Giải mã gen kháng nguyên h, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distemper virus gây bệnh care ở chó tại hà nội

ĐỖ ĐỨC THÀNH GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS GÂY BỆNH CARE Ở CHÓ TẠI HÀ NỘI Ngành: Thú y LUẬN VĂN THẠC

ĐỖ ĐỨC THÀNH

GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ

NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS

GÂY BỆNH CARE Ở CHÓ TẠI HÀ NỘI

Ngành: Thú y

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Đặng Thị Mai Lan - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2 TS Đoàn Thị Thanh Hương - Viện Công nghệ sinh học

Thái Nguyên - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện với sự giúp đỡ của:

- Ths Đỗ Thị Roan, Ths Nguyễn Thị Khuê, Ths Phạm Thị Khánh Linh, KS Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Tác giả

Đỗ Đức Thành

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo: TS Đặng Thị Mai Lan và TS Đoàn Thị Thanh Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin được chân thành cảm ơn tới Ths Đỗ Thị Roan, Ths Nguyễn Thị Khuê, Ths Phạm Thị Khánh Linh, KS Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô, các anh chị em đồng nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y, Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã luôn kịp thời động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Đỗ Đức Thành

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu 4

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 4

1.1.2 Con đường xâm nhập và cách lây lan 4

1.1.3.Cơ chế gây bệnh 5

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 6

1.1.5 Chẩn đoán và phòng, trị bệnh 8

1.2 Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu 14

1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV) 14

1.2.2 Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus Care 17

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

1.4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.2.1 Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội 24

2.2.2 Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV 24

2.2.3 Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR 24

2.2.4 Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H 24

2.2.5 So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV Việt Nam với các chủng của thế giới 24

2.2.6 Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam 24

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa bàn Hà Nội 34

3.1.1 Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận ở Hà Nội 34

3.1.2 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống 35

3.1.3 Tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi 37

3.1.4 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa 39

3.1.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo nhóm đã được tiêm phòng và chưa được tiêm phòng vaccine 40

3.1.6 Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care 42

3.2 Kết quả về số mẫu xét nghiệm và thu nhận gen H của chó mắc bệnh Care 43

3.3 Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide, amino acid của gen H 45

3.4 Kết quả phân tích gen H và so sánh với các chủng của thế giới 49

3.5 Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam 55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

1 Kết luận 58

2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CDV: Canine Distemper Virus

bp: base pair (cặp base)

DNA: Deoxyribonucleic acid

CPE Cyto pathogenic Effect

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

RT-PCR Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction

PCR: Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Bộ mồi thu nhận gen H 25

Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số 27

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số 28

Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR 28

Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR 31

Bảng 3.1 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội 34

Bảng 3.2 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống 36

Bảng 3.3 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi 37

Bảng 3.4 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa 39

Bảng 3.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm phòng vaccine 40

Bảng 3.6 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care 42

Bảng 3.7 Các mẫu virus CDV sử dụng trong nghiên cứu 44

Bảng 3.8 Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy Nanodrop 45

Bảng 3.9 Danh sách các chủng CDV của Việt Nam và thế giới sử dụng trong nghiên cứu 49

Bảng 3.10 Tỷ lệ đống nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng CDV nghiên cứu và các chủng của thế giới 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV) 15

Hình 1.2 Hình thái của virus Canine Distemper 16

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 29

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội 34

Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống 36

Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi 38

Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa 39

Hình 3.5 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm phòng vaccine 41

Hình 3.6 Sản phẩm điện di RNA các chủng CDV thu thập được 43

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen H của 2 mẫu CDV nghiên cứu 45

Hình 3.8 Trình tự nucleotide và amico acid (suy diễn) của gen H chủng CDVHN7 47

Hình 3.9 Trình tự nucleotide và amino acid (suy diễn) của gen H chủng CDVHN6 48

Hình 3.10 Sai khác nucleotide ở cuối gen H dẫn đến sự khác biệt của chủng virus vaccine so với chủng virus nghiên cứu 54

Hình 3.11 Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ nguồn gốc giữa các chủng CDV nghiên cứu và các chủng của thế giới 56

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh Care hay còn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền

nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV)

gây ra Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hô hấp và rối loạn

hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003)

Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó lan ra toàn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước châu Âu Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs., 2006), Thái Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ (Swati và cs.,2015) Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó Chó mắc bệnh Care bao gồm chó chưa được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo ghi nhận của các phòng khám thú y)

Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước

khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi Morbillivirus Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein không cấu trúc

(protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein Trong đó, protein H

và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus Đây

là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc phả hệ (Ke và cs.,2015)

Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm: Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockborn-like, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 và

South America-3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013)

Ở châu Á, một số nước đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm phân tử và xác định được nguồn gốc, genotype của các chủng CDV đang lưu hành Một

số nghiên cứu cho thấy, các chủng CDV của Trung Quốc thuộc genotype Asia-1, các chủng của Hàn Quốc thuộc về hai genotype Asia-1 và Asia-2 (An

và cs., 2008), trong khi các chủng CDV phân lập tại Ấn Độ lại tách riêng khỏi nhóm Asia-1 và Asia-2, gần gũi với các chủng của Thụy Điển, Hungary và Đức (Cheng và cs., 2015; Swati và cs., 2015) Gần đây đã phát hiện genotype Asia-4 tại Trung Quốc và Thái Lan

Gen H (mã hóa protein H) là một trong những gen biến đổi nhất được dùng để xác định mối liên hệ di truyền giữa các chủng (Gámiz và cs., 2011) Gen H có khả năng biến đổi cao, quyết định tính dinh dưỡng của tế bào và vật chủ bằng cách liên kết với phân tử hoạt hóa tế bào lympho báo hiệu (SLAM)

và các thụ thể hoại tử -4 của vật chủ

Tuy nhiên, nhiều sự kiện tiến hóa có thể đã tạo điều kiện cho CDV thích nghi với các vật chủ khác nhau và phải được đánh giá bằng cách giải trình tự bộ gen hoàn chỉnh mới có khả năng xác định được (Duque-Valencia

J và cs., 2019)

Xuất phát từ những điều kiện thực tiễn trên, tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và

xác định phả hệ nguồn gốc của Canine Distemper virus gây bệnh Care ở chó tại Hà Nội”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được tình hình mắc bệnh Care trên chó tại một số quận trên địa bàn Hà Nội

- Nghiên cứu và xác định được gen kháng nguyên H, phân tích được các đặc điểm phân tử, xác định được phả hệ nguồn gốc của virus CDV, xác định genotype của chủng virus gây bệnh Care trên chó tại địa bàn Hà Nội

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp tư liệu khoa học về gen kháng nguyên H, đặc điểm phân tử

và phả hệ nguồn gốc của virus CDV gây bệnh Care trên chó

- Cung cấp thêm thông tin về thành phần, đặc điểm, cấu trúc gen kháng nguyên H của virus CDV nhằm phát triển vắc xin tái tổ hợp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu

Bệnh Care được coi là bệnh cổ điển và phổ biến ở chó trên thế giới cũng như tại Việt Nam Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế và là mối lo ngại cho các nhà chăn nuôi và người nuôi chó Ở Việt Nam trước đây, có thể nói các bệnh về chó chưa được quan tâm đúng mức, ngoại trừ ở các trại nuôi và huấn luyện chó nghiệp vụ Tuy nhiên ngày nay, các bệnh này ngày càng được quan tâm nhiều hơn do tầm ảnh hưởng của nó trong đời sống xã hội Có rất nhiều loại chó quý, đắt tiền đã được nhập về Việt Nam; nhiều bệnh viện, bệnh

xá thú y, phòng khám và các cơ sở chăm sóc chó mèo đặc biệt đã mọc lên trên

cả nước

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

Virus gây bệnh Care là một siêu virus có cấu trúc rất tinh vi thuộc

nhóm paramyxovirus

Bệnh gây hại cho chó ở tất cả mọi lứa tuổi Chó một tuổi trở xuống (2 -

6 tháng tuổi) dễ cảm thụ nhất, tỷ lệ mắc bệnh lên đến 70% Chó đang bú mẹ ít mắc bệnh, nếu chó mẹ có miễn dịch thì chó mẹ có thể truyền miễn dịch thụ động cho chó con qua sữa đầu cho tới hơn 1 tháng, có khi tới 3 tháng

1.1.2 Con đường xâm nhập và cách lây lan

1.1.2.1 Con đường xâm nhập

Virus CDV xâm nhập vào chó qua đường hô hấp, tiêu hóa và da Chó thường bài thải virus sau 7 ngày cảm nhiễm, virus lẫn vào các hạt bụi trong không khí và có thể tồn tại từ 6 - 22 ngày hoặc lâu hơn ngoài môi trường Dịch chảy từ mắt, mũi trong cơn sốt đầu tiên của bệnh chứa rất nhiều virus Mầm bệnh được thải qua dịch tiết mắt, mũi, nước bọt, phân, nước tiểu…

1.1.2.2 Cách lây lan

Bệnh lây do tiếp xúc trực tiếp với con bệnh, con mắc thể ẩn tính, con mang trùng hoặc gián tiếp do thức ăn, nước uống bị nhiễm những chất bài tiết của con bệnh Sự lây nhiễm nhanh hay chậm phụ thuộc vào mật độ chó nuôi tại vùng đó và tỷ lệ chó được tiêm phòng Đặc biệt, virus có thể xâm nhập vào

cơ thể qua da qua các vết thương hở (Nguyễn Vĩnh Phước và cs.,1978)

Mặc dù virus được bài tiết qua môi trường thông qua hầu hết các chất dịch cơ thể, bệnh này ít có khả năng lây lan qua nước tiểu Chất bài tiết qua đường hô hấp từ chó bị ho có thể gây bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993)

Thời gian ủ bệnh của CDV có thể thay đổi từ 1 đến 4 tuần Ban đầu, CDV lây nhiễm qua mô lympho đường hô hấp Giai đoạn đầu virus nhân lên

và phân bố khắp các mô bạch huyết của toàn thân, dẫn đến ức chế miễn dịch

và sốt Giai đoạn thứ hai xảy ra từ 6 - 9 ngày sau khi nhiễm bệnh, các tế bào nhu mô và biểu mô trên khắp cơ thể bị nhiễm trùng (Pope và cs., 2016)

1.1.3 Cơ chế gây bệnh

Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên, virus nhân lên trong mô lymphoid của

hệ thống hô hấp, trong 24 giờ virus sẽ nhân lên ở đại thực bào và phát tán bởi

hệ lymphocyte tới hạch amydal và các hạch bạch huyết 2 - 4 ngày sau số lượng virus tăng lên nhanh chóng và xuất hiện trong máu, amydal, tuyến ức,

lá lách, hạch bạch huyết, tủy xương, mô bạch huyết Trong 4 - 6 ngày tiếp theo, lượng virus sẽ tăng lên nhiều lymphocyte ở lá lách, biểu mô dạ dày và ruột, niêm mạc ruột và tế bào Kuffer trong gan Sự lan truyền của virus trong

hệ bạch huyết gây ra cơn sốt đầu tiên, cùng lúc đó, virus tiếp tục phá hủy các lympho bào (bạch cầu lymphô bào, bạch cầu lympho T) dẫn đến suy giảm bạch cầu (Carter và cs., 1992)

Vào ngày 8 - 9 sau khi bị nhiễm, virus theo máu đến hệ thống thần kinh trung ương và chó có biểu hiện thần kinh hay không phụ thuộc vào hệ miền dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cua vật chủ

Ngày thứ 9 - 14 sau khi nhiễm trùng, hệ miễn dịch của chó bị suy giảm, sức đề kháng kém, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội - ngoại tiết, trong mô dạ dày, ruột, đường hô hấp, niệu quản Virus tồn tại lâu dài khiến triệu chứng lâm sàng của bệnh trở nặng tới khi con bệnh chết

Biểu hiện bệnh và phụ thuộc vào độ tuổi của chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng cũng như độc lực của mầm bệnh (Greene và Appel, 1987)

Thời gian ủ bệnh chó mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, sốt cao 40 - 41°C kéo dài 1 - 2 ngày, chó bỏ ăn, mắt đỏ, sau đó thân nhiệt trở về 38,5 - 39,5°C; chó tỉnh táo hơn 3 - 4 ngày sau, xuất hiện đợt sốt thứ 2 kèm theo chảy nước mắt, nước mũi ban đầu loãng sau đặc dần, đôi khi kèm mủ xanh hoặc máu đen Viêm niêm mạc miệng và hạch amidan Chó ho do viêm thanh quản, viêm phế quản rồi viêm phổi, ban đầu ho khan, sau ho ướt dẫn đến khó thở, nhịp thở tăng rõ, suy nhược cơ thể, bỏ ăn, bạch cầu (lympho bào) giảm

Chó có biểu hiện nôn khan, nôn liên tục, mệt lả, háo nước Sau đó ỉa chảy, lúc đầu phân lỏng có màu xám vàng lẫn bọt và niêm mạc dạ dày, ruột lầy nhày kèm lẫn máu màu cà phê hoặc màu hồng nhớt như máu cá, có mùi tanh khẳm điển hình, giai đoạn cuối phân sẽ gần như nước do virus CDV đã làm hỏng hệ tiêu hóa Chó mất nước và mất chất điện giải nên gầy sút nhanh, mắt trũng, bụng hóp, đi lại không vững, nằm liệt một chỗ, nhiệt độ hạ, loạn nhịp tim

Gương mũi khô và bong tróc, chảy nước mũi có màu xanh, thở khó, thở khò khè Da dầy lên, nổi các nốt chấm đỏ to bằng hạt đỗ xanh, hạt gạo ở những vùng da mỏng, có thể loét, chảy mủ (gọi là các nốt sài) làm lông bết lại, hôi hám, vết thương nhanh chóng lành, không hình thành sẹo Màng kết mạc sung huyết, mắt có nhiều ghèn, bị đục, có thể kèm thêm viêm giác mạc mắt Sau khi bị bệnh từ 10 đến 15 ngày, ở khoảng 80 - 90% số con bị bệnh, da

ở gan bàn chân, mõm có hiện tượng tăng sinh dày lên và cứng lại, có khi bị nứt ra làm cho chó đi khập khiễng

Một số trường hợp chó chạy lung tung không định hướng, sủa rống lên, miệng chảy rãi rớt, ngã và dãy dụa, sau đó chó tỉnh táo lại nhưng rất mệt, chệch choạng, co giật và run rẩy liên tục Chó bài tiết tiểu tiện và đại tiện không tự chủ Cuối cùng nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ dẫn đến liệt chân rồi chết

Từ khi ủ bệnh cho tới khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng khoảng 14

- 18 ngày, chó thường sốt cao từ 3 - 6 ngày sau khi nhiễm Carre thể thần kinh khi chữa khỏi vẫn để lại di chứng (đi xiêu vẹo, mù và điếc, gầy còm )

1.1.4.2 Bệnh tích

Theo Appel và Gillespie (1972), bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá da ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức độ kế phát các loại vi khuẩn mà có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da

Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong nguyên sinh chất tế bào Chó mẹ

có thai thời kỳ cuối mắc bệnh thì chó con sau khi sinh thường xuất hiện triệu chứng toàn thân, tổn thương đường hô hấp trên, viêm mũi, viêm phế quản, viêm kết mạc mắt (Carter và cs., 1992) Viêm kẽ phổi lan toả mà đặc trưng là

sự tăng sinh và dày lên của biểu mô vách phế nang, lòng phế nang bao gồm các tế bào long vách phế nang và đại thực bào

Xác chết thường gầy, mắt trũng sâu, niêm mạc mũi, miệng viêm cata

đỏ mọng, sưng dầy lên, có nhiều chất nhớt Phổi viêm, sung to, mầu đỏ thẫm, khí quản - phế quản có nhiều bọt, nhiều vùng phổi chắc đặc, hạch lympho sung và xuất huyết, trên vùng da mỏng có nốt sài, xoang bao tim, xoang ngực, xoang bụng tích nước và não sung huyết Ruột viêm cata xuất huyết khiến thành niêm mạc bong ra lẫn máu với phân Đây chính là nguyên nhân khiến phân có mùi đặc trưng (Nguyễn Thị Huyền và cs., 2018)

Các biến đổi bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care chủ yếu thể hiện

ở hệ hô hấp (phổi, họng), ở hệ tiêu hóa (ruột non), hạch là nhiều nhất Các bệnh tích đặc trưng của bệnh Care trên chó Phú Quốc như sau: Phổi có hiện tượng viêm xuất huyết ở chó C1, C3, C4, sưng hay xốp dai, có trường hợp phổi viêm dính với thành ngực Bên cạnh đó, sung huyết mạch máu ruột và xuất huyết ruột non ở hầu hết các chó nghiên cứu Hạch lympho sưng to, xuất huyết, mặt cắt của hạch lồi có dịch màu hồng chảy ra Các cơ quan còn lại, sung huyết, xuất huyết ở mạch máu, não, lách nhồi huyết, dạ dày sung huyết, gan hơi sưng, túi mật sưng to, thận sưng và màng thận khó bóc (Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam, 2012)

1.1.5 Chẩn đoán và phòng, trị bệnh

1.1.5.1 Chẩn đoán bệnh

* Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng

Sốt cao, chán ăn hay bỏ ăn, chảy nước mũi, ho, khó thở, có gỉ mắt, nôn mửa và ỉa chảy nặng đối với chó con, xuất hiện các triệu chứng thần kinh trong thời kỳ cuối của bệnh, co giật cơ chân, cơ mắt, không đi được hoặc đi lại khó khăn, lắc đầu, ho ở chó trưởng thành, có các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phía trong đùi có các triệu chứng trên đường tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả năng chó mắc bệnh Care là rất cao (Hồ Đình Chúc, 1993)

Chẩn đoán ban đầu chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng liên quan đến nhiễm trùng Tuy nhiên, hình thức chẩn đoán này còn gặp nhiều khó

khăn vì cần tiến hành phân biệt với các bệnh khác có dấu hiệu hô hấp, thần kinh và/hoặc tiêu hóa, chẳng hạn như bệnh dại, giảm bạch cầu ở mèo,

coronavirus, toxoplasmosis, vi khuẩn enteritides và parvovirus (Angelika K

Loots và cs., 2017)

* Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Bằng xét nghiệm sinh hóa và phân tích nước tiểu

Xét nghiệm huyết thanh học có thể xác định các, kháng thể dương tính, nhưng xét nghiệm này không thể phân biệt giữa các kháng thể tiêm chủng và kháng thể được cơ thể con vật sản sinh ra khi tiếp xúc với virus độc hại

Chụp X-Quang để xác định con vật có mắc bệnh viêm phổi hay không Chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI) có thể được sử dụng

để kiểm tra não đối với bất kỳ tổn thương nào có thể phát triển

Xét nghiệm tế bào để phát hiện sự hiện diện protein đặc hiệu của virus hàm trong nguyên sinh chất, chủ yếu trên lớp tế bào biểu mô (Chó còn sống lấy lớp màng nhầy biểu mô màng sinh dục hoặc niệu đạo Chó đã chết lấy mẫu sớm nhất ở các cơ quan: phổi, bàng quang, thận, não, hạch lâm ba…)

* Chẩn đoán virus học

Phân lập virus: bệnh phẩm máu, lách, phổi, nước và chất bài tiết của con vật

* Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi có gắn receptor đặc hiệu cho virus CDV), virus CDV chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp Bệnh tích tế bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào

Tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi Ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc

vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs., 2005)

* Chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)

ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Trên kháng thể có có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009)

* Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết họp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu

(Nguyễn Hữu Nam, 2010)

* Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno Fluorescent test) có độ sáng của bước sóng nhất định sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên - kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

* Chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR/PCR

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp

mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA

thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT) Sau

đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus Sự hiện diện của sản phấm này thường được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan

đỡ tốn kém hơn

So với các phương pháp chẩn đoán khác, chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử cho độ chính xác tuyệt đối, ngoài ra bằng giải trình tự gen có thể xác định chính xác các type/genotype của virus gây bệnh

* Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh

Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng nguyên của virus Care trong máu, gỉ mắt và nước mũi của chó Hai kháng thể đơn dòng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhóm quyết định kháng nguyên khác nhau của virus Care Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng thứ nhất Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh Kết quả xét nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp

“sắc ký miễn dịch”

Ưu điểm: có độ nhạy cao, có thế chẩn đoán bệnh sớm trong thời gian đầu của bệnh, dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết

tương, huyết thanh, gỉ mắt và nước mũi Có thể đọc kết quả phản ứng sau

Thị trường thuốc thú y Việt Nam hiện nay, vắc xin phòng bệnh Care cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và nhập khẩu từ nước ngoài như Intervet - Hà Lan, Merial - Pháp, Biocan - Cộng hòa Séc, Pfizer - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ Thống kê từ danh mục vắc xin và chế phẩm sinh học được phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới

17 loại vắc xin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum - Merial, Pháp) để phòng và điều trị bệnh này

Xí nghiệp thước thú y Trung ương (Vetvaco) đã chế tạo được vaccine phòng bệnh Care từ chủng virus nhược độc đông khô, sản xuất qua môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus

Khi phát hiện chó nghi mắc bệnh Care phải cách ly triệt để, điều trị bằng kháng huyết thanh hoặc xử lý đúng quy trình để tránh lây lan cho chó khỏe mạnh Chó chết do mắc bệnh phải được chôn sâu, rắc vôi bột Chuồng trại và môi trường nuôi thả phải được vệ sinh sạch sẽ, phun sát trùng đầy đủ bằng Vim iodin hoặc Han iodin 5% hoặc nước vôi 10%

* Trị bệnh

Hiện nay, chưa có loại thuốc kháng virus CDV nào đặc hiệu Chủ yếu

là điều trị triệu chứng và chống phụ nhiễm, hỗ trợ mất nước và chất điện giải Nếu con vật chán ăn hoặc bị tiêu chảy, có thể dùng chất hỗ trợ tiêm, truyền

tĩnh mạch Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc đặc trị tiêu chảy Imodium uống I viên/con, sau 12h mà con vật vẫn bị tiêu chảy thì uống tiếp viên thứ 2; Bisepton: uống nửa viên đối với chó nhỏ, chó to uống 1 viên, uống cho tới khi khỏi tiêu chảy; Hampiseptol: tiêm bắp 1ml/ 10kgP Dùng kháng huyết thanh: liều 15 - 30ml/con, tiêm sớm Khi con vật đã có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có tác dụng Lấy gỉ khỏi mắt và mũi con vật, sau đó làm sạch mắt mũi thường xuyên bằng cách nhỏ nước muối sinh lý 0,9% Giảm tình trạng con vật bị nôn bằng cách tiêm Atropin hay Primeran tiêm dưới da Bổ sung nước và chất điện giải bằng cách cho uống Ozeron 5%, tiêm nước muối sinh lý 0,9% hay nước đường Glucoza 5% vào tĩnh mạch khoeo của chó

Thuốc kháng sinh được sử dụng để kiểm soát các triệu chứng do nhiễm khuẩn thứ phát, gentamycin (tiêm bắp) 8 - 10 mg/kg, 2 lần/ngày, streptomycin (tiêm bắp) 10 - 20mg/kg, 2 lần/ngày Meprobamat (an thần) cho chó nhỏ uống

1 viên/ngày, chó to 2 viên/ngày trong 3 ngày Ngoài ra, phenobarbital và kalibromua có thể được sử dụng để kiểm soát các cơn co giật

Điều trị nhiễm CDV thường điều trị triệu chứng và hỗ trợ vì không có

loại thuốc kháng virus cụ thể nào Các nghiên cứu về tác dụng in vitro của các

hợp chất kháng virus trong điều trị CDV đang được tiến hành nhằm xác định tính an toàn và hiệu quả của chúng trong việc điều trị (Angelika K Loots và cs., 2017)

Krumm S A và cs (2014) đã đánh giá một chất ức chế virus

pan-morbillivirus có sẵn bằng đường uống, ổn định trong thời hạn sử dụng khi điều trị cho chồn bị nhiễm CDV bằng thuốc ức chế và nhận thấy những con chồn này giảm lượng virus trong máu, không có triệu chứng và sẽ hồi phục sau khi nhiễm bệnh trong khi các con chồn đối chứng không qua khỏi

Các hợp chất khác như fucoidan, một polysaccharide sulfat được tìm thấy trong tảo nâu, cũng đã được đánh giá về khả năng hoạt động như thuốc

kháng virus chống lại CDV (Trejo-Avila và cs., 2014) Kết quả in vitro cho

thấy fucoidan có thể ức chế các bước ban đầu của chu trình nhân lên của virus, ngăn chặn mạnh sự hình thành hợp bào trong các tế bào bị nhiễm bệnh

Carvalho O V và cs (2013) đã đánh giá hoạt tính kháng virus của một

số flavonoid (quercetin, morin, rutin và hesperidin) và các axit phenolic (axit

cinnamic, trans - cinnamic và ferulic), tập trung vào khả năng in vitro của

chúng để ức chế các giai đoạn của chu trình sao chép CDV Tất cả các flavonoid và axit phenolic đã chứng minh tác dụng kháng virus chống lại sự lây nhiễm của CDV

Ngoài ra, các phương pháp điều trị nhiễm CDV khác đã được xác định bao gồm liệu pháp tế bào gốc trung mô và sử dụng chế phẩm dược phẩm thú

y chứa các hạt nano bạc (Angelika K Loots và cs., 2017)

1.2 Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu

1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV)

1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus CDV

Virus CDV được bao phủ bởi các gai glycoprotein có kích thước 8 - 14

nm và chứa một nucleocapsid đối xứng xoắn ốc, có chiều dài 1μm và đường kính 18nm (MacLachlan và Dubovi, 2011)

Hệ gen CDV là phân tử RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7

kb, không chứa đầu 5'-UTR và không có chuỗi poly (A) ở đầu 3'-UTR, nhưng

có các phân tử mã hóa thực hiện chức năng của vùng 5'-UTR và vùng UTR Hệ gen của virus mã hóa cho hai protein không cấu trúc (là C và V protein) và 6 protein cấu trúc, gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsidprotein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990)

3'-Hình 1.1 Mô hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV)

(Nguồn: www.veteriankey.com) Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở gen P (Lamb và Kolakofsky, 2001) Chức năng của protein C cho đến nay vẫn chưa được xác định rõ ràng

Protein N: là nucleocapsid, có khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho hệ gen của virus Protein này rất nhạy cảm với những chất phân giải protein

Protein P: là phosphoprotein, có khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của RNA (Sidhu và cs., 1993)

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc (Sidhu và cs., 1993)

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59

- 62 kDa, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào)

H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc virus, khối lượng phân tử 76 - 80 kDa, đóng vai trò gắn virus vào tế bào đích, quyết định tính kháng nguyên của virus

L: Large protein, có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do đó nó thể hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo,1990)

Trong đó, protein H được mã hóa bởi gen H là protein kháng nguyên, quyết định tính kháng nguyên và độc lực của virus Độ dài gen H của các chủng virus Care đã được công bố là 1824 bp Đây là protein có vai trò quan trọng nhất trong hệ gen của virus và thường được sử dụng trong phân tích xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của virus CDV

1.2.1.2 Hình thái của virus CDV

Hình thái virus CDV quan sát được dưới kính hiển vi điện tử có hình

vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi tóc cuộn tròn hình thành Dạng vòng tròn này có đường kính từ 115 - 230 nm Màng cuộn kép có độ dày từ 75 - 85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy và cs., 1989)

Hình 1.2 Hình thái của virus Canine Distemper

(Nguồn: http://www.marvistavet.com/canine-distemper)

1.2.1.3 Phân loại virus gây bệnh Care

Virus gây bệnh Care là Canine Distemper Virus - CDV, thuộc:

Loài: Cannine morbilivirus

Họ: Paramixoviridae

Giống: Morbillivirus

Là một virus có kích thước tương đối lớn, đường kính 150 - 250nm, cấu trúc xoắn, nhân là một RNA sợi đơn, có vỏ Lipoprotein Virus này chỉ có một

serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng được phân lập ở nhiều khu vực địa lý khác nhau trên thế giới và có những đặc trưng riêng (Lê Thị Tài, 2006) Virus CDV có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên và sinh lý với virus gây bệnh sởi ở người và virus dịch tả trâu bò (Lan NT và cs., 2005)

Nguyen Thi Lan và cs (2008) đã mô tả cây phân loại dựa trên việc giải trình tự gen mã hóa protein H Kết quả nghiên cứu cho thấy: trên thế giới có 5 type virus lớn, phân lập tại những vùng địa lý khác nhau, đó là: genotype châu

Âu (Europe), cổ điển (classic type), Asia 1, Asia 2 và America Chủng gây

bệnh tiêu chuẩn là chủng Snyderhill thuộc genotype cổ điển Viện Thú y Việt

Nam đã và đang sử dụng chủng này để công cường độc, kiểm nghiệm hiệu lực của vaccine phòng bệnh Care trên chó (Lê Thị Tài, 2006)

1.2.2 Một số hiểu biết về gen H và tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus Care

Bộ gen của virus Care là sợi RNA đơn khoảng 15,7kb, mã hóa cho 8 loại protein Trong đó, protein H giữ vai trò quan trọng trong việc gắn virus vào tế bào đích, có nhiệm vụ là kênh protein màng tế bào và cũng có thể giữ vai trò là protein kháng nguyên màng của virus Gen mã hóa cho protein H có

sự biến đổi khá lớn giữa các chủng virus khác nhau Chính vì vậy, trình tự nucleotide của vùng gen H thường được lựa chọn để nghiên cứu về dịch tễ học phân tử và đánh giá sự biến đổi di truyền giữa các chủng virus CDV (Hashimoto và cs., 2001; Lednicky và cs., 2004)

Đoạn gen protein H này chứa một khung đọc mở mã hóa cho khoảng

607 axid amin, trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen H của CDV Haku93 và Haku00 cho thấy sự tương đồng cao (Hirama K và cs., 2004), do

đó việc nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus Care dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen H là cần thiết để hiểu mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus nghiên cứu

Có hai kiểu gen hemagglutinin riêng biệt đã được xác định trong virus gây bệnh Care ở chó từ năm 1991 tại Nhật Bản Một là kiểu gen KDK-1 bản địa, chiếm ưu thế về mặt số lượng, trong khi kiểu kia là kiểu gen 98-002 có thể đã phát triển ở Viễn Đông bên ngoài biên giới giữa Nhật Bản và Hàn Quốc (Hashimoto và cs., 2001)

Messling và cs (2001) cho biết: protein H là yếu tố chính quyết định hiệu quả dung hợp Một hệ thống di truyền ngược để tạo ra các CDV tái tổ hợp đã được thiết lập dựa trên một plasmid chứa trình tự kháng gen có chiều dài đầy đủ của CDVOS Các vùng mã hóa của protein H của tất cả các chủng CDV và MVEdm đã được đưa vào nền tảng di truyền CDV và MV, và các vi rút tái tổ hợp rCDV-H5804, rCDV-HOL , rCDV-HEdm, rMV-H5804, rMV-HOL và rMV-HOS đã được phục hồi Do đó, các protein H của hai morbillivirus có thể hoán đổi cho nhau và có đầy đủ chức năng trong một phức hợp dị loại

Gen H của CDV có sự biến đổi di truyền lớn nhất và được sử dụng rộng rãi để khảo sát tính đa hình ở các chủng CDV Dựa trên sự biến đổi của gen H, các chủng CDV có thể được nhóm thành ít nhất 14 dòng di truyền liên quan đến vùng địa lý: châu Á-1, châu Á-2, châu Á-3, châu Á-4, châu Âu, động vật hoang dã châu Âu, giống Bắc Cực, Rockborn-like, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 and South America-3 (Li W và cs., 2018)

Trong số sáu protein cấu trúc được mô tả cho CDV, protein H có sự biến đổi di truyền lớn nhất và là protein quan trọng trong việc gắn virion vào các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ Tính đặc hiệu mà CDV-H tương tác với SLAM và tiềm năng của nó như một yếu tố quyết định phạm vi vật chủ đã được nghiên cứu Các gốc axit amin Y525, D526 và R529 của CDV-H đã được xác định bằng cách gây đột biến hướng vào vị trí để tương tác với SLAM (Angelika K Loots và cs., 2017)

Protein H phần lớn được biết đến là có sự biến đổi kháng nguyên và các kháng thể đối với protein H rất quan trọng đối với khả năng miễn dịch bảo

vệ chống lại nhiễm trùng Do tính chất biến đổi di truyền của nó, gen H đã được sử dụng để xác định các dòng di truyền CDV có liên quan đến nguồn gốc địa lý mà các dòng được phát hiện (Chutchai Piewbang và cs., 2019) []

Các phân tích trình tự gen chỉ ra rằng protein H liên quan đến khả năng

di truyền ở các khu vực địa lý khác nhau, tập trung ở châu Mỹ 1 (bao gồm hầu hết các chủng vắc xin thương mại có sẵn), châu Mỹ 2, châu Á 1 và 2, châu Âu/Nam Mỹ 1, châu Âu động vật hoang dã, Nam Mỹ 2 và 3, Bắc Cực, giống Rockborn, châu Phi và châu Phi 2 Kiểu gen được xác định trên cơ sở các chủng nằm trong cùng một nhánh có sự tương đồng >95%về axit amin trong protein H của chúng Sự lây nhiễm của CDV có thể được ngăn ngừa bằng một phản ứng miễn dịch đầy đủ của vật chủ chống lại protein

H (Angelika K Loots và cs., 2017)

Tại thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Dũng và cs (2018) đã phát hiện được gen H trong 5 chó nuôi bị bệnh tiêu chảy thuộc giống chó Việt Nam và hai trong số các chủng CDV phát hiện được phân lập thành công với toàn bộ bộ gen là CDV/dog/HCM/33/140816 đều thuộc genotype Asia-1 và

có độ tương đồng khá cao (98,4 - 99,3%) với các chủng CDV từ Trung Quốc

Các gen hemagglutinin có 1824 nucleotit và mã hóa cho các protein H,

trong đó cho thấy sự thay đổi lớn nhất trong CDV khi so sánh với morbillivirus khác Gen này có sự khác biệt cao nhất trong bộ gen CDV với tỷ

lệ thay thế trong khoảng 5,4×10-4 -1,8×10-3 lần thay thế nucleotide trên mỗi vị trí, mỗi năm Protein H xác định tính hữu cơ của virus và bắt đầu lây nhiễm bằng cách liên kết với thụ thể truyền tín hiệu phân tử kích hoạt tế bào lympho (SLAM) trong tế bào miễn dịch và thụ thể hoại tử -4 trong tế bào biểu

mô Khi chó hồi phục sau nhiễm trùng/bệnh tự nhiên do CDV, chúng sẽ phát

triển các kháng thể trung hòa chống lại protein H, giúp tạo ra khả năng miễn dịch suốt đời đối với các bệnh (Duque-Valencia J và cs., 2019)

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bệnh sài sốt ở chó đã được phát hiện đầu tiên ở Peru, sau đó lây lan sang Tây Ban Nha trong thế kỷ 17 Theo như mô tả của Antonio de Ulloa vào năm 1746: vào khoảng giữa thế kỷ 18, căn bệnh lần đầu tiên được báo cáo ở Tây Ban Nha, tiếp theo là Anh, Ý (1764) và Nga (1770) (Blancou, 2004) Còn theo Appel và Gillespie (1972), bệnh Care ở chó được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả từ năm 1809 bởi Edward Jenner

Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré đã phân lập được mầm bệnh từ nước mũi của chó bị bệnh, ông đã lọc mẫu bệnh phẩm qua màng lọc

vi khuẩn và đem gây bệnh thực nghiệm cho chó khỏe mạnh khác thì thấy vẫn gây được bệnh Vì thế, ông kết luận nguyên nhân của bệnh là do virus Sau này, người ta lấy tên ông để đặt tên cho mầm bệnh và tên bệnh (David và Martin, 1979) Gần đây, bệnh còn được ghi nhận ở các nước châu Á như Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam (Kubo và cs., 2007; An và cs., 2008; Swati và cs., 2015; Dung và cs.,2016; Đoàn Thị Thanh Hương và cs.,2018)

Vào năm 1923, Putoni lần đầu tiên tạo ra được vaccine nhược độc, tuy nhiên vaccine này độc lực vẫn còn cao Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh mẽ của virus học, nhiều vaccine phòng bệnh Care có hiệu quả đã được tìm ra Trong nhiều thập kỷ, bệnh Care đã được khống chế bằng vắc xin Tuy nhiên thời gian gần đây các ổ dịch lại liên tiếp nổ ra ở nhiều nước khác nhau,

kể cả ở những chó chưa được tiêm vaccine cũng như những chó đã được tiêm vaccine (Demeter và cs., 2010)

Hiện nay, bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể động vật hoang dã Tại Brazil, tỷ lệ nhiễm CDV

ở chó hoang rất cao do chó không được tiêm chủng Do đó, đòi hỏi những nghiên cứu mới về dịch tễ học phân tử Kết quả phân tích sinh thái học vào những năm 1980 cho thấy, các chủng có nguồn gốc từ Brazil chủ yếu tập trung tại Nam Mỹ (SAI) clade 1 Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care nhưng không biểu hiện triệu chứng rõ ràng đã trở thành mối đe dọa nghiêm trọng cho công tác bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Con người là tác nhân làm gia tăng sự tiếp xúc của chó nuôi với động vật hoang dã, kéo theo sự lan truyền bệnh vào các quần thể mới và các vùng địa lý mới Do dân

số của con người trên trái đất tiếp tục phát triển và xâm phạm môi trường sống của các loài động vật hoang dã, khiến bệnh này có thể sẽ tiếp tục lây lan vào quần thể động vật mới Các thống kê cho thấy, bệnh Care là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự tuyệt chủng của chồn chân đen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong của chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005)

Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn đàn (Timothy và cs., 2009) Còn vào năm 2014, virus gây bệnh Care đã được các nhà khoa học xác định là nguyên nhân, ít nhất là một phần của sự suy giảm số lượng hổ ở loài hổ Amulet ở Nga Sikhote - Alin Biosphere Zapovednik (SABZ) Năm 2018, một nghiên cứu mới được công bố trên tạp chí Journal of Wildlife Diseases mô tả trường hợp đầu tiên của bệnh CDV được phát hiện trong một con báo cái 2 tuổi thuộc bộ báo Viễn Đông hoang dã

Li W và cs (2018) đã phân lập thành công 9 mẫu CDV từ bệnh phẩm trong phân và dịch mắt của 20 chó nghi mắc bệnh Kết quả cho thấy, ba mẫu CDV (ANHAO, 11HAO và 2HAO) thu được từ những chó đã được tiêm phòng vaccine và sáu CDV (56hao, xiaosi, 54hao, 55hao, 14hao và 17hao) thu được từ những chó không được tiêm phòng

Các gen H của những virus này được nhân bản với các cặp mồi: WH1 (5′-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3′) và CDV-WH2 (5′- AATGCTAGAGATGGGTTTATT-3′) và giải trình tự Trình tự gen H của ba CDV phân lập từ chó đã tiêm phòng được nộp vào cơ sở dữ liệu NCBI với số gia nhập: MG922460, MG922458 và MG922459

CDV-Chutchai Piewbang và cs (2019), trình tự bộ gen hoàn chỉnh của 8

chủng CDV được phân lập từ chó nhà ở Thái Lan là (CDV1-3, -5, -8 TH/2014) được nhóm lại như một dòng Asia-4 mới, trong khi CDV4, -6, -7 TH/2014 thuộc dòng Asia-1

Cho đến nay đã có tổng số 82 hệ gen của CDV của thế giới được giả

mã toàn bộ hệ gen và đăng kí trên Ngân hàng Gen, bao gồm các chủng virus phân lập tại Mỹ, Anh, Italia, Thụy Điển, Brazil, Canada, Kazakhstan, Uruguay, Trung Quốc, Nhật Bản và một chủng của Việt Nam

1.4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, lần đầu tiên bệnh được phát hiện từ năm 1920 Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước và gây thiệt hại lớn do

tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Trần Văn Nên và cs., 2016)

Ở nước ta, bệnh Care cũng được nhiêu nhà thú y quan tâm Các nghiên cứu của các tác giả nhận thấy chó mắc bệnh Care sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: sốt, viêm phổi, viêm ruột và các nốt sài ở vùng da mỏng Cuối thời

kỳ của bệnh, chó thường có triệu chứng thần kinh Bệnh trở nên trầm trọng hơn

do sự kế phát của vi khuẩn ký sinh sẵn có ở đường tiêu hóa, hô hấp Bệnh Care thường biểu hiện ở hai dạng: viêm phổi và viêm ruột Khi mắc bệnh Care con vật có biểu hiện sốt rất cao trên 40°C Tất cả các giống và lứa tuổi đều mẫn cảm với bệnh sài sốt, tuy nhiên đối với giống chó ngoại và chó non thì chúng lại mẫn cảm hơn (Tô Du và Xuân Giao, 2006) Các nghiên cứu về bệnh mới chủ yếu tập trung về dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích và một số biến đối bệnh lý

của bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993; Lê Thị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam, 2012; Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên, 2010)

Việc phân lập virus và nghiên cứu gen học hệ gen virus vẫn còn rất hạn chế Năm 2008, một chủng virus Care (CDV-768) đã được nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh thực nghiệm (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015) Một số nghiên cứu khác cũng đã được thực hiện trong thời gian gần đây nhưng chỉ tập trung vào triệu chứng lâm sàng và bệnh lý (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015; Trần Văn Nên và cs., 2016)

Cho đến nay đã có một số công bố về sinh học phân tử giải mã 01 hệ gen virus Care tại Việt Nam (Dung và cs., 2016) Khi so sánh về trình tự nucleotide ở gene H giữa 5 chủng virus nghiên cứu với nhau kết quả thu được chủng CDV-VNUA-768 có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-02H, CDVHUA-03R, CDV-HUA-04H và CDV-HUA-05P lần lượt là: 126,

131, 154, 16 vị trí Chủng CDVHUA-02H có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-03R, CDV-HUA-04H và CDV-HUA-05P lần lượt là: 7,

153, 124 vị trí Chủng CDV-HUA-03R có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-04H và CDVHUA-05P lần lượt là 156 và 128 vị trí Chủng CDV-HUA-04H có 154 vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-05P (Trần Văn Nên và cs., 2017)

Lan và cs (2005), đã nghiên cứu thành công đặc tính sinh trưởng cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Qua đó, tác giả cũng chỉ ra

tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus

Năm 2018, Nguyễn Văn Dũng và cs (2018) đã nghiên cứu và phát hiện gen H của CDV với các chủng phân lập là CDV/dog/HCM/33/140816 và CDV/dog/HCM/38/140827 được phân lập thành công từ 5 chủng được phát hiện toàn bộ gen H với các bệnh tích điển hình là tế bào nhiễm tạo thể hợp bào

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chó nghi mắc bệnh Care ở mọi lứa tuổi đã được kiểm tra dương tính bằng test thử nhanh One - step Canine Distemper Virus Ag test (IMMUNO)

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: một số phòng khám tại quận Cầu Giấy, Hà Đông

và Nam Từ Liêm trên địa bàn Hà Nội

- Địa điểm phân tích mẫu: Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2019 đến tháng 8/2020

