Nghiên cứu điều chế cao lỏng hà thủ ô đỏ chế và xây dựng một số tiêu chuẩn hóa học bằng phương pháp tlc uv

So với sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết hợp sắc ký lớp mỏng và quang phổ hấp thụ tử ngoại trong phân tích định lượng hoạt chất của dược liệu là một phương pháp đơn giản, chi phí thấp, đã đ

PHƯƠNG PHÁP TLC – UV

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thái Hà Văn,

người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ

em trong quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thành khóa luận

Em xin cảm ơn các thầy cô của Bộ môn Dược cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học tập và nghiên cứu tại bộ môn

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội

đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu giúp em học tập và phát triển bản thân mình hơn

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ, động viên trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đề tài

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Sinh viên Ngọc

Vũ Thị Hồng Ngọc

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về hà thủ ô đỏ 3

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây hà thủ ô đỏ 3

1.1.2 Bộ phận dùng và cách chế biến 4

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Tác dụng theo y học cổ truyền 6

1.2 Vài nét về 2,3,5,4’ – tetrahydroxystilben – 2 – O – β – D – glucosid 7

1.2.1 Đặc điểm và tính chất hóa lý của THSG 7

1.2.2 Tính chất dược lý của THSG 7

1.3 Tổng quan về kỹ thuật điều chế cao dược liệu 8

1.3.1 Khái niệm cao dược liệu 8

1.3.2 Phân loại cao dược liệu 8

1.3.3 Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm 9

1.3.4 Kỹ thuật điều chế cao dược liệu 10

1.3.5 Chỉ tiêu chất lượng cao dược liệu 13

1.4 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ hấp thụ tử ngoại (TLC - UV) 13

1.4.1 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 13

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ hấp thụ tử ngoại 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp điều chế cao lỏng hà thủ ô đỏ chế 18

2.3.2 Định tính một số nhóm chất bằng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng 19

2.3.3 Định lượng THSG bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ hấp thụ tử ngoại 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Điều chế cao lỏng hà thủ ô đỏ chế 24

3.2 Định tính một số nhóm hoạt chất trong cao lỏng hà thủ ô đỏ chế 24

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 24

3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 25

3.3 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của THSG 27

3.4 Thẩm định phương pháp định lượng 28

3.4.1 Khảo sát độ thích hợp hệ thống 28

3.4.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THSG 29

3.5 Kết quả định lượng THSG trong mẫu dược liệu và mẫu cao lỏng hà thủ ô đỏ chế 31

BÀN LUẬN 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các stilben được phân lập từ rễ hà thủ ô đỏ 5

Bảng 1.2 Nồng độ Ethanol thích hợp với một số nhóm hoạt chất 11

Bảng 1.3 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC 13

Bảng 2.1 Thể tích chấm định lượng 21

Bảng 3.1 Cảm quan cao lỏng HTÔĐC 24

Bảng 3.2 Tỉ trọng của các mẫu cao lỏng 24

Bảng 3.3 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của cao lỏng HTÔĐC 24

Bảng 3.4 Độ hấp thụ UV của mẫu THSG chuẩn ở bước sóng 319nm 30

Bảng 3.5 Kết quả định lượng THSG trong các mẫu thử 31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Một số anthraquinon có trong hà thủ ô đỏ 4

Hình 1.2 Công thức của THSG 7

Hình 1.3 Phổ hấp thụ UV (MeOH) của THSG 7

Hình 3.1 Sắc ký đồ hệ (1), (2), (3), (4) (366nm) 26

Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính DL và cao lỏng của hà thủ ô đỏ chế 26

Hình 3.3 Phổ UV và các cực đại hấp thụ của THSG 28

Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát độ thích hợp hệ thống của phương pháp 28

Hình 3.5 Sắc ký đồ định lượng THSG (366nm) 29 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ THSG và độ hấp thụ 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hà thủ ô đỏ là một vị thuốc được sử dụng phổ biến trong cả y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc với tác dụng dưỡng huyết; bổ âm; bồi bổ can, thận; nhuận tràng thông tiện, làm đen râu tóc [3], [19] Nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ ra các tác dụng của hà thủ ô đỏ trên tim, gan, thần kinh; tác dụng chống oxy hóa mạnh, chống các gốc tự do [14], [18], [26], [28]

