Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng và đánh giá ảnh hưởng đến thời gian pt và aptt của quá trình đông máu in vitro của cao khô nhọ nồi

Bảng 3.4: Kết quả xác định pH của 6 mẫu cao Bảng 3.5: Kết quả định tính các nhóm chất có trong các mẫu cao bằng phản ứng hóa học Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ tuyến tính và xây dựng đườn

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LINH

XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU

CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ

ẢNH HƯỞNG ĐẾN THỜI GIAN PT VÀ

APTT CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU

IN-VITRO CỦA CAO KHÔ NHỌ NỒI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2020

3

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LINH

Mã sinh viên: 1501267

XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG ĐẾN THỜI GIAN PT VÀ APTT CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU

IN-VITRO CỦA CAO KHÔ NHỌ NỒI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Quỳnh Chi

2 PGS.TS Nguyễn Thùy Dương

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, quan tâm từ các thầy cô, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS

Nguyễn Quỳnh Chi đã luôn quan tâm, động viên, chỉ bảo tận tình, truyền đạt cho tôi

rất nhiều kiến thức và niềm đam mê nghiên cứu Cô đã luôn lắng nghe, giải đáp những thắc mắc và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Tuấn Anh, người

thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu nghiên cứu khoa học tại bộ môn Niềm đam mê nghiên cứu và cách làm việc khoa học của thầy sẽ là tấm gương cho tôi học tập

Tôi cũng được cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thùy Dương, đã đưa ra những lời

khuyên quý báu và hỗ trợ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược liệu nói riêng và Trường Đại học Dược Hà Nội nói chung

đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến các anh chị, bạn bè đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường, luôn giúp đỡ chia sẻ những khó khăn, cùng nhau tạo nên những kỷ niệm thật đẹp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn và niềm yêu thương tới gia đình tôi, những người luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong học tập

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Đặc điểm phân bố 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Công dụng và tác dụng dược lý 5

1.1.6 Tiêu chuẩn dược liệu Cỏ nhọ nồi 7

1.2 Quá trình cầm máu và tác dụng cầm máu của Cỏ nhọ nồi 9

1.2.1 Các giai đoạn của quá trình cầm máu 9

1.2.2 Vài nét về quá trình đông máu 10

1.2.3 Một số nghiên cứu về tác dụng đông máu in-vitro của dược liệu 10

1.2.4 Tác dụng cầm máu của cây Cỏ nhọ nồi 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.3 Các trang thiết bị nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi 14

2.2.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi 15

2.3.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô Cỏ nhọ nồi 23

3.1.1 Đánh giá sơ bộ nguồn nguyên liệu đầu vào 23

3.1.2 Điều chế cao khô Cỏ nhọ nồi 24

3.1.3 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô Cỏ nhọ nồi 24

3.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro 30

3.3 Bàn luận 32

3.3.1 Về xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao khô Cỏ nhọ nồi 32

3.3.2 Về tác dụng đông máu in-vitro của cao khô Cỏ nhọ nồi 34

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DĐVN V Dược điển Việt Nam V

Bảng 3.4: Kết quả xác định pH của 6 mẫu cao Bảng 3.5: Kết quả định tính các nhóm chất có trong các mẫu cao bằng phản ứng hóa học

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ tuyến tính và xây dựng đường chuẩn Bảng 3.7: Kết quả thẩm định độ lặp phương pháp chiết xuất wedelolacton trong cao khô cỏ nhọ nồi

Bảng 3.8: Kết quả khả sát tính thích hợp hệ thống phân tích Bảng 3.9: Kết quả định lượng wedelolacton có trong các mẫu cao khô cỏ nhọ nồi Bảng 3.10: Khảo sát tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian APTT Bảng 3.11: Khảo sát tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian PT

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Sắc ký đồ 6 mẫu dược liệu khi quan sát ở bước sóng 366 nm

Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký đồ cao khô Cỏ nhọ nồi khi quan sát ở 2 bước sóng (a) UV

254 nm, (b) 366 nm

Hình 3.3: Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính định lượng wedelolacton trong cao khô Cỏ nhọ nồi

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, việc sử dụng các sản phẩm làm từ dược liệu của người dân càng gia tăng với xu hướng "Trở về thiên nhiên" Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80 % dân số hiện nay trên thế giới sử dụng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khoẻ ban đầu [66], [72]

Cỏ nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae) được biết đến như

một loại dược liệu với nhiều công dụng quý Trong dân gian nước sắc Cỏ nhọ nồi để chữa các bệnh chảy máu trong và ngoài, phối hợp với một số loại dược liệu khác như ngó sen, lá trắc bá, bách hợp,… để cầm máu Một bài thuốc cầm máu gồm Cỏ nhọ nồi

và cóc kèn đã được nghiên cứu dược lý và áp dụng trên lâm sàng [1] Bên cạnh đó, Cỏ nhọ nồi còn có mặt trong một số bài thuốc để điều trị sốt xuất huyết, viêm gan virus,

sỏi tiết niệu [1] Liên quan đến tác dụng cầm máu, đã có một số nghiên cứu in-vivo

được thực hiện, tuy nhiên, ảnh hưởng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên các yếu tố đông máu chưa được đánh giá một cách đầy đủ

Hiện đã có tiêu chuẩn dược liệu Cỏ nhọ nồi trong dược điển Việt Nam, dược điển Trung Quốc và dược điển châu Âu Tuy nhiên, chưa có tiêu chuẩn cho cao khô Cỏ nhọ nồi, một sản phẩm trung gian để sản xuất các chế phẩm từ Cỏ nhọ nồi cũng như để phát triển các bài thuốc có thành phần Cỏ nhọ nồi với các dạng bào chế hiện đại Để góp phần đảm bảo chất lượng các chế phẩm từ Cỏ nhọ nồi, đồng thời đánh giá được ảnh hưởng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên các yếu tố đông máu nhằm tìm hiểu sâu hơn

về cơ chế cầm máu của Nhọ nồi, đề tài “ Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng và

đánh giá ảnh hưởng đến thời gian PT và APTT của quá trình đông máu in-vitro

của cao khô Nhọ nồi” được thực hiện với hai mục tiêu sau đây:

1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô Cỏ nhọ nồi

2 Đánh giá sơ bộ tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian PT và APTT của

quá trình đông máu in-vitro

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta prostrata L.)

