Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo

Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus

niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo” do Nguyễn Thị Kim Ngân thực hiện

và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Cán bộ hướng dẫn

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009

Chủ tịch hội đồng

LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009

Nguyễn Thị Kim Ngân

LỜI CẢM TẠ



Để hoàn thành tốt luận văn, ngoài những cố gắng của bản thân, thì sự giúp đỡ của quý thầy cô là động lực to lớn giúp tôi vượt qua tất cả những khó khăn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Mười và cô Trần Thanh Trúc

đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy những kiến thức quý báu cho tôi, không chỉ trong quá trình thực hiện luận văn mà trong suốt thời gian học tập Thầy cô đã chuẩn bị hành trang vững chắc cho tôi bước vào con đường tương lai

Chân thành cảm ơn tất cả thầy, cô giảng dạy bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức, những bài học quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin gửi lời cảm ơn thân thương và chúc thành công đối với các bạn Công Nghệ Thực Phẩm khóa 31, những người sẵn sàng giúp đỡ và động viên tinh thần trong khi tôi thực hiện đề tài

TÓM TẮT



Đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo”, được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo để thu được PME có hoạt tính cao Trong đó, các điều kiện môi trường như độ ẩm (dựa trên tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất

bã táo và nước), pH môi trường, thành phần đạm bổ sung và thời gian ủ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME hoạt tính cao được khảo sát

Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tỉ lệ pha loãng 1:3, pH = 4,0, nuôi cấy nấm mốc trong 96 giờ và bổ sung thêm 0,2% (NH 4 ) 2 SO 4 là các điều kiện môi trường tối ưu để nấm mốc phát

triển và sinh tổng hợp PME có hoạt tính cao nhất Hoạt tính PME đạt 383,20 (U/mL)

MỤC LỤC



LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH BẢNG ix

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 TỔNG QUAN 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU PECTIN METHYLESTERASE 3

2.1.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa 3

2.1.2 Kiểu phản ứng 4

2.1.3 Nguồn tổng hợp PME 5

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME 6

2.2 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PME 10

2.3 PECTIN 11

2.3.1 Cấu tạo hóa học của pectin 11

2.3.2 Mức độ ester hóa của pectin 12

2.3.3 Vai trò chuyển hóa pectic trong sự thay đổi cấu trúc tế bào thực vật 13

2.4 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PME TỪ NẤM MỐC A NIGER TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO 14

2.4.1 Khái quát về nguyên liệu táo 14

2.4.2 Giống vi sinh vật 15

2.4.3 Môi trường nuôi cấy 17

2.4.4 Thu nhận enzyme 18

2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PME 18

2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU 19

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 21

3.1.1 Thời gian địa điểm 21

3.1.2 Dụng cụ - hóa chất 21

3.1.3 Nguyên liệu táo 21

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 22

3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 22

3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 22

3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nước đến khả năng tổng hợp PME của A.niger 22

3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Aspergillus niger 23

3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 25

3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ amonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 bổ sung đến khả năng sinh PME từ nấm mốc A.niger 26

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 28

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ PHA LOÃNG GIỮA CƠ CHẤT VÀ NƯỚC 28

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME CỦA NẤM MỐC A NIGER 30

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ THAY ĐỔI pH MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME TỪ ASPERGILLUS NIGER 31

4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA AMONIUM SULFATE (NH4)2SO4 BỔ SUNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH A NIGER PME 33

Chương 5 KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ 35

5.1 KẾT LUẬN 35

5.2 KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC x

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT



β-GALase: β-galactosidase

DE: degree of esterification

DP: degree of polymerization

FDA: food and drug administration

GalA: acid polygalacturonic

PME: pectin methyl esterase

PMEI: pectin methyl esterase inhibitor

DANH SÁCH HÌNH



Hình 1: Mô tả vị trí thủy phân của PME đối với nhóm methoxyl 5

Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ c ơ chất đến hoạt tính enzyme 7

Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme 7

Hình 4: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme 8

Hình 5: Cấu tạo phân tử pectin 12

Hình 6: Cấu tạo phức chất calci pectate 13

Hình 7: Trái táo (Ziziphus nummularia) 15

Hình 8: Hình dạng nấm mốc Aspergillus niger 16

Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nước đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 23

Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 24

Hình 11: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 25 Hình 12: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 27

Hình 13: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng giữa nước và cơ chất đến hoạt tính PME 29

Hình 14: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt tính PME sinh ra 30

Hình 15: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 32

Hình 16: Ảnh hưởng của tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung đến hoạt tính của PME 34

DANH SÁCH BẢNG



Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase 10

Bảng 2: Hàm lượng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây 12

Bảng 3: Thành phần pectin của táo và một số loại trái cây 15

Bảng 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nước đến khả năng sinh PME 28

Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt tính của PME sinh ra từ A niger 30

Bảng 6: Ảnh hưởng của sự thay đổi pH môi trường đến khả năng tổng hợp PME của A niger 32

Bảng 7: Ảnh hưởng của tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của A niger 33

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ XX đến nay, đem lại những thuận lợi lớn và mở ra sự phát triển mạnh mẽ hơn nữa cho ngành công nghệ thực phẩm

Enzyme pectinmethylesterase (PME) ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong ngành sản xuất thực phẩm nhất là đối với các sản phẩm từ rau quả Nghiên cứu dùng PME để cải thiện độ cứng của sản phẩm rau quả bằng cách kích hoạt PME nội bào hay bổ sung PME ngoại bào đã thu được nhiều kết quả khả quan Nghiên cứu

và sử dụng chế phẩm enzyme pectinase (bao gồm PME, PG, cellulase…) có những tiến bộ trong chế biến nhằm làm tăng hiệu suất thu hồi nước quả, làm trong và ổn định chất lượng nước quả (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Việc trích ly và ứng dụng PME vào trong quá trình chế biến thực phẩm đã được phát triển khá rộng rãi ở nhiều quốc gia, tuy nhiên khả năng sử dụng của enzyme này vẫn chưa được quan tâm ở Việt Nam Hiện nay không có PME thương mại được sản xuất ở nước ta, nhập khẩu PME từ nước ngoài thường có giá rất cao Điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng PME vào trong quá trình chế biến thực phẩm Chính vì thế, nghiên cứu trích ly PME trong điều kiện hiện tại ở Việt Nam là việc hết sức cần thiết

Hai nguồn đối tượng nghiên cứu và sản xuất PME là vi sinh vật và thực vật Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt như hiệu suất thu hồi cao, khả năng sản xuất trên quy

mô công nghiệp và tốc độ sinh sản nhanh, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu Pectinase có thể được sản xuất từ nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc, nhưng

Aspergillus là nguồn chủ yếu (Polizeli et al., 1991) Trong đó, việc trích ly enzyme

PME từ Aspergillus niger được ưu tiên chọn lựa nhiều nhất Aspergillus niger được

sử dụng phổ biến từ nhiều thập kỷ qua trong ngành công nghệ thực phẩm và không

có tác động xấu đến sức khỏe con người Sản phẩm từ Aspergillus niger cũng được

Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận là sản phẩm an

toàn Ngoài ra, Aspergillus niger còn là một nấm mốc có khả năng phát triển nhanh

chóng trên các cơ chất rẻ tiền và tiết ra enzyme vào trong môi trường, dễ dàng thu hồi

Việc lựa chọn nguồn rau quả cho trích ly PME không chỉ quan tâm hoạt tính của enzyme này trong nguyên liệu, hiệu suất trích ly, mà còn phụ thuộc vào tính kinh tế Táo là loại trái cây được trồng rộng rãi ở đồng bằng sông Cửu Long, và được dùng

để sản xuất nước ép, đồ hộp, rượu táo,…Phần phụ phẩm còn lại sau khi ép là bã táo

ép – đây là một nguồn giàu pectin nên có thể được dùng làm cơ chất cho quá trình sản xuất PME Điều này giúp làm giảm giá thành sản phẩm enzyme, đồng thời là một phương pháp hữu hiệu để tận dụng nguồn phụ phẩm như bã