Hiện nay, hà thủ ô đỏ trên thị trường phần lớn là dạng chế biến với phụ liệu chính là đậu đen nhưng Dược điển Việt Nam V không quy định chỉ tiêu hóa học đối với hà thủ ô đỏ chế Phương pháp sắc thuốc là phương pháp đã được dân gian

áp dụng từ rất lâu để sử dụng hà thủ ô đỏ nhưng phương pháp này lại có nhược điểm là mất nhiều thời gian và phá hủy các hoạt chất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao Trong khi đó, cao lỏng là một chế phẩm tiện lợi, có thể dùng trực tiếp [1] để uống hoặc đưa vào các dạng bào chế khác, khắc phục được những nhược điểm của sắc thuốc Vì vậy, cần thiết nghiên cứu phương pháp điều chế cao lỏng hà thủ

ô đỏ sau chế biến và xây dựng một số chỉ tiêu hóa học cho sản phẩm

2,3,5,4’ – tetrahydroxystilben – 2 – O – β – D – glucosid (THSG) là một stilben chiếm tỉ lệ cao trong hà thủ ô đỏ [8] Dược điển Trung Quốc, Dược điển Mỹ đều quy định chỉ tiêu định lượng của hà thủ ô đỏ là hàm lượng THSG [15], [29] Trong khi đó, chỉ tiêu định lượng của hà thủ ô đỏ trong Dược điển Việt Nam V là hàm lượng anthraquinon [6]

Sắc ký lớp mỏng điều chế là một công cụ tách hoạt chất trong dược liệu hiệu quả Hoạt chất chiết được từ vết sắc ký cho độ tinh khiết cao Mặt khác, các thiết

bị khai triển sắc ký ngày càng hiện đại dẫn đến phương pháp sắc ký lớp mỏng ngày càng được tối ưu hóa [5] So với sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết hợp sắc ký lớp mỏng và quang phổ hấp thụ tử ngoại trong phân tích định lượng hoạt chất của dược liệu là một phương pháp đơn giản, chi phí thấp, đã được áp dụng định lượng artemisinin trong thanh cao hoa vàng [6] Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu “Nghiên cứu điều chế cao lỏng hà thủ ô đỏ chế và xây dựng

một số tiêu chuẩn hóa học bằng phương pháp TLC – UV” với mục tiêu:

1 Điều chế được cao lỏng hà thủ ô đỏ chế

2 Khảo sát được một số tiêu chuẩn hóa học (định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, định lượng THSG trong mẫu cao lỏng hà thủ ô đỏ chế bằng phương pháp TLC – UV)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hà thủ ô đỏ

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây hà thủ ô đỏ

- Vị trí phân loại

Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson hoặc

Polygonum multiflorum Thunb

Hà thủ ô đỏ được phân loại thực vật học theo Takhtaijan [23] như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)

Bộ Rau răm (Polygonales)

Họ Rau răm (Polygonaceae)

Chi Fallopia Loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

- Đặc điểm thực vật:

Dây leo nhỏ, sống lâu năm Thân quấn mọc xoắn vào nhau, mềm, nhẵn Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ Lá mọc so le, hình tim, có mũi nhọn ở đỉnh, dài 4 – 8cm, rộng 2,5 – 5cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng Cuống lá dài khoảng 2cm, phủ lông tơ, bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt [4]

Cụm hoa dạng chùy, dài 10 – 30cm, mọc ở nách lá hay ở ngọn Hoa nhiều, xếp thưa, nhỏ, đường kính 2mm Lá bắc ngắn, dạng trứng hoặc tam giác, đầu nhọn, trong mỗi lá bắc có 2 – 4 hoa Hoa đều, lưỡng tính, màu trắng hoặc lục nhạt, dài

2 – 3mm Bao hoa 5, không bằng nhau, hơi dính nhau ở gốc, xếp 2 vòng Nhị 8 thường đính ở gốc của bao hoa; bao phấn đính lưng, 2 ô, hướng trong, mở dọc Bầu trên, dạng trứng 3 cạnh; vòi nhụy 3, rất ngắn [4], [7], [8]

Quả bế, màu nâu đen, hình chóp 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa đồng trưởng dạng cánh

Mùa hoa: thàng 9 – 11; mùa quả: tháng 12 – 2 [4], [7]

1.1.2 Bộ phận dùng và cách chế biến

- Bộ phận dùng:

Rễ củ thu hoạch vào mùa thu, đào lấy củ, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, củ dài 6 – 16cm, đường kính 4 – 8cm, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi hoặc bổ tư, phơi hoặc sấy khô Mặt ngoài màu nâu đỏ, mặt cắt màu hồng, có bột, vị hơi đắng chát [6], [7], [15], [24]

1.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của HTÔĐ có hai nhóm chất chính chiếm hàm lượng lớn

là anthraquinon và stilben Ngoài ra, trong HTÔĐ còn chứa flavonoid, tanin cùng với một số nhóm chất khác [4], [7], [11], [19]

a Nhóm chất anthraquinon

Hà thủ ô đỏ chứa 1,7% anthraquinon [7], trong đó có emodin, chrysophanol, rhein và các dẫn xuất glucosid [19]

Hình 1.1 Một số anthraquinon có trong hà thủ ô đỏ

Tỉ lệ anthraquinon tự do và anthraquinon toàn phần thay đổi trong quá trình chế biến Theo y học cổ truyền, hà thủ ô sống chứa 0,259% anthraquinon tự do và 0,805% anthraquinon toàn phần (tính theo dược liệu khô) Sau khi chế biến, anthraquinon tự do chiếm 0,113%, anthraquinon toàn phần chiến 0,25% (tính theo dược liệu khô) [7]

b Nhóm chất stilben

Stilben là một trong những nhóm hoạt chất chính của hà thủ ô đỏ tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucopyranosid là stilben đầu tiên được phân lập và xác định vào năm 1976 Sau đó là hàng loạt các stilben khác được tìm ra [19], [20]

2,3,5,4’-Bảng 1.1 Các stilben được phân lập từ rễ hà thủ ô đỏ

Năm Stilben được phân lập

- Bổ khí huyết, dùng trong các trường hợp khí huyết đều hư, cơ thể mệt nhọc

vô lực, thở ngắn hơi, thiếu máu, da xanh gầy khô sáp, chóng mặt, nhức đầu, râu tóc bạc sớm, ra mồ hôi trộm, tim loạn nhịp, mất ngủ

- Bổ thận âm, dùng khi chức năng thận âm kém dẫn đến đau lưng, di tinh, liệt dương, phụ nữ bạch đới, kinh nguyệt không đều [3]

- Giải độc chống viêm, dùng trong các trường hợp mụn nhọt, thấp chẩn lở ngứa, còn dùng để trị bệnh tràng nhạc [15] và điều trị viêm gan mạn tính [3]

- Nhuận tràng thông tiện, dùng trong các trường hợp thiếu máu vô lực mà dẫn đến đại tiện bí táo Ngoài ra còn dùng để chữa trĩ, đi ngoài ra máu

1.2 Vài nét về 2,3,5,4’ – tetrahydroxystilben – 2 – O – β – D – glucosid

1.2.1 Đặc điểm và tính chất hóa lý của THSG

O

OH

OH

O H

O

OH

OH

OH O

H

Hình 1.2 Công thức của THSG

Danh pháp IUPAC: (2S, 3R, 4S, 5S, 6R) – 2 – [2,4 – dihydroxy – 6 – [(E) – 2 –

(4 –hydroxyphenyl) ethenyl] phenoxy] – 6 – (hydroxymethyl)oxan – 3,4,5 – triol Công thức phân tử: C20H22O9

Trọng lượng phân tử: 406,39 g/mol

THSG có dạng tinh thể hình kim, màu trắng, dễ tan trong nước, ethanol, methanol [30] THSG trong nước dễ bị phân hủy bởi enzym, nhiệt và ánh sáng [30]; không ổn định trong dung dịch acid, dung dịch kiềm [22]

THSG hấp thụ cực đại tại bước sóng khoảng 204nm và 320nm [10], [24]

Hình 1.3 Phổ hấp thụ UV (MeOH) của THSG

1.2.2 Tác dụng dược lý của THSG

Các nghiên cứu in vivo về tác dụng dược lý của THSG được thực hiện và đã

cho thấy THSG có khả năng:

- Chống oxy hóa: THSG có khả năng loại bỏ các gốc tự do [17]; tăng cường hoạt động chống oxy hóa tế bào và ức chế quá trình oxy hóa lipid [26]

- Bảo vệ tế bào thần kinh, là cơ sở để điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh thoái hóa thần kinh khác [22], [28]

- Bảo vệ gan: giảm tổng hợp cholesterol, triglycerid; giảm lắng đọng triglycerid tại gan; tăng lipoprotein lipase ở tế bào gan, tăng cường phân hủy triglycerid ở gan, tăng nồng độ HDL trong huyết thanh [16]

- Ngoài ra, THSG còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, tăng cường chức năng miễn dịch, chống lão hóa, … [26]

1.3 Tổng quan về kỹ thuật điều chế cao dược liệu

1.3.1 Khái niệm cao dược liệu

Cao dược liệu là những chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với dung môi thích hợp [1]

1.3.2 Phân loại cao dược liệu

Theo thể chất, cao dược liệu được chia thành 3 loại:

- Cao lỏng: có thể chất hơi sánh Tỉ lệ giữa thể tích cao và khối lượng dược liệu thường là 1:1 đến 1:5 (1ml cao chứ 1-5g dược liệu) Cao lỏng 1:1 và 1:2 có thể uống trực tiếp vì cao này không quá đặc, dễ uống, dễ hấp thu và thuận tiện chuyển thành dạng thuốc nước khác như dễ hòa tan với đường, chất bảo quản, các thành phần khác, đong đo dễ dàng Cao lỏng 1:3 đến 1:5 thường áp dụng với dược liệu cứng rắn, thân gỗ vì khi chiết các thành phần rất ít, dịch chiết rất loãng không

đủ tác dụng điều trị Cao lỏng ít chịu tác dụng của nhiệt độ hơn so với cao đặc, cao khô vì thời gian cô ít hơn, dễ trộn với những dung môi để chiết nó [9]

- Cao đặc: thể chất đặc, quánh, hoặc dẻo, sờ không dính tay ở nhiệt độ thường, nhưng chảy lỏng thành khối dịch đặc hoặc nhớt khi đun nóng Cao đặc được điều chế bằng cách cô đặc kéo dài và cẩn thận các dịch chiết dược liệu Hàm lượng nước trong cao thường không quá 20% [1], [6]

- Cao khô: là khối khô hoặc bột khô, rất dễ hút ẩm Hàm ẩm của cao khô không quá 5% [6]

Phân loại theo dung môi chiết xuất: cao cồn, cao nước, cao ether; theo phương pháp chiết xuất: thuốc sắc, thuốc hãm; theo trạng thái dược liệu đem chiết xuất: cao dược liệu tươi, cao dược liệu khô

1.3.3 Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm

1.3.3.1 Nguyên tắc

Ngâm là phương pháp chiết xuất bằng cách cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, hết thời gian ngâm thì rút dịch chiết, ép bã lấy dịch ép, để lắng gạn hoặc lọc lấy dịch trong [1]

Ngâm đơn giản được tiến hành một lần với toàn bộ dung môi Do vậy, tỉ lệ dược liệu và dung môi ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết Ngâm phân đoạn

là quá trình ngâm nhiều lần, mỗi lần dùng một phần của toàn lượng dung môi Mỗi phân đoạn dịch chiết đều đạt tới cân bằng với cùng một hệ số phân bố, tổng thể tích các phân đoạn dịch chiết sẽ cho lượng chất tan nhiều hơn so với việc chiết xuất một lần với toàn lượng dung môi

Tùy theo nhiệt độ chiết xuất, ngâm được chia thành các phương pháp: ngâm lạnh, hầm, hãm, sắc

- Ngâm lạnh: là quá trình ngâm tiến hành ở nhiệt độ phòng Thời gian ngâm lạnh thường kéo dài nhiều ngày Ngâm lạnh thường áp dụng cho các dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phâp hủy ở nhiệt độ cao, dược liệu chứa chất nhựa, hoạt chất

có đặc tính chậm hòa tan [1]

- Hầm: là phương pháp ngâm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi và giữ ở nhiệt độ đó trong thời gian quy định, thỉnh thoảng có khuấy trộn Nhiệt độ hầm thường từ 40 – 60oC, thời gian kéo dài vài giờ Hầm thường được sử dụng với các dược liệu có hoạt chất ít tan ở nhiệt độ thường nhưng dễ phân hủy ở nhiệt độ cao, hoặc với dung môi có độ nhớt cao như dầu thực vật [1]

- Hãm: là cho dung môi sôi vào dược liệu đã chia nhỏ trong bình chịu nhiệt,

để trong thời gian xác định (thường từ 15 – 30 phút), có khuấy trộn hoặc lắc, sau

đó gạn, ép lấy dịch chiết Hãm được áp dụng cho dược liệu có cấu trúc mỏng manh (hoa, lá), có hoạt chất dễ tan trong một thời gian ngắn ở nhiệt độ cao Dung môi sử dụng thường là nước, ít dùng dung môi dễ bay hơi Ưu điểm của phương pháp hãm là đơn giản, thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn, chiết được phần lớn hoạt chất nhưng ít tạp chất [3]

- Sắc: là đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong thời gian quy định, sau đó gạn lấy dịch chiết Thời gian sắc thường từ 30 phút đến vài giờ Sắc được dùng để chiết xuất các dược liệu rắn chắc như vỏ, gỗ, rễ, hạt, … và hoạt chất không bị phân hủy ở nhiệt độ cao, thường áp dụng điều chế thuốc uống và cao dược liệu [1], [3]

1.3.3.2 Ưu nhược điểm

- Ưu điểm: ngâm là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất; thích hợp với dược liệu có đặc tính trương nở mạnh

- Nhược điểm: khó chiết kiệt hoạt chất; muốn chiết kiệt hoạt chất phải chiết nhiều lần, tốn dung môi, dịch chiết loãng; nếu dung môi là nước thì dễ nhiễm vi khuẩn nấm mốc do thời gian chiết kéo dài [1]

1.3.3.3 Một số biện pháp làm tăng hiệu quả của phương pháp ngâm

Ngâm là quá trình chiết xuất rất chậm, việc khuấy hoặc lắc bình chiết liên tục trong phương pháp ngâm động giúp thiết lập cân bằng chiết nhanh hơn Ngoài ra, một số biện pháp được áp dụng nhằm rút ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết như chiết xuất kiểu turbin, chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm, vi sóng hay xung điện [1]

1.3.4 Kỹ thuật điều chế cao dược liệu

1.3.4.1 Điều chế dịch chiết

❖ Chuẩn bị dược liệu, dung môi

Dược liệu dùng điều chế dịch chiết phải đạt tiêu chuẩn quy định Dược liệu thường được sấy khô và chia nhỏ tới độ mịn thích hợp Mức độ chia nhỏ phụ thuộc

vào cấu trúc vật lý của dược liệu, khả năng thấm của dung môi, tỉ lệ dung môi sử dụng và thời gian quy định để chiết kiệt dược liệu

- Dược liệu có cấu trúc rắn chắc phải được nghiền mịn

- Dược liệu mềm, xốp, dễ thấm dung môi có thể được chiết ở dạng bột thô Một số dược liệu đặc biệt có thể phải diệt enzym hoặc loại chất béo Các bột dược liệu khác nhau có thể được trộn lẫn trước khi chiết

Dung môi để điều chế cao dược liệu thường là nước và ethanol Có thể dùng hỗn hợp ethanol- nước hoặc ethanol- diethyl ether

Để tăng độ tan của hoạt chất, có thể acid hóa hoặc kiềm hóa dung môi bằng acid hydrochloric, acid acetic, amoni hydroxyd, natri hydroxyd Điều chế cao đặc, cao khô nên dùng dung môi dễ thu hồi và tái sử dụng được [1]

❖ Chiết xuất hoạt chất

Tùy theo bản chất của dược liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm cũng như điều kiện trang thiết bị và quy mô sản xuất, có thể sử dụng các phương pháp: ngâm, ngấm kiệt, chiết xuất ngược dòng hay các phương pháp chiết xuất thích hợp khác

Nếu dung môi là nước thường dùng phương pháp ngâm (ngâm lạnh, hầm, hãm, sắc), ít khi dùng phương pháp ngấm kiệt lượng nước thường gấp 8 – 12 lần lượng dược liệu Dung môi là ethanol, diethyl ether thường áp dụng phương pháp ngấm kiệt Lựa chọn độ cồn tùy theo thành phần của dược liệu Lượng dung môi thường dùng gấp 6 lần lượng dược liệu [1]

Bảng 1.2 Nồng độ Ethanol thích hợp với một số nhóm hoạt chất

1.3.4.2 Tinh chế dịch chiết

❖ Nguyên tắc

Dịch chiết thu được khi chiết xuất bằng một dung môi hay hỗn hợp dung môi thường chứa các thành phần không mong muốn cùng với các hoạt chất cần thiết Mục đích của tinh chế là loại bớt tạp chất, giảm vi sinh vật nhiễm hoặc làm trong dịch chiết mà không ảnh hưởng đến hiệu suất và độ ổn định của hoạt chất cũng như chất lượng cao thu được [1]

❖ Tinh chế loại bớt tạp chất

Loại tạp tan trong nước (protein, gôm, chất nhầy, pectin, tinh bột):

- Dùng nhiệt: đun nóng và cô đặc dịch chiết còn ½ - ¼ thể tích ban đầu, để lắng chỗ mát sau đó gạn lọc sẽ loại được protein, chất nhầy và các chất dễ bị đông vón do nhiệt

- Dùng ethanol: cô dịch chiết đến khi đạt tỷ lệ khoảng 2kg nguyên liệu/ 1l dịch chiết, thêm 2 – 3 lần thể tích ethanol 96% khuấy trộn đều, để lắng chỗ mát, sau đó gạn lọc; cất thu hồi ethanol rồi cô đặc đến thể tích quy định loại được chất nhầy, albumin, gôm

Loại tạp chất tan trong ethanol (nhựa, chất béo):

- Cô đặc dịch chiết để hạ thấp độ cồn, nhựa và chất béo sẽ kết tủa hoặc có thể thêm vài phần trăm bột talc để hấp phụ tạp chất, tạo điều kiện cho chúng kết tủa

- Dùng paraffin: dịch chiết được cô đặc còn lại ½ - ¼ thể tích ban đầu, thêm paraffin vào dịch chiết nóng, khuấy kỹ, để nguội, tạp chất hòa tan trong paraffin

sẽ bị loại bỏ

- Dùng diethyl ether để chiết chất béo và nhựa ra khỏi dịch chiết

❖ Làm trong dịch chiết: có thể áp dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm để làm trong dịch chiết tùy theo đặc điểm dịch chiết

❖ Tinh chế giảm vi sinh vật:

Phương pháp thích hợp để làm giảm số lượng vi sinh vật có trong dịch chiết dược liệu là phương pháp Pasteur và phương pháp Ultra - High Temperature (UHT) [1]

1.3.4.3 Cô đặc và sấy khô

Điều chế cao lỏng, dịch chiết được cô đặc đến tỷ lệ quy định; điều chế cao đặc,

cô dịch chiết đến độ ẩm không quá 20%

❖ Sấy khô

Để điều chế cao khô, dịch chiết đã cô thành cao lỏng hoặc cao đặc được sấy đến khi hàm ẩm trong cao chỉ còn dưới 5%

1.3.5 Chỉ tiêu chất lượng cao dược liệu

- Cảm quan: cao dược liệu phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng

- Định tính và định lượng

- Tính tan: cao phải hoàn toàn tan trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Mất khối lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

- Các chỉ tiêu khác: giới hạn độ nhiễm khuẩn, kim loại nặng, giới hạn chất bảo vệ thực vật, chất bảo quản, … [1], [6]

1.4 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ hấp thụ tử ngoại (TLC - UV)

1.4.1 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC)

1.4.1.1 Nguyên tắc

Quá trình tách bằng TLC được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh (kích thước 10 – 30µm) làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, … [5]

Bảng 1.3 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC

Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Ứng dụng phân tích

vitamin

phẩm, lipid

Cellulose trao đổi ion Trao đổi ion Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,

halogenid

Pha động thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf = ⅆR

ⅆM

Trong đó: dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết (cm)

Rf: có giái trị dao động giữa 0 và 1 [5], [6]

1.4.1.2 Ứng dụng của TLC

a Định tính

- Thường dựa vào chỉ số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện Trong trường hợp do sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rf để đặc trưng cho chất phân tích:

Rf =ⅆR,x

ⅆR,cTrong đó: dR,x: Đường đi của chất phân tích (cm)

dR,c: Đường đi của chất chuẩn (cm)

Rf: càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất [5]

b Thử tinh khiết

Dùng TLC để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ Trong các Dược điển thường quy định kiểm tra tạp chất có mặt trong dược chất bằng SKLM [5]

Phát hiện sự trộn lẫn các chất tân dược vào trong đông dược, ví dụ trộn sildenafil, vardenalafil (cường dương); trộn nimesulide (giảm đau), trộn reserpine

(terpenoid alkaloid) từ cây Ba gạc Rauwolfia sp trong một số chế phẩm hạ huyết

áp Phát hiện việc dùng thay thế hay giả mạo một số dược liệu [21]

c Định lượng

Định lượng các chất trong vết sắc ký có thể theo 2 cách sau:

- Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp (phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ…)

- Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hoặc cường độ màu của vết sắc ký theo một trong hai kỹ thuật: Densitometer (chiếu chùm tia vào vết sắc

ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang), xử lý ảnh với camera kỹ thuật số [5]

d Đánh giá TLC

- Ưu điểm: so với GC và HPLC, TLC sử dụng thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát); dễ dàng tách các mẫu có nhiều thành phần:

có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10 – 20 mẫu hoặc hơn; so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn

- Nhược điểm: độ lặp lại thấp của trị số Rf do thành phần pha động thay đổi trong quá trình triển khai sắc ký; tăng giãn rộng pic do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ hấp thụ tử ngoại

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu hoạt chất chuẩn và mẫu thử phù hợp Khai triển sắc ký lớp mỏng: chấm mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng (thường là dung môi pha mẫu) lên bản mỏng, triển khai sắc ký

- Xác định vết hoạt chất trong mẫu chuẩn, thử và vùng không có vết hoạt chất của mẫu trắng

- Chuẩn bị mẫu đo quang: cạo các vết đã xác định ở trên lấy bột silicagel, chiết lại bằng dung môi thích hợp

- Đo độ hấp thụ tại λmax của mẫu chuẩn và mẫu thử, sử dụng phương pháp so sánh chuẩn, đường chuẩn, … để xác định nồng độ hoạt chất trong mẫu thử

Phương pháp TLC – UV kết hợp ưu điểm tách được hoạt chất tinh khiết của SKLM và ưu điểm về độ chính xác của quang phổ hấp thụ tử ngoại trong định lượng, thao tác đơn giản, hiệu quả cao, chi phí thấp [5], [6]