1.1.1 Vị trí phân loại

Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là Cỏ mực, hạn liên thảo có tên khoa học là Eclipta

prostrata L thuộc họ Cúc (Asteraceae)

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [53], vị trí phân loại của cây Cỏ nhọ nồi được tóm tắt như sau:

Giới: Thực vật (Plantae) Lớp: Ngọc Lan (Magnolipsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae) Bộ: Cúc (Asterales) Họ: Cúc (Asteraceae) Chi: Eclipta

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, mọc đứng, đôi khi bò rồi vươn thẳng, cao 30 – 40 cm, có khi hơn Thân tròn, có lông cứng áp sát, màu lục hoặc đỏ tía Mủ trong rồi đen khi ra ngoài không khí Lá mọc đối, hình mác, dài 2 – 8 cm, rộng 0,5 – 1,5 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, mép khía răng rất nhỏ, hai mặt có lông nháp, cuống lá rất ngắn Cây rất đa dạng Thân có thể thắt lại ở mấu và phình ra ở dóng Lá có khi to bản, hình bầu dục hoặc hình trứng Mùa hoa tháng 2 – 5 Cụm hoa mọc ở ngọn thân hoặc kẽ lá thành đầu, cuống dài 1 – 4 cm, có lông thô áp sát; đầu có đường kính 0,8 – 1,2 cm; lá bắc thuôn nhọn, có lông; hoa màu trắng, hoa cái ở ngoài, hình lưỡi, xếp thành một hàng, hoa lưỡng tính hình ống, mào lông giảm thành vảy nhỏ và ngắn, tràng hoa cái có lưỡi nguyên hoặc xẻ

2 răng, tràng hoa lưỡng tính có 4 thùy hình trái xoan nhị 4

Quả bế, dài 3 mm, rộng 1,5 mm, có 3 cạnh, hơi dẹt, đầu bẹt, có 2 sừng nhỏ [1], [2]

1.1.3 Đặc điểm phân bố

Chi Eclipta L ở Việt Nam chỉ có một loài là Eclipta prostrata L (Syn Eclipta

alba (L.) Hassk.)

Cỏ nhọ nồi (E prostrata L.) ở nước ta rất phổ biến, phân bố rộng khắp các tỉnh

vùng đồng bằng, trung du và miền núi, đến độ cao 1500 m (ở các tỉnh phía Nam), như: Yên Bái, Hà Giang (Vị Xuyên), Tuyên Quang, Lạng Sơn (Chi Lăng), Bắc Giang (Hiệp

3

Hoà), Hà Nội, Kon Tum (Đắk Glêi), Đắk Lắk (Đắk Nông), Bà Rịa-Vũng Tàu và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long [2] Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn với các cây Cỏ thấp, trên bãi sông, ruộng trồng hoa màu, ven đường

đi, bãi hoang quanh làng bản…Ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt Bên cạnh đó với khả năng mọc chồi gốc và phân cành nhiều, cây dễ dàng phát triển, tạo thành đám bò lan trên mặt đất [1]

Ngoài ra, Cỏ nhọ nồi còn được tìm thấy ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia [2]

1.1.4 Thành phần hóa học

Đã có rất nhiều nghiên cứu về các thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi, các nhóm chất được tìm thấy trong cây bao gồm: alcaloid, coumarin, saponin, tanin, chất đắng, tinh dầu, acid hữu cơ, thiophen, flavonoid, acid phenolic, triterpenoid, các sterol [15], [23], [63]

 Coumarin

 Các coumarin có trong cây Cỏ nhọ nồi chủ yếu thuộc dẫn chất của coumestan và

là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong cây, bao gồm một số chất như

wedelolacton (1), demethylwedelolacton (2), demethylwedelolacton-7-glucoside (3)

 Gần đây, đã xác định thêm được 2 coumarin có trong cây thuộc nhóm

furanocoumarin: psoralen, isopsoralen [28].

 Tinh dầu

Tinh dầu trong Cỏ nhọ nồi có thể thu được từ lá và thân cây, các phân tích

GC-MS cho thấy các chất có trong tinh dầu chủ yếu thuộc nhóm sesquiterpen, trong đó thành phần chính được tìm ra là α-humulen; 6,9-heptadecadien; (E)-β-farnesen; và α-phellandren [14], [40]

(1) R = CH3

(2) R = H

(3) R = Glu

4

 Alcaloid

 Nghiên cứu về các alcaloid có trong cây Cỏ nhọ nồi, đã xác định được hai chất

đó là nicotin (0,078 %) và ecliptin [1]

 Năm 1998, từ dịch chiết methaol, MS Abdel-Kader và cộng sự đã phân lập được

8 alcaloid có khung steroid, lần lượt là:

(20S)(25S)-22,26-imino-cholesta-5,22(N)-dien-3β-ol (verazin) (4); (20R)-verazin (5); 4,5-dehydroverazin (6); ecliptalbin [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (7), (20R)-4β-hydroxyverazin (8); 4β-hydroxyverazin (9); (20R)-25β-hydroxyverazin (10)

20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-và 25β-hydroxyverazin (11) [10].

 Gần đây đã xác định được thêm công thức của bốn alcaloid mới thuộc nhóm

guanidin được đặt tên là eclitamin A, B, C, D (12 - 15) [52]

 Flavonoid

 Các flavonoid được tìm thấy có trong cây chủ yếu thuộc 3 nhóm: flavon, isoflavon, flavonol

+ Nhóm flavon: luteolin (16) [22], [25], [28], [29], [34], [76], luteolin-7-O-glucoside

(17) [22], [29], apigenin (18) [22], [34], [76] , acacetin (19) [28], rutinoside (20) [28], [76], diosmetin (21) [27]

+ Nhóm isoflavon: pratensein (22) [19], [22], pratensein-7-O-β-D-glucopyranosid

(23) [22], 7-O-methylorobol-4′-O-β-D-glucopyranosid (24) [19], 3′-O-methylorobol (25) [27], orobol (26) [54], orobosid (27) [20]

+ Nhóm flavonol: quercetin (28) [22], [28], [77], kaemferol (29) [28], kaemferid (30)

[28]

 Saponin

Các saponin được tìm thấy trong cây thuộc nhóm saponin triterpenoid, phần lớn thuộc nhóm oleanan:

 Năm 1994, Yahara và cộng sự đã xác định được cấu trúc của 6 saponin và đặt tên

là eclalbasaponin từ I đến VI (31-36) [49] Năm 2013, Han đã phân lập được echinocystic acid-28-O-β-D-glucopyranosid (37) [19] Đến năm 2014, Feng-Min Xi đã tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của 8 chất (38-45) là: 3-O-(2-O-acetyl-β-D-

glucopyranosyl) oleanolic acid-28-O-(β-D-glucopyranosyl) este; Dglucopyranosyl) oleanolic acid-28-O-(β-D-glucopyranosyl) este; 3-O-(β-D-glucopyranosyl) oleanolic acid-28-O-(6-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) este; [23]

 Năm 1997, Yahara tiếp tục phân lập được các saponin thuộc phân nhóm

taraxasteran, đặt tên là eclalbasaponin từ VII đến X (46-49) [60]

 Phân nhóm lupan mới xác định được 1 chất là 28-O-β-D-glucopyranosyl

betulinic acid 3β-O-β-D-glucopyranosid (50) [58]

Công thức các chất được phân lập từ Cỏ nhọ nồi được trình bày trong Phụ lục 2

1.1.5 Công dụng và tác dụng dược lý

1.1.5.1 Công dụng

Dựa theo kinh nghiệm dân gian, Cỏ nhọ nồi được sử dụng để chữa nhiều bệnh

Trong một nghiên cứu về việc sử dụng cây cỏ làm thuốc của người dân địa phương tại quần đảo Hải Nam, Trung Quốc cho thấy nước sắc Cỏ nhọ nồi có giá trị sử dụng cao,

có thể sử dụng để điều trị các bệnh về gan, chống viêm, dùng để cầm máu, chữa rắn cắn [17] Ở Ấn Độ, Cỏ nhọ nồi được dùng làm thuốc bổ và chữa ứ tắc trong các bệnh phì đại gan và lách, điều trị xổ mũi ở trẻ nhỏ [1] Trong y học cổ truyền Trung Quốc,

Cỏ nhọ nồi có trong thành phần thuốc mỡ để điều trị một số bệnh ngoài da [1], nước sắc Cỏ nhọ nồi có chứa các thành phần được xem là có tác dụng trong việc thúc đẩy quá trình melanogenesis, bảo vệ da dưới tác động của ánh sáng [69]

Tại Việt Nam, Trung Quốc, Cỏ nhọ nồi thường được dùng làm thuốc bổ máu, cầm máu bên trong và bên ngoài, chữa ho ra máu, lỵ ra máu, rong kinh, băng huyết, chảy máu cam, trĩ ra máu, nôn ra máu, đái ra máu, bị thương chảy máu Còn dùng chữa bệnh ban sởi, ho hen viêm họng, bỏng, lao phổi, di tinh, mộng tinh, bệnh nấm da, làm thuốc mọc tóc và nhuộm tóc Cỏ nhọ nồi có mặt trong một số bài thuốc điều trị viêm gan virus, sốt xuất huyết, sỏi tiết niệu [1]

1.1.5.2 Tác dụng dược lý

 Tác dụng bảo vệ gan:

Trên mô hình gây độc gan cấp ở chuột bằng các tác nhân như CCl4 [32], [62], [74], hay paracetamol [44], [45], [51] đều cho kết quả ở nhóm chuột thử (nhóm chuột được

sử dụng Cỏ nhọ nồi trước khi gây độc gan) có sự giảm đáng kể về tỷ lệ tử vong, nồng

độ các enzim aminotransferase (ASAT, ALAT), phosphatase kiềm, hình ảnh mô bệnh

6

học cho thấy tình trạng tổn thương hoại tử tế bào gan ít hơn so với nhóm chuột không dùng thuốc Trên mô hình gây tăng lipid máu chuột bằng chế độ ăn giàu chất béo cho thấy so với nhóm chứng (không được sử dụng Cỏ nhọ nồi), nhóm chuột thử cho kết quả bảo vệ rõ rệt, thể hiện ở việc làm giảm lắng đọng mỡ ở gan, giảm sự giãn mạch máu trong gan, giảm hoại tử tế bào gan và kích thích tái tạo tế bào gan [36] Cơ chế bảo vệ gan của Cỏ nhọ nồi vẫn chưa rõ ràng, tuy nhiên có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các coumestan (wedelolacton và demethylwedelolacton) có thể là thành phần chính liên quan đến tác dụng này [57], [30], [64]

Tác dụng ức chế virus viêm gan C đã được báo cáo cho dịch chiết nước Cỏ nhọ nồi Phân tích các thành phần hóa học có trong dịch chiết cho thấy sự hiện diện của ba

hợp chất có thể có tác dụng, đó là wedelolacton, luteolin và apigenin Trên mô hình

in-vitro, các hợp chất này thể hiện sự ức chế sao chép của virus thông qua ức chế enzym

NS5B và tác dụng này là phụ thuộc liều [16][41]

 Tác dụng trên hệ thần kinh

Dịch chiết cồn nước của cây Cỏ nhọ nồi với liều 300 mg/kg có tác dụng an thần, giãn cơ, giải lo âu, hỗ trợ thần kinh và chống trầm cảm [55] Ngoài ra dịch chiết còn cho thấy có hiệu quả chống lại tổn thương tế bào thần kinh do thiếu máu cục bộ Tác dụng này có thể giải thích là do cây có tác dụng chống oxi hóa mạnh [33]

Cao chiết methanol lá cây Cỏ nhọ nồi đã được chứng minh có tác dụng chống động kinh tiềm tàng trên mô hình gây động kinh chuột bằng pentylenetetrazol và picrotoxin khi dùng ở mức liều từ 10-200 mg/kg [31] Wedelolacton và luteolin được xem là thành phần có tác dụng Điều này được giải thích là rối loạn chức năng thụ thể GABAA góp phần gây ra bệnh động kinh [18], trong khi cả 2 chất trên đều được báo cáo là có điều biến tích cực, đều có tính ái lực chọn lọc đối với vị trí gắn kết benzodiazepin trên các thụ thể GABAA [47][49], từ đó hoạt hóa thụ thể này, giúp ngăn chặn các cơn động kinh

 Tác dụng giảm đau và chống viêm

Dịch chiết ethanol Cỏ nhọ nồi có tác dụng giảm đau ở mức liều 200 mg/kg trên các mô hình kẹp đuôi, mâm nóng và gây đau quặn ở chuột [26], [42]

Cỏ nhọ nồi cũng cho thấy tác dụng chống viêm rõ rệt trên cả mô hình gây viêm cấp bằng carrageenan và các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin cũng như trên mô hình gây viêm mạn [24]

7

 Tác dụng chống ung thư:

Nghiên cứu in-vitro của Navneet Kumar Yadav và cộng sự đã cho thấy được tác dụng

gây độc tế bào từ dịch chiết ethyl acetat của cây Cỏ nhọ nồi (AEEA) trên cả 7 dòng tế bào ung thư bao gồm ung thư vú, cổ tử cung, buồng trứng, đại tràng, tuyến tiền liệt, phổi, tuyến tụy; trong số đó tác dụng trên dòng tế bào ung thư vú là mạnh nhất với biểu hiện là sự giảm kích thước khối u và cải thiện quá trình apotosis [59]

 Tác dụng chống oxi hóa:

Nghiên cứu của Chin-Feng Chan và cộng sự đã chứng minh dịch chiết nước của E

prostrata L có tác dụng mạnh trong việc dọn sạch 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

(DPPH), gốc superoxid và các ion kim loại với giá trị IC50 lần lượt là 0,23 mg/mL, 0,48 mg/mL và 1,25 mg/mL [13] Ngoài ra, tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết ethyl acetat [9]; dịch chiết ethanol [12], [75]; dịch chiết methanol [21], [39], [48] của

Cỏ nhọ nồi cũng được ghi nhận

 Tác dụng kháng khuẩn

Cỏ nhọ nồi có tác dụng kháng nhiều chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, và Proteus vulgaris và một số loại nấm như Candida albicans, Aspergillus fumigatus [65] Dịch chiết ethyl acetat của lá Cỏ nhọ nồi đã

