Nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của loài trân châu hoa chụm ( lysimachia congestiflora hemsl )

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HIỀN Mã SV: 1401204 NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI TRÂN CHÂU HOA CHỤM Lysimachia congestiflora Hemsl.. Mặc dù n

(Lysimachia congestiflora Hemsl.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HIỀN

Mã SV: 1401204

NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI TRÂN CHÂU HOA CHỤM

(Lysimachia congestiflora Hemsl.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên, chỉ bảo tận tình từ quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc nhất đến DS NCS Nguyễn Thanh Tùng người thầy tận tụy đã trực tiếp hướng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ và

dẫn dắt tôi từ những ngày đầu bỡ ngỡ đến hết chặng đường thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Dược sĩ Lê Ngọc Văn, là người anh hướng dẫn và đồng

hành, chỉ bảo hết mực, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung

và bộ môn Dược liệu nói riêng đã tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức trong suốt những năm tháng ngồi trên ghế nhà trường

Tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới toàn thể anh chị, bạn bè cùng làm việc và các

em đã luôn đồng hành, giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc để tiếp thêm động lực giúp tôi cố gắng hơn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 21 tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Lê Thị Hiền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đặc điểm thực vật và phân bố chi Lysimachia L 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Lysimachia L 3

1.1.2 Lịch sử phân loại chi Lysimachia L 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái thực vật chi Lysimachia L 4

1.1.4 Phân bố các loài thuộc chi Lysimachia L 4

1.2 Tổng quan về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Lysimachia L ở Việt Nam 8

1.2.1 Nhóm hợp chất flavonoid 8

1.2.2 Nhóm hợp chất saponin 9

1.2.3 Các hợp chất thuộc nhóm khác 11

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Lysimachia L 12

1.3.1 Công dụng của các loài thuộc chi Lysimachia L 12

1.3.2 Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Lysimachia L 12

1.4 Tổng quan về loài Lysimachia congestiflora Hemsl 13

1.4.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 13

1.4.2 Thành phần hóa học 14

1.4.3 Công dụng và tác dụng sinh học 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật 17

2.2.2 Nội dung nghiên cứu thành phần hóa học 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi 18

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hóa học 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu 25

3.2 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm vi học dược liệu 26

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá 26

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân 27

3.2.3 Đặc điểm bột dược liệu 27

3.3 Kết quả định tính thành phần hóa học 28

3.4 Kết quả định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu 29

3.5 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu 30

3.5.1 Khảo sát cực đại hấp thụ 30

3.5.2 Thẩm định phương pháp định lượng 31

3.6 Kết quả triển khai sắc kí lớp mỏng dịch chiết của loài L congestiflora Hemsl 35

3.6.1 Khảo sát hệ dung môi khai triển 35

3.6.2 Kết quả triển khai sắc kí lớp mỏng của dịch chiết thân và lá của loài L congestiflora Hemsl 36

3.7 Kết quả bán định lượng myricetin trong loài L congestiflora Hemsl bằng HPTLC 37

3.7.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng 37

3.7.2 Kết quả bán định lượng 38

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 41

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NP/PEG Natural products/ Polyethylenglycol

(Đương lượng acid gallic)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Phân bố của các loài thuộc chi Lysimachia L tại Việt Nam 5

1.2 Công thức một số hợp chất flavonoid trong loài L congestiflora

Hemsl

15

2.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận ở các nồng độ khác nhau 21 2.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau 22 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong dịch chiết mẫu nghiên

phương pháp định lượng

34

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

1.2 Công thức saponin nhóm olean-12-en và nhóm

3.1 Ảnh chụp đặc điểm thực vật loài L congestiflora Hemsl 25

3.4 Một số đặc điểm bột loài L congestiflora Hemsl 28

3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

3.7

Ảnh chụp sắc kí đồ dịch chiết L congestiflora Hemsl và

myricetin chuẩn triển khai với hệ dung môi toluen - ethyl acetat - acid formic (5:5:1) quan sát ở: (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (b) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (c) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG

35

3.8

Ảnh chụp sắc kí đồ dịch chiết L congestiflora Hemsl và

myricetin chuẩn triển khai với hệ dung môi toluen - ethyl acetat - acid formic (14:10:1) quan sát ở: (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (b) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (c) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG

35

3.9

Ảnh chụp sắc kí đồ dịch chiết thân, lá của loài L congestiflora

Hemsl và myricetin chuẩn triển khai với hệ dung môi toluen - ethyl acetat - acid formic (5:5:1) quan sát tại UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG

36

3.10 Đồ thị 2D biểu diễn diện tích pic sắc kí của thân và lá L

3.11 Đồ thị 3D biểu diễn diện tích pic sắc kí của thân và lá L

Ảnh chụp sắc kí đồ định lượng myricetin trong L congestiflora

Hemsl triển khai với hệ dung môi toluen - ethyl acetat - acid formic (14:10:1) quan sát tại: (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG; (b) UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG; (c) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG

39

3.15 Đồ thị thể hiện tính chọn lọc và đặc hiệu của phương pháp 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Trân châu (Lysimachia L.), một trong những chi lớn nhất của họ Anh Thảo

(Primulaceae Rich.) với khoảng 180 loài được ghi nhận trên toàn thế giới, phân bố chủ yếu ở vùng khí hậu ôn đới và cận nhiệt đới ở Bắc bán cầu, cùng với một số loài ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Mỹ, châu Phi, châu Úc và châu Á, trong đó có cả Việt Nam [30] Phần lớn các loài trong chi này ưa bóng, ưa ẩm, mọc trong rừng rậm ẩm, dọc sông suối, mọc dưới tán rừng, mọc rải rác trong ven rừng thưa; đôi khi phát triển tốt ở những nơi ít bóng như ven đường mòn, sườn núi hay vách đá [3] Tính đến nay, chi này

có khoảng 20 loài được ghi nhận ở Việt Nam phân bố ở khắp các tỉnh từ Bắc vào Nam Trong dân gian cây được dùng làm thức ăn và làm thuốc chữa bệnh như Trân châu nhị

dài (L lobeloides Wall.) dùng để chữa ho, vú sưng đau, tiêu viêm, thấp khớp, phù nề, kiết lỵ; Trân châu rau (L clethroides Duby) dùng để chữa bạch đới, cam tích, lỵ, đau họng, sưng vú, làm thuốc điều kinh; Trân châu hoa chụm (L congestiflora Hemsl.) dùng

