảy chồi, nơi đóng vai trò quan trọng trong

sự phân bào( khi chồi vừa chớm nở) Trong nấm men mạng lưới các sợi

1,3-β-glucan chiếm tới 40% khối lượng khô của vách tế bào, có ảnh hưởng chính đến cơ

chế cân bằng của vách tế bào 1,3-β-glucan được tổng hợp tại bề mặt của tế bào và

chứa những chuỗi hẹp trung bình khoảng 1500 đơn vị glucose 1,3-β-glucan có cấu

trúc sợi và vô định hình Sự hình thành này chỉ ra khả năng giữ vững hình dạng và

cấu trúc vững chắc của vách tế bào cũng như tính đàn hồi Các sợi glucan không tan

trong nước, kiềm và acid acetic trong khi đó phần vô định hình hòa tan trong nước

và acid những không hòa tan trong kiềm Hai polysacharide khác nhau,1,6-β-glucan

và chitin đã được liên kết với 1,3-β-glucan và có những chức năng khác vượt trội

hơn là chỉ ổn định hình dạng và tính bền vững cho vách tế bào

Một lượng nhỏ lipid và phophate vô cơ là thành phần trong mạng lưới vách tế

bào Lượng lipid chứa trong S cerevisiae chứa khoảng 2-15% Đối với tế bào khỏe

mạnh bề mặt tế bào mang lưới có điện tích âm, được cho rằng các chuỗi phosphate

nằm trên lớp mannoprotein ngoài Bề mặt tế bào có cấu trúc kị nước , các liên kết

trên lớp màng chủ yếu là lipid, nằm trên lớp vách ngoài phức tạp

Những tác động của pH thấp, hàm lượng đường cao và khả năng chịu áp suất

thẩm thấu của tế bào là những yếu tố đánh giá cho màng tế bào Khi nấm men làm

quen với môi trường chứa áp suất thẩm thấu cao thì kết quả mang lại sau quá trình

lên men là nông độ ethanol từ 12-15% khi đó lại trở thành tác nhân có hại cho nấm

men Ngoài ra sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng cũng gây ra những biến động đáng

kể cho sự sinh trưởng của nấm men Do đó phải cân nhắc trong các phương pháp và

kỹ thuật lên men

Lipid màng gồm phopholipid và sterol, và mang tính kỵ nước Các

phospholipid chính là phosphotidylinositol, phosphotidylserine,

phosphotidylcholine và phosphotidylethanolamine, còn các sterol là ergosterol

Zymosterol cũng là một sterol khá phổ biến ở màng tế bào nấm men Các sterol

được gắn trong màng tế bào, giữa các chuỗi lipid khác nhau và tự điều chỉnh trong

cấu trúc lỏng của chúng

Tế bào chất là hệ keo lỏng có pH acid khoảng 5,25 chủ yếu chứa các ion hoặc

các phân tử hữu cơ có trọng lượng thấp hoặc trung bình hoặc các hợp chất hòa tan(

protein enzyme và glycogen) Những enzyme chính trong tế bào chất chủ yếu liên

quan đến quá trình thủy phân glycogen,sinh tổng hợp acid béo, tổng hợp protein Sự

cân bằng bên trong và tổ chức cấu trúc được đảm nhận bởi cytosketeton, trong đó

bao gồm vi ống (tubulin) và vi sợi ( actin) Đây là cấu trúc động trong việc thực

hiện chức năng của chúng là nhận và loại bỏ các tiểu đơn vị protein Vi ống

(tubulin) và vi sợi ( actin) có tầm quan trọng trong cả nguyên phân, giảm phân, hình

thành vách ngăn và nhu động Các sợi actin sắp xếp tạo thành cấu trúc cũng chắc để