được chứng minh có hoạt tính chống vi khuẩn E coli, K pneumoniae, Shigella

dysenteriae, Salmonella typhi, P aeruginosa, Bacillus subtilis và S aureus với nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động trong khoảng 4,5-90  μL/ml [50]. Dịch chiết methanol từ phần trên mặt đất của cây cho thấy tác dụng ức chế tối đa trên các

chủng S cholermis, S aureus và Salmonella typhimurium Cũng trong nghiên cứu này

wedelolacton cho thấy tác dụng kháng khuẩn mạnh và do đó có thể là thành phần quyết định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Cỏ nhọ nồi [15] Ngoài ra, một thành

phần khác là eclalbasaponin đã được chứng minh là chất có tác dụng ức chế B

subtilis và P.aeruginosa [46] Tác dụng này được cho là do sự phá vỡ màng tế bào vi

khuẩn dẫn đến làm chết tế bào

1.1.6 Tiêu chuẩn dược liệu Cỏ nhọ nồi

Dược liệu Cỏ nhọ nồi từ lâu đã được đưa vào sử dụng ở nhiều nước với mục đích chăm sóc sức khỏe Do đó các chỉ tiêu chất lượng đã được công bố để kiểm soát chất lượng của dược liệu

8

Tiêu chí đánh giá

Dƣợc điển Việt Nam V [6]

Dƣợc điển Châu

Âu (EP 8.0) [16]

Dƣợc điển Trung Quốc [56]

- Bằng SKLM (chất đối chiếu)

Có

Sử dụng chất đối chiếu wedelolacton

Không

Sử dụng chất đối chiếu

wedelolacton

Không

Sử dụng chất đối chiếu

ecliptasaponin A

HPLC Yêu cầu: Hàm lượng của wedelolacton không được dưới 0,04 % tính theo dược liệu khô kiệt

Phương pháp HPLC Yêu cầu: Hàm lượng của wedelolacton không được dưới 0,04 % tính theo dược liệu khô kiệt

mm

Không Không

Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu

Không ít hơn 15,0 % tính theo dược liệu khô kiệt

Tiến hành theo

Không Không

9

phương pháp chiết nóng, dùng ethanol

50 % làm dung môi

Bảng 1.1 cho thấy so với dược điển Châu Âu và dược điển Trung Quốc, thì chuyên luận dược liệu Cỏ nhọ nồi trong dược điển Việt Nam V chưa có chỉ tiêu định lượng, một chỉ tiêu quan trong dùng để đánh giá chất lượng dược liệu

1.2 Quá trình cầm máu và tác dụng cầm máu của Cỏ nhọ nồi

1.2.1 Các giai đoạn của quá trình cầm máu

Cầm máu là một quá trình diễn ra nhằm hạn chế hoặc ngăn cản máu thoát ra khỏi mạch khi thành mạch bị tổn thương Quá trình cầm máu được thực hiện qua các giai đoạn chính:

- Co mạch tại chỗ

- Tạo nút tiểu cầu

- Đông máu

- Co cục máu đông và tan cục máu đông

Co mạch xảy ra ngay khi bị tổn thương để hạn chế lượng máu thoát mạch, và tạo điều kiện để hình thành nút tiểu cầu Các yếu tố tham gia vào quá trình này bao gồm thần kinh giao cảm, serotonin và thromboxan A2 (từ tiểu cầu) Thời gian co mạch bình thường từ vài phút đến vài giờ Tổn thương càng lớn thì mức độ co mạch càng mạnh Thành mạch bị tổn thương bộc lộ collagen thích hợp cho các tiểu cầu đến kết tập Tại đó, các tiểu cầu này giải phóng ra một lượng lớn chất trung gian hóa học như ADP, thromboxan A2 lôi kéo các tiểu cầu đang lưu hành trong máu đến kết tụ Tiểu cầu kết tụ lại lôi kéo các tiểu cầu khác, cứ như vậy nút tiểu cầu được hình thành bịt kín tổn thương

Đông máu xảy ra sau khi có phản xạ co mạch và hình thành nút tiểu cầu, là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc Đông máu là một chuỗi phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu có trong huyết tương, mô tổn thương và tiểu cầu, bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo phức hợp prothrombinase, giai đoạn hình thành thrombin, và giai đoạn chuyển fibrinogen thành các sợi fibrin, từ đó hình thành cục máu đông bịt kín chỗ tổn thương

10

Dưới tác dụng của tiểu cầu cục máu đông sau khi hình thành sẽ được co lại sau

20 phút đến 1 giờ Sau đó 1-2 tuần, các chất ở bên trong cục máu đông sẽ được hoạt hóa và hoạt động như 1 enzim làm tan cục máu đông [4], [5]

1.2.2 Vài nét về quá trình đông máu

Khi thành mạch bị tổn thương, đông máu được khởi động đồng thời bởi 2 con đường: đông máu nội sinh và đông máu ngoại sinh Đông máu ngoại sinh được bắt đầu bằng sự giải phóng ra thromboplastin của mô (yếu tố III) từ mạch máu hoặc mô bị tổn thương Yếu tố III sẽ kết hợp và hoạt hóa yếu tố VII Phức hợp yếu tố III-VII hoạt hóa

và ion Ca++ sẽ hoạt hóa yếu tố X Yếu tố X hoạt hóa kết hợp với phospholipid tiểu cầu, ion Ca++ và yếu tố V hoạt hóa (nhờ thrombin) tạo ra phức hợp prothrombinase Còn quá trình đông máu nội sinh bắt đầu khi yếu tố XII (yếu tố tiếp xúc) được hoạt hóa Sau đó các yếu tố đông máu khác (yếu tố XI, IX) sẽ được hoạt hóa theo kiểu dây chuyền Khác với đông máu ngoại sinh, sự hoạt hóa yếu tố X cần có mặt phospholipid tiểu cầu, ion Ca++ và yếu tố VIII (được hoạt hóa bằng thrombin) Yếu tố X sau khi được hoạt hóa thì quá trình tạo prothrombinase cũng giống như cơ chế ngoại sinh Sau khi phức hợp prothrombinase được tạo ra thì nó sẽ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin (yếu tố II) thành thrombin Thrombin sau khi được hình thành sẽ hoạt hóa chuyển fibrinogen thành các fibrin đơn phân, tạo điều kiện cho sự trùng hợp các fibrin bịt kín chỗ tổn thương

Trong thực nghiệm, người ta có thể làm đông huyết tương sau khoảng 10 – 14 giây bằng cách cho thromboplastin mô và ion calci vào trong huyết tương, đây là cơ sở của xét nghiệm thời gian PT để đánh giá quá trình đông máu ngoại sinh Còn thông số

để đánh giá thời gian đông máu ngoại sinh là thời gian Cephalin - Kaolin (thời gian APTT) trong đó Cephalin – chất giống phospholipid của tiểu cầu và Kaolin là chất hoạt hóa yếu tố tiếp xúc [5]

1.2.3 Một số nghiên cứu về tác dụng đông máu in-vitro của dược liệu

Năm 2012, Hataichanok Pandith đã khảo sát tác dụng cầm máu in-vitro của cây

Chromolaena odorata Dược liệu sẽ được chuẩn bị dưới dạng dịch chiết nước đông

khô, cao đặc (chiết với ethanol 50, 70, 95 %), sau đó sẽ được ủ với huyết tương theo tỷ

lệ 1:1 Tác dụng cầm máu sẽ được so sánh với mẫu chứng là NaCl 0,9 % (khi mẫu thử

là dịch chiết đông khô), và Tween 80 1 % (khi mẫu thử là cao đặc) Thông số quan sát

11

là thời gian PT (thời gian đông máu ngoại sinh) và thời gian đông APTT (thời gian đông máu nội sinh) [43]

Năm 2014, nghiên cứu của Naoki Ohkura tiến hành sàng lọc tác dụng cầm máu

in-vitro của 114 loại Dược liệu từ Trung Quốc Dược liệu được đun trong nước 30

phút Sau đó dịch chiết nước sẽ được pha loãng tới nồng độ cuối cùng là 10 mg/ml làm dung dịch khảo sát Thông số quan sát là thời gian PT (con đường ngoại sinh) và sự hoạt hóa yếu tố XII (con đường nội sinh) Mẫu huyết tương được ủ với dịch thử trong

5 phút Thời gian PT sẽ được tính từ lúc cho thêm thuốc thử PT Còn yếu tố XII hoạt hóa sẽ được phát hiện và định lượng bằng phương pháp điện di không liên tục SDS-PAGE [41]

Năm 2018, Hoàng Thị Phương Liên và cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng cầm

máu in-vitro của cao chiết nước từ lá cây Lấu đỏ Psychotria rubra (Lour.) Trong đó,

tác dụng cao chiết được khảo sát ở 3 mức nồng độ 0,5; 1,0; 2,0 mg/ml trên mẫu huyết tương của chuột Tác dụng cầm máu sẽ được so sánh với nhóm chứng là DMSO Mẫu huyết tương sẽ được ủ với các mẫu khảo sát trong 3 phút Thời gian PT sẽ được tính từ lúc cho thêm thuốc thử PT, thời gian APTT sẽ được tính từ lúc cho thêm CaCl2 [7]

1.2.4 Tác dụng cầm máu của cây Cỏ nhọ nồi

Trong quyển “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi, Cỏ nhọ nồi được xếp vào nhóm thuốc cầm máu, chữa các bệnh chảy máu trong và ngoài, sốt xuất huyết,….[1] Nước sắc Cỏ nhọ nồi khô, với liều 3 g/kg thể trọng khỉ có tác dụng giảm thời gian Quick rõ rệt, làm tăng tổng lượng prothrombin (yếu tố II) toàn phần Cỏ nhọ nồi cũng như vitamin K, có tác dụng chống lại tác dụng dicoumarin [8] Hoạt tính cầm máu của 1 g Cỏ nhọ nồi tương đương với 1,33 g vitamin K [1]

Khi nghiên cứu về tác dụng này, Mahar đã đánh giá hoạt động cầm máu của dịch chiết ethanol cây Cỏ nhọ nồi (EEEA) trên 3 nhóm thỏ gồm nhóm bình thường, nhóm gây rối loạn chức năng tiểu cầu bằng aspirin và nhóm gây rồi loạn các yếu tố đông máu bằng heparin Quá trình cầm máu được đánh giá qua thời gian chảy máu, thời gian máu đông, các thông số của quá trình đông máu (thời gian đông máu ngoại sinh (PT), thời gian đông máu nội sinh (APTT)) và số lượng tiểu cầu Nghiên cứu được thực hiện với các liều khác nhau 200, 400, 600 & 800 mg/kg bằng đường uống Tuy không có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình đông máu và số lượng tiểu cầu ở các mức liều nhưng với mức liều cao 600 mg/kg và 800 mg/kg đã thể hiện được sự giảm đáng

12

kể thời gian cầm máu ở cả 3 nhóm thông qua các thông số thời gian chảy máu và thời gian máu đông [35]

13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Mẫu nghiên cứu: Phần trên mặt đất của cây Cỏ nhọ nồi được thu hái vào tháng 10/2019 tại 6 vùng và được ký hiệu như sau:

9-Bảng 2.1: Các mẫu dược liệu Cỏ nhọ nồi

6 Tp Điện Biên Phủ, Điện Biên ĐB

- Mẫu sau khi thu hái được giám định tên khoa học là Eclipta prostrata L Mẫu tiêu

bản được lưu giữ tại bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội

- Mẫu nguyên liệu sau khi làm sạch được cắt nhỏ thành từng đoạn dài 3-5cm, sấy khô ở nhiệt độ không quá 70°C và được bảo quản trong các túi nilon kín

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi được điều chế từ các mẫu dược liệu tương ứng Quá trình điều chế cao được trình bày chi tiết ở mục 3.1.2

2.1.3 Các trang thiết bị nghiên cứu

2.1.3.1 Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất và thuốc thử dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích:

- Hóa chất: n-hexan, toluen, ethyl acetat, methanol, acid formic, aceton, dicloromethan, ether ethylic, anhydrid acetic, acetonitril, acid phosphoric, amoniac, acid sulfuric, acid clorohydric, ethanol 90 %, nước cất

- Chất chuẩn (dùng trong định tính bằng SKLM và định lượng): wedelolacton với độ tinh khiết 98,0 % (Chengdu Biopurify)

14

- Thuốc thử dùng trong phản ứng định tính: dung dịch sắt (III) clorid 5 %, dung dịch chì acetat 10 %, gelatin 1 %, thuốc thử diazo, dung dịch natri hydroxyd 10 %

- Bản mỏng tráng sẵn TLC silicagel 60 F254 của hãng MERCK (Đức)

- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (cốc có mỏ, pipet, phễu, đũa thủy tinh, kẹp gỗ, giấy lọc, ống nghiệm, bình định mức, bình gạn,…), các dụng cụ thí nghiệm khác (mao quản, bình khai triển sắc ký,…)

- Hóa chất, dụng cụ dùng trong thí nghiệm đánh giá tác dụng: thuốc thử PT, thuốc thử APTT, calci clorid, ống falcon, micro pipet, đầu côn, bi từ…

2.1.3.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu:

- Tủ sấy MEMMERT (Đức)

- Bể siêu âm DAIHAN Scientific (Hàn Quốc)

- Cân kỹ thuật SATORIUS (Đức)

- Cân phân tích PRECISA (Thụy Sỹ)

- Cân xác định hàm ẩm OHAUS (Trung Quốc)

- Hệ thống TLC CAMAG gồm hệ thống chấm sắc ký tự động Linomat V, bình khai triển tự động ADC2, buồng chụp sắc ký Visualizer

- Hệ thống HPLC bao gồm: máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimazu (Nhật Bản) (bơm LC-20AD, detector DAD SPD-M20A, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ phận điều nhiệt CTO-20A); cột sắc ký lỏng hiệu năng cao C18 Agilent (250 mm x 4,6 mm; 5µm)

- Hệ thống đông máu bán tự động Urit 610

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi

- Thu mẫu dược liệu và kiểm nghiệm theo các chỉ tiêu định tính (bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng) theo tiêu chuẩn DĐVN V

- Điều chế cao khô từ các mẫu dược liệu thu được

- Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi: cảm quan, mất khối lượng do làm khô, pH, định tính bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng, định lượng wedelolacton có trong cao khô Cỏ nhọ nồi

15

2.2.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi

2.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu và đánh giá sơ bộ

Để cho ra một chế phẩm cao khô có thể sử dụng trực tiếp hoặc làm nguyên liệu để sản xuất thì việc kiểm soát nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng Sáu mẫu dược liệu tươi sau khi thu hái, xử lý sơ bộ sẽ được đem đi giám định tên khoa học và kiểm nghiệm các chỉ tiêu định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng theo tiêu chuẩn DĐVN V:

 Phương pháp A (dùng để định tính khung steroid): Lấy 1 g bột dược liệu, thêm

5 ml ether ethylic, ngâm 10 phút, thỉnh thoảng lắc, lọc Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 10 giọt anhydrid acetic, thêm từ từ 15 giọt acid sulfuric theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi nơi tiếp giáp giữa 2 lớp chất lỏng có màu nâu đỏ, đồng thời lớp ether chuyển sang màu xanh da trời

chuẩn

→ Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rfvới các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn

2.3.1.2 Điều chế cao khô Cỏ nhọ nồi

Dược liệu sau khi sấy đạt độ ẩm theo quy định thì được chiết với nước bằng phương pháp sắc Cao khô Cỏ nhọ nồi sẽ được điều chế từ dịch chiết nước tương ứng Cân khoảng 50 g dược liệu đã chia nhỏ, thêm nước vừa ngập và đun trong 1 giờ Lọc dịch chiết Lặp lại quá trình trên 2 lần, mỗi lần 30 phút Gộp dịch chiết thu được,

Trong đó: H (%): hàm lượng cao thu được

mc: khối lượng cao thu được (g)

mdl: khối lượng dược liệu (g)

4 nhóm chất trên Do đó nhóm nghiên cứu đề xuất việc kiểm soát 4 nhóm chất: coumarin, flavonoid, saponin, tanin trong các mẫu cao bằng các phản ứng hóa học như sau [3]:

mc

mdl x (1 - RHdl)

 Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %, ống 2 giữ nguyên Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội rồi quan sát Ống 1 sẽ có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong suốt

 Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 2 ml nước, đun sôi, để nguội rồi quan sát Ống 1 trong trở lại, ống 2 có tủa đục

 Acid hóa ống 1 bằng vài giọt acid clohydric đặc, quan sát

=> Phản ứng dương tính khi ống 1 có tủa đục như ống 2

Saponin Hiện tượng tạo

bọt

Cho vào cốc có mỏ 0,5 g cao khô Cỏ nhọ nồi, thêm 5

ml nước Đun sôi Để nguội, lọc dịch chiết vào 1 ống nghiệm lớn, thêm 5 ml nước lắc mạnh trong 5 phút

Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt

=> Dương tính nếu bọt còn bền vững sau 15 phút

Flavonoid Cân khoảng 0,5 g cao khô Cỏ nhọ nồi vào cốc có mỏ,

thêm 10 ml ethanol 90˚ đun cách thủy đến sôi trong 2 – 3 phút Lọc nóng, để nguội dịch lọc làm các phản ứng hóa học

Cyanidin

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm một ít bội magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc

=> Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu

18

vàng sang màu đỏ

Phản ứng với kiềm

 Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm một vài giọt NaOH 10 % sẽ thấy có tủa vàng, thêm 1

ml nước cất, tủa sẽ tan và dương tính nếu màu vàng của dung dịch tăng thêm

 Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đã mở nút, sẽ thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên

Phản ứng với

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa xanh đen

Phản ứng diazo hóa

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH 10 %) thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ

Tanin Cân khoảng 0, 5 g cao khô Cỏ nhọ nồi thêm 10 ml

nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội rồi lọc, dịch lọc dùng để làm các phản ứng

Phản ứng với gelatin 1 %

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt gelatin 1 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng

Phản ứng với

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

Phản ứng với chì acetat 10 %

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông

19

 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Tham khảo chuyên luận về dược liệu Cỏ nhọ nồi của Dược điển Việt Nam V, nghiên cứu sử dụng wedelolacton làm chất đối chiếu cho chỉ tiêu định tính cao khô Cỏ nhọ nồi bằng sắc ký lớp mỏng

Các điều kiện sắc ký:

 Dung dịch thử: Cân khoảng 0,5 g cao khô Cỏ nhọ nồi vào cốc có mỏ, chiết siêu âm

với MeOH 3 lần, mỗi lần 15 ml, lọc và gộp dịch, dịch lọc đem cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 5ml MeOH thu được dịch thử

 Dung dịch đối chiếu: Dung dịch wedelolacton trong MeOH nồng độ 0,05 mg/ml

 Pha tĩnh: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 hoạt hóa ở 105°C trong 1h

 Pha động: Hệ dung môi toluen – aceton – acid formic (9:6:1)

 Tiêm mẫu: Thể tích tiêm 2 µl, độ dài vết là 5 mm đối với cả dung dịch thử và

dung dịch đối chiếu

 Khoảng khai triển: 85 mm

 Phát hiện vết: Quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm

 Chỉ tiêu định lượng wedelolacton trong cao khô nhọ nồi bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tham khảo Dược điển châu âu (EP 8.0), chuyên luận dược liệu Cỏ nhọ nồi về chỉ tiêu định lượng wedelolacton có trong cây, nhóm nghiêu cứu đưa ra quy trình định lượng wedelolacton có trong cao khô Cỏ nhọ nồi như sau:

- Chuẩn bị dung dịch thử: cân chính xác khoảng 0,25 g cao khô nhọ nồi vào

bình định mức 25 ml Thêm 7,5 ml nước cất, siêu âm 5 phút Tiếp tục thêm 10 ml MeOH, siêu âm 30 phút, sau đó bổ sung bằng MeOH đến vạch Lọc qua màng 0,45

20

 Nhiệt độ cột : t = 40 ºC

 Thời gian chạy bằng 1,5 x tr (tr là thời gian lưu của wedelolacton)

- Thẩm định phương pháp:

 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 5 mg wedelolaton cân chuẩn vào bình định mức 25 ml, thêm 15 ml methanol (TT), lắc kĩ để hòa tan, bổ sung methanol (TT) vừa đủ đến vạch, trộn đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch chuẩn gốc 0,25 mg/ml

 Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng bằng MeOH để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,0125; 0,05 và 0,1 mg/ml

 Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên, thiết lập phương trình hồi quy biểu diễn mỗi tương quan giữa diện tích pic và nồng

độ của wedeloacton, yêu cầu hệ số tương quan R2

 Độ lặp lại của phương pháp chiết

 Chuẩn bị 6 mẫu dịch thử của cùng một mẫu cao Nghệ An theo quy trình trên

 Tiêm 6 mẫu dịch thử trên trong cùng điều kiện sắc ký, ghi lại diện tích và

độ phân giải pic của wedelolacton của các mẫu

 Yêu cầu: RSD hàm lượng wedelolacton giữa các mẫu không vượt quá 4 % [11]

- Sau khi thẩm định lại phương pháp, tiến hành chuẩn bị dung dịch thử của các mẫu cao và định lượng wedelolacton có trong từng mẫu Ghi lại kết quả diện tích pic của wedelolacton thu được, dựa đường chuẩn sẽ tính được nồng độ (mg/ml) của

Trong đó: H (%): Hàm lượng wedelolacton có trong mẫu cao khô nhọ nồi

C (mg/ml): nồng độ wedelolacton có trong mẫu

m (g): khối lượng mẫu cao khô ban đầu

RH (%): Hàm ẩm của các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi

2.3.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro

Nghiên cứu đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu

in vitro sử dụng mẫu huyết tương của những người tình nguyện khỏe mạnh Thời gian đông máu sẽ được đo bằng máy phân tích đông máu bán tự động Urit – 610 (URIT) (bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội) theo phương pháp hạt từ tính mạch kép, dựa trên mô hình của Hoàng Thị Phương Liên [7]

Mẫu cao khô được lựa chọn cho thí nghiệm đánh giá tác dụng là mẫu cao đã đạt các chỉ tiêu chất lượng mà nhóm nghiên cứu xây dựng (cảm quan, hàm ẩm, pH, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng) và có hàm lượng wedelolacton cao nhất (marker được lựa chọn cho các chỉ tiêu chất lượng)

2.3.2.1 Thiết kế thí nghiệm

- Mô tả thí nghiệm: Mỗi thí nghiệm được thiết kế gồm 1 giếng chứng trắng và 5

giếng tương ứng với các mẫu thử có nồng độ khác nhau Mỗi giếng bao gồm huyết tương, thuốc thử và các chất thử tương ứng:

 Thực hiện thí nghiệm trên các giếng như đã thiết kế, bố trí hỗn hợp thử trong

giếng theo mô tả trong bảng 2.3 (đo thời gian APTT) và bàng 2.4 (đo thời gian PT)

C × 25 ×10-3

m x (100 – RH)/100

Trộn đều, ủ trong 3 phút, ở 37ºC

Bảng 2.4: Thiết kế thí nghiệm thời gian đông máu PT

23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô Cỏ nhọ nồi

3.1.1 Đánh giá sơ bộ nguồn nguyên liệu đầu vào

 Kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu định tính theo DĐVN V:

Hình 3.1: Sắc ký đồ 6 mẫu dược liệu khi quan sát ở bước sóng 366 nm

24

 Nhận xét: Các mẫu dược liệu thu hái đều đạt chỉ tiêu về định tính theo Dược điển

Việt Nam V

3.1.2 Điều chế cao khô Cỏ nhọ nồi

Bảng 3.2 tổng hợp kết quả hàm lượng cao khô thu được từ 6 mẫu dược liệu Cùng một phương pháp điều chế cao, nhưng hàm lượng cao thu được giữa các mẫu không đồng đều, trong đó, mẫu Cỏ nhọ nồi ở Nghệ An cho lượng cao lớn nhất (25,21 %), mẫu Cỏ nhọ nồi ở Nam Định cho lượng cao nhỏ nhất (13,08 %)

Bảng 3.2: Kết quả hàm lượng cao khô của 6 mẫu dược liệu

Khối lƣợng dƣợc liệu (g)

50,70 50,50 50,30 50,40 51,00 50,10

Hàm ẩm dƣợc liệu (%)

12,64 11,20 12,20 13,10 12,28 12,76

Khối lƣợng cao khô (g)

5,91 11,14 8,21 9,43 9,06 8,11

Hàm ẩm cao khô (%)

1,94 0,79 2,74 1,19 0,98 1,87

Hàm lƣợng cao khô thu đƣợc (%)

3.1.3.2 Mất khối lượng do làm khô

Kết quả hàm lượng nước (hàm ẩm) có trong các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi được trình bày trong bảng 3.3 Kết quả cho thấy hàm ẩm của các mẫu cao không giống nhau, nhưng cả 6 mẫu đều đạt yêu cầu về hàm ẩm của cao khô theo DĐVN V

25

Bảng 3.3: Kết quả xác định hàm ẩm của 6 mẫu cao

Chỉ tiêu pH dùng để biểu thị nồng độ ion hydrogen trong dung dịch nước Tiến hành

đo pH các mẫu dung dịch thử có nồng độ 1 %, kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Kết quả xác định pH của 6 mẫu cao

Giá trị pH 6,12 5,39 6,44 5,63 5,40 5,88

Nhận xét: Giá trị pH giữa các mẫu cao khô có sự chênh lệch, dao động trong

khoảng 5,39 – 6,44

3.1.3.4 Định tính bằng phản ứng hóa học

Kết quả định tính các mẫu cao bằng các phản ứng hóa học, cho thấy cả 6 mẫu đều

có 4 nhóm chất: coumarin, flavonoid, saponin, tanin Đây là cơ sở để xây dựng phép thử định tính bằng phản ứng hóa học cho cao khô Cỏ nhọ nồi

Bảng 3.5: Kết quả định tính các nhóm chất có trong các mẫu cao bằng phản ứng

(++) (++) (++) (++) (++) (++)

26

10 % Phản ứng

(++) (++) (++) (++) (++) (++)

Phản ứng với gelatin 1

27

a) b)

Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký đồ cao khô Cỏ nhọ nồi khi quan sát ở 2 bước sóng a)

254 nm; b) 366 nm Nhận xét: Hình ảnh sắc ký đồ quan sát ở cả 2 bước sóng đều cho thấy :

- Có sự tương đồng về thành phần hóa học giữa các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi

- Các mẫu cao đều xuất hiện vết ở vị trí Rf = 0,57, có màu sắc và vị trí trùng với vết của chất chuẩn wedelolacton

- Giữa các mẫu cao đều xuất hiện thêm 2 vết có huỳnh quang xanh đậm ở 2 vị trí Rflần lượt là 0,55 và 0,75

- Từ sự khác biệt về cường độ vết có thể sơ bộ so sánh hàm lượng wedelolacton có trong các mẫu cao, trong đó hàm lượng wedelolacton mẫu cao khô Thái Nguyên cao nhất và trong mẫu cao khô Nghệ An nhỏ nhất

3.1.3.6 Định lượng wedelolacton trong cao khô Cỏ nhọ nồi

 Thẩm định tính tuyến tính và xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Tiến hành phân tích dãy dung dịch chuẩn được chuẩn bị ở trên, ghi lại diện tích pic thu được và xây dựng đường chuẩn, đánh giá mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ wedelolacton thông qua hệ số R2, thu được kết quả:

Hình 3.3: Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính định lượng

wedelolacton trong cao khô Cỏ nhọ nồi

Nhận xét: R2 = 1,0000 chứng tỏ trong khoảng nồng độ từ 0,00125 – 0,1 mg/ml có mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích, như vậy có thể lựa chọn khoảng nồng độ từ 0,00125 – 0,1 mg/ml để làm đường chuẩn định lượng wedelolacton có trong cao khô nhọ nồi

 Độ lặp lại giữa các lần tiêm mẫu (tính thích hợp hệ thống)

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu dung dịch chuẩn nồng độ 0,05 mg/ml Ghi lại diện tích pic wedelolacton của các lần tiêm, tính toán RSD của thông số thu được

29

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống phân tích

Bảng 3.7: Kết quả thẩm định độ lặp phương pháp chiết xuất wedelolacton có

trong cao khô nhọ nồi

STT Khối lƣợng

cân (g)

Hàm ẩm (%)

Diện tích pic (mAu.s)

Hàm lƣợng wedelolacton (mg/ml)

Hàm lƣợng wedelolacton (%)

Nhận xét: RSD hàm lượng wedelolacton của các mẫu nhỏ hơn 4 % (2,07 %),

chứng tỏ phương pháp khảo sát có sự lặp lại giữa lần chiết độc lập trên cùng một mẫu cao

30

Kết quả thẩm định phương pháp: các kết quả thu được ở trên đã cho thấy phương

pháp nghiên cứu có thể được lựa chọn làm phương pháp định lượng wedelolacton có trong cao khô nhọ nồi

 Kết quả định lƣợng wedelolacton trong các mẫu cao khô nhọ nồi

Từ các mẫu cao khô nhọ nồi thu được, tiến hành chuẩn bị dung dịch thử và phân tích sắc ký, ghi lại diện tích pic và tính toàn hàm lượng wedelolacton có trong các mẫu cao khô

Bảng 3.9: Kết quả định lượng wedelacton có trong các mẫu cao khô nhọ nồi

Mẫu dƣợc liệu

Ký hiệu mẫu cao

Khối lƣợng cao khô (g)

Hàm ẩm (%)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lƣợng wedelolacton (%)

Nam Định CNĐ 0,2527 1,94 173068 0,03 Nghệ An CNA 0,2521 0,79 94522 0,02 Thái Bình CTB 0,2789 2,41 175613 0,03 Thái Nguyên CTN 0,2440 1,19 951896 0,15

Hà Nội CHN 0,2501 0,98 81167 0,01 Điện Biên CĐB 0.2469 1,87 373992 0,06

Nhận xét: bảng kết quả trên cho thấy hàm lượng wedelolacton có sự dao động giữa

các mẫu cao Mẫu cao khô Thái Nguyên cho hàm lượng cao nhất (0,15 %), trong khi mẫu cao ở Hà Nội cho hàm lượng thấp nhất (0,01 %, thấp hơn 10 lần so với mẫu cao ở Thái Nguyên) Mẫu cao khô Điện Biên cho hàm lượng cao thứ 2 (0,06 %), và hai mẫu còn lại là mẫu cao Thái Bình và Nam Định cho hàm lượng tương đồng nhau (0,03 %)

3.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro

Mẫu cao khô ở Thái Nguyên được lựa chọn cho thí nghiệm đánh giá tác dụng do đã đạt các chỉ tiêu chất lượng (cảm quan, hàm ẩm, pH, định tính) và cho hàm lượng wedelolacton cao nhất

Tiến hành thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao khô Thái Nguyên trên thời gian

đông máu in-vitro ở các nồng độ khác nhau Kết quả được trình bày trong bảng 3.10

(đo thời gian APTT) và bảng 3.11 (đo thời gian PT)

31

Bảng 3.10: Khảo sát tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian APTT

Nhận xét: kết quả bảng 3.10 cho thấy thời gian APTT của mẫu thử ở các nồng độ

0,5; 1; 2 mg/ml không có sự khác biệt so với mẫu trắng (nước cất) (p > 0,05) Mẫu thử

ở 2 nồng độ còn lại là 5; 10 mg/ml mặc dù có sự khác biệt (p < 0,05) nhưng thời gian APTT không ngắn hơn so với mẫu trắng

Bảng 3.11: Khảo sát tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian đông máu PT

Mẫu thử Thời gian PT (giây)

Nhận xét: kết quả bảng 3.11 cho thấy thời gian PT của mẫu thử ở các nồng độ 0,5;

1; 2; 5 mg/ml không có sự khác biệt so với mẫu trắng (p > 0,05) Mẫu thử ở nồng độ

10 mg/ml có sự khác biệt (p < 0,05) tuy nhiên thời gian PT không ngắn hơn so với

mẫu trắng

32

3.3 Bàn luận

3.3.1 Về xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao khô Cỏ nhọ nồi

Đảm bảo chất lượng luôn là một vấn đề cần quan tâm để các chế phẩm có nguồn gốc dược liệu đảm bảo tính hiệu quả và an toàn Hơn nữa, kết quả đánh giá tác dụng dược lý các dạng cao đã có các chỉ tiêu về chất lượng đảm bảo được tính ổn định và chính xác Đảm bảo chất lượng là một quá trình xuyên suốt, từ đảm bảo chất lượng nguyên liệu đầu vào, chất lượng các sản phẩm trung gian, chế phẩm cuối cùng cũng như toàn bộ quá trình sản xuất, bảo quản, lưu thông, phân phối cho đến tay người sử dụng Trong đó xây dựng các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng là một trong những khâu của quá trình này

Cỏ nhọ nồi là một cây thuốc nam đã được sử dụng từ lâu trong dân gian để hạ sốt và cầm máu Nhiều tác dụng khác của Cỏ nhọ nồi như tác dụng bảo vệ gan [32], [62], [74], chống viêm [26], [42], chống oxy hóa [13] cũng đã được báo cáo Đây cũng là một cây dược liệu dễ trồng, dễ phát triển và là một trong những nguồn dược liệu có tiềm năng để khai thác Cao khô Cỏ nhọ nồi là một sản phẩm trung gian để phát triển các dạng bào chế hiện đại Do đó trong khuôn khổ đề tài này, một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng cao khô Cỏ nhọ nồi được xây dựng và sơ bộ bước đầu đánh giá tác dụng

của cao khô này trên quá trình đông máu in-vitro Các mẫu dược liệu trong nghiên cứu này được thu từ 6 vùng khác nhau, được giám định tên khoa học và đạt các chỉ tiêu định tính theo tiêu chuẩn dược điển Việt Nam V Tiến hành điều chế 6 mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi từ dịch chiết nước 6 mẫu dược liệu tương ứng Từ các mẫu cao khô thu được, xây dựng các chỉ tiêu chất lượng bao gồm: cảm quan, mất khối lượng do làm khô, pH, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, định lượng wedelolacton có trong các mẫu cao khô

Chỉ tiêu cảm quan được thu được sau khi quan sát, đánh giá các mẫu cao khô thu được về thể chất, màu sắc, mùi vị

Chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô dùng để xác định hàm lượng nước và các chất

dễ bay hơi có trong các mẫu cao Trong dược liêu Cỏ nhọ nồi có chứa tinh dầu, nhưng với hàm lượng ít (0,24 %), hơn nữa quá trình điều chế cao có tác động bởi nhiệt và lực

cơ học, tinh dầu lại là hợp chất dễ hay hơi, nên chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô chủ yếu dùng để xác định hàm lượng nước có trong các mẫu cao khô Lượng nước có trong các mẫu cao khô nằm trong một giới hạn nhất định để hạn chế sự phát triển của các vi