để chữa viêm gan, lỵ, ho nhiều đờm, trẻ em co giật [3], [9] Ngoài ra, các loài thuộc chi

Lysimachia L còn được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền như Trân châu ba lá

(L insignis Hemsl.) có tác dụng điều huyết, chỉ huyết, hành khí, tán ứ, sơ phong thông lạc, bình can; Trân châu hoa chụm (L congestiflora Hemsl.) có tác dụng phong tán hàn,

chỉ khái hóa đảm, tiêu tích giải độc [3]

Mặc dù nhiều loài thuộc chi Trân châu có giá trị làm thuốc, vừa có giá trị cây vườn thương mại và vừa là phương thuốc thảo dược truyền thống [11], tuy nhiên thông tin về

đặc điểm thực vật cũng như thành phần hóa học của các loài thuộc chi Lysimachia L ở

Việt Nam còn rất hạn chế Trong các tài liệu đã công bố cũng chỉ mô tả khá sơ bộ về đặc điểm hình thái, sinh thái, tính vị tác dụng và công dụng của một số loài thuộc chi

này ở Việt Nam, trong đó có loài Trân châu hoa chụm (L congestiflora Hemsl.) Nhằm mục đích cung cấp các dữ liệu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của loài L

congestiflora Hemsl tại Việt Nam, làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn và xây dựng

tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này, khóa luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật,

thành phần hóa học của loài Trân châu hoa chụm (Lysimachia congestiflora

Hemsl.)” được thực hiện Đề tài gồm các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu

- Định tính thành phần hóa học mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

- Định lượng polyphenol toàn phần, flavonoid toàn phần trong dược liệu và bán định lượng một hợp chất có trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về đặc điểm thực vật và phân bố chi Lysimachia L

1.1.1 Vị trí phân loại chi Lysimachia L

Họ Anh thảo (Primulaceae Rich.) gồm 24 chi và khoảng 1000 loài Chi

Lysimachia L là một trong những chi lớn nhất của họ này Theo hệ thống phân loại thực

vật của Armen Takhtajan (2009), chi Lysimachia L có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật: Plantae

Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta

Lớp thực vật hai lá mầm: Magnoliopsida

Bộ Anh Thảo: Primulales

Họ Anh Thảo: Primulaceae

Chi Trân Châu: Lysimachia L [35]

1.1.2 Lịch sử phân loại chi Lysimachia L

Nhiều nhà phân loại học đã xây dựng hệ thống khóa phân loại cho chi Lysimachia

L Năm 1866, Klatt là người đầu tiên nghiên cứu phân loại chi này, ông đã mô tả 45 loài và phân chia chi thành 9 phần Sau đó, năm 1905, Pax và Knuth đã công nhận 110 loài và chia chi này thành 16 phần Một sự đóng góp quan trọng nhất trong việc phân

loại chi Lysimachia L là bởi Handel-Mazzetti (1928), ông đã công nhận 147 loài trên

toàn thế giới, trong đó có 83 loài ở Trung Quốc Đồng thời ông cũng sắp xếp lại và phân

chia chi Lysimachia L chủ yếu dựa trên các đặc điểm về màu hoa, số lượng và hình

dáng cánh hoa, sự hiện diện hay vắng mặt của nhị lép, kiểu mọc của hoa thành 5 phân

chi bao gồm: Idiophyton, Lysimachiopsis, Lysimachia, Naumburgia và Pallidia Hệ

thống phân loại của ông tiếp tục được sửa đổi và đóng góp thêm bởi nhiều tác giả sau

đó như Chen & Hu (1979), Bennell & Hu (1983) [13], [18]

Trên thế giới, theo website www.theplantlist.org [63] thống kê từ nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, hiện nay đã có khoảng 190 loài được chấp nhận rộng rãi

Tại Trung Quốc, khóa phân loại chi Lysimachia L của thực vật chí Trung Quốc

đã ghi nhận 138 loài [17]

Trong bộ Thực vật chí Campuchia-Việt Nam-Lào xuất bản năm 1973 bởi Bảo

tàng lịch sử tự nhiên quốc gia Paris, đã có 18 loài thuộc chi Lysimachia L được ghi

nhận [62]

Tài liệu “Cây cỏ Việt Nam” (1999) của Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận 17 loài có mặt tại Việt Nam, trong đó 11 loài được dùng làm thuốc theo ghi nhận ở cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tiến sĩ Võ Văn Chi xuất bản năm 2012 [3] Năm 2005, giáo sư

Phan Kế Lộc ghi nhận thêm 1 loài L.vittiformis F.H Chen & C.M Hu [6] và tiếp tục công bố thêm 2 loài thuộc chi này vào năm 2011 là L vietnamensis L K Phan & C M

Hu và L verbascifolia C M Hu & L K Phan [28] Gần đây nhất vào năm 2017, Hua Tong cùng cộng sự ghi nhận thêm một loài L rupestris F H Chen & C M Hu [36] Như vậy, tổng cộng nước ta hiện có khoảng 20 loài thuộc chi Lysimachia L

Yi-1.1.3 Đặc điểm hình thái thực vật chi Lysimachia L

Cây cỏ mọc thẳng đứng hoặc bò, hiếm khi là cây bụi thấp; nhẵn nhụi hoặc có lông

tơ, thường có các tuyến xuất hiện dưới dạng các chấm nhỏ hoặc sọc Lá mọc xen kẽ, mọc đối hoặc mọc so le, thường nguyên, không chia thùy Hoa đơn độc mọc ở nách lá hoặc thành chùm ở ngọn, thường được rút ngắn thành cụm hoa có lá bắc Hoa có cuống, đối diện với một lá hoặc lá bắc [48] Đài thường có 5 thùy (hiếm khi 6-9), có thể phát triển cùng quả Tràng màu trắng hoặc vàng, đôi khi tím; hoa đều, hiếm khi không đều; hàn liền hình đinh hoặc hình chuông, chia thùy 5 (hiếm khi 6-9) Nhụy hoa thường có 5

lá noãn Chỉ nhị tự do hoặc hợp thành ống chỉ nhị, dính trên thành ống tràng; bao phấn đính gốc, đính lưng hoặc đính giữa; mở bằng lỗ ở đỉnh hoặc khe ở bên Quả nang hình cầu hoặc hình trứng, thường mở bằng van hoặc không tự mở [17]

Hạt hình bầu dục có vỏ ngoài sáng bóng, được bao phủ bởi vỏ dày, màu xám hoặc màu vàng nâu, bề mặt có lỗ như tổ ong Thường xuất hiện lông ở các nốt của thân cây, trong các bộ phận của hoa, bề mặt bên trong tràng hoa, ống nhị và chỉ nhị [48]

1.1.4 Phân bố các loài thuộc chi Lysimachia L

Trên thế giới, chi Lysimachia L bao gồm hơn 180 loài thảo mộc hằng năm hoặc

lâu năm Chi này phân bố rộng rãi trên thế giới, chủ yếu xuất hiện ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới ở Bắc bán cầu, cùng với một số loài ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Mỹ,

Châu Phi và Úc [17], [18], [30] Ở châu Á, chi Lysimachia L chủ yếu nằm ở phía đông

Ấn Độ, miền bắc Miễn Điện và miền Nam Trung Quốc [48], trong đó Trung Quốc là trung tâm của sự đa dạng với khoảng 140 loài, nhất là khu vực núi đá vôi phía Tây Nam Trung Quốc (đặc biệt ở miền nam Tứ Xuyên, Quý Châu và Vân Nam), và chi này kéo dài sang Myanmar, Lào, Campuchia, Việt Nam và Thái Lan nhưng không có sự đa dạng như ở Trung Quốc [19], [39], [44]

Tại Việt Nam các loài thuộc chi này phân bố rộng rãi từ Bắc vào Nam Đặc điểm

phân bố và bộ phận dùng của các loài thuộc chi Lysimachia L ở Việt Nam hiện nay

được tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 1.1 Phân bố của các loài thuộc chi Lysimachia L tại Việt Nam

Bộ phận dùng

Tài liệu ghi nhận

Cao Bằng, Lạng Sơn (Đồng Đăng), Thái Nguyên, Hà Nội, Ninh Bình (chợ Ghềnh, Nho Quan), Thanh Hóa, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế

Toàn cây

[3], [5], [8], [9], [62]

3

Lysimachia

chapaensis Merr

Lý mạc sapa, Trân châu Sapa

Lào Cai (Sapa)

[5], [8], [9],[62]

4

Lysimachia chenii

C.M.Hu

Lý mạch chen, Trân châu chen

Quảng Trị (núi Răng

[3], [5], [8], [9], [62]

Kon Tum (Đắk Glei, Ngọc Linh), Núi Ngọc

cây

[3], [5], [8], [9], [62]

Lào Cai (Sapa), Quảng

cây

[3], [5], [8], [9], [62]

châu hoa phù

Phổ biến từ Bắc vào Nam: Lai Châu, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hoà Bình (Chợ Bờ, Suối Rút), Hà Nội, Thanh Hoá, Nghệ An, Quảng Trị (Bố Giang), Thừa Thiên Huế,Quảng Nam

Toàn cây

[3], [5], [8], [9], [62]

Lâm Đồng (Đà lạt, Langbian, Bidoup);

Khánh Hòa, Nha Trang Toàn

cây

[3], [5], [8], [9], [62]

9

Lysimachia

fortunei Maxim

Lý mạc Fortune, Rau tinh tú

Cao Bằng, Lạng Sơn (Đồng Đăng), Quảng Ninh (Quảng Yên)

[5], [8], [62]

10

Lysimachia

insignis Hemsl

Trân châu hoa vàng, Trân châu

ba lá, Tam trương diệp

Cao Bằng, Lạng Sơn đến Quảng Nam, Đà Nẵng (Lạng Sơn, Hà Nam (Kim Bảng), Đà Nẵng, Kon Tum (Đắc Tô)

Toàn cây

[3], [5], [8], [9], [62]

11

Lysimachia laxa

Baudo

Lý mạch thưa, Trân châu hoa thưa

Lào Cai (Ô Quy Hồ, Sapa), Kon Tum (Đắc

Tô, Ngọc Phan), Lâm Đồng (Bidoup)

Toàn cây

[3], [5], [8], [9], [62]

Lào Cai (Sapa)

Toàn cây

[3], [5], [8], [9], [62]

Kon Tum (Kon Plong, Tân Lập), Ninh Thuận (Cà Ná)

[5], [8], [62]

14

Lysimachia

siamensis Bon

Lý mạc xiêm

Lai Châu, Sơn La (Mường La, 700m), Hoà Bình, Gia Lai, Kon Tum, Đắc Lắc( 1000-1100m), Lâm Đồng(Đà Lạt)

[5], [8], [62]

15

Lysimachia

petelotii Merr

Lý mạc Pételot, Trân châu petelot

Lào Cai (Sapa), Kon

Làng Na Bo, xã Liêm Thuỷ, Na Rì, Bắc Cạn

[6]

19 Lysimachia

sikokiana Miq

Trân châu Sikok

Lào Cai (Sapa), Kon Tum

Toàn cây [3], [8]

Trên thế giới ở nhiều nước, đặc biệt là Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu từ rất

sớm về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Lysimachia L như hợp chất flavonoid

từ L punctata L (1970), L clethroides Duby (1986), L nummularia (1990), L

thysiflora (1997); benzoquinon trong sáu loài L clethroides Duby, L ephemerum L.,

L thyrsiflora L., L nummularia L., L punctata L., L ciliata (2008); ecdysteroid từ L thyrsiflora (2002); acid phenolic từ L nummularia (1989); saponin từ L thyrsiflora

(1975) và L vulgaris (1998) [32]

Tại Việt Nam, hiện nay các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc

chi Lysimachia L còn rất hạn chế, chưa có nghiên cứu nào được công bố Trong số 20 loài ở Việt Nam, chỉ có 5 loài được nghiên cứu thành phần hóa học là L congestiflora Hemsl., L clethroides Duby, L fortunei Maxim, L candida Lindl., L sikokiana Miq

Từ những nghiên cứu trên thế giới, các hợp chất có trong các loài thuộc chi Lysimachia

L chủ yếu là flavonoid, saponin, acid hữu cơ, triterpen và steroid [32], trong đó điển hình hơn cả là flavonoid và saponin triterpenoid

1.2.1 Nhóm hợp chất flavonoid

Các loài Trân châu thuộc chi Lysimachia L rất giàu flavonoid với khoảng 70 hợp

chất được nghiên cứu và tồn tại chủ yếu dưới dạng flavonol-O-glycosid của một số hợp chất như kaempferol, quercetin, myricetin và syringetin [15] Trong một số loài, flavonoid là thành phần có hoạt tính sinh học chính

Các hợp chất flavonoid chủ yếu được phân lập từ các loài L clethroides Duby, L

candida Lindl., L fortunei Maxim, L congestiflora Hemsl., trong đó nhiều nhất vẫn là

loài L clethroides Duby với khoảng hơn 40 flavonoid được phân lập từ loài này Ngoài

các hợp chất tồn tại dưới dạng flavonol-O-glycosid, điển hình như kaempferol glycosid (astragalin [40] và các kaempferol glycosid khác có các gốc đường là rutinose [27], galactose [52], pyranose [59], [25], [53]) hay quercetin glycosid (như isoquercitrin [10])

chiếm đa số, trong loài L clethroides Duby còn có dạng flavonol aglycon như

kaempferol [40] , quercetin [52], myricetin [11] và rutin [51] Một số thành phần điển hình của các loài khác như: isorhamnetin glycosid (L fortunei Maxim [45], [55]); kaempferol glycosid (L congestiflora Hemsl [15], L candida Lindl [58], L fortunei Maxim [45]); syringetin glycosid (L congestiflora Hemsl [60]); larycitrin (L

congestiflora Hemsl [49]); myricetin, myricitrin và myricetrin (L congestiflora Hemsl

[56], [54])

Ngoài ra, các dạng flavonoid khác cũng chiếm tỷ lệ nhỏ trong các loài thuộc chi này, bao gồm: flavan-3-ol ((+)-catechin, (-)-epicatechin, epigallocatechin, (+)- gallocatechin); flavanon (eriodictyol, naringenin), flavon (vitexin, 7-O-glucosyl

liquiritigenin); dạng C-glycosid; flavonoid bị methyl hóa (isorhamnetin trong loài L

fortunei Maxim [50]) và flavonol glycosid bị acyl hóa

(quercetin-3-O-β-D-(6-O-Z-p-coumaroyl)glucopyranosid) [11], [27]

flavonol flavan-3-ol flavanon

Hình 1.1 Cấu trúc một số khung flavonoid

1.2.2 Nhóm hợp chất saponin

Saponin được xác định từ các loài đã nghiên cứu chủ yếu đều thuộc nhóm saponin triterpenoid và hầu hết có cấu trúc khung oleanan, có 2 nhóm cấu trúc phổ biến: 13β,28-epoxyoleanan và olean-12-en Đến năm 2007, saponin đã được báo cáo từ khoảng 12

loài thuộc chi trên toàn thế giới, chủ yếu là các loài có nguồn gốc ở Châu Á bao gồm L

capillipes Hemsl., L candida Lindl., L congestiflora Hemsl., L davurica Ledeb., L foenum-graecum Hance, L microcarpa Hand-Mazz., L paridiformis Franch., L sikokiana Miq., L heterogenea Klatt, L clethroides Duby và 2 loài ở Châu Âu gồm L vulgaris L và L thyrsiflora L [32] Đến nay, đã có khoảng 5 loài thuộc chi này ở Việt

Nam được thế giới nghiên cứu về hợp chất saponin

Năm 2017, một nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 saponin triterpenoid từ bộ

phận trên mặt đất của loài L fortunei Maxim gồm fortunosid A - F [12] Trong khi đó,

từ bộ phận toàn cây của loài L lobelioides Wall phân lập được 4 hợp chất lobelioidosid

A - D cũng có cầu nối 13,28-epoxy nhưng ở vị trí 16 có nhóm oxo và một nhóm OH ở

vị trí 23 [22]

Thành phần có hoạt tính quan trọng nhất trong loài L sikokiana Miq là hợp chất

saponin Từ bộ phận trên mặt đất của loài này đã phân lập được 7 saponin chính, trong

đó lysikokianosid 1 là thành phần có hoạt tính mạnh nhất Hợp chất lisikokianosid 1 có chứa sapogenin là protoprimulagenin A gắn với các gốc đường α-arabinose; β-glucose; β-xylose [20] Ngoài ra, lysikokianosid 1 còn được tìm thấy trong các loài khác của chi

như L clethroides Duby [24], [32]; L candida Lindl [42], [57]; L fortunei Maxim [12] Đối với loài L clethroides Duby, các hợp chất saponin chủ yếu thuộc 4 nhóm cấu

trúc [24]:

+ Cấu trúc olean–12–en gồm: clethroidosid A, clethroidosid B, candidosid, O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- (1→4)]-α-L-arabinopyranosyl-3β,16α,28-trihydroxyolean-12-en

+ Cấu trúc 13β,28–epoxyoleanan gồm các hợp chất: clethroidosid C – F; ardisianosid E; ardisimamilosid E; lysikokianosid 1 và 3 -O-β-D-glucopyranosyl-

(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- (1→

4)]-α-L-arabinopyranosyl-13β,28-epoxy-3β,16α-dihydroxyoleanan

+ Cấu trúc ursan: clethroidosid H

+ Cấu trúc 12-oxoolean-30-al: clethroidosid G

Nhóm olean-12-en Nhóm 13β,28 - eopxyoleanan

Hình 1.2 Công thức saponin nhóm olean-12-en và nhóm 13β,28-eopxyoleananan

1.2.3 Các hợp chất thuộc nhóm khác

Acid hữu cơ đã được nghiên cứu phân lập từ 4 loài ở Việt Nam Năm 2012, Dong liang và cộng sự đã phân lập được 17 acid carboxylic từ bộ phận trên mặt đất của loài

L clethroides Duby [23] Các acid béo (acid hexadecanoic, acid lacceroic) cũng được

phân lập từ loài L lobelioides Wall năm 2009 [61] Ngoài ra, acid palmitic cũng được tìm thấy trong 2 loài L candida Lindl.[58] và L fortunei Maxim [50]

Năm 2012, Xu Qiong-ming cùng các cộng sự đã báo cáo nghiên cứu phân lập được một triterpenoid pentacylic từ dịch chiết cloroform là 3β-myristoxyurs-12-en-19,28-olid cùng với 4 triterpenoid khác gồm: hederagenin, acid betulinic, acid ursolic,

acid 19α-hydroxyurs-12-en-28-oic từ loài L clethroides Duby [43] Các triterpenoid điển hình của loài L lobelioides Wall gồm acid oleanolic , 12-oleanen-3,22-diol, acid ursolic [61] Triterpenoid phân lập được trong 2 loài L fortunei Maxim và L

congestiflora Hemsl hạn chế hơn: 9,19-cyclolanost-24-en-3-on trong loài L fortunei

Maxim [50], Taraxerol trong loài L congetiflora Hemsl [45]

Hợp chất sterol phổ biến nhất là stigmasterol có trong các loài L candida Lindl [58]; L fortunei Maxim [50]; L clethroides Duby [59] và L congetiflora Hemsl

[54],[56],[60] Ngoài ra có các steroid khác phân lập được như β-sitosterol, daucosterol,

chondrillasterol từ L lobelioides Wall [61]; spinasterol từ L candida Lindl [58]; ethyl-5α-cholesta-7,22(E)-dien-3β-ol và 9,19-cyclolanost-24-en-3-on từ L fortunei

24-Maxim [50]

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Lysimachia L

1.3.1 Công dụng của các loài thuộc chi Lysimachia L

Các loài thuộc chi Lysimachia L có nhiều ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là ở Châu

Á, trong đó phổ biến hơn cả là ở Trung Quốc Trong dân gian cây thường được dùng làm trà thảo mộc cho các bệnh về đường tiêu hóa [37] Rễ hay toàn cây của loại thảo

mộc truyền thống L clethroides Duby được dùng chữa bệnh phù nề, vàng da, kiết lỵ,

sốt thấp khớp, vô kinh, bầm tím, gãy xương, chảy máu, chấn thương, viêm vú, nhọt, rắn cắn, và viêm gan; thân và lá mềm còn được dùng làm rau ăn [27], [40]; trong khi bộ phân trên mặt đất được sử dụng rộng rãi với công dụng chữa đau họng, phù nề, mãn

kinh [10], [23], [26] Ngoài ra, toàn bộ cây của loài L candida Lindl được sử dụng để điều trị sốt, sưng, viêm da, gãy xương [42] Lá tươi của loài L laxa Baudo dược dùng

để tẩy giun sán đường tiêu hóa [33] Loài L lobelioides Wall được dùng trong dân gian

điều trị thấp khớp, phù nề, kiết lỵ và chấn thương [22]

1.3.2 Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Lysimachia L

- Tác dụng gây độc tế bào: Ở Việt Nam hiện nay hầu như chưa có nghiên cứu nào về tác

dụng gây độc tế bào của các loài thuộc chi Lysimachia L Trên thế giới, một số nghiên cứu tập trung chủ yếu một số loài như L clethroides Duby, L candida Lindl., L laxa Baudo, L fortunei Maxim Trong các loài kể trên, L clethroides là loài được nghiên cứu

nhiều nhất Cụ thể, năm 2009, Liu Yan-li cùng các cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng

gây độc tế bào của hỗn hợp flavonoid toàn phần từ loài L clethroides Duby thông qua

ức chế sự tăng trưởng các tế bào ung thư bạch cầu K562 Các nghiên cứu trước đó cũng cho thấy loài này có tác dụng ngăn chặn hiệu quả một số dòng tế bào ung thư như dòng

tế bào ung thư bạch cầu ở người L1210, ức chế di căn trên dòng tế bào ung thư gan H22

và dòng tế bào ung thư cổ tử cung U14 [27] Năm 2012, Qiong-ming Xu cùng cộng sự tiến hành đánh giá hiệu quả gây độc tế bào của các hợp chất triterpen pentacylic trên các dòng tế bào ung thư biểu mô phế quản A549, SK-MES-1 và NCI-H446, kết quả dựa trên giá trị IC50 [43] Đến năm 2013, một nghiên cứu ghi nhận rằng các hợp chất lysilacton A - C có trong loài này có hoạt tính chống lại nhiều dòng tế bào ung thư gồm dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng HCT-8, ung thư biểu mô gan Bel-7402, ung thư biểu mô dạ dày BGC-823 và ung thư biểu mô buồng trứng A2780 [26]

- Chống nấm: Anagallisin C là hợp chất chính trong loài L candida Lindl., có khả năng chống nấm Aspergillus flavus [42]

- Chống oxy hóa: Một nghiên cứu gần đây vào năm 2017 của Sanjoy Gupta và cộng sự

cho thấy tác dụng loại bỏ gốc tự do DPPH từ dịch chiết methanol của loài L laxa Baudo

bởi cơ chế cung cấp nguyên tử Hydro hoặc cho điện tử Theo đó, hàm lượng phenolic

và flavonoid trong cây cao nhất nên cho tính khử mạnh nhất và hoạt động dọn gốc tự do triệt để [16], [33]

- Tác dụng khác: Tác dụng giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, diệt vius, chống dị ứng [37]; chống kết tập tiểu cầu, hạ đường huyết và tác dụng bảo vệ gan [10], [40]

1.4 Tổng quan về loài Lysimachia congestiflora Hemsl

1.4.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Lysimachia congestiflora Hemsl., tên thường gọi là Trân châu hoa chụm hay Trân châu hoa phù, thuộc chi Lysimachia L., họ Anh thảo (Primulaceae), bộ Anh thảo

(Primulales)

Đặc điểm thực vật: Cây thảo lâu năm, có thân cao 6 - 30cm, mọc nằm nhiều hay ít

ở gốc tạo thành tán với độ dày 5 - 15cm; có rễ phụ, phần trên và nhánh mọc thẳng đứng, phủ lông đa bào màu hung dày đặc Lá mọc đối, hai cặp lá trên mọc sít nhau; cuống lá dài 1 - 2cm (bằng 1/3 - 1/2 phiến lá), cánh lá hẹp Phiến lá hình tim hay trứng rộng tới gần tròn, kích thước (0,7-)1,4 - 3(-4,5) x (0,6-)1,3 - 2,2(-3) cm, có nhiều lông tơ bao phủ, có chấm màu đỏ hoặc đen tập trung gần mép lá Chóp lá nhọn hoặc tù, gốc lá tròn; gân bên màu tím 5 - 6 đôi; gân phụ 2 – 6 cặp, không nổi rõ Hoa mọc ở nách lá và ngọn, hình đầu; xếp 2 - 4 cái ở ngọn thân và các nhánh, ít khi mọc đơn độc ở nách của cặp lá thứ hai ở ngọn; cuống hoa dài 2mm Lá đài hình mác, chẻ sâu đến gốc, kích thước 5 -8,5 x 1-1,5mm, bên dưới có lông nhung rải rác Tràng màu vàng, ở gốc có rạch tím, chia sâu thành thùy hình trứng – bầu dục hoặc hình mác dài 9 – 11 mm; rải rác các chấm nhỏ màu đỏ sẫm hoặc đen; đầu nhọn đến tù Nhị có chỉ nhị 0,5 – 1 cm, dính với nhau tạo thành ống cao 2,5mm gắn với gốc của ống tràng; bao phấn đính lưng, hình thuôn, mở bằng lỗ ở bên Bầu nhụy có lông mịn, vòi dài 5 - 7mm Quả nang hình cầu, đường kính