Với những thuận lợi và sự cần thiết sản xuất enzyme pectinmethylesterase, đề tài

“Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã

táo” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài là khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi

trường đến khả năng sinh PME của nấm mốc Aspergillus niger

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Pectinmethylesterase (PME) (pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11) là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin PME thường tấn công vào các nhóm estermethyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân cắt các nhóm methoxyl (–OCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol Hiệu suất thủy phân pectin của enzyme này rất cao, có thể đạt 98% Enzyme này còn có tên khác là pectinesterase (PE) PME cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc kiểm soát hoạt động của enzyme này cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa

PME từ những nguồn khác nhau có những đặc trưng không giống nhau Nhiều loại PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa được tìm thấy ở các thực

vật 2 lá mầm (Bordenave et al., 1996)

Thông thường các enzyme PME có chung nguồn gốc có cùng khối lượng phân tử (MW), điểm đẳng điện (pIs) và các đặc điểm động học phản ứng Chúng có kích

thước trung bình và phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003) Tuy

nhiên, việc đo lường hoạt tính đã chỉ ra có sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các bộ phận khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau

Nhìn chung, PME rất nhạy cảm đối với môi trường chứa ion và chịu tác động lớn bởi pH Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH tối ưu của PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996) Giá trị pH tối thích cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là phù

hợp cho Aspergillus PME (Duvetter, 2006) PME thường được hoạt hóa bởi các ion

Ca2+ và Mg2+

Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến 11 đối với PME cà chua Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME có tính acid (Bordenave, 1996)

Hai nguồn được dùng sản xuất PME là từ thực vật (cà chua, cam, táo, cà rốt…) và

vi sinh vật (nấm mốc Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger…) Trong vi sinh vật thì không có sự đa dạng lớn về PME ngoại trừ Erwinia chrysanthemi, một PME duy nhất được tìm thấy trong tất cả các nghiên cứu (Benen et al., 2003)

2.1.2 Kiểu phản ứng

Phản ứng thủy phân pectin được thực hiện ở đơn vị galacturonic chứa ester bên

cạnh nhóm carboxyl tự do hoặc từ cuối chuỗi pectin (Rexova–Benkova et al.,

2004) Kết quả là hình thành methanol và chất pectin có độ methoxyl thấp hơn (pectinic acid hoặc pectic acid) Điều này dẫn đến sự thay đổi thuộc tính tạo keo của pectin nên làm tăng độ nhớt của rau quả và làm giảm pH

Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc điều khiển

sự thoái hóa của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín và là enzyme đầu tiên tác dụng lên pectin trên vách tế bào

Động học phản ứng của PE thường tuân theo định luật Michaelis-Menten, tuy nhiên cũng có sự khác biệt về pH tối thích và đặc điểm động học ở các isozyme khác nhau (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991) Các PME acid và kiềm có thể khử gốc methyl của cơ chất pectin theo cùng một kiểu PME kiềm hình thành các pectin ít được ester hóa và pectin này có thể tạo gel mạnh với ion Ca2+

PME acid tạo ra pectin bị ester hóa có khả năng tạo gel yếu với ion Ca2+

PME có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của acid polygalacturonic Tuy nhiên, PE không khử hoàn toàn mạch ester hóa Sự thủy phân dừng lại ở một mức

độ ester nhất định, có thể do giới hạn bởi các nhóm polymer thế có kích thước nhỏ hiện diện trên mạch Pectin ở độ methoxyl 65 ÷ 75% cho hoạt tính PME mạnh nhất (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991)

PE không hoạt động trên các cơ chất polyuronic như các chuỗi pectin được methoxyl hoàn toàn hay methyl alginate PE cũng không thủy phân ở các glycyl và glycerin ester, ethyl acetate Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm như ethyl polygalacturonase (1 ÷ 6% so với methyl galacturonase) Các nhóm allyl, propyl, propargyl ester thủy phân ở mức độ rất ít (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991) Các nhóm methylester của acid polymanuronic thì không hề bị tấn công Cho đến nay chưa có enzyme methylesterase nào được tìm thấy là có tác động đến nhóm methyl

ester của RG (rhamnogalacturonan) (Benen et al., 2003)

Do sự khác biệt về cách sắp xếp thứ tự các acid amin của các loại PME thực vật, nấm mốc và vi khuẩn mà cơ chế phản ứng của mỗi loại sẽ khác nhau PME nguồn gốc vi sinh vật thủy phân tại vị trí bất kì (các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên), PME thực vật thủy phân tại những vị trí định trước (Markovic and Janecek, 2004)

