kiem nghiem vi sinh vat trong nuoc sinh hoat

Chọn khuẩn lạc điển hình,cấy vào MT Tryptone, ủ ở 44,5±0,2 o C , 24hChọn khuẩn lạc điển hình,cấy vào Tryptone, MR-VP, SC Citrate Thử nghiệm Indol Thử nghiệm IMViC Đếm số ống MT EC+&IMViC

CNSH VI SINH VẬT

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG

NƯỚC SINH HOẠT

GVHD:Nguyễn Thị Kim Cúc Nhóm: WAO_One

Lớp :50SH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CNSH & MT

Nội dung

I./ Vai trò của nước:

 Đối với cơ thể sống:

- Là một dung môi quan trọng nhất trong tế bào sống.

- Nước tham gia như một thành phần rất quan trọng trong cấu trúc của tế bào.

- Nước tham gia vào các phản ứng thủy phân & các phản ứng oxy hóa trong tế bào.

- Nước như là một bộ xương có tính chất đệm tạo nên khung mềm của tế bào, ở đó các cơ quan tồn tại & hoạt động sinh lý bình thường.

- Nước tham gia quá trình điều hòa nhiệt của cơ thể.

- Nước tham gia bôi trơn các bộ phận của đường tiêu hóa,

đường hô hấp, các khớp xương.

 Trong sinh hoạt:

Nước là một nhu cầu sống không thể thay thế được Nước cung cấp cho các hoạt động của tế bào, mô, cơ thể, cũng như cho các nhu cầu về tắm, giặt, vệ sinh nhà cửa…

 Trong sản xuất:

Nước là một loại nguyên liệu rất đặc biệt, một loại nguyên liệu không thể thay thế Nước dùng trong sản xuất chủ yếu là dùng vào hoạt động sản xuất nông nghiệp & sản xuất công nghiệp, trong đó nước dùng trong nông nghiệp chiếm trên 70%.

 Tóm lại nước rất quan trọng trong đời sống, không thể thiếu được và càng nghiêm trọng hơn nếu nước bị ngộ độc, hay bị ô nhiễm.

I./ Vai trò của nước:

II./ Những chỉ tiêu tiêu chuẩn

trong nước sinh hoạt:

 Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam (TCVN 5942-1995) quy định nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xử lý giới hạn tối đa coliforms cho phép 5000MPN/100ml

 Tiêu chuẩn bộ y tế (QCVN 02: 2009/BYT):

Coliform tổng số vi khuẩn /100ml: 50

E coli hoặc Coliform chịu nhiệt vi khuẩn /100ml: 0

III./ Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật:

+ Klebsiella + Enterobacter

2/ Coliforms chịu nhiệt:

- Là những Coliforms có khả

năng lên men lactose sinh hơi

trong khoảng 24h khi được ủ

ở 44 o C trong môi trường EC.

3/ Coliforms phân (E.coli giả

định):

- Là Coliforms chịu nhiệt có

khả năng sinh indole khi được

ủ khoảng 24h ở 44.5 o C trong

môi trường Trypton. Fecal Coliform

III./ Đặc điểm sinh lý,sinh hóa của vi sinh vật:

IV/ Phương pháp lấy mẫu và phân tích

các chỉ tiêu vi sinh vật1.1/ Phương pháp lấy mẫu:

a/ Đặc điểm của mẫu:

• Mật độ của vsv trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm thường thấp hơn từ vài chục đến vài triệu lần so với trong bệnh phẩm và phân bố không đều trong mẫu

• Trong quá trình xử lý nước vsv hiện diện thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống, do các biện pháp xử lý như lọc, khử trùng (clo, ozon, tia cực tím )

 vì vậy khi kiểm nghiệm nước ta cần có thêm bước phục hồi sức sống và tăng sinh chọn lọc nhằm gia mật độ tương đối của các vsv cần phát hiện, ức chế

sự tăng sinh trưởng các vsv không mong muốn khác

IV/ Phương pháp lấy mẫu và phân tích

các chỉ tiêu vi sinh vật1.1/ Phương pháp lấy mẫu:

b/ Phương pháp thu mẫu:

Nguyên tắc thu mẫu: mẫu thu được có tính đại diện cho khối nước cần kiểm tra

Đối với nước mặt: mẫu nước được thu vào bình thủy tinh dung tích 100-1000ml đã khử trùng

Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết liên quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu…)

Mẫu nên được phân tích trong vòng 6h sau khi thu mẫu

9ml dd SPW

1ml

9ml dd SPW 9ml dd SPW 9ml dd SPW

1ml 1ml

Độ pha loãng 10 1 10 2 10 3 10 4

Định lượng Coliforms, Coliforms phân,

Coliforms chịu nhiệt, và E coli bằng

phương pháp MPN

Định lượng Coliforms, Coliforms phân,

Coliforms chịu nhiệt, và E coli bằng

phương pháp MPN

Nguyên tắc:

- Đây là pp định lượng dựa trên kết quả định

tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một

số độ pha loãng khác nhau.

- Thường lặp lại 3 lần ở 3 nồng độ bậc 10 liên tiếp.

- Kết quả tra ở bảng MPN và nhân với hệ số

pha loãng.

-Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth (LBS).

-Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL)

-Môi trường lỏng E coli (EC)

Cấy vào ống canh BGBL,

ủ 37 o C, 48h

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu

để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 ,10 -3 …

Chuyển 1ml dd trên vào ống 10ml canh LSB, mỗi ống nồng độ 3 ống lặp lại, ủ ở 37 o C, 48h

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Cấy vào ống canh EC,

ủ ở 44,5 0 C, 24h

Cấy lên thạch EMB, ủ ở 37 o C, 24h

Coliforms Coliforms chịu nhiệt

Chọn khuẩn lạc điển hình,cấy vào MT Tryptone, ủ ở 44,5±0,2 o C , 24h

Chọn khuẩn lạc điển hình,cấy vào Tryptone, MR-VP, SC Citrate

Thử nghiệm Indol Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống MT EC(+)&IMVi(C++ )

tra bảng MPN

Đếm số ống MT EC(+) & Indol(+)

tra bảng MPN

Coliforms phân E coli

Quy trình định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân

Và E.coli bằng pp MPN

Ghi nhận ống có sinh hơi (+).

- Cấy dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (+) sang các ống chứa canh BGBL.

- Ủ 37 o C ± 1 o C trong 48h.

Quy trình phân tích:

Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi

độ pha loãng.

c/ Định lượng Coliforms phân:

• Cấy ria dịch dịch mẫu từ ống (+) trên môi trường EC sang môi trường EMB ủ 37oC trong 24h

 khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là

khuẩn lạc của Colifoms phân (E coli giả định).

Quy trình phân tích:

- Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1ml cấy vào canh Tryptone, ủ ở 44,5 ± 0,2oC, trong 24h.Nhỏ thuốc thử

Kovac’s vào các ống nghiệm: ống có xuất hiện màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+)

- Thực hiện cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC

Ghi nhận các ống (+) trên môi trường tryptone tương ứng với mỗi độ pha loãng

Quy trình phân tích:

c/ Định lượng Coliforms phân:

d./ Định lượng E coli

• Thực hiện tương tự như trường hợp coliforms phân

để tìm các khuẩn lạc E coli giả định.

• Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực thử nghiệm IMViC

Quy trình phân tích:

(-) (+)

•Khuẩn lạc E Coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính là E coli.

Quy trình phân tích:

-Thực hiện tương tự các ống (+) trong môi trường EC và

tạo được được khuẩn lạc E coli gỉa định trên môi trường

EMB

- Ghi nhận số ống nghiệm có E coli (+) ở mỗi độ pha

loãng của mẫu

Quy trình phân tích:

Quy trình phân tích:

Hệ thống MPN 15 ống

Định lượng Coliforms, Coliform phân

bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:

Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1oC trong 24-48h

Máy đếm khuẩn lạc

Định lượng Coliforms, Coliform phân

bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:

Ngoài lactose mt chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram(+) & chất chỉ thị pH như neutral red, crystal violet Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên mt canh chọn lọc như BGBL

Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương

tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 44oC Mật độ coliforms hay coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lê khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA).

- Violet Red Bile Agar (VRB)

- Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)

- Môi trường canh EC Broth

- Môi trường canh Trypton Broth

- Thuốc thử Kovac’s hay Indol

Môi trường hóa chất:

Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở

37 o C, 24-48h Cấy vào ống canh EC, ủ ở 44 o C, 24-48h

Đếm số ống canh(+) (sinh hơi)

Tính tỉ lệ khẳng định Coliforms

Chọn ống canh (+) (sinh hơi)

Mật độ Coliforms

Cấy vào ống canh Trypton, MR-VP, thạch SC Citrate Thử nghiệm Indol

- Mẫu được đồng nhất hóa và pha loãng, sao cho chưa < 100 tế

bào Coliforms trong 1ml dd pha loãng.

- Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu vào đĩa petri, Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45 o C.

- Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần để trộn đều dd mẫu với mt Để ở nhiệt độ phòng trong 1-2h để hồi phục các tế bào bị tổn thương.

- Bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml mt thạch VRB Chờ cho mt trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37±1 o C trong 24-48h.

- Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng.

Quy trình phân tích:

Thử nghiệm khẳng định Coliforms:

- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy

chuyền sang các ống nghiệm chứa mt BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms tổng số) hoặc mt EC (trường hợp

khẳng định Coliform phân).

- Ủ các ống BGBL ở 37±1 o C và các ống EC ở 44 o C trong 48h.

24 Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục

MT & sinh hơi trong ống Durham.

- Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng

định.

- Trường hợp thử nghiệm khẳng định Coliform phân, các

khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm Indol ở 44 o C Thử nghiệm khẳng định Coliform phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên mt EC vừa là (+) trên thử nghiệm Indol.

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật

độ của Coliforms và Coliform phân.

N

n1vf1+…+nivfi

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được tuyển chọn tại mỗi độ pha loãng v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

R: tỉ lệ khẳng định

Cách tính kết quả:

E.coli bằng pp thử nghiệm IMViC.

Môi trường và hóa chất:

• Môi trường Tryntone Soya Agar (TSA) và môi

trường thạch Violet Red Bile Agar (VRB)

• Môi trường E.coli (EC)

• Môi trường Lactose tryptone Lauryl Sulphate Broth (LST Broth)

• Môi trường Tryptone Broth

• Môi trường MR-VP Broth

• Môi trường thạch Simmon Citrate

• Thuốc thử Kovac’s

Quy trình phân tích

• Mẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng

tương tự như phần Coliforms phân với các bước khẳng định được tiến hành như sau:

– Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy truyền sang môi trường EC ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h  chọn ống

có sinh hơi (+)

– Cấy truyền sang các môi trường sau: Tryptone, MR-VP, thạch Simmon Citrate Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h

– Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate Ghi nhận số khuẩn lạc có thử

nghiệm khẳng định E.coli (+) (IMViC là ++ ).

Cách tính kết quả

• Tính tỷ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli (CFU/ml)

theo công thức trên

Pha môi trường:

Môi trường Lauryl Sulphate Broth:

Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH môi trường

là 6,8±0,2

Môi trường BGBL (Brilliant Green Bile Lactose Broth):

Môi trường EC:

Môi trường tryptone:

Môi trường MR-VP Broth:

Thành phần Khối lượng( thể tích)

1 Casein Pancreatic Digest 3,5g

2 Peptic digest of animal

Môi trường 2:

Môi trường MR-VP Broth:

Môi trường TSA (Tryptone Soya Agar)

Môi trường thạch VRB (Violet Bile Agar):

Thành phần Khối lượng( thể tích)

2 Peptone hoặc gelysate 7g

Môi trường LST Broth (Lactose Tryptone Lauryl sulphate broth)

Môi trường LST Broth (Lactose Tryptone Lauryl sulphate broth)

Thuốc thử Kovac’s:

Thuốc thử α-napthol:

Thuốc thử methyl đỏ:

Thành phần Khối lượng( thể tích)

Hòa tan methyl đỏ vào 300ml ethanol Thêm nước cất vào cho đủ thể tích 500ml

Chân thành cảm ơn Cô & các

bạn đã theo dõi

Nhóm: WAO_One

Võ Lê Chi 50130120

Lê Thị Ngọc Dung 50130219 (nhóm trưởng) Nguyễn Thị Diệu 50130205