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội

- Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận ở Hà Nội

- Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống, theo lứa tuổi, theo mùa, theo nhóm đã được tiêm phòng và chưa được tiêm phòng vaccine

- Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care

2.2.2 Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV

2.2.3 Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR

2.2.4 Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H

2.2.5 So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV Việt Nam với các chủng của thế giới

2.2.6 Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1.1 Nguyên liệu

Mẫu bệnh phẩm: gỉ mắt, gỉ mũi, phân, máu, thu nhận trên chó mắc bệnh Care ở mọi lứa tuổi (cho kết quả dương tính với kit thử nhanh) phân lập tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm và Cầu Giấy trên địa bàn TP Hà Nội

2.3.1.2 Các dụng cụ và thiết bị

- Máy móc, dụng cụ và thiết bị dùng cho sinh học phân tử: thuộc phòng thí nghiệm của phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.1.3 Hóa chất

- Hoá chất: Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo - Pháp), đệm TAE (1X) Các mồi dùng cho phản ứng PCR, Macrogen (Hàn Quốc) Dung

dịch dùng để điện di trên thạch agarose

- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp

- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA của hãng Thermo (Mỹ)

- Bộ kit Dream Taq PCR master mix (2X) để thực hiện phản ứng PCR của hãng Thermo (Mỹ)

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Thermo (Mỹ)

Bảng 2.1 Bộ mồi thu nhận gen H

Tên mồi Trình tự (5’….3’) Độ dài

C9071H-R ATTTGGGCTATCTAGATGGACC 22 9049-9071 Mồi cho phản ứng

PCR

(Nguồn: Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và

Công nghệ VN)

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Để thu nhận hệ gen virus chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo sơ đồ sau đây

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

2.3.2.2 Phương pháp khảo sát triệu chứng lâm sàng

Lập sổ theo dõi, ghi đầy đủ thông tin: lứa tuổi, giới tính, giống, địa phương, tình trạng tiêm phòng vaccine… thông qua chủ nuôi

Chó nghi mắc bệnh sẽ được khảo sát đầy đủ thông tin về triệu chứng lâm sàng ở: mắt, mũi, nôn mửa, tiêu chảy, gan bàn chân, nốt sài, biểu hiện thần kinh… Sau đó dùng test để kiểm tra và xác định chó mắc bệnh

* Biểu hiện của chó nghi mắc bệnh: Chó ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn hoặc

bỏ ăn Con vật nôn ra bọt vàng, bọt trắng, thời gian nôn kéo dài Chảy nước mũi, lâu dần sẽ thở gấp, thở khò khè Tiêu chảy kéo dài, phân nhày, mùi tanh Chó kiệt sức nhanh, co giật và chịu tác động trực tiếp vào hệ thần kinh Mắt đục dần và có mủ, loét Xuất hiện chấm đỏ ở bẹn và bụng dưới Phân chuyển màu theo các giai đoạn bệnh cho tới khi ra máu tươi và chết

Thu mẫu bệnh

phẩm

Tách chiết ARN tổng số

Chuyển đổi cDNA

Giải trình tự

Tinh sạch sản phẩm PCR

hệ Thực hiện phản ứng PCR

2.3.2.3 Phương pháp thu thập bệnh phẩm

Dùng tăm bông vô trùng lấy các mẫu bệnh phẩm (gỉ mắt, gỉ mũi, phân) thu nhận trên chó nghi mắc bệnh Care, sau đó cho vào túi nilon và buộc kín,

có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết

Dùng xilanh lấy máu tĩnh mạch, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh và đem về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học

2.3.2.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Mẫu bệnh phẩm được hòa tan lại trong 200 µl nước vô trùng trước khi dùng để tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số

Bước 1 Bổ sung 350 µl RLT Working vào ống eppendorf 2ml sạch

Bước 2 Thêm 150 µl mẫu và lắc đều

Bước 3 Bổ sung 350µl Ethanol 70%, lắc đều và đảo trộn

Bước 4 Chuyển toàn bộ dịch lên cột, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1

phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng

Bước 5 Bổ sung 700µl dung dịch RW1, ly tâm 10.000 vòng/phút trong

1 phút rồi bỏ dịch phía dưới ống hứng

Bước 6

Thêm 500µl RPE Working, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút và bỏ dịch dưới ống hứng Làm khô cột bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 7

Bổ sung 30µl dịch Elution Buffer vào giữa màng lọc của cột, ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút để thu dịch

Bước 8 Bảo quản RNA tổng số ở -800C cho đến khi sử dụng

2.3.2.5 Phương pháp chuyển đổi cDNA

Sợi cDNA được tổng hợp theo phương pháp chuyển đổi từ RNA tổng

số của virus bằng mồi xác suất (hexamer) sử dụng bộ kit và enzyme Maxima

Reverse Transcriptase của hãng Fermentas Phản ứng được thực hiện ở 500C trong 1 giờ, sau đó dừng phản ứng ở 800C trong 5 phút

Sản phẩm cDNA được bảo quản -200C cho đến khi được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR thu nhận vùng gen H của virus Thành phần phản ứng chuyển cDNA được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số

RiboLock™Rnase Inhibitor (50U/µl) 0,5 µl

Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl) 1 µl

2.3.2.6 Phương pháp PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn cDNA thu vùng gen H của mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng bộ kit DreamTaq PCR Mastermix (2X) do hãng Thermo Scientific (Mỹ) cung cấp và phản ứng thực hiện trên máy PCR (PTC-100) Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong bảng 2.4 và hình 2.2

Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR

Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Sản phẩm PCR được bảo quản ở -200C Kết quả phản ứng PCR được đánh giá bằng điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Sản phẩm chất lượng tốt chúng sẽ được dùng để giải trình tự trực tiếp

2.3.2.7 Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose

Nguyên lý: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính do có chứa gốc phosphat trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điện (pI) đặc trưng cho kích thước của mỗi loại phân tử acid nucleic Các phân tử có trọng lượng cao di chuyển chậm hơn các phân tử có trọng lượng thấp Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm gel trong Ethidium bromide và soi dưới tia cực tím

Có 2 loại gel sử dụng trong kỹ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử là: Gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA

Một trong các chất chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của

thực khuẩn Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzym giới hạn HindIII thành 8

phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb Tuy nhiên, trên thực tế chỉ nhìn được 7 băng, còn băng có chiều dài