Hình 1: Mô tả vị trí thủy phân của PME đối với nhóm methoxyl

Thủy phân ở vị trí gần nhóm carboxyl tự do

PME nấm mốc: pH tối thích 4,5; thủy phân ở vị trí bất kỳ

PME thực vật: pH tối thích > 7; thủy phân ở vị trí đã được định trước

và PME2 Trong giai đoạn trái bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hoặc như hai dạng đồng phân của PME trong cam, PME1 có pI là 10,05 và PME2 có pI > 11 Các đồng phân PME trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử, cùng pI nhưng lại khác nhau về tính bền nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

PME thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp như Ca2+

có khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của

PME

2H 2 O

enzyme Các ion Ca2+ và Na+

làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ lần lượt là 0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996)

Các PME ở thực vật tấn công vào đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do

và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid không bị ester hóa rất mẫn cảm với calcium (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hoạt tính của PME thực vật có thể được gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt được cường độ hoạt động tối ưu ở áp suất thay đổi trong khoảng 200 ÷ 500 MPa và

nhiệt độ từ 50 ÷ 57°C (Verlent et al., 2004)

2.1.3.2 Vi sinh vật

­ Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

­ Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terrus, Aspergillus saitoi, Penicillium glaucum, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam, Penicillium Cilrimim, Fusarium monniliforme,…

­ Nấm men: Saccharomyces fragilis,…

­ Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella

aerogenes, Erwinia,…

­ Các PME có nguồn gốc từ nấm mốc chịu nhiệt kém hơn so với các PME có nguồn gốc từ thực vật Các PME của nấm mốc khác với PME của thực vật theo cơ cấu đa dạng, các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Ly Nguyen, 2004)

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME

Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn:

­ Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ c ơ chất đến hoạt tính enzyme

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

2.1.4.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Cũng như các phản ứng hoá học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng Tuy nhiên, do enzyme có bản chất là protein nên nó kém bền với nhiệt độ cho nên tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt

độ 40 ÷ 50°C Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng Một số enzyme có nhiệt độ tối ưu ở 60°C, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70°C Enzyme pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 ÷ 45°C và bị vô hoạt ở 55 ÷ 62°C (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ 0°C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

2.1.4.4 pH

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme

Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid

Enzyme pectinesterase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong

khoảng acid, hoạt động của PE đạt tối đa ở pH = 4,5 và nhiệt độ 40°C Khi pH > 7, pectin tự khử nhóm ester và tăng cường độ hoạt động của PME Đối với pectinase

có nguồn gốc từ nấm mốc, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng 3 ÷ 5 (Nguyễn

Đức Lượng et al.,2004)

Hình 4: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

2.1.4.5 Các chất kìm hãm

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme Chất kìm hãm có thể phân là hai nhóm chính tác dụng lên PME bao gồm chất kìm hãm nguồn gốc protein (proteinaceous PMEIs) và chất kìm hãm nguồn gốc không là protein (non–proteinaceous PMEIs)

Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng:

này có thể hoạt động trên tất cả các loại PME từ nhiều nguồn khác nhau (Camardella

et al., 2000) đã xác nhận kiwi PMEI có pI = 3,5 và có phân tử khối vào khoảng

16,3 kDa PMEIs kết hợp bất hoạt PME theo tỉ lệ 1: 1 (Giovane et al., 1995)

(ii) Chất kìm hãm không cạnh tranh

Chất kìm hãm sẽ kết hợp với enzyme ở vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme, kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme Đường là một chất ức chế không cạnh tranh (noncompetitive) đối với PME Ở nồng độ cao, đường ức chế hầu hết các PE thực vật Nồng độ sucrose 15% có thể bất hoạt trên 40% hoạt tính PME Các chất có phân tử lượng thấp khác như polyol (glycerol, glucose, maltose) có khả năng ức chế hoạt động của PME chuối

(Brady, 1976; trích dẫn bởi Sajjaanantakul and Pitifer, 1991)

2.1.4.6 Chất hoạt hoá

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là các chất hoạt hoá enzyme Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là:

­ Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học

­ Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt động enzyme

­ Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau

để hình thành trung tâm hoạt động

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PME

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học lớn Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nước trái cây và rượu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất này nằm ở thành tế bào được phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết

ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật

Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép Nếu pectin còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao

và rất khó lọc trong

Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase

Loại nước quả

Hiệu suất nước quả (%)

Hàm lượng chất khô (%)

Độ acid chuẩn (%)

Đường (%)

Pectin (%)

Điểm đánh giá cảm quan Nước quả từ táo

a- Không có chế phẩm enzyme

b- Có chế phẩm enzyme

71,2 78,8

10,2 11,5

0,53 0,62

6,7 8,0

0,33 0,15

4,5 4,8 Nước quả vải

a- Không có chế phẩm enzyme

b- Có chế phẩm enzyme

49,2 72,4

8,5 10,2

0,91 1,16

5,62 7,4

0,26 0,12

3,8 4,3

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

Trong các sản phẩm đòi hỏi tính giòn, độ cứng chắc của sản phẩm (như trong sản phẩm rau muối chua, táo cắt lát, rau quả đóng hộp…) Trong quá trình làm trắng nguyên liệu ở nhiệt độ thấp, thời gian dài sẽ làm kích hoạt PME phân cắt nhóm ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+

tạo cấu trúc theo mong muốn

Ảnh hưởng của sự demethoxyl pectin đối với độ cứng mô thực vật bao gồm hai hiện tượng: ở mô chưa xử lý, sự hiện diện các nhóm carboxyl tự do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calci giữa hai mạch pectin, và ở mô đã xử lý nhiệt sẽ

có sự gia tăng liên kết với ion Ca2+

và làm giảm nguy cơ bị tự phân cắt hay còn gọi

là β–elimination (Sajjaanatukal and Van Buren, 1989)

Tuy nhiên, một vài loại trái cây chỉ chứa một lượng rất nhỏ PME nội bào Do đó nhiều phương pháp khác nhau được đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật

nguyên vẹn và cách đơn giản nhất là phương pháp ngâm – thấm thụ động Tuy nhiên đây là một quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mô chỉ giới hạn ở

bề mặt Vì thế cần có sự hiện diện của các chất phụ gia Nếu trong mô có khoảng không chứa khí đáng kể thì phải tiến hành dưới áp lực trực tiếp hoặc là chân không

Kỹ thuật trong trong chân không (vacuum infusion–VI) được sử dụng trong nhiều quá trình chế biến khác nhau để cải thiện chất lượng về cấu trúc của sản phẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành phần chức năng trong sản phẩm

Ngâm bằng kỹ thuâ ̣t chân không áp dụng cho trái đào cắt nửa với PME của bưởi và CaCl2 đã làm tăng đáng kể độ cứng của trái đào đóng hộp Theo Baker và Wicker (1996), có mối tương quan giữa mức độ ester hóa của pectin với khả năng cải thiện

độ cứng VI của PME nấm mốc với CaCl2 được khảo sát thấy có hiệu quả cải thiện

độ cứng cho dâu tây cắt nửa lạnh đông

Trong lĩnh vực chăn nuôi, người ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn Lượng chế phẩm pectinase thường dùng là 0,03 ÷ 0,05% so với nguyên liệu

PME có tính đặc hiệu cao và chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định là pectin Chính

vì thế, đặc điểm tính chất của pectin cũng cần được quan tâm

2.3.1 Cấu tạo hóa học của pectin

Pectin là một polymer được hình thành chủ yếu nhờ những đơn vị acid polygalacturonic (GalA) gắn kết nhau bởi các liên kết α – 1,4 glycoside Trong pectin tự nhiên có khoảng hai phần ba nhóm acid được ester hóa bằng methanol Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 ÷ 200.000 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Pectin trong thương mại có hàm lượng acid galacturonic thường hơn 75% và độ ester hóa từ 30 ÷ 80% (Ly Nguyen, 2004) Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác Pectin hòa tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và glycerine nóng Độ hòa tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tăng và khi

khối lượng phân tử pectin giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Cấu trúc của pectin gồm chủ yếu các đơn vị galacturonic acid mặc dù chúng có thể được cấu tạo từ 17 loại monosaccharide khác nhau Có 3 loại pectic polymer chính cấu thành pectin: homogalacturonan (HG), rhamnogalacturonan I (RGI) và rhamnogalacturonan II (RGII) Bên cạnh 3 loại polysaccharide chính kể trên, một số dẫn xuất khác của galacturonan cũng được tìm thấy trong vách tế bào của những

loại thực vật đặc biệt, chẳng hạn xylogalacturonans và apiogalacturonans (Ridley et

al., 2001)

