Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta

Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp thay đổi một yếu tố OFAT .... DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTIC50 Nồn

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

- -

NGÔ MINH KHOA

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CHIẾT XUẤT FLAVONOID

TỪ VỎ CỦ HÀNH TA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo

PGS TS NGUYỄN THU HẰNG, Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội

Cô là người đã thay đổi nhận thức của tôi về dược liệu, là người đã truyền cho tôi một tinh thần khoa học và ngọn lửa đam mê nghiên cứu cháy bỏng Với tôi, cô không chỉ là người thầy luôn tận tâm truyền đạt và chỉ bảo tri thức, cô còn là một người thân luôn tận tình đồng cảm, lo lắng và động viên tôi trước mỗi khó khăn và thử thách trong cuộc sống

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Văn Phương, người đã luôn

đồng hành, dìu dắt tôi từ những ngày đầu tiên trong suốt thời gian tôi may mắn được tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược liệu Không chỉ là người luôn cho tôi những lời khuyên trong quá trình thực nghiệm khoa học, anh còn như một người anh trai sẵn sàng chia sẻ cùng tôi mọi vấn đề dù là nhỏ nhất

Tôi xin cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của GS TS Phan Kế Lộc và ThS Nguyễn Anh Đức, thầy đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc giám định tên khoa học và lưu

tiêu bản mẫu cây

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin cảm ơn các thầy cô đang công tác tại bộ môn Dược liệu và các thầy cô trong Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn đến các anh chị sinh viên khóa 69 và các bạn sinh viên khóa 70 cùng làm đề tài tại bộ môn đã luôn chia sẻ cùng tôi những kinh nghiệm quý báu

và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến bố mẹ, anh chị, những người bạn luôn động viên, khích lệ để tôi có thể đạt được kết quả này

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về củ hành ta 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của thứ Allium cepa var aggregatum G.Don 3

1.1.2 Thành phần hóa học của củ hành ta 3

1.1.3 Tác dụng sinh học của củ hành ta 7

1.1.4 Công dụng 10

1.1.5 Các nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ củ hành ta 10

1.2 Tổng quan về các phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu 11

1.2.1 Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) 11

1.2.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 12

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, phần mềm 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta 20

2.3.2 Phương pháp chiết xuất 20

2.3.3 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

flavonoid từ vỏ củ hành ta 21

2.3.3.1 Các yếu tố khảo sát và thông số đánh giá 21

2.3.3.2 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 22 2.3.4 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao chiết vỏ củ hành ta 24

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta 26

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) 28

3.3 Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 36

3.3.1 Kết quả thiết kế thí nghiệm và tiến hành thực nghiệm 36

3.3.2 Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất 37

3.4 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của mẫu cao vỏ củ hành ta chiết xuất tại điều kiện tối ưu 48

3.5 Kết quả nâng cấp quy mô chiết xuất 48

3.6 Bàn luận 49

3.6.1 Về nguyên liệu vỏ củ hành ta 49

3.6.2 Về kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta 50

3.6.3 Về tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao chiết vỏ củ hành ta 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym

A Chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu trắng

UV-Vis Quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến

OFAT Phương pháp khảo sát thay đổi một yếu tố

DoE Phương pháp thiết kế thí nghiệm

RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng

CCD Mô hình phức hợp trung tâm

ANOVA Phương pháp phân tích phương sai

XO Xanthin oxidase

LOD Giới hạn phát hiện

LOQ Giới hạn định lượng

MLR Hồi quy tuyến tính đa biến

ANN Mạng neuron nhân tạo

Y1 Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được (mg/g)

Y2 Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được (%kl/kl)

X1 Nhiệt độ chiết xuất

X2 Thời gian chiết xuất

X3 Dung môi chiết xuất

MLR1 Mô hình biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ ethanol

đến Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được xây dựng bằng phương

pháp hồi quy tuyến tính đa biến MLR2 Mô hình biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ ethanol

đến Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được xây dựng bằng phương pháp hồi

quy tuyến tính đa biến ANN1 Mô hình biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ ethanol

đến Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được xây dựng bằng phương

pháp mạng neuron nhân tạo ANN2 Mô hình biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ ethanol

đến Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được xây dựng bằng phương pháp

mạng neuron nhân tạo

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 1.1 Cấu trúc của các hợp chất flavonoid trong củ hành ta 4

2 2.1 Cách bố trí hỗn hợp phản ứng trong các giếng 25

Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp phương pháp xác

định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ

hành ta

25

4 3.2 Ma trận thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm 36

5 3.3 Kết quả đánh giá mô hình MLR1 và MLR2 bằng ANOVA 39

6 3.4 Kết quả phân tích thống kê hai mô hình MLR1 và MLR2 39

7 3.5 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa dự đoán và thực nghiệm

8 3.6 Kết quả đánh giá mô hình xây dựng bằng phương pháp

9 3.7 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa dự đoán và thực nghiệm

10 3.8 Kết quả so sánh mô hình xây dựng bằng hai phương pháp

13 3.11 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

của mẫu cao chiết xuất ở điều kiện tối ưu 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

1 1.1 Sơ đồ các bước tối ưu hóa quá trình chiết xuất sử dụng

3 1.3 Mô hình phức hợp trung tâm CCD cho 2 và 3 biến đầu vào 15

7 2.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất vỏ củ hành ta 21

8 3.1 Hình ảnh phổ UV-Vis của quercetin (tạo phức màu với

15 3.8 Mô hình MLR1 và MLR2 biểu diễn dưới dạng các đồ thị

16 3.9 Mô hình ANN1 và ANN2 biểu diễn dưới dạng đồ thị 3D 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hành ta (Allium cepa var aggregatum G.Don) là một loại thực phẩm và gia vị

được sử dụng phổ biến ở Việt Nam Nhờ điều kiện khí hậu thuận lợi và nhu cầu sử dụng lớn, cây hành ta được trồng lấy củ với sản lượng lớn ở nhiều vùng trên cả nước Không chỉ là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cho người dân, củ hành ta còn là đối tượng được quan tâm của các nhà nghiên cứu dược liệu với các tác dụng như hạ đường huyết,

hạ lipid máu, chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, [22], [27], [30]

Thành phần hóa học chính của củ hành ta là flavonoid - một nhóm polyphenol tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh [15] Flavonoid trong củ hành tập trung chủ yếu ở lớp

vỏ ngoài, phần lớn là quercetin và các dẫn chất [48] Quercetin được đánh giá là một trong những flavonoid có hoạt tính mạnh nhất với các tác dụng như chống oxy hóa, bảo

vệ tim mạch, chống viêm, chống dị ứng và đáng chú ý là hoạt tính ức chế mạnh và rõ rệt xanthin oxidase - enzym chìa khóa trong bệnh gút [7], [12], [57] Với những tác dụng trên, một số sản phẩm từ quercetin đã được phát triển trên thế giới và được sử dụng trong

hỗ trợ phòng và điều trị bệnh gút Mặc dù lớp vỏ ngoài củ hành ta rất giàu quercetin và các dẫn chất nhưng cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết vỏ ngoài củ hành ta đối với hoạt tính enzym xanthin oxidase [48] Do đó, nhóm nghiên cứu ở Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lớp vỏ ngoài, phần ruột và toàn củ hành ta đối với hoạt tính

enzym xanthin oxidase in vitro Kết quả bước đầu cho thấy cao chiết methanol vỏ củ

hành ta thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh và vượt trội so với phần ruột và toàn củ (giá trị IC50 của cao chiết lớp vỏ ngoài đạt 21,09 µg/ml trong khi phần ruột và toàn củ đều có giá trị IC50 lớn hơn 300 µg/ml) Từ đó gợi ý rằng nghiên cứu vỏ củ hành

ta theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase để phát triển sản phẩm phòng và điều trị bệnh gút là một hướng đi triển vọng Tuy nhiên, quá trình nghiên cứu phát triển thuốc thảo dược hiện nay là một quá trình phức tạp, trong đó chiết xuất dược liệu là giai đoạn có ảnh hưởng quyết định đến thành phần, chất lượng và tác dụng điều trị của sản phẩm cuối cùng Vậy nên, để có thể hiện thực hóa việc phát triển các sản phẩm phòng

và điều trị bệnh gút từ vỏ củ hành ta, việc nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ dược liệu này là một bước đi thiết yếu cần được tiến hành Mặc dù vậy, trên thế giới vẫn chưa có nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta

Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ

hành ta” được thực hiện với ba mục tiêu:

1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành

ta

2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của mẫu cao vỏ củ hành ta chiết

xuất ở điều kiện tối ưu

3 Nâng cấp quy mô chiết xuất lên 20 lần và đánh giá độ ổn định của quy trình

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về củ hành ta

Tên khoa học của cây hành ta: Allium cepa var aggregatum G.Don, họ Hành

(Alliaceae) [50]

Tên đồng nghĩa: Allium ascalonicum L [3], [50]

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của thứ Allium cepa var aggregatum G.Don

Cây thảo, sống nhiều năm, có mùi thơm đặc biệt; thân hành gồm 3-6 thân tập trung, hình trứng thuôn, hình trứng hẹp hoặc hình trụ trứng, dài 3-5 cm, đường kính 1-

2 cm, có lớp áo mỏng dạng màng màu nâu đỏ hoặc trắng vàng bao ngoài Lá 4-8, hình trụ dài 15-30 cm, đường kính 3-4 mm, màu xanh sẫm, hơi có phấn trắng, rỗng, hẹp dần

về phía chóp Trong điều kiện tự nhiên thường không ra hoa, một số trường hợp ra hoa sau vòng sinh trưởng đầu tiên của cây Trục mang hoa hình trụ rỗng, dài 60 cm, có bẹ

lá bao quanh ở phía gốc Cụm hoa có 2 mo hình bướm dài 1,5 cm Cụm hoa kiểu tán, hình cầu, hoa mọc dầy Cuống hoa đều, dài 3 cm Bao hoa màu trắng, cánh hoa hình trứng thuôn, kích thước 4x2 mm, có gân xanh ở giữa Chỉ nhị đều, dài 4 mm, gắn với cánh hoa ở 1/5 chiều dài, các chỉ nhị bên ngoài hình dùi trống, chỉ nhị bên trong phình

ra ở phía dưới Vòi nhụy thò Bầu nhụy hình gần cầu, có phần nhô ra hình móc ở phía gốc [3], [50]

Cây hành ta (Allium cepa var aggregatum G.Don) có nguồn gốc từ thị trấn

Ascalon, Palestin và từ thị trấn Echalogne, Pháp [15] Hiện nay, cây hành ta được trồng

phổ biến để lấy củ làm gia vị và thực phẩm ở Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới như Iran, Pháp, Ý, Trung Quốc, Ba Lan,…

1.1.2 Thành phần hóa học của củ hành ta

Củ hành ta là thân hành của cây hành ta, là cơ quan dự trữ dinh dưỡng của cây, gồm một đoạn thân ngắn mọc thẳng đứng, được bao phủ bởi các lá biến dạng dày và mọng nước Thành phần hóa học trong củ hành ta được chia thành 4 nhóm chính: flavonoid, tinh dầu, saponin và một số hợp chất khác

1.1.2.1 Flavonoid

Flavonoid là thành phần hóa học chính của củ hành ta [15] Có 9 flavonoid đã

được tìm thấy trong củ hành ta, các hợp chất này được kí hiệu từ 1 đến 9 và được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Cấu trúc của các hợp chất flavonoid trong củ hành ta

Quercetin-[15], [37], [48]

5

3,4’-di-O-[15]

Trong số các flavonoid đã được xác định của củ hành ta, quercetin và các dẫn chất

là thành phần chính [7], [37], [48] Tổng lượng flavonoid toàn phần trong củ hành ta tính theo quercetin được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) là 8,3 µg/g dược liệu trong nghiên cứu của P Seyfi và cộng sự [42] Theo

P Bonaccorsi và cộng sự, lớp vỏ ngoài của củ hành ta thu hái tại Pháp và Ý có hàm lượng quercetin-4’-glucosid lần lượt là 478-509 và 393-452 mg/kg dược liệu, cao gấp

hơn 2 lần so với hành tây (A cepa L.); trong khi đó, hàm lượng quercetin-3,4’-diglucosid

lần lượt là 531-605 và 516-572 mg/kg dược liệu, so sánh với hành tây là 321-368 mg/kg [9] Tuy nhiên, theo Wiczkowski và cộng sự, có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng quercetin giữa lớp vỏ khô bên ngoài và phần ruột bên trong của củ hành ta Kết quả của nghiên cứu này cho thấy quercetin và các dẫn chất tập trung chủ yếu ở lớp vỏ ngoài với hàm lượng cao gấp 23 lần so với phần ruột bên trong (111 µmol/g so với 4,93 µmol/g) [48] Đồng thời, đối với phần ruột, quercetin tồn tại chủ yếu ở dạng glycosid với tỷ lệ lên đến hơn 99%, trong khi ở phần vỏ lại chủ yếu tồn tại dưới dạng aglycon với hàm

lượng trên 83% [48] Điều này cho thấy sự khác biệt đáng kể về thành phần hóa học giữa lớp vỏ ngoài và phần ruột bên trong của củ hành ta

Ngoài ra, bằng việc kết hợp các phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao, khối phổ

phân giải cao, chiết pha rắn và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (HPLC - HRMS - SPE - NMR), Kongstad và cộng sự đã chỉ ra quercetin aglycon trong củ hành ta tồn tại dưới

các dạng monomer, dimer, trimer và tetramer [26]

1.1.2.2 Tinh dầu

Củ hành ta chứa 0,3-0,5% tinh dầu [45] Bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp

khối phổ (GC-MS), thành phần trong tinh dầu của củ hành ta được xác định bao gồm 42

hợp chất [31], trong đó thành phần chính là các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh [30], [31], [45] R Tocmo và cộng sự (2014) đã xác định 16 hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh

có mặt trong tinh dầu củ hành ta với tổng hàm lượng chiếm đến 76,47% [45], các hợp

chất này được kí hiệu từ 10 đến 25 và được trình bày chi tiết ở Phụ lục 1

Ngoài ra, trong tinh dầu của củ hành ta còn chứa các thành phần khác như borneol, methyl eugenol, methyl chavicol, các aldehyd và các este của acid béo [31]

1.1.2.3 Saponin

Các saponin được xác định trong củ hành ta đều có khung furostanol [15], [23] Năm 2002, Fattorusso và cộng sự đã phân lập được 2 saponin khung furostanol từ dịch chiết methanol của củ hành ta và đặt tên là Ascalonicosid A1/A2 và Ascalonicosid

B, cùng với đó là 2 dẫn chất O-methyl ở vị trí C10 của Ascalonicosid A1/A2 [15] Đến năm 2007, L Kang và cộng sự tiếp tục phân lập được thêm 4 saponin khung furostanol

là Ascalonicosid C, Ascalonicosid D, Dichotomin và Parisaponin I [23] Các saponin

này được kí hiệu từ 26 đến 32 với cấu trúc hóa học được trình bày chi tiết ở Phụ lục 2

1.1.2.4 Một số hợp chất khác

Một số các hợp chất khác cũng được tìm thấy trong củ hành ta như alcaloid (3,41%) [40], tanin (0,049%) [40], các acid hữu cơ và acid béo [31]

1.1.3 Tác dụng sinh học của củ hành ta

1.1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết

Tác dụng hạ đường huyết của cao chiết methanol củ hành ta được đánh giá trên đối tượng chuột nhắt trắng Wistar trong nghiên cứu của L Moradabadi và cộng sự [33] Kết quả cho thấy trong thử nghiệm dung nạp glucose đường uống, cao chiết methanol

củ hành ta được sử dụng với liều 250 và 500mg/kg thể trọng chuột có tác dụng hạ glucose máu tại thời điểm 30 phút lần lượt là 12% và 11%, tại thời điểm 60 phút là 6%

và 8%, tại thời điểm 120 phút là 9% và 12% so với nhóm đối chứng [33]

Ngoài ra, liên quan đến việc xác định cơ chế tác dụng trên đường huyết của dịch

chiết củ hành ta, K.T Kongstad và cộng sự đã chứng minh tác dụng ức chế enzym glucosidase in vitro của dịch chiết methanol lớp vỏ ngoài, lớp trong và toàn bộ củ thể