3 - 4mm [3], [5], [17]

Sinh thái: Cây mọc ở rìa rừng, dọc các suối, dọc đường mòn, rãnh mương nước

dọc theo các con đường, trong các hốc, rìa rừng ẩm ướt, trong các rú bụi đầm lầy ở độ cao 1500-1800 Ra hoa vào tháng cuối mùa xuân và kéo dài khoảng 30 ngày, giai đoạn

ra hoa cao điểm vào tháng 5-6 Ra quả tháng 7-9 [3], [5], [8], [9], [17]

Phân bố: Ở Trung Quốc, loài L congestiflora Hemsl phân bố chủ yếu ở các tỉnh

phía nam sông Trường Giang và phía nam Sơn Tây, tỉnh Cam Túc và Đài Loan [21] Loài này được tìm thấy ở rộng khắp các nơi ở Trung Quốc như An Huy, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hải Nam, Hồ Bắc Ngoài ra còn được tìm thấy ở Đông Hy Mã Lạp Sơn, từ Nepal đến Bhutan, Miễn Điện, Thái Lan, ở độ cao 1600-2100m [62], [21]

Tại Việt Nam, loài L congestiflora Hemsl được ghi nhận ở các tỉnh Lào Cai (Sapa),

Quảng Nam, Đà Nẵng [3], [5], [8], [9], [62]

1.4.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, các thành phần hóa học chủ yếu được phân lập từ loài L congestiflora

Hemsl gồm flavonoid (phần lớn có cấu trúc khung flavonol và flavon), triterpen glycosid, hợp chất phenol và steroid

Hợp chất flavonoid: Thành phần flavonoid chiếm đa số trong cây và được nghiên cứu nhiều nhất Năm 1998, Jian Guo cùng cộng sự đã báo cáo phân lập được các flavonoid trong toàn cây trên cơ sở phân tích phổ UV, MS và NMR [15] Các flavonoid

điển hình của L congestiflora Hemsl bao gồm:

- Flavonol dạng aglycon: syringetin, quercetin, myricetin, larycitrin, tamarixetin

- Flavonol dạng glycosid: Các gốc đường gắn với aglycon chủ yếu là furanosid, rhamnosid, pyranosid như myricitrin, myricetrin; kaempferol 3-O- α-arabinofuranosid; myricetin 3-rhamnosid; myricetin 3-O-α-arabinofuranosid; syringetin 3-O-arabinofuranosid; syringetin 3-rhamnosid…[15]

- Flavon: vitexin, cerarvesin [56]

- Hợp chất triterpen: taraxerol [54]

- Hợp chất steroid: stigmasterol, β - sitosterol [49], [54], [56], [60]

- Hợp chất phenol: eugenin, myricanon [54]

- Hợp chất saponin triterpenoid: ardicrenin, ardisiacrispin A [60]

Bảng 1.2 Công thức một số hợp chất flavonoid trong loài L congestiflora Hemsl

STT Tên chất

Công thức hóa học

Tài liệu ghi nhận

Công dụng: Trân châu hoa chụm (L congestiflora Hemsl.) từ lâu đã được sử dụng

trong dân gian Tại Trung Quốc, cây được sử dụng để giảm ho tiêu đờm, giải cảm lạnh, giải độc, chữa bệnh sỏi mật, sỏi niệu đạo, trị nọc độc rắn, áp xe, hầu họng sưng đau, viêm gan thể hoàng đản, ho nhiều đờm, trẻ em sài giật [3], [47] Tại Việt Nam, theo ghi nhận trong tài liệu Danh lục cây thuốc Việt Nam (Viện Dược liệu) và cuốn từ điển cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi), cây được sử dụng để chữa viêm gan, lỵ, ho nhiều đờm, trẻ em co giật [3], [9]

Tác dụng sinh học: Hiện nay chưa có nghiên cứu nhiều về tác dụng dược lí của loài này, nghiên cứu gần đây nhất vào năm 2015 của Xia Li cùng cộng sự về tác dụng kháng

khuẩn và chống nấm từ dịch chiết thân và lá của loài L congestiflora Hemsl Kết quả cho thấy cao chiết ethanol 65% có tác dụng ức chế mạnh nhất trên Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus [41]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu cây tươi được thu hái tại Phong Thổ - Lai Châu vào tháng 9/2019 Sau khi thu hái, một phần được ngâm trong ethanol 60 % để nghiên cứu đặc điểm hiển vi Một phần mẫu được ép thành tiêu bản khô để nghiên cứu đặc điểm hình thái và lưu mẫu Phần còn lại được phơi se, sấy trong tủ sấy ở 50 ºC đến khô, xay tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon sạch kín, để chỗ mát, sử dụng làm nghiên cứu

đặc điểm bột và thành phần hóa học

Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học và lưu tiêu bản tại phòng Tài nguyên thực vật - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật (Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam) với mã số tiêu bản (106.03-2018.06)-1 (Phụ lục 1 và 2)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

❖ Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Nước Javen, nước cất, acid acetic 5 %, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin

❖ Dùng trong định tính sơ bộ các thành phần hóa học: NaOH 10 %, dd gelatin 1 %, FeCl3 5 %, H2SO4 đặc, thuốc thử diazo, thuốc thử Fehling A & B, Na2CO3, thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Bouchardat, chì acetat 10 %, acid picric…

Chất đối chiếu: quercetin và acid gallic được mua từ Biopurify Phytochemicals (Trung Quốc), độ tinh khiết 98 %

