Phân Tích Đồng Thời Paracetamol Và Caffein Trong Dược Phẩm Bằng Phương Pháp HPLC

HPLC là một trong những phương pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các loại thuốc đa thành phần đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM

LỜI CÁM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng vì đã giao cho

em đề tài nghiên cứu này Cám ơn thầy vì đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt thời gian nghiên cứu

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến các thầy cô ở phòng thí nghiệm bộ môn phân tích đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận

Cám ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn

Một lần nữa xin cám ơn tất cả mọi người Kính chúc thầy cô, tất cả bạn bè và gia đình thật nhiều sức khỏe

TP HCM, tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Trinh

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

MỤC LỤC iv

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH VẼ vii

KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3

1.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 3

1.1.1. Giới thiệu 3

1.1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 3

1.1.3. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột 5

1.1.4. Các đại lượng đặc trưng 7

1.1.5 Định lượng bằng HPLC 13

1.2. Paracetamol [3, 4] 15

1.3. Caffein [3, 4] 19

1.4. Các phương pháp phân tích paracetamol 20

1.5. Các phương pháp phân tích caffein 21

1.6. Các phương pháp xác định đồng thời paracetamol và caffein 21

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 24

2.1. Hóa chất, dụng cụ 24

2.1.1. Hoá chất 24

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 25

2.2. Thực nghiệm 26

2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu 26

2.2.2 Phân tích mẫu dược phẩm 29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 32

3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu 32

3.1.1. Khảo sát thành phần pha động 32

3.1.2. Khảo sát tốc độ pha động 34

3.2. Phân tích mẫu dược phẩm 36

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính 36

3.2.2. Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu dược phẩm 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 44

4.1. Kết luận 44

4.2. Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của methanol trong pha động 32 Bảng 3.2.Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và chiều cao pic sắc kí 34 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào nồng độ của paracetamol 37 Bảng 3.4.Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào nồng độ của caffein 38 Bảng 3.5.Diện tích pic thu được sau mỗi lần lọc 39 Bảng 3.6 Kết quả phân tích các mẫu dược phẩm 40 Bảng 3.7 Kết quả phân tích hàm lượng paracetamol và caffein trong 2 viên thuốc Panadol Extra 42

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1.Sơ đồ hệ thống HPLC 5

Hình 1.2.Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải 6

Hình 1.3.Quá trình tách sắc kí của các chất 6

Hình 1.4.Thời gian lưu trong HPLC 7

Hình 1.5.Giản đồ về sự tách hai pic sắc kí A và B 11

Hình 1.6.Phương trình đường cong Van Deemter 12

Hình 1.7.Mối quan hệ H = f(C) và S = f(C) 13

Hình 3.1.Sắc kí đồ của paracetamol và caffein khi khảo sát pha động 31

Hình 3.2 Sắc kí đồ hỗn hợp paracetamol và caffein với pha động là methanol 32

Hình 3.3 Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào tốc độ pha động 34

Hình 3.4 Đường chuẩn của paracetamol 37

Hình 3.5.Đường chuẩn của caffein 38

Hình 3.6 Sắc kí đồ của các mẫu thuốc 41

KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Trang 1

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng Chính vì thế mà các sản phẩm ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người ngày càng được quan tâm

Paracetamol và caffein là thành phần phổ biến có trong hầu hết các loại thuốc giảm đau, hạ sốt trên thị trường hiện nay Paracetamol là thuốc có tác dụng giảm đau,

hạ sốt và được xếp vào nhóm thuốc không cần kê đơn Ngoài tác dụng làm giảm cảm giác mệt mỏi và buồn ngủ, caffein còn có khả năng gây co mạch, làm giảm cường độ

và thời gian đau Do vậy, khi được phối hợp với paracetamol, caffein không những làm tăng hiệu quả giảm đau của thuốc mà còn giúp người bệnh tỉnh táo Tuy nhiên việc sử dụng một cách tùy tiện hoặc lạm dụng quá mức các loại thuốc chứa paracetamol và caffein có thể gây ra những triệu chứng, các tác dụng phụ không mong muốn, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của chúng nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe của người

sử dụng HPLC là một trong những phương pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các loại thuốc đa thành phần đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế Tại Việt Nam đã có các công trình nghiên cứu xác định thành phần của paracetamol và caffein trong dược phẩm sử dụng phương pháp quang phổ UV-VIS, quang phổ đạo hàm, HPLC,… Trong đó, các phương pháp quang phổ UV-VIS, quang phổ đạo hàm thường được dùng để xác định đồng thời paracetamol và caffein Trong khi đó, HPLC thường chỉ dùng để xác định từng chất riêng rẽ

Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol

và caffein trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC” với mong muốn

tìm ra một phương pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm với hai mục tiêu:

Trang 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.1.1 Giới thiệu

Sắc kí là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh,một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích

có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc kí.Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc kí lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong cột tách mà người ta chia thành:

− Sắc kí phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau

− Sắc kí hấp phụ pha thường (NP-HPLC)

− Sắc kíhấp phụ pha ngược hay pha đảo (RP- HPLC)

− Sắc kí trao đổi ion (IEX-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)

− Sắc kí rây phân tử (FG-HPLC)

1.1.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

Hệ thống trang bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản (đơn giản và đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC) bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:

a) Bơm cao áp:

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc kí Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ nằm trong vùng 0,5 – 3 ml/phút

b) Van bơm mẫu:

Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc kí Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác

Đây thường là các loại detector dựa theo các tính chất của chất phân tích Một

số detector thông dụng như:

− Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV-VIS

− Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hấp thụ nguyên tứ (AAS)

− Detector huỳnh quang phân tử

− Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng)

− Detector chiết suất

− Detector đo độ dẫn nhiệt

− Detector diode phát quang và diode mảng

− Detector phổ khối lượng

Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng Trong

các loại trên, thì detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay đang được dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại không quá đắt

e) Bộ phận hiển thị kết quả:

Bộ phận hiển thị kết quả có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả

Trang 5

Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC

Những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm:

− Bộ chương trình gradient dung môi (pha động)

− Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu

− Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc kí

− Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC

và xử lý kết quả tách, in kết quả tách

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống HPLC

1.1.3 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột

Trong quá trình sắc kí các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc kí Khi ở trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột sắc kí Vì vậy, trong quá trình sắc kí, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ

Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các mối tương tác:

injector

Trang 6

 Giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1)

 Giữa chất phân tích và pha động (F2).

 Giữa pha tĩnh và pha động (F3).

Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước Đối với mỗi chất,sự lưu giữ được qui định bởi ba lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ

di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây)

Hình 1.3 Quá trình tách sắc kí của các chất

Trang 7

1.1.4 Các đại lượng đặc trưng

1.1.4.1 Thời gian lưu

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc kí sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầubơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại Như vậy

nếu gọi tRilà thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:

tRi = ( to + t′Ri ) Trong đó:

+ to là thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động )

+ t′Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc kí (thời gian lưu hiệu chỉnh)

Nếu to = 0 thì ta sẽ có tRi = t′Ri Trường hợp này chỉ có khi tRi là rất nhỏ (thường

là khi tRi nhỏ hơn 4 phút)

Hình 1.4 Thời gian lưu trong HPLC

Giá trị t′Ri của một chất tan trong quá trình sắc kí là phụ thuộc vào nhiều yếu tố

Ví dụ như:

 Bản chất sắc kí của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp

 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

Trang 8

 Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

 Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc kí

Giá trị thời gian lưu t′Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc kí Vì

nó cho ta biết các chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn Đồng thời đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tính một chất

là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và nó được tính theo công thức:

𝐾 = 𝐶𝐶𝑖𝑆𝑃

Trong đó Ci

SP và Ci

MPlà nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động

Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh)

- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh

- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích)

- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc kí

- Độ nhớt của pha động

Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc kí đã chọn, thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan Chiều cao lí thuyết H và số đĩa lí thuyết N được xác định theo công thức:

𝐻 = 16𝐿 ( 𝑊𝑖

𝑡 𝑅𝑖)2 (1.8)

𝑁 = 𝐻𝐿 = 16 ( 𝑡𝑊𝑅𝑖

𝑖)2 (1.9)

Trong đó Wilà chiều rộng đáy pic sắc kí và tRi là thời gian lưu của chất i

Trong thực tế của quá trình sắc kí, thì số đĩa hiệu dụng Nef và chiều cao hiệu dụng Hef của một cột sắc kí mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng được khả năng của

RAB = 2.(tWRB−tRA)

A + WB (1.12)

Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai pic sẽ

có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc kí Song nếu đoạn đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết Vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn Do đó giá trị R chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được

