Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất rượu nếp trắng

Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất rượu nếp trắng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE

TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE

TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG

TS Nguyễn Công Hà Huỳnh Thị Mỹ Duyên

MSSV: 2051625

Lớp: CNTP K31

Cần Thơ, 2009

Luận văn tốt nghiệp kèm theo sau đây, với tựa đề là “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNGENZYME α-AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG”, do HuỳnhThị Mỹ Duyên thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn tốt nghiệpthông qua.

Giáo viên hướng dẫn

Nguyễn Công Hà

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Chủ tịch hội đồng

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của Thầy hướng dẫn và bản thân Các thôngtin về số liệu, hình ảnh, kết quả đã được trình bày trong luận văn này là trung thực

và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

LỜI CẢM TẠ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Nguyễn Công Hà, người trựctiếp hướng dẫn đề tài đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báutrong suốt thời gian thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy

cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức chotôi trong suốt những năm học qua

Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của bộ môn Công Nghệ ThựcPhẩm đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên Công Nghệ Thực Phẩm khóa 31

đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt khóa học cũng như trong thời gian thực hiện đềtài này

Chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Mỹ Duyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iv

LỜI CẢM TẠ v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

TÓM TẮT x

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 GẠO NẾP 2

2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin 2

2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột 4

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột 5

2.2 ENZYME AMYLASE 5

2.2.1  - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1) 6

2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2) 8

2.2.3  - amylase ( - 1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3) 9

2.2.4 Oligo-1,6- glucosidase 10

2.2.5 Pullulanase 11

2.2.6 Transglucosidase 11

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME 11

2.3.1 Nồng độ cơ chất 11

2.3.2 Nồng độ enzyme 12

2.3.3 Nhiệt độ 13

2.3.4 pH môi trường 14

2.3.5 Các chất kìm hãm 14

2.3.6 Các chất hoạt hóa 15

2.4 PHƯƠNG TRÌNH ĐỘNG HỌC – PHƯƠNG TRÌNH MICHALIS-MENTEN .16

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 19

3.1.1 Thời gian và địa điểm 19

3.1.2 Nguyên liệu 19

3.1.3 Hóa chất 19

3.1.4 Dụng cụ 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 20

3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng .20

3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng .21

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH ENZYME α-AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG 22

4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME α-AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG 26

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

5.1 KẾT LUẬN 30

5.2 ĐỀ NGHỊ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC

Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase đượctrích ly từ các loại nấm mốc khác nhau

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạttính enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắngKết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nếp trắng lên hoạttính enzyme α-amylase

Bảng tra hàm lượng đườngKết quả thí nghiệm xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trên tinh bột tinh khiết

Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme amylase trên nếp than

Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme amylase trên gạo

α-2792326

32333333

Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước

Cơ chế tác động của enzyme α-amylase trên tinh bột

Cơ chế tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bộtTổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylaseẢnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ enzymeẢnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứngẢnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứngẢnh hưởng của nồng độ enzyme đến thời gian phản ứngẢnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzymeẢnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng enzymeẢnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ phản ứngẢnh hưởng của pH đến thời gian thủy phân của enzyme

Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tínhenzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng

Đồ thị Michaelis – Menten biễu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nếptrắng sử dụng đến hoạt tính của enzyme α-amylase

Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trìnhthủy phân tinh bột nếp trắng và nếp than xúc tác bởienzyme α-amylase

Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trìnhthủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase

4810111212121213131313242627

28

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” đã được thực hiện với mục tiêu tìm ra pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động trên nếp trắng, xác định hằng số K m của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nếp trắng và so sánh với các nguyên liệu khác như tinh bột tinh khiết, gạo, nếp than.

Với mục tiêu đó, đề tài đã thực hiện các thí nghiệm và thu được kết quả như sau:

Trên nguyên liệu nếp trắng, nhiệt độ để enzyme α-amylase hoạt động mạnh nhất là 85 0 C

và pH tối thích của enzyme α-amylase có giá trị là 6,5 Trên các nguyên liệu khác nhau như nếp trắng, gạo, nếp than và tinh bột tinh khiết, giá trị pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzyme α-amylase không khác nhau do trong những nguyên liệu này không có thành phần nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme Hằng số K m của enzyme α-amylase là 17,0755% và V max là 7,3926% trong 30 phút Hợp chất màu anthocyanine trong nếp than làm cho ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng lớn hơn với nếp than Tỷ lệ amylopectin trong nếp trắng nhiều hơn trong gạo làm cho độ nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn với gạo Tinh bột tinh khiết rất nhạy đối với enzyme α-amylase nên K m của enzyme α-amylase trên nếp trắng (17,0755%) lớn hơn rất nhiều so với tinh bột tinh khiết (0,7824%).

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ

Ngày nay, khoa học càng hiện đại, xã hội càng phát triển thì nhu cầu cuộc sống củacon người càng được nâng cao Con người đòi hỏi xã hội phục vụ cho nhu cầu củamình phải tiến bộ hơn về mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần, từ ăn uống, trangphục, nhà ở đến vui chơi, giải trí… nhưng quan trọng nhất vẫn là vần đề ăn uốnghằng ngày Trước kia, khi cuộc sống vật chất còn khó khăn con người chỉ cần ăn no,mặc ấm nhưng ngày nay khi cuộc sống vật chất được cải thiện, con người đòi hỏi ănngon, mặc đẹp, bữa ăn phải đầy đủ những chất dinh dưỡng cần thiết

Không những thế, truyền thống dân tộc Việt Nam có nhiều những hội hè, đìnhđám… Trong những dịp như thế, rượu là một thức uống không thể thiếu Rượu làmột thức uống có cồn nên giúp dễ tiêu hóa để nâng cao sức khỏe hay để chúc mừngtrong những dịp lễ Tết, cưới xin… Các loại rượu vang nếu uống với liều lượng vừaphải thì rất có lợi cho sức khỏe

Nghề nấu rượu thủ công đã có từ xa xưa Ngày nay, nghề nấu rượu đã rất phổ biến

có loại chưng cất và có loại không qua chưng cất Các loại rượu ra đời ngày càng đadạng hơn và càng được ưa thích hơn như rượu nho, rượu nếp than, rượu gạo, rượunếp trắng… Rượu nếp trắng là một thức uống có cồn thường được sản xuất bằngphương pháp truyền thống nên thời gian sản xuất ra rượu thường kéo dài

Việc ứng dụng enzyme α-amylase vào quy trình sản xuất rượu nhằm rút ngắn thờigian sản xuất cũng như giảm chi phí sản xuất là rất quan trọng nên đề tài “Nghiêncứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” cần được thựchiện

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mỗi enzyme đều có những điều kiện hoạt động khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng

độ cơ chất… Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc rất lớn vào những điều kiện

này Do đó, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” được thực hiện hướng đến những mục tiêu chính như sau:

- Tìm ra nhiệt độ và pH tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động tốt nhấttrên nguyên liệu nếp trắng

- Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nếptrắng nhằm xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (nếp trắng) lên hoạt tínhenzyme α-amylase

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 GẠO NẾP

Ngũ cốc là loại nguyên liệu chứa hàm lượng tinh bột rất cao phù hợp với ngànhcông nghiệp sản xuất rượu Trong đó, nếp trắng là một loại gạo với hàm lượngtinh bột trên 70 % được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu

Trong phân tử tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin Haithành phần này khác hẳn về tính chất hóa học cũng như về tính chất vật lý Ví dụ:amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho màu tím đỏ, amylose dễ hòatan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectinchỉ hòa tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao

Tinh bột là hỗn hợp của hai loại glucan là amylose và amylopectin Hầu hết cácloại tinh bột đều chứa từ 20 ÷ 30 % amylose, tinh bột gạo nếp có thành phần gầnnhư 100 % amylopectin (Hoàng Kim Anh, 2007)

Độ hòa tan và tính lưu biến

Amylose thu được bằng phương pháp công nghiệp thường là sản phẩm thoái hóanên không hòa tan Amylose mới tách ra từ tinh bột (bằng cách tạo phức với n-

butanol) ở dạng bột xốp khô, có thể hòa tan dễ dàng trong nước nóng đến nồng độ15% Amylose cũng có thể dễ dàng hòa tan trong dung dịch kiềm loãng, tại nồng độkiềm tối ưu Ngoài ra, một số dung môi khác cũng hòa tan được amylose làchloralhydrate, acid dichloacetic, acid formic, urea… trong đó dung môi tốt nhất làdimethylsulphoxide Do trọng lượng phân tử lớn và cấu hình mạch thẳng nên độnhớt của dung dịch amylose thu được cũng cao.

Dung dịch amylose rất dễ tạo keo, ngay cả ở nhiệt độ cao Tốc độ tạo keo là hàmcủa thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ và phương pháp hòa tan amylose Trong dungdịch amylose có khuynh hướng liên kết lại với nhau để tạo ra các tinh thể Khi tốc

độ liên hợp là cực tiểu sẽ tạo ra khối không tan của các hạt đã thoái hóa, khi tốc độliên hợp là cực đại, dung dịch sẽ chuyển thành thể keo (Hoàng Kim Anh, 2007)

Phản ứng đặc trưng với Iodine

Khi tương tác với iod, amylose sẽ cho phức màu xanh đặc trưng Iod được coi làthuốc thử đặc hiệu để xác định hàm lượng amylose trong tinh bột bằng phươngpháp trắc quang Tác nhân hoạt động trong trường hợp này là HI hoặc muối củachúng Trong phức amylose-iodine, các phân tử iodine sẽ chui vào trong vòng ưabéo của xoắn amylose tạo thành một chuỗi các nguyên tử nằm cạnh nhau

Phản ứng xảy ra với amylose khô dễ dàng hơn với amylose ướt Nước chỉ có vai tròtạo điều kiện hình thành vòng xoắn và tạo độ linh động cho phân tử amylose vàiodine

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, mạch amylose chứa 200 gốc đường glucose cókhả năng gắn kết với iodine lớn nhất (khoảng 20% khối lượng) ở nhiệt độ 200C.Phức hợp này hấp thụ sóng mạnh nhất tại bước sóng 620nm cho màu xanh thẫm Áilực của amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polymer.Khi chiều dài mạch của amylose giảm, khả năng gắn của polymer với iodine vàbước sóng hấp thụ mạnh nhất cũng giảm (Hoàng Kim Anh, 2007)

2.1.1.2 Amylopectin

Amylopectin là một glucan phân nhánh; trong phân tử amylopectin, ngoài liên kếtα-1,4, tỷ lệ liên kết phân nhánh α-1,6 chiếm khoảng 4% Trung bình mỗi nhánh củaamylopectin chứa khoảng 15 ÷ 30 gốc glucose Cấu trúc tinh thể của tinh bột có liênquan chặt chẽ đến thành phần amylopectin và khả năng tạo các chuỗi xoắn kép.Amylopectin có phân tử lượng trong khoảng 107 đến 108

Amylopectin cũng có khả năng gắn kết nhất định với iodine Ở nhiệt độ 200C, khảnăng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2% khối lượng và phức hợp vớiiodine thể hiện hấp thụ mạnh nhất ở bước sóng 550 nm

Quá trình thủy phân amylopectin cũng giống như quá trình thủy phân amylose amylase không thủy phân được các liên kết nhánh α-1,6, phần mạch nhánh còn sótlại này được gọi là các dextrin giới hạn (limit dextrin).

β-Khi đun nóng trong nước, amylopectin tạo thành dung dịch trong, đặc, dính và có

độ nhớt cao Khác với amylose, amylopectin không bị thoái hóa, khả năng tạo gelcũng kém (trừ khi nồng độ rất cao) Tuy nhiên, dung dịch amylopectin bị giảm độnhớt rất nhanh trong môi trường acid, trong quá trình hấp tiệt trùng và khi chịu mộtlực cắt lớn (Hoàng Kim Anh, 2007)

2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột

2.1.2.1 Quá trình trương nở

Khi hòa tan tinh bột vào nước, đầu tiên các phân tử nước sẽ thâm nhập vào giữa cáccác phân tử tinh bột có kích thước lớn và tương tác với các nhóm hoạt động của tinhbột, tạo ra lớp vỏ nước và làm cho mắt xích nào đó của phân tử tinh bột bị yếu đi.Kết quả, phân tử tinh bột bị “rão” ra rồi trương lên Quá trình trương xảy ra khônghạn chế sẽ làm bung các phân tử tinh bột và hệ chuyển thành dạng dung dịch Quátrình trương luôn luôn đến trước quá trình hòa tan và đây là một quá trình phụ thuộcđiều kiện nhiệt độ bên ngoài (Hoàng Kim Anh, 2007)

2.1.2.2 Quá trình hấp thụ nước

Ở trạng thái tự nhiên, các phân tử tinh bột liên kết với nhau bằng liên kết hydro rấtbền Ở nhiệt độ lạnh, tinh bột vẫn có thể hấp thụ nước một cách thuận nghịch nhưngvới một lượng rất nhỏ

- Liên kết với nước kiểu 1:

Khi hấp thụ nước sẽ xảy ra sự hydrat hóa các nhóm hydroxy tự do và kết quả là tạothành liên kết hydro với nước theo kiểu 2

- Liên kết với nước kiểu 2:

O

Nhiệt độ tăng làm đứt các liên kết kiểu 1, và làm khả năng hấp thụ nước tăng Nhiệt

độ tăng cao quá sẽ làm đứt tiếp các liên kết hydro kiểu 2 Nói chung quá trìnhhydrat hóa tinh bột trong nước gồm các giai đoạn sau:

Hình 2.1: Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước

Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái ban đầu có mức độ hydrat hóakhác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt độ hồ hóa Các hạt tinh bột có kíchthước và nguồn gốc khác nhau cũng có nhiệt độ hồ hóa khác nhau Các hạt nhỏ cócấu tạo chặt, liên kết hydro kiểu 1 rất bền nên nhiệt độ hồ hóa các hạt nhỏ lớn hơncác hạt lớn, vì thế nhiệt độ hồ hóa tinh bột (là hỗn hợp các hạt có kích thước khácnhau) thường không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ Trong quá trình

hồ hóa, độ nhớt tinh bột tăng dần đến điểm cực đại rồi giảm xuống (Hoàng KimAnh, 2007)

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột

Nhiệt độ hồ hóa phụ thuộc vào thành phần amylose và amylopectin Các ion kimloại liên kết với tinh bột cũng ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro bên trongphân tử tinh bột Các chuỗi trong mạch tinh bột chứa các ion tích điện trái dấu sẽđẩy nhau làm lỏng lẻo cấu trúc tinh bột dẫn đến thay đổi nhiệt độ hồ hóa Các muối

vô cơ ở nồng độ thấp phá hủy các liên kết hydro nên làm tăng khả năng hòa tan củatinh bột, tuy nhiên ở nồng độ cao nó gây hiện tượng kết tủa tinh bột và giảm sựhydrat hóa Các chất không điện ly như đường, rượu cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ

hồ hóa và làm cho nhiệt độ hồ hóa tăng lên (Hoàng Kim Anh, 2007)

2.2 ENZYME AMYLASE

Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệsinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thựcphẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy.Amylase đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp năm 1894, nó có nguồn gốc

từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh về tiêu hóa.Ngày nay các amylase vi sinh vật đã thay thế thành công acid trong công nghiệpthủy phân tinh bột Amylase cũng được sử dụng rộng rãi để đường hóa trong công

hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa chất tinhkhiết.

α-amylase, β-amylase, glucoamylase là những enzyme biến tính tinh bột quan trọngnhất α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1) là loại enzymengoại bào thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucoside của phân tử amylose một cách ngẫunhiên Đó cũng là những endo-enzyme phân cắt bên trong mạch tinh bột với sảnphẩm chính tạo thành là các dextrin β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC3.2.1.2) là một exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose,amylopectin và glycogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose

Do enzyme này không thủy phân được liên kết α-1,6 glucoside ở amylopectin nênkết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 ÷ 60% maltose và dextrin giới hạn.Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase EC 3.2.1.3) là enzyme thủy phân liênkết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra đườngglucose Enzyme thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin,glycogen và những polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isoamylasethường được sử dụng kết hợp với β-amylase trong sản xuất siro hay đường glucosevới mục đích tăng hiệu suất thủy phân

Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase

2.2.1  - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)

 Đặc tính

α-amylase từ động vật và vi sinh vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị I như Cl- >

Br- > I-, α-amylase từ thực vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị II như Ca2+ amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+

α-Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành

và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase Đồng thời, nó còn có vai tròquan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động củacác tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein Nếuenzyme α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó bị mất hoàn toàn khả năng thủy phân cơchất

α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt α-amylase bềnnhiệt hơn các amylase khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trongphân tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Bảng 2.2: Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn khác nhau

Khoảng nhiệt

độ tối thích ( 0 C)

1 α-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis 4,5 - 9

(6,5 - 7,5)

70 - 85 (95)

2 α-amylase vi khuẩn

chịu nhiệt Bac licheniformic

5,8 - 8 (7,0)

90 - 105 (120)

α-sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2,3 của enzyme Ngoài duy trì cấu hình hoạtđộng của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylase có độ bền cực lớnđối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein

(Nguyễn Đức Lượng, 2004).

 Cơ chế tác dụng

α-amylase có khả năng phân cắt liên kết -1,4 glycoside ở bất kỳ vị trí nào trênmạch tinh bột đã được hồ hóa Do đó α-amylase được gọi là enzyme nội phân(endoenzyme)

Quá trình thủy phân này trải qua nhiều giai đoạn:

Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thủy phân nhanhtạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh

Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa được tạo

chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.

Dưới tác dụng của α-amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thànholigosaccharide Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩmmalttotetrose, matotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phâncủa amylose chứa 13% glucose và 87% maltose (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylasekhông phân cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh trong phân tửamylopectin nên sản phẩm cuối cùng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrinphân tử thấp và các izomaltose 8% (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Dưới tác dụng của α-amylase, dung dịch hồ tinh bột sẽ bị làm loãng nhanh chóng

và các dextrin sẽ được tạo thành cho phản ứng màu với iodine hay cho màu đỏnâu Do đó có thể xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo độ nhớt của dung dịch

hồ tinh bột hoặc xác định lượng tinh bột đã bị phân giải dựa vào phản ứng màu vớiiodine hoặc bằng cách xác định đường khử tạo thành (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)

 Đặc tính

Enzyme βamylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc SH, COOH, cùng với vòng amidazol, của các gốc histidine Enzyme β-amylase chỉ phổbiến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm Trong vi khuẩnkhông có β-amylase Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định.Enzyme β-amylase không bền khi có Ca2+, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như

-Cu2+, Hg2+, acetanic, iod, ozon β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưngbền với acid hơn Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 700C Nhiệt độ tối thích là 550C

Hình 2.2

và pH tối thích là 5,1-5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

 Cơ chế tác dụng

Enzyme β-amylase thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside trong tinh bột,glycogen, polysacharid đồng loại Phân cắt tuần tự gốc maltose ở đầu không khử,maltose có cấu hình β được tạo thành, β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân(exoenzyme)

Enzyme β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose Do mỗi nhánh củaamylopectin có 20 ÷ 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo thành 10 ÷ 12phân tử maltose Khi tới liên kết α-1,4 glycoside gắn với α-1,6 glycoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn Cácdextrin này có chứa liên kết α-1,6 glycoside bắt màu đỏ tím với iod

Tinh bột Maltose (54 ÷ 58%) + Dextrin (42 ÷ 46%)

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.3  - amylase ( - 1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)

 Đặc tính

 - amylase còn có tên gọi là glucoamylase

 - amylase có chủ yếu trong nấm mốc và một số loài vi khuẩn, -amylasebền với acid hơn β-amylase

 - amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+

  - amylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phânpolysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose Glucoamylase có khả năng xúctác thủy phân cả liên kết -1,4 glucoside và -1,6 glucoside

 Cơ chế tác dụng

Glucoamylase phân hủy tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tụctách gốc glucose và cuối cùng tạo thành glucose mà không cần có một enzymeamylase nào khác Nó có tác dụng thủy phân tinh bột, glucogen, polysaccharideđồng loạt ở các mối nối liên kết -1,4 glucoside Nó có giá trị đặc biệt trong sảnxuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men được và do đónâng cao hiệu suất nấu rượu từ tinh bột (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

β - amylase

Bảng 2.3: Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase được trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau.

Nguồn enzyme Khoảng pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu ( 0 C)

Aspergillus 3,0 – 6,0

(4,5 – 5,0)

55 – 60 90

A awamori 2,0 – 7,0

(3,0 – 5,0)

55 – 65 85

Amylose

Amylopectin

2.2.5 Pullulanase

Enzyme pullulanase thủy phân các liên kết α-1,6-glycoside trong tinh bột vàglycogen Phân tử lượng của nó là 145000 Enzyme này có khả năng thủy phânnhững dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside

2.2.6 Transglucosidase

Enzyme transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase Nó có hoạt tínhtransferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó thường gây sự nhằm lẫnvới sự tồn tại của glucoamylase Transglucosidase không chỉ thủy phân maltosethành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltosetriose và panose, tức là nó cókhả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucosekhác bằng liên kết α-1,6-glucoside để tạo thành panose và izomaltose

Cơ chế phân cắt tinh bột của amylase được minh họa trong hình sau:

Hình 2.4: Tổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylase

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME

2.3.1 Nồng độ cơ chất

Phản ứng khi có enzyme xảy ra 3 giai đoạn:

 Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES Ởgiai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tínhvới nồng độ cơ chất.

 Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nóhoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

 Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do Hiện tượng nàyđược xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất Nếu nồng độ cơ chấtvượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khảnăng tăng theo Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể

có tốc độ phản ứng cao hơn được

Thời gian phản ứng của enzyme amylase sẽ giảm nếu như tăng nồng độ enzymeamylase theo thời gian.

2.3.3 Nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein Do đó, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc củachúng Tốc độ phản ứng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó màprotein chưa bị phá vỡ cấu trúc Tại khoảng nhiệt độ mà enzyme có thể tồn tại vậntốc phản ứng tăng từ 1,4 ÷ 2 lần khi nhiệt độ tăng 100C (Nguyễn Thị Thu Thủy).Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Mỗi enzyme cómột nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng

Qua đồ thị trên ta thấy nhiệt độ tăng cao thì thời gian phản ứng càng rút ngắn Tuynhiên, ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dầnprotein của enzyme với nhiệt độ, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạtđộng nữa do khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâmhoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất

Nồng độ enzyme 0