Tất cả hóa chất và dung môi đều đạt tiêu chuẩn DĐVN V

2.1.2.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

❖ Dụng cụ:

Dụng cụ thí nghiệm thường quy bằng thủy tinh: cốc có mỏ, bình nón, bình định mức, phễu, bình gạn, pipet, ống nghiệm, đũa thủy tinh, lọ vial

Dao lam, bộ dụng cụ làm tiêu bản: Phiến kính, lam kính

Dụng cụ khác: Chày, cối, bát sứ, thuyền tán, khay tráng men…

❖ Máy móc, thiết bị:

Máy xay Tủ sấy Memmert

Cân kỹ thuật: Precisa BJ 610C

Kính hiển vi quang học Leica DM 1000 có kết nối camera

Kính lúp soi nổi Stereo Blue

Máy cô quay Rotavapor R-220 Máy đo độ ẩm OHAUS Máy ảnh kỹ thuật số Canon Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H)

Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC của CAMAG (Thụy Sĩ) bao gồm:

+ Máy chấm sắc kí CAMAG Linomat 5

+ Hệ thống triển khai sắc ký tự động ADC-2

+ Buồng chụp sắc ký TLC Visualizer

+ Máy vi tính cài đặt phần mềm visionCATs để điều khiển quá trình sắc ký

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Mô tả đặc điểm bột và vi phẫu của mẫu nghiên cứu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu thành phần hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học

- Định lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu bằng phương pháp đo quang

- Triển khai sắc kí lớp mỏng dịch chiết thân và lá

- Bán định lượng myricetin trong mẫu nghiên cứu bằng sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học

- Thu thập mẫu cây Trân châu hoa chụm ở Phong Thổ - Lai Châu khi cây có hoa và có quả Mẫu thu thập được xử lý và làm tiêu bản theo quy trình làm tiêu bản thực vật trong tài liệu “Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc” [2] Mẫu nghiên cứu được lưu giữ tại phòng Tài nguyên thực vật - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật (Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam)

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của mẫu nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp so sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam [3], [17], đồng thời tham khảo ý kiến của các chuyên gia về phân loại thực vật để giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi

- Đặc điểm vi phẫu: Mẫu nghiên cứu được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo phương pháp

nghiên cứu vi học trong kiểm định dược liệu [7], mô tả đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh

- Đặc điểm bột: Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, đem tán thành bột mịn bằng thuyền tán đã được làm sạch và khô, rây qua rây 180µm và lên tiêu bản Soi tìm và quan

sát các đặc điểm dưới kính hiển vi quang học Mô tả đặc điểm của bột và chụp ảnh [7]

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hóa học

2.3.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học

Tiến hành các phản ứng định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu theo tài liệu “Thực tập dược liệu” [1]; “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [4] Quy trình định tính được trình bày trong Phụ lục 3

2.3.3.2 Định lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong dịch chiết của loài L congestiflora Hemsl

Từ kết quả định tính, sơ bộ kết luận được flavonoid, saponin, anthranoid, tannin

và steroid là các hợp chất chính có trong loài L congestiflora Hemsl Dựa vào mức độ

phản ứng, dự đoán sơ bộ flavonoid là thành phần chính trong loài này Do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành định lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong

dịch chiết của mẫu nghiên cứu

❖ Định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp Folin - Ciocalteu

• Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:

- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình cầu

Chiết hồi lưu với 20ml methanol 80%trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 85 0C Lọc thu lấy dịch chiết, thêm tiếp 20ml methanol 80% và tiến hành chiết lần 2 Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 50ml và bổ sung bằng methanol 80% đến vạch Để đảm bảo nồng

độ thử nằm trong khoảng tuyến tính, dịch chiết tiếp tục được pha loãng bằng cách lấy chính xác 2 ml dịch chiết cho vào bình định mức 50ml, thêm methanol 80% đến vạch thu được dung dịch thử

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 mg acid gallic chuẩn vào

trong bình định mức 25 ml, hòa tan và bổ sung bằng methanol 80% vừa đủ đến vạch Pha loãng tiếp bằng methanol 80% để được dãy dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml

• Tiến hành định lượng:

Lấy chính xác 1 ml dung dịch thử vào bình định mức 10 ml, thêm 2,5 ml thuốc thử Folin - Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút Sau đó thêm 1 ml nước cất lắc đều, thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5% và định mức bằng nước cất Sau 60 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 754,5

nm (đã khảo sát) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Giá trị A được ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần

Hàm lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu được xác định bằng cách quy

về đương lượng với acid gallic chuẩn theo công thức như sau:

V: Thể tích dung dịch chiết gốc K: Hệ số pha loãng

mdl : Khối lượng dược liệu (g) a: Độ ẩm dược liệu (%)

❖ Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp tạo màu với AlCl3 trong môi trường kiềm

• Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:

- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình cầu

Chiết hồi lưu với 20ml methanol 80% trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 850C Lọc thu lấy dịch chiết, thêm tiếp 20ml methanol và tiến hành chiết lần 2 Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 50ml và bổ sung tới vạch định mức bằng methanol 80%, lắc đều thu được dung dịch thử

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5mg quercetin chuẩn (độ tinh

khiết 98%) vào bình định mức 25ml và định mức bằng methanol 80% ta thu được dung dịch chuẩn gốc C0 có nồng độ 196µg/ml

• Tiến hành định lượng:

Hút chính xác 1ml dịch chiết vào bình định mức 10ml, thêm 0,2ml dung dịch nhôm clorid (10% kl/tt), 0,4ml dung dịch natri acetat 0,5M và định mức tới 10,0ml bằng methanol Hỗn hợp phản ứng để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó xác định

độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ tại bước sóng khảo sát Giá trị A ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu

Hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dược liệu được tính theo công thức:

𝑋 = 𝐶 𝑥 10−3𝑥 𝑉 𝑥 𝐾

𝑚𝑑𝑙 𝑥 (100−𝑎)𝑥 10 −2 (mg QE/g dược liệu)

Trong đó:

X: Hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết của mẫu thử (mg QE/g )

C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/ml)

V: Thể tích dung dịch chiết gốc (50 ml) K: Hệ số pha loãng

mdl: Khối lượng dược liệu (g) a: Độ ẩm dược liệu (%)

• Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết được tiến hành

theo hướng dẫn của ICH (Hội đồng hòa hợp quốc tế - International Conference of

Harmonization) trong văn bản hướng dẫn Q2B - Thẩm định quy trình phân tích

(Validation of Analytical Procedure: Methodology) [14]

a) Độ thích hợp hệ thống

- Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống

phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

- Tiến hành đo hấp thụ của dung dịch thử 6 lần Ghi lại các giá trị độ hấp thụ A Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD

- Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD không được lớn hơn 2%

a) Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ chất phân tích

- Tiến hành đo quang các dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần

- Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ A và

nồng độ dung dịch chuẩn

- Đường chuẩn được đánh giá dựa vào hệ số hồi quy tuyến tính R (hay giá trị R2)

- Yêu cầu: 0,995 ≤ R ≤ 1 (hay 0,99 ≤ R2 ≤1)

b) Độ lặp lại

- Độ lặp lại: là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại

trên cùng một đối tượng trong cùng một điều kiện phân tích Độ lặp lại được đánh giá bằng sự phân bố của các giá trị đo trong các phép thử quanh giá trị trung bình, được biểu thị bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) hay hệ số biến thiên

CV (%)

- Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên cùng một mẫu dược liệu và tính toán

SD và RSD theo công thức

- Yêu cầu RSD tối đa chấp nhận tùy từng trường hợp theo Bảng 2.1 như sau:

Bảng 2.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận ở các nồng độ khác nhau

c) Độ đúng:

- Độ đúng của phương pháp định lượng: Là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa

các giá trị trung bình của phép phân tích và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

- Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): Là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với

𝐶𝑚+𝑐: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (µg/ml)

C𝑚 : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/ml)

C𝑐 : Nồng độ chuẩn thêm theo lý thuyết (µg/ml)

- Yêu cầu R (%) tối đa chấp nhận tùy từng trường hợp theo Bảng 2.2 như sau:

Bảng 2.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau

Hàm lượng flavonoid tổng trong dịch chiết (%) Yêu cầu độ thu hồi R (%)

d) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện bằng phép phân tích nhưng chưa thể định lượng

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng cho kết quả đảm bảo yêu cầu về độ chính xác và độ lặp lại

- LOD và LOQ có thể được xác định theo công thức:

LOD= 3,3 𝑥 SDtrắng

𝑎 ; LOQ= 10 𝑥 SDtrắng

𝑎

Trong đó: SDtrắng: Độ lệch chuẩn trong phép phân tích mẫu trắng

a : Độ dốc của đường tuyến tính

2.3.3.3 Triển khai sắc kí lớp mỏng dịch chiết của loài L congestiflora Hemsl

- Chuẩn bị dịch chấm sắc kí: Cân 1g bột dược liệu thô vào bình cầu, chiết hồi lưu với

50ml methanol 80% trong 2 giờ Lọc lấy phần dịch trong và cất thu hồi dung môi đến cắn Phân tán cắn trong 10 ml nước cất và lắc với diethyl ether 5 lần (10ml/lần) Loại bỏ lớp diethyl ether Lấy lớp nước và tiếp tục lắc với ethyl acetat 5 lần (10ml/lần) Thu lấy lớp ethyl acetat và loại bỏ lớp nước Gộp các dịch chiết phân đoạn ethyl acetat, cất thu hồi dung môi đến cắn Hòa tan cắn thu được trong 1m methanol, lọc loại tủa thu được dịch chấm sắc ký lớp mỏng

- Dung dịch đối chiếu: myricetin nồng độ 104 µg/ml

- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

- Pha động: Khảo sát một số hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, lựa chọn hệ dung môi

cho kết quả tách tốt nhất

Hệ I: Toluen - ethyl acetat - acid formic (5:5:1)

Hệ II: Toluen - ethyl acetat - acid formic (14:10:1)

- Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín, để

yên, quan sát quá trình chạy sắc kí đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng

1 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

- Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254

nm và 366 nm Sau đó phun thuốc thử hiện màu NP/PEG rồi soi, chụp ảnh ở bước sóng 366 nm

2.3.3.4 Bán định lượng myricetin trong loài L congestiflora Hemsl bằng HPTLC

Kết quả triển khai sắc ký lớp mỏng cho thấy trên sắc ký đồ của cả thân và lá loài

L congestiflora Hemsl đều có vết tương đồng với myricetin về giá trị R f và màu sắc

Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu tiến hành bán định lượng myricetin trong loài

L congestiflora Hemsl bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Phương

pháp này có một số ưu điểm như tiến hành đơn giản, ít tốn kém, hiệu quả

Quy trình bán định lượng myricetin trong dược liệu bằng HPTLC bao gồm những bước sau:

Bước 1: Chuẩn bị dịch chấm sắc kí:

Cân chính xác khoảng 2g bột dược liệu cho vào bình cầu Thêm chính xác 25ml methanol 80% và đun hồi lưu 1giờ Lọc lấy dịch chiết và tiến hành chiết lần 2 Hút chính xác lấy 25ml dịch chiết cho vào cốc có mỏ rồi đem cô dưới áp suất giảm thu được cắn toàn phần Phân tán cán trong 10ml nước cất và chuyển vào bình gạn rồi lắc với diethyl ether 5 lần (10ml/lần) Gạn bỏ lớp diethyl ether, tiếp tục lấy dịch chiết nước rồi lắc với ethyl acetat 5 lần (10ml/lần) Loại bỏ lớp nước, gộp dịch chiết ethyl acetat rồi đem cô quay thu hồi dung môi tới cắn Hòa tan cắn trong methanol 80% và định mức đến vạch thu được dịch chấm sắc kí

Bước 2: Chuẩn bị dung dịch myricetin chuẩn:

Cân chính xác khoảng 1mg myricetin chuẩn vào định mức 10ml, hòa tan và định

mức đến vạch bằng methanol 80% thu được dung dịch myricetin chuẩn có nồng độ

104µg/ml

Bước 3: Triển khai sắc kí

Triển khai sắc ký với hệ dung môi (dựa trên kết quả khảo sát) Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm Sau

đó phun thuốc thử hiện màu NP/PEG rồi soi, chụp ảnh ở bước sóng 366 nm

Bước 4: Xử lý kết quả

Xây dựng đường chuẩn định lượng Xác định lượng myricetin trên vết mẫu thử, từ

đó tính ra hàm lượng myricetin trong dược liệu