Trang 11

a) b ) c) Hình 1.5 Giản đồ về sự tách hai pic sắc kí A và B

a) Tối thiểu để có sự tách

b) Đủ để hai chất tách khỏi nhau

c) Hai chất tách xa hẳn nhau

1.1.4.7 Phương trình Van Deemter

Phương trình Van Deemter thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao H của một đĩa

và tốc độ tuyến tính của pha động u Phương trình Van Deemter được viết như sau:

𝐻 = 𝐴 + 𝐵

𝑢 + [𝐶𝑆 + 𝐶𝑀]𝑢 Trong đó:

+ A: hệ số mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy đến H

+ B: hệ số khuếch tán dài

+ CS và CM: hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động

Nếu biểu thị các đường biểu diễn tổng cộng trong quan hệ của H với u thì chúng ta có được đường cong Van Deemter

Trang 12

Hình 1.6 Phương trình đường cong Van Deemter

Hệ số A phụ thuộc vào đường kính hạt nhồi dp trong pha tĩnh; cách chúng được nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ (hệ số nạp cột) phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột:

A = 2.λ.dp (1.13)

Hệ số B chỉ ra cho ta ảnh hưởng của hệ số khuếch tán DM của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của cột

B = 2γ DM (1.14) Trong đó:

+ DM: hệ số khuyếch tán của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của cột

+ γ: hằng số đặc trưng cho sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian và trong điều kiện cột nạp tốt thì giá trị γ hầu như bằng 1

Hệ số C tỉ lệ thuận với tốc độ pha động và ảnh hưởng đáng kể đến đường cong

H – u Hệ số CM và CS được tính theo công thức sau:

CM = ϕ.(dp)2 / DM (1.15)

CS = k ρ2 / DS (1.16)

Trang 13

Trong đó:

+ ϕ: một hệ số thực nghiệm, nó được quyết định bởi hệ số dung tích ki’ của chất tan

+ k: một hằng số phụ thuộc vào điều kiện nạp cột, và thường nhỏ hơn 2

+ ρ:tỷ khối của pha tĩnh

+ Ds: hệ số khuyếch tán của chất tan trong pha tĩnh

Đường cong Van Deemter được dùng để xác định tốc độ pha động tối ưu uopt

mà tại tốc độ đó chiều cao đĩa H là nhỏ nhất nên hiệu quả tách là tốt nhất

1.1.5 Định lượng bằng HPLC

1.1.5.1 Phương trình cơ bản để định lượng

Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phương trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc kí (diện tích, hay chiều cao) của chất với nồng độ C của chúng được bơm vào cột tách

Trong đó:

+ H : Chiều cao pic sắc kí của chất

+ S : Diện tích pic sắc kí của chất

Hình 1.7 Mối quan hệ H = f(C) và S = f(C)

Trang 14

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn.Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng

chất phân tích

1.1.5.2 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Dựa trên (1.17) và (1.18) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với các đặc trưng sau:

=

i i

x n

n

i i

(1.20)

Độ lệch chuẩn tương đối: (%) 100

x s

hoặc Acetaminophen) là chất chuyển hóa có

hoạt tính cuả phenacetin, là thuốc giảm đau,

hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế aspirin

Paracetamol không có hiệu quả điều trị viêm

Với liều ngang nhau tính theo gam,

paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt

tương tự aspirin

Paracetamol làm giảm thân nhiệt của người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt ở người bình thường Thuốc tác dụng lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn tĩnh mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên

Với liều điều tri, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng axit-bazơ, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như dùng salicylat Nguyên nhân do paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase toàn thân, chỉ tác động đến cyclooxygenase / prostaglandin của hệ thần kinh trung ương Paracetamol không tác dụng trên tiểu cầu hoặc thời gian chảy máu

Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là N-bezoquinonimin gây độc nặng cho gan.Liều bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều tác dụng phụ của aspirin.Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm thương tổn gan gây chết người Những vụ ngộ độc và tự vẫn bằng paracetamol đã tăng lên một cách đáng

lo ngại trong những năm gần đây

Hấp thu:

Paracetamol được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua đường tiêu hóa Thức ăn có thể làm viên nén giải phóng kéo dài paracetamol chậm được hấp thu

Trang 16

một phần và thức ăn giàu cacbonhydrat làm giảm tỷ lệ hấp thu của paracetamol Nồng

độ đỉnh trong huyết tương đạt trong vòng 30 đến 60 phút sau khi uống với liều điều trị

N-Thải trừ:

Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa, độ thanh thải là 19,3 lít/giờ Thời gian bán thải khoảng 2,5 giờ Khi dùng paracetamol ở liều cao (trên