α-hiện qua giá trị IC50 lần lượt là 47; 1078 và 970 µg/ml; và với dịch chiết ethyl acetat có giá trị IC50 lần lượt là 12, 35 và 52 µg/ml [26] Kết quả trên cho thấy dịch chiết lớp vỏ

ngoài có tác dụng ức chế α-glucosidase rõ rệt hơn so với phần ruột bên trong và toàn củ

Mặt khác, nghiên cứu này đã xác định các chất đóng vai trò quan trọng trong tác dụng

ức chế enzym của dịch chiết củ hành ta là quercetin và các dẫn chất dimer, trimer và tetramer [26] Điều này rất phù hợp với việc dịch chiết ethyl acetat có tác dụng ức chế

α-glucosidase mạnh hơn rõ rệt so với dịch chiết methanol [26], bởi ethyl acetat là dung

môi hòa tan tốt và chọn lọc hơn đối với quercetin Từ kết quả trên có thể thấy, quercetin

và nhóm hợp chất flavonoid đóng vai trò quan trọng trong tác dụng hạ đường huyết của

thấy trong củ hành ta có chứa hàm lượng phenolic tính theo acid gallic là 17,18 mg/1g dược liệu [27] Khả năng chống oxy hóa xác định theo các phương pháp TEAC, DPPH

và FRAP của dịch chiết methanol - nước củ hành ta lần lượt là 34,40; 5,71 và 6,40 µmol

Trolox/g dược liệu [27] Đồng thời, nghiên cứu cũng đã xác định được mối quan hệ chặt chẽ giữa TPC và TAC cho thấy các hợp chất polyphenol nói chung cũng như flavonoid nói riêng là nhóm chất có vai trò quan trọng trong tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết

củ hành ta [27]

Mặt khác, quercetin, một flavonoid là thành phần chính trong củ hành ta, đã được

chứng minh tác dụng chống oxy hóa in vivo và in vitro thông qua tác động trên hệ thống

glutathion, tác dụng ức chế các enzym oxy hóa, dọn các gốc tự do bởi một số nghiên cứu trên thế giới [7], [12], [51]

1.1.3.3 Tác dụng chống viêm

K Mansouri và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính in vivo của cao

chiết nước củ hành ta trên mô hình tăng tính thấm thành mạch bởi acid acetic trên chuột theo phương pháp của Whittle [47] Các nhóm chuột được sử dụng mức liều 25, 50, 100

và 200 mg/kg thể trọng có tác dụng ức chế sự tăng tính thấm thành mạch với các giá trị phần trăm ức chế lần lượt là 10,2%; 21,4%; 38,3% và 80,1%, so với thuốc đối chứng là indomethacin có tác dụng ức chế 35,4% sự tăng tính thấm thành mạch với mức liều 5mg/kg thể trọng [32] Mặt khác, Maleki và cộng sự đã chỉ ra rằng, flavonoid là nhóm chất có tác dụng ức chế các enzym và các yếu tố phiên mã có liên quan trực tiếp đến các chất trung gian hóa học quan trọng trong phản ứng viêm [28] Ngoài ra, quercetin cũng

đã được chứng minh tác dụng chống viêm trong điều kiện in vitro như ức chế hoạt động của các enzym gây ra phản ứng viêm như COX, LOX, và in vivo trên một số động vật;

tuy nhiên cơ chế tác dụng vẫn chưa được nghiên cứu cụ thể [12] Do đó có thể thấy rằng, flavonoid là một nhóm chất đóng vai trò quan trọng trong tác dụng chống viêm của củ hành ta

1.1.3.4 Tác dụng hạ lipid máu

Nghiên cứu trên chuột nhắt trắng Wistar giống đực của Owoyele cho thấy cao chiết ethanol củ hành ta được sử dụng với liều 100 và 200 mg/kg thể trọng/ngày kéo dài trong vòng 21 ngày có tác dụng giảm mạnh cholesterol toàn phần và lipoprotein tỷ trọng thấp, giảm nhẹ lipoprotein tỷ trọng cao so với nhóm chứng sử dụng nước muối sinh lý [36] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Sani và cộng sự trên đối tượng chuột bị tiểu đường, nhóm chuột sử dụng cao chiết methanol từ củ hành ta với liều 500mg/kg thể trọng/ngày trong thời gian 21 ngày có ghi nhận sự giảm đáng kể 2 chỉ số là VLDL và LDL, lần lượt

là 24% và 28% [40] Kết quả này tương đối phù hợp với kết quả của tác giả Owoyele đã công bố trước đó [36]

1.1.3.5 Tác dụng chống ưng thư và gây độc tế bào

Hoạt tính chống tăng sinh và phát triển tế bào của dịch chiết ethanol củ hành ta

được đánh giá in vitro trên các dòng tế bào khối u khác nhau như dòng tế bào ung thư

sợi ở chuột (Wehi164), dòng tế bào T trong bệnh ung thư bạch cầu ác tính ở người (Jurkat) và dòng tế bào ung thư hồng cầu ở người (K562), so sánh với nhóm tế bào lành

là tế bào nội mô tĩnh mạch rốn ở người (HUVEC) trong nghiên cứu của K.Mansouri và cộng sự [32] Khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư được đánh giá qua giá trị

GI50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh của tế bào) Kết quả cho thấy tác dụng chống tăng sinh của dịch chiết ethanol củ hành ta trên cả 3 dòng tế bào đều phụ thuộc vào liều

sử dụng, trong đó khả năng ức chế tăng sinh trên dòng tế bào K562 và dòng tế bào Jurkat

là rõ rệt nhất (GI50=100 µg/ml), đối với dòng tế bào Wehi164 và dòng tế bào lành HUVEC thể hiện tác dụng ức chế yếu (GI50=400 µg/ml) [32] Kết quả về tác dụng gây độc tế bào thể hiện qua giá trị IC50 (nồng độ gây chết 50% số lượng tế bào) tương đồng với khả năng ức chế sự tăng sinh, khả năng gây độc tế bào của dịch chiết củ hành ta thể hiện rõ rệt trên dòng tế bào K562 và Jurkat (IC50=100 µg/ml), tác dụng yếu hơn được thể hiện trên dòng Wehi164 (IC50=400 µg/ml) và hầu như không có độc tính trên dòng

tế bào lành HUVEC (IC50=1600 µg/ml) [32]

1.1.3.6 Tác dụng chống hình thành mạch

Hình thành mạch (Angiogenesis) là tình trạng bệnh lý được đặc trưng bởi sự hình

thành nhiều các mao mạch nhỏ từ xung quanh một mạch máu ban đầu dẫn đến sự tăng sinh bất thường của các tế bào, gây ra nhiều tình trạng bệnh lý, dẫn tới hình thành những khối u và di căn [10], [42] P Seyfi và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống hình thành

mạch của các phân đoạn dịch chiết củ hành ta in vitro trên mô hình tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVEC) [16] và in vivo theo phương pháp quan sát sự phát triển mạch

máu trên màng chorioallantoic của trứng gà (CAM) [25] Kết quả cho thấy phân đoạn ethyl acetat được tách từ dịch chiết ethanol 50% của củ hành ta thể hiện tác dụng ức chế

sự hình thành mạch máu trên cả 2 mô hình in vitro và in vivo [42] Ngoài ra, phân đoạn

này vẫn thể hiện tác dụng ức chế rõ rệt sau khi xử lý ở điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp Theo P Seyfi, tác dụng chống hình thành mạch của củ hành ta được cho là do vai trò của các flavonoid có độ ổn định nhiệt cao có trong dược liệu này [42]

1.1.3.7 Một số tác dụng khác

Một số tác dụng khác của củ hành ta đã được chứng minh bằng thực nghiệm như kháng khuẩn [6], [30], [31], [38], [39], kháng nấm [46], [56], điều chỉnh đáp ứng miễn dịch [14], giảm độc tính trên thận của cyclosporin [49], diệt ký sinh trùng [30], kháng

virus [30], diệt vi khuẩn Helicobacter pylori [5]