đáp ứng lại những kích thích của sự thẩm thấu đồng thời tái hiện cấu trúc sau khi

sự cân bằng với áp suất thẩm thấu được phục hồi

Ty thể được chú trọng trong cấu trúc và chức năng của bào quan này Cũng

như các sinh vật nhân chuẩn khác chúng có ribosome riêng, có sự khác nhau với

ribosome của tế bào chất Một số được phân bố tự do trong tế bào chất, hoặc được

phân bố trong mạng lưới nội chất Ở giai đoạn phát triển nhất định ty thể chiếm

12% khối lượng tế bào, cấu trúc bao gồm sự tự sao chép DNA và hệ thống tổng hợp

protein DNA ty thể (mtDNA) không bao gồm hệ thống gen của nấm men, nhưng

vật liệu cho các chủng đơn bội được sử dụng trong quá trình được thiết lập một

trình tự Khối lượng 86kb, mtDNA kém quan trọng hơn so với nhiễm sắc thể nhỏ

nhất của nấm men Và chỉ đại diện khoảng 0,5% trong hệ gen của nấm men Các ty

thể mã hóa bộ gen chỉ khoảng 5% trong tất cả các protein ty thể Các hệ gen của ty

thể được nhân lên khoảng 10 lần bởi có sự phiên mã thành RNA Ty thể được xem

là nơi sản sinh năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào, quá trình

sinh tổng hợp ATP, góp mặt trong chuỗi vận chuyển điện tử bên trong màng tế bào,

quá trình sinh tổng hợp phospholipid, hoặc trong quá trình β-oxy hóa

Không bào hiện diện là một bào quan lớn, có cấu trúc thay đổi theo các điều

kiện khác nhau Không bào có 2 chức năng chính: đầu tiên là nguồn dự trữ cung cấp

chất dinh dưỡng, thứ hai là cung cấp những vị trí quan trọng cho các đại phân tử,

protein, trở thành con đường trung gian trao đổi các chất trong tế bào Không bào

cũng được xem như kho dự trữ nguồn phospho hoặc các polyphosphate chứa liên

kết có năng lượng cao

Có cấu trúc lớn thứ 2 sau không bào là nhân, đượcc bao bọc với lớp màng kép,

và rải rác các lỗ nhân ( hiện nay được gọi là khu phức hợp của nhân, NPC), kiểm

soát quá trình trao đổi các phân tử trong và ngoài nhân.Nhân có đường kính từ

0,1-2µm, các lỗ trên về mặt có kích thước thay đổi được phù hợp với việc trao đổi chất,

các protein có khối lượng thấp giữa nhân và tế bào chất

Quá trình sinh sản của nấm men thường thông qua sinh sản vô tính, phân chia

tế bào bất đối xứng ( nảy chồi) tế bào con được hình thành giống hệt tế bào mẹ

dưới điều kiện thích hợp tế bào con sẽ phát triển khỏe mạnh như tế bào mẹ Quá

trình này kéo dài đến khi các tế bào bị lão hóa và chất dinh dưỡng bị cạn kiệt, sau

đó tế bào chết Chu trình sinh trưởng của nấm men được nghiên cứu đóng một vai

trò quan trọng trong công nghiệp cũng như là đại diện cho tế bào eukaryote Trên

thực tế nấm men có một hệ gen nhỏ tuân theo những kĩ thuật di truyền và chu kì tế

bào được xảy ra nhanh chóng cho thấy khả năng ứng dụng trong phòng thí nghiệm

Hình 2.3.3: Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

[8]

Một chu kì tế bào được chia làm 4 pha G1, S, G2, và M Pha S và M là giai

đoạn DNA tự phân và phân chia nhân xảy ra tương ứng với sự kiểm soát của tế bào

Xen giữa quá trình tự nhân đôi và phân chia nhân là các pha G1 và G2, trong đó có

sự thay đổi trong đó quá trình trao đổi chất diễn ra bình thường như quá trinh tăng

trưởng và phát triển của tế bào G1 đại diện cho quá trình tế bào con tách khỏi mẹ

và phát triển đến cuối quá trình tế bào bắt đầu sinh chồi Ngay sau khi DNA được

tạo thành các tế bào bước vào giai đoạn 2 Sự kiểm soát thực sự bắt đầu khi quá

trình đến cuối giai đoạn G1, buộc tế bào phải phân chia Sau khi sự phân chia bắt

đầu thì các yếu tố ngoại cảnh, chất dinh dưỡng cạn kiệt thì ngăn chặn quá trình phân

chia tế bào Yêu cầu của quá trình này là tế bào phải phát triển vượt qua mức tối

thiểu về kích thước và chắc chắn rằng tế bào đã phân chia tạo vòng ở 2 tế bào con

Sau đó tế bào thực hiện các con đường cần thiết cho sinh tổng hợp DNA và chuyển

vào giai đoạn phase S Sau khi quá trình tổng hợp DNA được hoàn thành, tế bào

tiến vào giai đoạn G2, với sự phát triển các chồi được nhân lên, nhân tham gia vào

quá trình nguyên phân( pha M) Bước cuối cùng của chu kì tế bào là phân tách tế

bào chất của tế bào mẹ và tế bào con Sự phân tách tế bào con không được thực hiên

toàn vẹn có thể tạo nên kiểu hình đặc trưng cho các tế bào con

Hình 2.3.4: Quá trình sinh trưởng của tế bào chồi con nấm men[8]

Nguồn gốc của sự hình thành chồi trên cơ thể tế bào mẹ được bắt đầu với sự

lựa chọn một vị trí thích hợp trên cơ thể mẹ, nơi có sự phát triển mạnh Vị trí điểm

chồi được xác định dưới sự điều khiển của kiểu gen Sự tạo nên một chồi mới bao

gồm sự hình thành vòng chitin,một đoạn vòng ngắn khoảng 10nm và một vài

protein được gắn trên vòng chitin

Sự sinh trưởng và phát triển của chồi phụ thuộc vào lớp vách tế bào

polysaccharide bao quanh bề mặt chỉ cho phép tế bào phát triển tới mức giới hạn về

kích thước Và sau đó quá trình tách chồi khỏi tế bào mẹ được thực hiện

Việc tạo nên vách là quá trình còn khá bí ẩn, những liên kết ở màng, có nguồn

gốc từ bộ máy golgi đóng vai trò nổi bật Chứa các túi tiền chất và các enzyme

(chitin synthase và β-glucan synthase) Tạo nên những lối đi giúp các chất xây dựng

tế bào con di chuyển từ tế bào mẹ sang tế bào chồi con Sau đó quá trình phân chia

nhân được xảy ra tạo nên nhân phù hợp cho chồi con, hướng tế bào chất và các bào

quan sang chồi con Sau khi hoàn thành quá trình nguyên phân, các chồi con trưởng

thành tách khỏi tế bào mẹ[8]

Hình 2.3.5: Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở nấm men (Sharma,1998)

Sinh sản hữu tính ở nấm men: Nấm men không sinh ra các cơ quan sinh dục

mà chúng sinh ra hai tế bào dinh dưỡng có nhiệm vụ giống như các giao tử Quá

trình tích hợp tế bào chất (plasmogamy) và hợp nhân (karyogamy) xảy ra và thành

lập tế bào nhị bội, nang và cuối cùng là bào tử nang thành lập trong nang

Hình 2.3.6: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces

cerevisiae (Sharma, 1998)

Số bào tử nang tùy thuộc vào số lần phân chia nhân nhưng thường là 8, bào tử

nang được giải phóng, nẩy mầm để hình thành tế bào dinh dưỡng mới từ đây chúng

sinh sản vô tính bằng sự nẩy chồi hay phân đôi

Tuy nhiên, sinh sản hữu tính không phải đơn giản như mô tả ở phần trên; theo

Guilliermond (1949), nấm men có 3 loại chu kỳ sinh trưởng hay vòng đời khác

nhau được mô tả ở 3 loại nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces

ludwigii và Schizosaccharomyces octosporus

2.3.2 Một số chủng Saccharomyces:

Rosini và al (1982), phân loại lại môi trường của các chủng nấm men của viện

vi sinh học của trường Đại học Perouse, đã quan sát, trên 591 chủng S.cerevisiae

bảo quản malt thạch, 23 trường hợp mất khả năng lên men galactose, điều đó có

nghĩa là 23 chủng này trở nên bayanus theo sự phân loại của Lodder (1970) Sử

dụng các phương pháp di truyền đồng nhất nấm men trong lên men rượu vang,

nhanh và thường được sử dụng, sự khuếch đại thành các đoạn của gen đơn bội bởi

phản ứng poly hóa mạch (PCR), gần đây đã chỉ ra rằng một dụng cụ tuyệt vời của

sự phân biệt của loài lên men vang Dưới đây là một số loài được phân loại theo

nghiên cứu trên

Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1]

Khi lên men có khẳ năng tích lũy trong môi trường 13% đường

Ở 25oC trong 30 giờ nuôi cấy có thể tạo thành bào tử (thường trong tế bào

có 3 bào tử)

Chủng đầu tiên được ứng dụng trong sản xuất rượu

Lên men được các loại đường như chủng 12 nhưng khả năng sinh sản kém hơn

Chủng M.10

(được tách từ

năm1916)

Tế bào chủng này có hình tròn hay hình oval với kích thước 5-6 x 6-7µ

Chúng có khả năng sản sinh rất nhanh

Sản xuất các loại nguyên liệu chứa đường

Lên men được ở nồng

độ rất cao

Bền vững với acid sulfuric và tồn tại được ở

pH =2

Chủng B Tế bào hình trụ, hình

oval với kích thước tế bào 3,9-9,7 x 39-8,9 

Sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu từ mật

rỉ

Có khả năng lên men rượu rất tốt, đồng thời có đặc tính lên men bánh mì cao

Chủng M (thu

được vào 1905)

do Ghenebec

Bền và ổn định, thích nghi được những điều kiện không bình thường trong thực tế sản xuất

Sinh sản nhanh và hiệu suất lên men tương đối tốt

Lên men trong môi trường chứa các hỗn hợp đường khác nhau

2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu

Quá trình lên men là quá trình phức tạp trong đó có sự biến đổi quan trọng trong

hoạt động trao đổi chất của nấm men Quá trình chuyển hóa nguồn nguyên liệu thành

sản phẩm chính trong lên men rượu là ethanol và CO2, ngoài ra trong quá trình lên

men còn tạo ra nhiều sản phẩm hữu cơ khác có khả năng ảnh hưởng tới chất lượng của

rượu vang Do đó hiểu rõ những cơ sở khoa học trong quá trình lên men sẽ giúp cho

việc điều khiển quá trình lên men xảy ra theo chiều hướng có lợi

Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces

cerevisiae [6]

Quá trình lên men rượu thực chất là một quá trình chuyển hóa đường thành rượu

etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác.Quá trình chuyển hóa từ đường hexose đến

rượu etylic và CO2 có thể biểu diễn theo phương trình tổng quát của Gay-Lussac [5]

Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hóa glucose thành ethanol [31]

C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 + Q Theo phương trình thì khi lên men sẽ tạo ra 2 phân tử rượu etylic và 2 phân tử

CO2 Theo lý thuyết thì hiệu suất thu hồi rượu là 51,1% so với hexose và 53,8% đối

với maltose hoặc saccharose[5]

Năm 1857, Louis Pasteur đã công bố kết quả nghiên cứu của mình và kết luận:

Sự phân giải đường thành rượu và CO2 trong điều kiện yếm khí, cứ 100% glucose sẽ

tạo thành 51,1% C2H5OH và 49,4% CO2, 3,2 acid succinic và khoảng 1% các sản

phẩm khác[39]

Quá trình lên men được thực hiện qua một chuỗi phản ứng rất phức tạp và liên

quan đến quá trình phosphoryl hóa các hợp chất hữu cơ Toàn bộ quá trình này được

thông qua chu trình Embden-Meyerhof Trong đó, đáng chú ý là sự tham gia của ATP

trong quá trình chuyển hóa glucose thành rượu etylic:

C6H12O6 + 2ATP + 2H3PO4 + 4ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ADP + 4ATP

Năng lượng tích lũy trong liên kết ATP chính là nguồn năng lượng cung cấp cho

hoạt động của nấm men Và đây cũng là nguồn năng lượng làm tăng nhiệt độ của dịch

lên men trong quá trình lên men.Xét về mặt hóa học, sự lên men rượu có thể chia

thành 2 thời kì: thời kì cảm ứng và thời kì tĩnh

Thời kì cảm ứng:

Ở giai đoạn này, chất nhận H của enzyme alcohol-dehydrgenase là acetaldehyde

được tạo chưa đầy đủ Do đó, enzyme sẽ chuyển H đến cho andehyde

thủy phân để tạo thành glycerin Như vậy trong môi trường sẽ hình thành glycerin và

CO2

Thời kì tĩnh:

Đến lúc này, lượng acetaldehit là cơ chất bình thường của enzyme

alcohol-dehydrogenase được tạo thành đã có nhiều, nên enzyme sẽ chuyển H đến cho cơ chât

của nó, rượu etylic và CO2 được hình thành từ đây

Trong môi trường acid, glycerin là sản phẩm phụ chỉ được tạo ra trong thời kì

cảm ứng.Thực tế cho thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra một cách bình thường cho sản

phẩm chủ yếu là rượu và một số sản phẩm phụ khác như glycerin, acid hữu cơ, chỉ

trong điều kiện pH của môi trường từ 4-5 và môi trường yếm khí, sự lên men xảy ra

mới mạnh mẽ nhưng khi đó sự phát triển của nấm men có thể bị kìm hãm, do điều kiện

yếm khí nên lượng Oxy không cung cấp đủ cho quá trình gia tăng sinh khối Khi có

không khí thì sự lên men sẽ yếu dần đi và nấm men thu nhận năng lượng của cần thiết

để phát triển theo con đường hô hấp hiếu khí bằng cách oxy hóa glucose để chuyển

thành CO2 và H2O hiện tượng kìm hãm sư lên men rượu dưới ảnh hưởng của oxy

được gọi là hiệu ứng pasteur[5]

Con đường chuyển hóa từ đường glucose đến sản phẩm ethanol theo chuỗi phản

ứng của chu trình EMP(Embden-Meyerhof pathway) và chi phối bởi các enzyme

pyruvate decarboylase và enzyme alcohol dehydrogenase:

2.5.Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình

lên men rượu

2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ :

Trong công nghiệp lên men yếu tố nhiệt độ được đánh giá là nhân tố quan

trọng từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình lên men Ngày nay đã có rất nhiều

nghiên cứu xem xét tác động của nhiệt độ đối với quá trình lên men Nhiều nghiên

cứu đã chỉ ra nhiệt độ tối ưu trong quá trình lên men của nấm men saccharomyces

là khoảng 28 – 320C Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng

lên men sẽ cao và kéo dài hơn Ở nhiệt độ 300C nấm men thuần phát triển nhanh

hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 -380C chúng phát triển nhanh gấp 6

đến 8 lần Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyde và tổn thất rượu

theo CO2 sẽ tăng

Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào: (□) 15oC, (◊)20oC,(●)

25oC, (∆) 30oC, (▼) 35o

C [28]

Nhiệt độ có tác động đến những quá trình trao đổi chất của tế bào và đặc tính

của nấm men trong quá trình tạo ra lượng ethanol( Bảng: 2.4 ) Điều này yêu cầu sự

hiểu biết trong việc tìm hiểu những chủng nấm men đáp ứng yêu cầu và sự kiểm

soát nhiệt độ phụ thuộc những quá trình sinh lý học khác nhau, và chiều hướng thay

đổi sự trao đổi chất của nấm men Việc lên men ở nhiệt độ thấp trở thành một ứng

dụng quan trọng trong công nghiệp sản xuất rượu vang, một mặt nào đó nó có tác

dụng đến quá trình sinh trưởng của tế bào, bởi vì chúng làm tăng khả năng chịu

stress của nấm men trong suốt quá trình lên men

Bảng 2.4: Tác động của điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình

α : ethanol tạo thành(g/l) x 100/ nồng độ đường ban đầu(g/l)

Sự ảnh hưởng trong quá trình lên men ở chế độ nhiệt độ thấp chính là sự kéo

dài trong pha lag và điều này thúc đẩy nhiều nghiên cứu nhằm rút ngắn quá trình

này đó là sử dụng những chủng nấm men khô qua quá trình làm ướt Những phân

tích ở cấp độ phân tử đã cho thấy những minh chứng về khả năng tế bào nấm men

thích ứng với những điều kiện stress sau khi có sự biến đổi đột ngột về nhiệt độ[11]

Việc lên men tại những điều kiện nhiệt độ khác nhau dẫn đến sự sinh trưởng

của nấm men cũng hoàn toàn khác nhau.Việc sử dụng chửng Saccharomyces

cerevisiae EC1118 ở diều kiện nhiệt độ là 15oC và 30oC đã cho thấy những thay đổi

đáng kể của nấm men với các điều kiện stress về nhiệt độ Một trong những tác

động có ảnh hưởng lớn nhất tới quá trình lên men ở nhiệt độ thấp là là sự ảnh hưởng