10 g/ngày), sẽ tạo ra nhiều N-acetylbenzoquinonimin làm cạn kiệt glutathion gan.Khi

đó N-acetylbenzoquinonimin sẽ phản ứng với nhóm sulfydrid của protein gan gây tổn thương gan, hoại tử gan, có thể gây tử vong nếu không cấp cứu kịp thời

Chỉ định:

Paracetamol được dùng rộng rãi trong điều trị các chứng đau và sốt từ nhẹ đến vừa

Đau:

Paracetamol được dùng giảm đau tạm thời trong điều trị chứng đau nhẹ và vừa

Thuốc có hiệu quả nhất trong làm giảm đau cường độ thấp có nguồn gốc không phải nội tạng

Paracetamol không có tác dụng trị thấp khớp, là thuốc thay thế cho salicylat (đối với người bệnh chống chỉ định hoặc không dung nạp salicylat) để giảm đau nhẹ hoặc

hạ sốt

Sốt:

Paracetamol thường dùng để giảm thân nhiệt ở người bị sốt, khi sốt có thể có hại hoặc khi hạ sốt người bệnh sẽ dễ chịu hơn Tuy vậy, liệu pháp hạ sốt nói chung

Trang 17

không đặc hiệu, không ảnh hưởng đến tiến trình của bệnh cơ bản và có thể che lấp tình trạng của người bệnh

Chống chỉ định:

Người bệnh quá mẫn cảm paracetamol

Người bệnh thiếu hụt glucose-6-photphat dehydrogenase

Để giảm thiểu nguy cơ quá liều, không nên cho trẻ uống quá 5 liều paracetamol

để giảm đau và hạ sốt trong vòng 24 giờ Để giảm đau hoặc hạ sốt cho người lớn và trẻ

em trên 11 tuổi, liều paracetamol thường dùng hoặc đưa vào trực tràng là 320 – 650

mg, cứ 4 – 6 giờ khi cần thiết và không dùng quá 4 g một ngày Liều một lần lớn hơn (ví dụ 1g) có thể hữu ích để giảm đau ở một số người bệnh

Quá liều:

Nhiễm độc paracetamol có thể do dùng một liều duy nhất, do uống lặp lại liều lớn hơn hay do uống thuốc dài hạn Hoại tử gan là tác dụng độc cấp tính nghiêm trọng nhất do quá liều và có thể gây tử vong

Những biểu hiện thường gặp: buồn nôn, nôn và đau bụng thường xảy ra trong vòng 2 – 3 giờ sau khi uống liều đầu của thuốc Methemoglobin máu dẫn đến chứng xanh tím da, niêm mạc và móng tay là một trong những dấu hiệu đặc trưng nhiễm độc cấp tính p-amionphenol, một lượng nhỏ sulhemoglobin cũng có thể được sản sinh Trẻ

em có khuynh hướng tạo methemoglobin dễ hơn người lớn sau khi uống paracetamol

Khi bị ngộ độc nặng, ban đầu có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, kích động và mê sảng Tiếp theo có thể là ức chế hệ thần kinh trung ương, hạ thân nhiệt, mệt lả, thở nhanh, nôn, mạch nhanh, yếu, không đều, huyết áp thấp và suy tuần hoàn Trụy mạch do giảm oxy huyết tương và do tác dụng ức chế trung tâm chỉ xảy ra với

Trang 18

liều rất lớn Sốc thuốc có thể xảy ra nếu giảm mạch nhiều Cơn co giật nghẹt thở gây

tử vong có thể xảy ra Chuẩn đoán sớm rất quan trọng trong điều trị quá liều paracetamol.Khi nhiễm độc nặng, điều quan trọng là phải điều trị hỗ trợ tích cực.Cần rửa dạ dày trong mọi trường hợp, tốt nhất trong vòng 4 giờ sau khi uống.Liệu pháp giải độc chính là dùng những hợp chất sulfhydryl Ngoài ra có thể dùng than hoạt tính, thuốc tẩy muối hoặc nước chè đặc để làm giảm hấp phụ paracetamol

Các dạng thuốc thường gặp trên thị trường

Hiện tại có 4 dạng thuốc hạ sốt chứa paracetamol phổ biến có thể sử dụng rộng rãi trong cộng đồng:

Thuốc viên nén hoặc viên nhộng với nhiều loại, nhiều liều lượng khác nhau.Có

3 liều lượng phổ biến cho dạng viên là 100 mg, 325 mg và 500 mg Một số nhà sản xuất còn có loại thuốc dạng viên nén sủi bọtvới liều lượng thường gặp là 330 mg và

500 mg

Thuốc dạng bột chứa trong gói thường có vị ngọt thích hợp với trẻ em Có 3 liều lượng phổ biến cho dạng thuốc gói này là 80 mg, 150 mg và 250 mg

Dạng sirô với liều lượng thông thường là 120 mg cho 5 ml dung dịch

Dạng viên thuốc nhét hậu môn

Caffein là thuốc thuộc dẫn xuất xanthin

được chiết từ cà phê, ca cao hoặc được tổng hợp từ

axit uric Caffein có tác dụng rõ trên thần kinh

Trên hệ tuần hoàn: caffein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh tăng lưu lượng tim và lưu lượng mạch vành Ở liều điều trị thuốc ít ảnh hưởng đến huyết áp

Trên hệ hô hấp: kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch phổi Tác dụng này càng rõ khi trung tâm hô hấp bị ức chế

Trang 20

Trên hệ tiêu hóa: gây táo bón, tăng tiết dịch vị, có thể gây loét dạ dày, tá tràng Trên cơ trơn: thuốc có tác dụng làm giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn phế quản và cơ trơn tiêu hóa

Trên thận: thuốc làm giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp thu

Na+nên có tác dụng lợi tiểu, tuy nhiên tác dung lợi tiểu kém

Nguyên nhân là do caffein ngăn cản phân hủy AMPv do ức chế cạnh tranh với phosphodiesterase Nồng độ AMPv tăng thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội bào, tăng hoạt động của cơ tim, tăng chuyển hóa, tăng phân hủy lipid, tăng glucose trong máu

1.4 Các phương pháp phân tích paracetamol

Sinan Suzen, Cemal Akay, và các cộng sự sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng paraccetamol trong dược phẩm vào năm 1998 chương trình sử dụng cột sắc kí C18; hỗn hợp methanol và nước theo tỉ lệ thể tích 1:2 làm dung môi pha động, tốc độ pha động là 1,78 ml/phút tại bước sóng 193,3 nm Kết quả thu được thời gian lưu của paractamol là 2,560 phút và hệ số thu hồi của paracetamol đạt 98,8% ±0,83 [5]

Năm 2006, Shulin Zhaovà cộng sựđã sử dụng phương pháp điện di mao quản xác định paracetamol trong dược phẩm Khoảng tuyến tính nồng độ paracetamol thu

Trang 21

được từ 6,6.10-10 M đến 6,6.10-8 M (hệ số tương quan r = 0,9999) và giới hạn phát hiện paracetamol là 5,6.10-10 M [6]

1.5 Các phương pháp phân tích caffein

Hàm lượng caffein có trong huyết thanh người và thức uống có cola đã được Wenrui Jin và các cộng sự xác định bằng phương pháp điện di mao quảnvào năm

2000 Giới hạn phát hiện của caffein thu được là 2,9.10-4 mM và độ lệch chuẩn của thời gian điện di và diện tích pic thu được của caffein lần lượt là 0,68% và 2,3% [7]

Năm 2000, Guzin Alpdogan, Kadir Karabina, Sidika Sungurg dùng phương pháp phổ đạo hàm để xác định caffein trong các loại nước uống như cola, cà phê và trà, lấy phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng làm phương pháp đối chiếu với chương trình sắc kí sử dụng cột C18, hỗn hợp methanol: nước theo tỉ lệ thể tích 30:70 thu được pic sắc kí tại thời gian lưu là 5,14 phút Kết quả thu được giới hạn phát hiện của caffein với phương pháp trên là 2 μg/g; 1,5 μg/ml và 2 μg/g đối với trà, cola và cà phê [8]

1.6 Các phương pháp xác định đồng thời paracetamol và caffein

H Tavallali và M Sheikhaei đã tiến hành xác định đồng thời paracetamol và

caffein bằng phương pháp thêm chuẩn điểm H vào năm 2009 Phương pháp dựa trên

sự khác nhau về tỉ lệ oxi hóa của hai chất cần xác định với Cu(II) neocuproine và sự tạo thành phức Cu(I) neocuproine tại bước sóng quang phổ là 453 nm và điều kiện pH

là 5,0 với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt natri dodecyl sunfat Paracetamol được xác định trong khoảng nồng độ 1,5 – 7,0 µg/ml và caffein được xác định trong khoảng nồng độ 0,1 – 3,0 µg/ml [9]