Hình 5: Cấu tạo phân tử pectin

Nguồn: Brent L Ridley et al., 2000

Mặc dù cấu tạo của các pectic polymer đã đƣợc biết đến khá nhiều nhƣng cách kết hợp các phần tử nhỏ lại thành một đại phân tử vẫn chƣa sáng tỏ

2.3.2 Mức độ ester hóa của pectin

Pectin có thể đƣợc phân loại dựa vào chỉ số mức độ ester hóa DE (Degree

of esterification) Theo đó, pectin đƣợc chia thành ba nhóm:

­ Pectin có DE rất cao gần 100%,

­ Pectinic acid có DE trung bình,

­ Pectic acid có DE rất thấp hoặc không có

Mức độ ester hóa của các hợp chất pectin chi phối khả năng phản ứng của các enzyme có liên quan

Bảng 2: Hàm lƣợng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây

Loại trái cây Hàm lƣợng pectin % Mức độ ester hóa DE%

Mức độ este hóa của pectin cho thấy khả năng liên kết với các ion kim loại, đặc biệt

là những ion có hóa trị II Khi hai nhóm carboxyl tự do của hai chuỗi HG đứng cạnh nhau sẽ tạo nên một vùng tích điện âm, vùng này có thể được điều tiết bởi ion kim loại hóa trị II như Ca2+ Bằng cách này mà gel calci pectate có thể được tạo thành Phải có ít nhất chín đơn vị GalA chưa ester hóa để tạo nên liên kết ngang bền vững

giữa các chuỗi (Liners et al., 1992)

2.3.3 Vai trò chuyển hóa pectic trong sự thay đổi cấu trúc tế bào thực vật

Cấu trúc vách tế bào thực vật có thể được chia thành ba lớp: phiến giữa (lớp chung–middle lamella), vách sơ cấp (primarry wall), vách thứ cấp (secondary wall) (Brett and Waldron, 1996) Giữa hai vách sơ cấp của các tế bào liền kề nhau là phiến giữa,

là một lớp mỏng giàu chất bột đường đa là pectin, thường hiện diện dưới dạng calci pectate (hình 6)

Hình 6: Cấu tạo phức chất calci pectate

Nguồn: Buchanan et al., 2000; trích dẫn bởi Kalamaki et al., 2006

Khi quả chín, pectin hóa nhày nên các tế bào không còn gắn chặt vào nhau nữa, quả

bị mềm đi Trên vách tế bào thực vật có những lỗ nhỏ giúp các chất thông thương với nhau, các lỗ này được gọi là cầu liên bào (plasmodesmata) ở vị trí này tế bào chất của hai tế bào liền kề liên tục nhau (Brett and Waldron, 1996) Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectinic acid và protopectin

­ Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalaturonic pectin, trong tự nhiên

có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng methanol Pectin được ester hóa sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ cao (khoảng 60  65%) Enzyme pectinase tác

động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

­ Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol

­ Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học phức tạp Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan

Trong quá trình chín, sự hòa tan của các pectic polymer là một hoạt động có liên quan tới các enzyme giảm cấp pectin như protopectinase, polygalacturonase (PG), PME và β–galactosidase

Khi xử lí nhiệt, protopectin sẽ bị thủy phân thành pectin hòa tan mà kết quả là làm mềm rau quả Trong chế biến nhiệt, cần thiết tạo phản ứng giữa pectin hòa tan với ion calci để tạo phức calci–pectate Đây là dạng muối không hòa tan trong nước

và lấp đầy các mô rau quả làm cho cấu trúc sản phẩm trở nên rắn chắc hơn

TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO

2.4.1 Khái quát về nguyên liệu táo

Táo ta có tên khoa học là Ziziphus nummularia thuộc họ Rhamnaceae Đây là loài

cây ăn quả của vùng nhiệt đới, là loại cây được trồng khá phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long Cây có thể lớn rất nhanh thậm chí trong các khu vực khô và cao tới

12 mét và đạt tuổi thọ 25 năm

Quả là loại quả hạch, khi chín nó mềm, chứa nhiều nước, có vị ngọt Các quả chín vào các khoảng thời gian khác nhau ngay cả khi chỉ trên một cây và có màu lục nhạt khi còn xanh và vàng nhạt khi chín Kích thước và hình dạng quả phụ thuộc vào các giống khác nhau trong tự nhiên cũng như loại được trồng Quả được dùng để ăn khi

đã chín hoặc ngâm rượu hay sử dụng để làm đồ uống Nó là một loại quả giàu chất dinh dưỡng và chứa nhiều vitamin C

Khi chưa chín, lớp cùi thịt có màu trắng, giòn, nhiều nước, vị từ chua tới ngọt, có tính chất làm se nhẹ, tương tự như ở quả táo tây dại Quả đã chín ít giòn hơn và chuyển dần sang dạng bột; quả quá chín nhăn nhúm, lớp cùi thịt có màu vàng sẫm, mềm, xốp và có mùi thơm Lúc đầu hương vị giống như quả táo tây và dễ chịu nhưng nó trở thành có mùi xạ kỳ lạ khi đã chín kỹ Quả chứa một hột cứng hình ôvan hay thuôn dài Hột chứa 2 hạt hình elip, màu nâu, dài 6 mm

Táo là một trong những loại quả chứa rất nhiều chất dinh dưỡng quý giá và giúp chữa rất nhiều bệnh nguy hiểm: giảm các bệnh đường ruột, hạ lượng cholesterol trong máu, ngăn ngừa bệnh ung thư…

Hình 7: Trái táo (Ziziphus nummularia)

Táo cũng giống như nhiều loại quả khác có rất nhiều pectin đặc biệt là phía trong lõi (Joshi, 2006), nên được chọn làm cơ chất để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp PME

Bảng 3: Thành phần pectin của táo và một số loại trái cây

Nguồn: Bollag, 1991

2.4.2 Giống vi sinh vật

Enzyme pectinmethylesterase từ vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể Tuy nhiên, chúng đều được sản xuất bằng hai phương pháp nuôi cấy trên môi trường rắn và trên môi trường lỏng

PME có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn, trong đó Aspergillus

niger là một trong những chủng được sử dụng phổ biến (Schmitz, 2002)

Aspergillus niger thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales,

họ Aspergillaceae Khuẩn ty có vách ngăn Trên đầu tế bào hình chai mọc các

cuống sinh bào tử đính Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chùy được gọi là túi định Xung quanh túi định có rất nhiều những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các bào tử đính Các bào tử đính xòe ra như những bông hoa cúc và mang

màu sắc đặc trưng cho từng loài Aspergillus niger có bào tử đính màu đen

Hình 8: Hình dạng nấm mốc Aspergillus niger

Nguồn:http://www.giaoducsuckhoe.net/article.asp?articleID=248&CategoryID=1&SubCategoryID=4&Spe cialtyID=14

Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A niger, thường được sử dụng phổ biến

trong công nghệ chế biến nước quả, kế đến là cellulases và hemicellilases với doanh

số thu được từ 3 dạng enzyme này xấp xỉ 20% một triệu dollar Mỹ thu được hàng

năm đối với các enzyme công nghiệp khác (Kashyap et al., 2001) Các enzyme này

thường được sử dụng trong sản xuất các loại nước quả trong như nước táo, lê, nho,… và một lượng nhỏ sử dụng trong chế biến các dạng nước quả có độ đục ổn định như nước chanh, nước mận

A niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân

tử pectin Chúng bao gồm pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6), endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), … Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra pectin có độ methylester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và pectate lyase Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất có độ methyl ester bất kỳ

Hệ enzyme pectinolytic từ A.niger có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

và thức uống Tuy nhiên, các enzyme này thường ở dạng hỗn hợp, gây khó khăn cho việc ứng dụng chúng để tác động như các loại pectin công nghiệp, như trong các loại gel thực phẩm