1.1.4 Công dụng

Củ hành ta được dùng chủ yếu làm gia vị và thực phẩm Trong dân gian, củ hành

ta được sử dụng phối hợp với các dược liệu khác để điều trị một số bệnh như vàng da, sốt rét, thấp khớp, tiêu chảy, các bệnh da liễu và ung thư [5]

1.1.5 Các nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ củ hành ta

Hiện nay, trên thế giới chưa có nghiên cứu nào được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất và tối ưu hóa chiết xuất nhóm hợp chất flavonoid từ củ hành ta Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về tác dụng sinh học của củ hành ta, nhiều quy trình chiết xuất khác nhau đã được thực hiện để chuẩn bị các mẫu thử

Các quy trình chiết xuất được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới về củ hành ta rất đa dạng về phương pháp, dung môi, điều kiện chiết xuất… Có thể nhận thấy điểm chung của các quy trình sử dụng là đều khá đơn giản, chỉ bao gồm hai bước chính

là chiết xuất thu dịch chiết và loại dung môi thu sản phẩm, không có các bước loại tạp chất Các phương pháp chiết xuất được sử dụng có thể kể đến như ngâm ở nhiệt độ phòng kết hợp khuấy trộn [27], [32], [37], [42], [46]; ngâm nóng [52]; chiết soxhlet [33]; ngấm kiệt [21]; chiết siêu âm [26]; nghiền và thu dịch ép [22], [54] Dung môi sử dụng trong các nghiên cứu cũng rất đa dạng như nước muối sinh lý, nước cất, hỗn hợp ethanol

- nước hay methanol - nước ở các nồng độ khác nhau, các dung môi hữu cơ khác như ethyl acetat, aceton,… Yếu tố được đánh giá trong các nghiên cứu trên là tác dụng sinh học của dịch chiết củ hành ta khi thử nghiệm trên các mô hình khác nhau, một số nghiên cứu có quan sát về khối lượng cắn thu được Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất lên khối lượng cắn thu được cũng như thành phần của dịch chiết

Tại Việt Nam, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện về nhiệt độ, thời gian, số lần chiết, loại dung môi chiết xuất và tỷ lệ nguyên liệu - dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết củ hành

ta bằng phương pháp chiết siêu âm Quy trình chiết xuất được áp dụng trong nghiên cứu

như sau: Đối với mỗi thí nghiệm, sử dụng 50 g củ hành tím cắt nhỏ, tiến hành đồng nhất hóa với 50 ml dung môi chiết xuất Hỗn hợp sau khi đồng nhất hóa được bổ sung thêm dung môi đến tỷ lệ nguyên liệu - dung môi khảo sát Tiến hành chiết siêu âm ở tần số 20KHz trong thời gian và nhiệt độ được kiểm soát Ly tâm, gạn dịch trong và lọc qua giấy lọc để thu được dịch chiết Kết quả cho thấy khi tiến hành chiết xuất với dung môi

là nước cất, tỷ lệ 10 ml/g, chiết 1 lần trong 15 phút ở 40oC, dịch chiết thu được sẽ thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất [1]

1.2 Tổng quan về phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu

Tối ưu hóa là một bài toán thường xuyên được đặt ra trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu dưới nhiều dạng câu hỏi khác nhau như tối ưu hóa một công thức bào chế, tối ưu hóa điều kiện cho một phản ứng hóa học hay tối ưu hóa thông số của một quy trình,…Hiện nay, để giải quyết bài toán trên, có hai phương pháp được ứng dụng trong

quy hoạch thực nghiệm cho nghiên cứu là phương pháp thay đổi một yếu tố - One factor

at a time (OFAT) và phương pháp thiết kế thí nghiệm - Design of Experiments (DoE)

[11], [34]

1.2.1 Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) là thay đổi giá

trị của một thông số trong khi giữ cố định tất cả các yếu tố khác để đánh giá ảnh hưởng của từng thông số lên đáp ứng của một quá trình Trong các thí nghiệm thiết kế theo

phương pháp OFAT, yếu tố cần khảo sát cần được cô lập, tất cả các yếu tố còn lại phải

được giữ cố định và kiểm soát chặt chẽ để không gây ra nhiễu giữa các thí nghiệm [18]

Với những ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi xử lý thống kê

phức tạp, phương pháp OFAT là một phương pháp rất hữu hiệu và thường được ứng

dụng nhiều trong khảo sát các yếu tố đến một quá trình, đặc biệt trong trường hợp số lượng yếu tố cần khảo sát ít và các yếu tố này hoàn toàn độc lập với nhau [11]

Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp OFAT để xác định điều kiện tối ưu cho một

quá trình gặp phải những nhược điểm sau:

- Số lượng thí nghiệm cần phải tiến hành lớn, đặc biệt khi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố đến quá trình Điều này càng đáng cân nhắc khi các thí nghiệm cần tiến hành đòi hỏi chi phí cao và thời gian kéo dài

- Không đánh giá được ảnh hưởng của sự tương tác giữa các yếu tố khi coi các yếu tố cần khảo sát là độc lập với nhau

- Khả năng xác định chính xác điều kiện tối ưu bị hạn chế do số lượng quan sát

ít và chỉ có thể lựa chọn điều kiện tối ưu trong một tập hữu hạn các giá trị khảo sát Do đó, đối với các yếu tố có thể thay đổi trong một khoảng rộng các giá trị thì việc khảo sát trên toàn bộ khoảng giá trị đó sẽ rất tốn kém cả về chi phí lẫn thời gian, công sức

Để khắc phục các nhược điểm trên, nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa

trên các nguyên tắc về thống kê (Design of Experiments) đã được phát triển Trong đó, phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) là một trong những công

cụ được sử dụng phổ biến nhất để xác định điều kiện tối ưu [11]

1.2.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng hay còn được biết đến với một số tên gọi khác như phương pháp mặt đáp, phương pháp mặt mục tiêu được công bố đầu tiên vào năm 1951 bởi nhà thống kê học người Anh - George E.P.Box [34] Theo đó, phương pháp bề mặt đáp ứng là một tập hợp các kỹ thuật thống kê và toán học được ứng dụng trong việc phát triển, cải thiện và tối ưu hóa một quá trình hoặc ứng dụng trong thiết kế, phát triển và xây dựng công thức bào chế cho một thuốc mới, cũng như cải thiện một công thức thuốc

đã có [34]

Một số thuật ngữ cơ bản được sử dụng trong phương pháp bề mặt đáp ứng bao gồm: biến đầu vào, biến đầu ra, bề mặt đáp ứng, mô hình, tối ưu hóa, hàm kỳ vọng, mức

yếu tố được giải thích trong Phụ lục 3 [34]

Quy trình tối ưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng

Phương pháp bề mặt đáp ứng là một chuỗi các thao tác được tiến hành tuần tự

để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình Các bước chính khi ứng dụng RSM trong tối

ưu hóa quá trình được thể hiện ở sơ đồ hình 1.1 [24]

Hình 1.1 Sơ đồ các bước tối ưu hóa quá trình chiết xuất

sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) [24]

❖ Lựa chọn biến đầu vào và biến đầu ra

Đối với lĩnh vực tối ưu hóa quá trình chiết xuất dược liệu, biến đầu ra thường được lựa chọn là các thông số phản ánh hiệu quả của quá trình chiết xuất như hiệu suất chiết xuất hoạt chất, tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được hay hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm Tùy thuộc vào mục tiêu tối ưu của người tiến hành nghiên cứu mà biến đầu ra phù hợp sẽ được lựa chọn

Biến đầu vào được lựa chọn thường là các yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất như nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dược liệu - dung môi,… Các biến đầu vào được lựa chọn dựa trên cơ sở lý thuyết, kinh nghiệm của người thực hiện nghiên cứu hoặc qua quá trình khảo sát Quá trình lựa chọn và khảo sát như vậy còn được gọi là sàng lọc biến,

có vai trò giúp xác định các biến quan trọng có ảnh hưởng lớn đến đáp ứng, giảm bớt số lượng biến đầu vào qua đó giảm bớt đáng kể số lượng thí nghiệm cần tiến hành Tuy nhiên các biến đầu vào được lựa chọn cần thỏa mãn các đặc điểm sau:

- Là các biến độc lập: Sự thay đổi giá trị của một biến đầu vào chỉ làm thay đổi biến đầu ra mà không có ảnh hưởng đến các biến đầu vào khác

- Có thể điều chỉnh dễ dàng: Cần dễ dàng điều chỉnh đến các mức yếu tố tương ứng theo thiết kế thí nghiệm

- Là các biến định lượng

❖ Thiết kế thí nghiệm

Thiết kế thí nghiệm có vai trò đảm bảo cho các thí nghiệm sẽ tiến hành có khả năng cung cấp đầy đủ thông tin để xây dựng các bề mặt đáp ứng và mô hình tương ứng [13] Hiện nay có rất nhiều mô hình thiết kế thí nghiệm như mô hình Box-Behnken, mô hình Doehlert, mô hình đầy đủ,…Tuy nhiên, mô hình thiết kế thí nghiệm phù hợp khi

tiến hành phương pháp RSM cần đáp ứng một số yêu cầu sau [13]:

- Phân bố các điểm dữ liệu phù hợp trên toàn bộ miền khảo sát

- Cung cấp đầy đủ thông tin cho mô hình

- Cho phép tiến hành các thí nghiệm theo từng khối

- Xác định chính xác các hệ số trong mô hình

- Phương sai dự đoán nhỏ trên toàn bộ miền khảo sát

- Số lượng thí nghiệm cần tiến hành không quá lớn

- Không yêu cầu nhiều mức yếu tố của các biến

- Tính toán đơn giản

Khi biểu diễn mối quan hệ giữa biến đầu vào và biến đầu ra tại miền tối ưu, đồ thị thường có độ cong nhất định và mô hình bậc 2 sẽ rất phù hợp để biểu diễn mối quan hệ

đó Hai mô hình thiết kế thí nghiệm được sử dụng phổ biến nhất cho các mô hình bậc

hiện nay là mô hình Box-Behnken và mô hình phức hợp trung tâm (Central Composite Design – CCD) [13], [34]

Về mô hình Box-Behnken

Mô hình này lần đầu được công bố vào năm 1960 bởi 2 nhà khoa học G.Box và D.Behnken Mô hình Box-Behnken được thiết kế cho 3 biến đầu vào theo dạng khối lập phương với 12 điểm quan sát tại trung điểm của các cạnh khối lập phương và 1 quan sát tại tâm Với thiết kế này, ưu điểm của mô hình là tất cả các điểm đều cách đều tâm một khoảng cách là √2, nói cách khác, các điểm quan sát đều nằm trên một cùng một mặt

cầu, do đó mô hình Box-Behnken là một mô hình có tính xoay (rotatability) Đồng thời,

số thí nghiệm yêu cầu cũng được giảm thiểu Ngoài ra, một điểm đáng chú ý trong thiết

kế trên là không có điểm quan sát nào được đặt ở đỉnh của hình lập phương, do đó có thể tránh được các thí nghiệm tại tổ hợp các yếu tố đầu vào khó thực hiện trên thực tế

[13] Minh họa cho mô hình Box-Behnken được thể hiện ở hình 1.2

Hình 1.2 Mô hình Box-Behnken cho 3 biến đầu vào [13]

Về mô hình phức hợp trung tâm CCD

Đây là thiết kế thí nghiệm được sử dụng phổ biến nhất cho các mô hình bậc hai

Tổng quát, mô hình CCD thiết kế cho k yếu tố đầu vào (X 1-k) sẽ bao gồm 2k thí nghiệm theo mô hình đầy đủ 2 mức (-1 và +1) – là các điểm quan sát tại các đỉnh của hình lập phương; 2k thí nghiệm tại các điểm trục (điểm sao) nằm trên các trục tọa độ với li độ là

alpha (α) và Co thí nghiệm tại tâm của mô hình Qua đó, số thí nghiệm trong mô hình

CCD được tính theo công thức:

𝑁 = 2𝑘 + 2𝑘 + 𝐶𝑜 với k là số biến đầu vào

Mô hình CCD cho 2 và 3 yếu tố đầu vào (k=2;3) được thể hiện ở hình 1.3

Hình 1.3 Mô hình phức hợp trung tâm CCD cho 2 và 3 biến đầu vào [13]

Hai thông số cần xác định trong thiết kế thí nghiệm theo mô hình phức hợp trung

tâm CCD là li độ alpha của các điểm trục (axial runs) và số thí nghiệm tại tâm của mô

hình (Co)

Các thí nghiệm tại tâm của mô hình được thực hiện để đánh giá độ ổn định của

mô hình Thông thường, Co được lựa chọn từ 3-6 thí nghiệm, trong mộ số trường hợp,

có thể tăng số lượng thí nghiệm tại tâm để ước lượng chính xác sai số thí nghiệm [13]

Li độ của các điểm trục (α) là khoảng cách từ các điểm trục đến tâm của mô hình Ứng với các mức α lựa chọn, mỗi biến đầu sẽ được thực hiện ở 5 mức yếu tố là -α, -1,

0, 1 và +α Trong trường hợp α= √𝑘, khoảng cách giữa các điểm trục tới tâm sẽ bằng khoảng cách từ tâm đến các đỉnh của khối lập phương, như vậy mô hình sẽ có tính cầu

(spherical) hay tính xoay (rotatability) Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mô hình dạng khối (cuboidal) lại được sử dụng thay cho mô hình dạng cầu (spherical) Đó là trong

trường hợp ta lựa chọn li độ α = 1, tức là các điểm trục sẽ nằm tại tâm của các mặt phẳng của khối lập phương, ta được mô hình dạng khối hay còn được gọi là mô hình phức hợp

trung tâm kiểu hướng mặt (CCD face-centered) Biến thể của CCD này có ưu điểm là

với mỗi yếu tố đầu vào chỉ cần thực hiện trên 3 mức yếu tố là -1,0,1; do đó được ứng dụng nhiều trong các trường hợp khó thay đổi các yếu tố đầu vào và cần giới hạn vùng

quan sát Tuy nhiên, mô hình CCD kiểu hướng mặt không có tính xoay [13]

Trước khi thiết kế thí nghiệm, các biến đầu vào cần được mã hóa các giá trị khảo sát về đoạn [-1;1] để đảm bảo tính trực giao của thiết kế thí nghiệm, cũng như đơn giản hóa quá trình tính toán, hạn chế sai sót do chênh lệch đơn vị của các biến đầu vào [34]

❖ Xây dựng mô hình

Dựa trên cơ sở dữ liệu thực nghiệm thu được từ việc thực hiện các thí nghiệm, mô hình toán học biểu thị mối quan hệ giữa các biến đầu vào và biến đầu ra được xây dựng theo các phương pháp toán học khác nhau Phương pháp thông dụng nhất hiện nay được

sử dụng là phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến Mô hình xây dựng được có dạng các phương trình hàm số của các biến đầu vào và biến đầu ra, thường gặp ở dạng mô

hình bậc nhất (first-order model), mô hình tương tác (interaction model) hoặc mô hình bậc hai (second-order model) với các phương trình tổng quát như sau:

• Mô hình bậc nhất: 𝑦 = 𝛽0+ 𝛽1𝑥1+ 𝛽2𝑥2+ ԑ

• Mô hình tương tác: 𝑦 = 𝛽0+ 𝛽1𝑥1+ 𝛽2𝑥2+ 𝛽12𝑥1𝑥2+ ԑ

• Mô hình bậc hai:

𝑦 = 𝛽0+ 𝛽1𝑥1+ 𝛽2𝑥2+ 𝛽12𝑥1𝑥2+ 𝛽11𝑥12 + 𝛽22𝑥22+ ԑ Trong đó: Y là biến đầu ra

Xi là các biến đầu vào

β i là các hệ số hồi quy

ԑ là sai số/nhiễu quan sát được của biến đầu ra

Các hệ số hồi quy từng phần β i được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến theo phương pháp bình phương tối thiểu [34] Ở đây, đối với các mô hình tương tác và mô hình bậc 2, khi ta coi các biến có bậc lớn hơn 1 là một biến bậc nhất mới (ví dụ x3=x1 ; x4=x2 ; x5=x1x2,…) thì các mô hình đó cũng là các mô hình hồi quy tuyến tính, mặc dù đường biểu diễn của chúng có thể là các đường cong [34]

Trong số các mô hình trên, mô hình bậc hai (second-order model) được sử dụng

phổ biến nhất để xây dựng bề mặt đáp ứng nhờ các ưu điểm sau:

- Tính linh hoạt cao: Đa dạng trong biểu thị các biến, cả bậc nhất, bậc hai và biến tương tác

- Dễ dàng xác định các hệ số hồi quy từng phần β i bằng phương pháp bình phương tối thiểu

- Mặt cong của mô hình bậc hai thường phù hợp với mặt cong thực tế [34]

R 2 hiệu chỉnh, hệ số đánh giá chéo Q 2 hay R 2 dự đoán, phép kiểm định Lack of fit…

Ngoài ra, mức độ phân tán của dữ liệu cũng được đánh giá qua các biểu đồ như biểu đồ phần dư chuẩn hóa Normal P-P Plot, biểu đồ phân tán Scatter Plot,…[34]

❖ Tối ưu hóa và kiểm định điều kiện tối ưu

Căn cứ theo mục tiêu mà người thực hiện nghiên cứu muốn đạt được, hàm mục tiêu của các biến đầu ra sẽ được xác định Hàm mục tiêu sẽ được cụ thể hóa bằng các tùy chọn mục tiêu tối ưu trên các phần mềm; thông qua các thuật toán và mô hình toán học đã xây dựng ở trên, nghiệm tối ưu thỏa mãn sẽ được tìm ra và từ đó xác định điều kiện tối ưu cho quá trình [34] Điều kiện tối ưu sẽ được kiểm định bằng thực nghiệm để xác định các hệ số tìm lại so với dự đoán

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Củ hành ta được thu hái vào tháng 2 năm 2019 tại Kinh Môn, Hải Dương Dược

liệu sau khi thu hoạch được phơi khô, để nơi khô ráo, thoáng mát

Vỏ củ hành ta là lớp áo mỏng dạng màng màu nâu đỏ bao bên ngoài củ

Mẫu cây hành ta có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Bảo tàng thực vật - Trường

Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội với số hiệu tiêu bản HNU021920

Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, sử dụng khóa phân loại chi

Allium và đối chiếu với tài liệu Thực vật chí Trung Quốc - quyển 24 [50], được sự giúp

đỡ của GS TS Phan Kế Lộc và ThS Nguyễn Anh Đức, mẫu cây hành ta nghiên cứu

được giám định tên khoa học là Allium cepa var aggregatum G.Don, họ Hành

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, phần mềm

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:

- Dung môi: Ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd

- Hóa chất: Natri hydroxyd, nhôm clorid, dinatri hydrophosphat, kali

dihydrophosphat, acid hydroclorid, xanthin

- Chất chuẩn: Quercetin, độ tinh khiết 95,0% được cung cấp bởi Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương

- Enzym xanthin oxidase (EC.1.17.3.2), dạng hỗn dịch nhôm sulfat, hàm

lượng ≥ 0,8 IU/mg protein (Sigma - Aldrich)

Thiết bị:

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức) độ chính xác 0,01 g

- Máy đo pH Mettler Toledo Seven Easy S20 độ chính xác 0,01

- Máy đo hàm ẩm Precisa XM60

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy siêu âm Sonic vibra cell

- Máy cô cách thủy Memmert (Đức)

- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-1900

- Pipet pasteur, pipet chính xác 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml

- Bình định mức 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 1000 ml

Phần mềm:

- Design Expert 11; INForm 3.1; GraphPad Prism 8

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để giải quyết các mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành

ta

3 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của mẫu cao vỏ củ hành ta

chiết xuất ở điều kiện tối ưu

4 Nâng cấp quy mô chiết xuất lên 20 lần và đánh giá độ ổn định của quy trình

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta

Xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được bằng phương pháp quang

phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến, sử dụng phản ứng với dung dịch nhôm clorid [42] Lấy chính xác 0,5 ml dịch chiết phối hợp với 3,0 ml methanol; 1,0 ml dung dịch nhôm clorid 2% (kl/tt); 0,4 ml dung dịch natri acetat 0,5 M và định mức tới 10,0 ml bằng nước cất Hỗn hợp phản ứng được để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng 428 nm Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách phối hợp 3,0 ml methanol; 1,0

ml dung dịch nhôm clorid 2% (kl/tt); 0,4 ml dung dịch natri acetat (0,5 M) trong bình

định mức 10 ml và định mức vạch bằng nước cất Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được tính theo quercetin từ nồng độ thu được thông qua đường chuẩn Phương pháp

được thẩm định về độ phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát

hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và độ ổn định tại bước sóng 426 nm và 430 nm

[19]

2.3.2 Phương pháp chiết xuất

Cân chính xác khoảng 2,0 g vỏ củ hành sấy khô đã được làm nhỏ đến kích thước thích hợp, thêm dung môi và chiết hồi lưu trong thời gian và nhiệt độ tương ứng theo thiết kế của từng thí nghiệm Gộp dịch chiết của các lần chiết, để nguội ở nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức 250 ml và định mức tới vạch bằng dung môi chiết xuất Lấy

chính xác 0,5 ml dịch chiết để xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được theo

phương pháp ở mục 2.3.1 Phần dịch còn lại được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm,

cô cách thủy đến cắn và sấy ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2 giờ ở tủ sấy đối lưu thu được sản phẩm

Sơ đồ tóm tắt phương pháp chiết xuất cao vỏ củ hành ta được trình bày ở hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt phương pháp chiết xuất vỏ củ hành ta

2.3.3 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid

- Nhiệt độ chiết xuất: 25oC; 40oC; 55oC; 70oC; 85oC

- Thời gian chiết xuất: 5 phút; 15 phút; 30 phút; 45 phút;

60 phút; 90 phút; 120 phút

- Dung môi chiết xuất: Hỗn hợp ethanol - nước nồng độ ở các mức

nồng độ: 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 96%

❖ Thông số đánh giá

- Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được (mg/g) (Y1) tính theo công thức:

Y 1 = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑓𝑙𝑎𝑣𝑜𝑛𝑜𝑖𝑑 𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛 𝑐ℎ𝑖ế𝑡 đượ𝑐 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎ𝑒𝑜 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛

- Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được (Y2) (%kl/kl) tính theo công thức:

Y 2 = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ắ𝑛 𝑘ℎô

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑑ượ𝑐 𝑙𝑖ệ𝑢 𝑘ℎô 𝑥 100% (%kl/kl) Trong đó, hàm ẩm của dược liệu được xác định bằng máy đo độ ẩm Precisa XM60, hàm ẩm của sản phẩm chiết được xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm

khô (Phụ lục 9.6 - Dược điển Việt Nam V) [2]

2.3.3.2 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid từ vỏ củ hành ta được

khảo sát với sự kết hợp hai phương pháp: phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) [11]

và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) [34]

Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)

Các yếu tố: kích thước dược liệu, tỷ lệ dược liệu - dung môi, số lần chiết, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất và dung môi chiết xuất sẽ lần lượt được khảo sát bằng cách tiến hành các thí nghiệm có thay đổi các mức khảo sát một yếu tố trong khi điều kiện của tất cả các yếu tố còn lại được giữ nguyên Từ kết quả khảo sát, các điều kiện tốt nhất được lựa chọn và cố định để thực hiện các bước khảo sát tiếp theo

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

➢ Biến đầu vào và khoảng khảo sát của biến đầu vào

Ba biến đầu vào được lựa chọn là Nhiệt độ chiết xuất (X 1), Thời gian chiết xuất

(X 2 ) và Dung môi chiết xuất (X 3) Các khoảng khảo sát của biến đầu vào để xây dựng

mô hình sẽ được lựa chọn theo kết quả khảo sát từng biến bằng phương pháp OFAT:

- Nhiệt độ chiết xuất (X 1): 55oC - 85oC

- Thời gian chiết xuất (X 2): 60 phút - 120 phút

- Dung môi chiết xuất (X 3): Hỗn hợp ethanol - nước nồng độ từ 20%đến 60%

Các biến đầu vào được mã hóa thành các giá trị tương ứng trong đoạn [-1;1] Giá trị mã hóa của các biến được quy đổi từ giá trị thực thông qua công thức:

- Nhiệt độ chiết xuất: 𝐗𝟏 mã hóa =𝐗𝟏 thực − 70

Hai biến đầu ra để xây dựng mô hình là hai thông số đánh giá bao gồm: Tổng

lượng flavonoid toàn phần chiết được (mg/g) (Y1) và Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu

được (%kl/kl) (Y2)

➢ Thiết kế thí nghiệm

Sử dụng phần mềm Design Expert 11 để thiết kế các thí nghiệm theo mô hình

phức hợp trung tâm (Central Composite Design - CCD) kiểu hướng mặt (α=1,

face-centered) thu được dãy các thí nghiệm với các điều kiện tiến hành khác nhau [34] Các thí nghiệm được tiến hành lần lượt nhằm xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được và Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được tương ứng theo từng thí nghiệm

➢ Tối ưu hóa quá trình chiết xuất

Bước 1: Xây dựng và đánh giá các mô hình biểu thị ảnh hưởng của các biến đầu

vào đến Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được (Y1) và Tỷ lệ khối lượng sản phẩm

thu được (Y2) của quá trình chiết xuất

Tiến hành xây dựng mô hình bằng hai phương pháp:

- Phương pháp Hồi quy tuyến tính đa biến (Multivariable Linear Regression-MLR)

thông qua tính năng bề mặt đáp ứng (RSM) trên phần mềm Design Expert 11

[34]

- Phương pháp Mạng neuron nhân tạo (Artificial neural network - ANN) sử dụng

phần mềm INForm 3.1 [55]

Đánh giá chất lượng, mức độ phù hợp với thực nghiệm và khả năng dự đoán của

mô hình dựa trên hệ số xác định R 2 , hệ số xác định hiệu chỉnh R 2 hiệu chỉnh, hệ số đánh giá chéo Q 2 hay R 2 dự đoán và % sai số giữa giá trị dự đoán theo mô hình so với giá trị

Bước 3: Tiến hành thực nghiệm tại điều kiện tối ưu đã xác định để kiểm định lại

mô hình (số lần lặp lại n=3)

➢ Nâng cấp quy mô chiết xuất

Ở điều kiện tối ưu đã xác định, tiến hành nâng cấp quy mô chiết xuất lên 20 lần

so với quy mô ban đầu Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được (mg/g) và Tỷ lệ khối lượng sản phẩm thu được (%kl/kl) tại quy mô nâng cấp được so sánh với quy mô ban

đầu để đánh giá độ ổn định của quy trình khi nâng cấp

2.3.4 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao chiết

vỏ củ hành ta

Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các mẫu cao chiết vỏ củ hành ta được

đánh giá theo phương pháp xây dựng bởi T.Noro và cộng sự (1983) [35] và có điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Nguyên tắc đánh giá tác dụng dựa trên phản ứng:

Enzym xanthin oxidase xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất là xanthin tạo thành sản phẩm oxy hóa là acid uric Hoạt độ của enzym xanthin oxidase được xác định

từ lượng sản phẩm acid uric tạo thành So sánh hoạt độ của enzym trong giếng thử và giếng chứng sẽ đánh giá được khả năng ức chế xanthin oxidase của mẫu thử

Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của mẫu cao vỏ hành ta chiết trong điều

kiện tối ưu (mẫu cao A1) được đánh giá cụ thể như sau:

➢ Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu cao A1: 2,0 g vỏ hành ta được chiết xuất theo quy trình mô tả ở mục 2.3.2

tại điều kiện tối ưu đã xác định thu được mẫu cao A1

Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao A1, hòa tan hoàn toàn trong 10,0 ml DMSO thu được dung dịch gốc C o có nồng độ 10000 µg/ml Từ dung dịch gốc C o, pha loãng

với đệm phosphat 70 mM, pH = 7,5 thành các dung dịch C 1 đến C 6 với nồng độ lần lượt

là 300 µg/ml; 100 µg/ml; 50 µg/ml; 30 µg/ml; 10 µg/ml và 3 µg/ml

Xanthin oxidase

Acid uric Xanthin

Quercetin được lựa chọn là chứng dương của mô hình Cân chính xác khoảng

10 mg quercetin, hòa tan hoàn toàn trong 10,0 ml DMSO thu được dung dịch chuẩn gốc

có nồng độ 1000 µg/ml Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với đệm phosphat 70 mM;

pH = 7,5 thành dãy dung dịch có nồng độ lần lượt là 30 µg/ml; 10 µg/ml; 5 µg/ml; 3 µg/ml; 1 µg/ml và 0,3 µg/ml

➢ Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng:

Trình tự tiến hành và cách bố trí hỗn hợp phản ứng trong giếng thử, giếng nền thử,

giếng chứng và giếng nền chứng được trình bày ở bảng 2.1

10 Đo quang ở bước sóng 290 nm

Từ kết quả về độ hấp thụ của các giếng, ta xác định được giá trị phần trăm ức chế

hoạt tính enzym xanthin oxidase (I%) của các dung dịch thử từ C 1 đến C 6 theo công thức sau:

𝐼% = ∆𝐴 𝑐ℎứ𝑛𝑔 − ∆𝐴 𝑡ℎử

∆𝐴 𝑐ℎứ𝑛𝑔 𝑥 100%

Trong đó: ∆Achứng là độ hấp thụ của giếng chứng

∆Athử là độ hấp thụ của giếng thử (chứa dung dịch thử)

Dựa trên các giá trị phần trăm ức chế (I%) của các dung dịch với nồng độ từ C 1

đến C 6 , nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym (IC 50) của các mẫu cao được xác định

bằng phần mềm GraphPad Prism 8.0 theo phương pháp hồi quy phi tuyến

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta

Cân chính xác 7,3 mg quercetin chuẩn (độ tinh khiết 95,0%) vào cốc có mỏ dung tích 100 ml Thêm khoảng 30 ml ethanol 80%, siêu âm đến khi tan hoàn toàn Chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100 ml và bổ sung ethanol 80% đến vạch, lắc đều thu

được dung dịch chuẩn gốc C o có nồng độ 69,4 µg/ml

3.1.3 Khảo sát cực đại hấp thụ

Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc C o vào bình định mức 10 ml, bổ sung đến vạch bằng ethanol 80o để pha loãng dung dịch chuẩn gốc Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch đã pha loãng vào bình định mức 10 ml; phối hợp với 3,0 ml methanol; 1,0 ml dung dịch nhôm clorid (2% kl/tt); 0,4 ml dung dịch natri acetat (0,5 M) và định mức tới 10,0 ml bằng nước cất Hỗn hợp phản ứng được để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau

đó tiến hành quét phổ từ bước sóng 190 đến 600 nm Kết quả quét phổ được trình bày ở

hình 3.1 cho thấy có 3 cực đại hấp thụ ở các bước sóng 428 nm, 268 nm và 204,5 nm

Bước sóng 428 nm được lựa chọn là bước sóng đo quang do đây là bước sóng nằm trong vùng khả kiến, đặc trưng cho các phức màu tạo thành từ phản ứng của các flavonoid và nhôm clorid

Hình 3.1 Hình ảnh phổ UV-Vis của quercetin (tạo phức màu với nhôm clorid) 3.1.4 Thẩm định phương pháp xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được

từ vỏ củ hành ta

Kết quả thẩm định các tiêu chuẩn về độ phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng,

độ lặp lại, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và độ ổn định của

phương pháp được trình bày chi tiết ở Phụ lục 4 và được trình bày tóm tắt ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp phương pháp xác định

Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta

Nhận xét: Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp xác định Tổng lượng

flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống, độ

tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và

độ ổn định Do đó, phương pháp đã xây dựng có thể được sử dụng để xác định Tổng lượng flavonoid toàn phần chiết được từ vỏ củ hành ta [19], [20]

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid từ

vỏ củ hành ta sử dụng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)

Tiến hành khảo sát lần lượt 6 yếu tố: kích thước dược liệu, tỷ lệ dược liệu - dung môi, số lần chiết, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất và dung môi chiết xuất theo

quy trình chiết xuất đã được trình bày ở mục 2.3.2

Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất được trình bày

dưới dạng biểu đồ ở các hình 3.2 đến 3.7, số liệu cụ thể được trình bày ở Phụ lục 5

3.2.1 Kích thước dược liệu

Kích thước dược liệu được khảo sát ở 4 mức: lớn hơn 3 mm; từ 1-3 mm; từ 0,5-1

mm và nhỏ hơn 0,5 mm Tiến hành xay nhỏ vỏ hành đã làm sạch và sấy khô bằng máy xay, sau đó rây qua các rây có kích thước mắt rây lần lượt là 3 mm; 1 mm và 0,5 mm để thu được các khoảng kích thước tương ứng

Các thông số khác được cố định khi khảo sát bao gồm: tỷ lệ dược liệu - dung môi 1/20 g/ml, số lần chiết: 2 lần, nhiệt độ: 85oC, thời gian: 60 phút và dung môi chiết sử dụng là hỗn hợp ethanol - nước 80%

Kết quả khảo sát kích thước dược liệu được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Kết quả khảo sát kích thước dược liệu Nhận xét: Khi làm nhỏ kích thước dược liệu, diện tích tiếp xúc của dược liệu với

dung môi tăng lên, quãng đường khuếch tán của hoạt chất từ trong tế bào ra ngoài được rút ngắn; đồng thời tỷ lệ tế bào bị phá vỡ cũng tăng lên làm tăng lượng hoạt chất bị rửa giải; dẫn đến tăng tốc độ chiết xuất, do đó làm tăng đồng thời cả lượng flavonoid toàn phần chiết được và lượng sản phẩm thu được [4], [29]

Tuy nhiên, khi làm nhỏ kích thước từ khoảng 0,5 - 1 mm xuống khoảng kích thước dưới 0,5 mm, nhận thấy lượng hoạt chất thu được không tăng thêm đáng kể, chỉ từ 20,54 mg/g tăng lên 20,83 mg/g Không chỉ cho kết quả phù hợp trên 2 thông số đầu ra, khoảng kích thước từ 0,5 - 1 mm còn thuận lợi hơn rất nhiều cho quá trình thao tác chiết xuất so với khoảng dưới 0,5 mm do hạn chế được hiện tượng tắc giấy lọc gây khó khăn trong thao tác rút dịch chiết Do đó, khoảng kích thước từ 0,5 - 1 mm được lựa chọn để tiến hành những thí nghiệm khảo sát tiếp theo

3.2.2 Tỷ lệ dược liệu - dung môi

Lượng dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất được khảo sát ở 3 mức tỷ lệ dược liệu - dung môi là 1/10; 1/20 và 1/30 (g/ml)

Các thông số khác được cố định khi khảo sát bao gồm: kích thước dược liệu: từ 0,5 - 1 mm, số lần chiết: 2 lần, nhiệt độ: 85oC, thời gian: 60 phút và dung môi chiết sử dụng là hỗn hợp ethanol - nước 80%

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Kết quả khảo sát lượng dung môi chiết xuất được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3 Kết quả khảo sát lượng dung môi chiết xuất Nhận xét: Tỷ lệ dược liệu - dung môi trong khoảng khảo sát không ảnh hưởng

nhiều đến quá trình chiết xuất Khối lượng sản phẩm thu được ở 3 mức tỷ lệ dung môi thu được gần như tương tự nhau, chỉ có sự tăng lên rất nhỏ khi tăng lượng dung môi chiết xuất Lượng hoạt chất thu được ở tỷ lệ 1/20 có tăng lên so với tỷ lệ 1/10, điều này

có thể được giải thích là khi sử dụng lượng dung môi nhiều hơn, chênh lệch nồng độ hoạt chất giữa trong tế bào và dịch chiết tăng lên, làm tăng sự khuếch tán hoạt chất ra khỏi tế bào [4] Mặt khác, khi sử dụng tỷ lệ dung môi lớn như 1/30 thì dịch chiết thu được rất loãng, quá trình xử lý dịch chiết tốn nhiều thời gian và năng lượng, đồng thời gây lãng phí dung môi Bởi vậy, tỷ lệ dược liệu - dung môi phù hợp được lựa chọn cho những bước khảo sát tiếp theo là 1/20 (g/ml)

3.2.3 Số lần chiết

Số lần chiết được khảo sát ở 3 mức: 1 lần; 2 lần và 3 lần

Các thông số khác được cố định khi khảo sát bao gồm: kích thước dược liệu: từ 0,5 - 1 mm, tỷ lệ dược liệu dung môi: 1/20 g/ml, nhiệt độ: 85oC, thời gian: 60 phút và dung môi chiết sử dụng là hỗn hợp ethanol - nước 80%

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết được trình bày ở hình 3.4

15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 19.00

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

Hình 3.4 Kết quả khảo sát số lần chiết Nhận xét: Khi tăng số lần chiết, dung môi chiết xuất được làm mới, qua đó làm

tăng chênh lệch nồng độ hoạt chất trong dược liệu và trong dịch chiết dẫn tới tăng quá trình khuếch tán, lượng hoạt chất và lượng sản phẩm thu được sẽ tăng lên [4], [29] Lượng hoạt chất và lượng sản phẩm thu được khi chiết 2 lần nhiều hơn đáng kể

so với khi chiết 1 lần (lần lượt tăng lên 8,9 và 9,6% so với chiết 1 lần) Tuy nhiên, khi tăng số lần chiết lên 3 lần, lượng hoạt chất không tăng lên, điều này có nghĩa hoạt chất trong dược liệu đã được chiết kiệt ở lần chiết thứ 2 Do đó, số lần chiết phù hợp được lựa chọn để tiến hành các bước khảo sát tiếp theo là 2 lần

3.2.4 Nhiệt độ chiết xuất

Nhiệt độ chiết xuất được khảo sát ở 5 mức nhiệt độ trong khoảng từ nhiệt độ phòng

25oC tới nhiệt độ sôi của dung môi 85oC

Các thông số khác được cố định khi khảo sát bao gồm: kích thước dược liệu: từ 0,5 - 1 mm, tỷ lệ dược liệu dung môi: 1/20 g/ml, số lần chiết: 2 lần, thời gian: 60 phút

và dung môi chiết sử dụng là hỗn hợp ethanol - nước 80%

Kết quả khảo sát yếu tố nhiệt độ chiết xuất được trình bày ở hình 3.5

12.00 14.00 16.00 18.00 20.00

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

Hình 3.5 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết xuất

chiết xuất thì lượng hoạt chất và sản phẩm thu được cũng tăng lên Điều này có thể giải thích do khi nhiệt độ tăng lên, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi giảm xuống giúp tăng tính thấm của dung môi vào dược liệu, đồng thời sự chuyển động của dung môi cũng tăng giúp tăng quá trình khuếch tán hoạt chất ra khỏi tế bào [4] Ngoài ra, nhiệt

độ tăng cũng có tác động làm tăng độ tan của hoạt chất, do đó làm tăng cả tốc độ chiết

và hiệu suất chiết xuất [29] Từ kết quả trên, khoảng nhiệt độ từ 55oC đến 85oC được lựa chọn là khoảng khảo sát để xây dựng mô hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) trong các bước tối ưu hóa tiếp theo

3.2.5 Thời gian chiết xuất

Do đặc điểm đặc biệt của vỏ củ hành ta là rất mỏng và nhẹ, là yếu tố thuận lợi cho quá trình khuếch tán hoạt chất ra khỏi tế bào dược liệu nên nhóm nghiên cứu lựa chọn khoảng thời gian chiết xuất khảo sát từ 5 phút tới 120 phút Thời gian chiết xuất được khảo sát ở 7 mức là 5, 15, 30, 45, 60, 90 và 120 phút

Các thông số khác được cố định khi khảo sát bao gồm: kích thước dược liệu: từ 0,5 - 1 mm, tỷ lệ dược liệu dung môi: 1/20 g/ml, số lần chiết: 2 lần, nhiệt độ: 85oC, dung môi chiết sử dụng là hỗn hợp ethanol - nước 80%

Kết quả khảo sát yếu tố thời gian chiết xuất được trình bày ở hình 3.6

0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0