Năm 2010, Vijaya Vichare, Preeti Mujgond và cộng sự sử dụng phương pháp trắc quang để xác định đồng thời paracetamol và caffein trong các sản phẩm dược Khoảng tuyến tính thu được nằm trong khoảng 2 – 16 µg/ml đối với paracetamol và 2 – 32 µg/ml đối với caffein [10]

Paracetamol và caffein trong thuốc đã được M Prodan và cộng sự xác định bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18, dung môi pha động là methanol : nước

200 µg/ml and 0,233 – 600 µg/ml [12]

Viswanath Reddy Pyreddy cùng cộng sự xác định đồng thời paracetamol, caffein, pseudoephedrine và chlorpheniramine maleate trong dược phẩm bằng phương pháp HPLC vào năm 2011.Chương trình sắc kí sử dụng cột C18 (150mm, 4.6mm và 3µm) với chương trình gradient nồng độ Hệ dung môi pha động gồm dung dịch A là đệm phosphate (1,0g KH2PO4 trong 1000 ml nước) và dung dịch B là acetonitrile với tốc độ pha động là 1 ml/phút ở 400C tại bước sóng 210 nm và chương trình chạy sắc kí sau:

nm Khả năng thu hồi đạt 99,29 – 100,19% khi phân tích bằng phương pháp trắc quang

và đạt 99,14 – 100,25% khi phân tích bằng phương pháp HPLC [14]

Trang 23

Thái Duy Thìn đã sử dụng phương pháp HPLC với chương trinh sắc kí sử dụng cột C18 (250 x 4 mm, 10 µm), pha động là dung dịch axit photphoric 0,75% trong hỗn hợp dung môi methanol : nước (35 : 65), tốc độ dòng 1ml/phút Kết quả thu được thời gian lưu của paracetamol và caffein lần lượt là 2,219 và 6,041 Độ lặp lại của phương pháp tốt với sai số tương đối nằm trong khoảng 0,54 – 1,07% [15]

Trang 24

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, dụng cụ

Dung dịch gốc 1200 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn

và hòa tan trong metanol tinh khiết loại dùng cho HPLC, được bảo quản trong tủ lạnh Các dung dịch làm việc được pha từ dung dịch gốc bằng methanol Các dung dịch loãng chỉ sử dụng trong ngày

2.1.1.2 Dung môi

STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%)

1 Acetonitril Merk KGaA

1 Chlorofom Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 %

2 Acid Phosphoric Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 85,00 %

3 Bộ loại khí cho

dung môi Vacuum Degasser Perkin Elmer Series 200

5 Thiết bị nạp mẫu Injector 20 𝜇𝑙 USA

6 Cột sắc kí Brownlee Columns

RP - 18

Perkin Elmer Brownlee Columns 07110017

Intel Phần mềm do Perkin Elmer cung cấp

11 Giấy lọc 0,45𝜇𝑚 Membrane Filter

13 Máy đánh siêu

Trang 26

14 Cân phân tích Balances and

Precious Metal scales Sartorius 98648-012-13

15 Máy đo quang Lambda 25 UV/Vis

Spectrometor Perkin Elmer 101N7062504

- Bình tam giác, cốc thủy tinh

- Ống nhỏ giọt, bình tia, phễu busne, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường, giấy parafin

Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột.Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần làm chân pic sắc kí bị doãng ra Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách

Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng tuyến tính Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng nữa và lúc đó pic sắc kí sẽ tù, doãng chân và không sắc nét Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng

Trang 27

Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao, tránh doãng pic Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 µl trong đó vòng mẫu 20 µl thường hay được sử dụng nhất Trong đề tài nghiên cứu này để phân tích đồng thời paracetamol và caffein chúng tôi lựa chọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu

là 20 µl

2.2.1.2 Chọn cột

Trong đề tài nghiên cứu này, paracetamol và caffein là những chất rất ít phân cực và dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành phần trong dược phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc kípha đảo C8 và C18 Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin Elmer được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm và được trang bị cho hệ thống HPLC của phòng thí nghiệm của trường, cho thấy khả năng tách tốt, thời gian lưu ngắn và được nhà sản xuất hỗ trợ về

kỹ thuật nên chúng tôi chọn cột Brownlee RP – 18,5µm, 220 x 4,6mm cho phép định lượng này

2.2.1.3 Khảo sát thành phần pha động

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc kí Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau: