Nghiên Cứu Tổng Hợp, Xác Định Cấu Trúc Và Thăm Dò Hoạt Tính Ức Chế Tế Bào Ung Thư Của Phức Ion Cu2+

Khi TSCs và M-TSCs được tiêm vào người bệnh, các phân tử này hoạt động như các chất ức chế, có thể tạo liên kết với DNA của tế bào ung thư bằng hệ thống liên hợp NNS, ngăn chặn sự phiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GV HƯỚNG DẪN: ThS TRẦN BỮU ĐĂNG

Thành phố Hồ Chí Minh 9–2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

SALICYLALDEHYDE-N(4)-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GV HƯỚNG DẪN: ThS TRẦN BỮU ĐĂNG

Thành phố Hồ Chí Minh 9–2018

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình hoàn thành khoán luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được nhiều

sự giúp đỡ, động viên từ gia đình, thầy cô và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô bộ môn Hóa Vô cơ nói riêng và quý thầy cô khoa Hóa học nói chung Thầy cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu để tôi có đủ hành trang tiến bước vào đời

Tôi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến thầy Trần Bữu Đăng người trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt rất nhiều kiến thức cần thiết, giúp đỡ tôi rất nhiều, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa luận này Hơn thế nữa, tôi học được ở thầy đức tính tỉ

mỉ, cần cù, sáng tạo và phong cách giản dị - đó là những giá trị sống rất cao đẹp

Và hơn hết, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, các em khóa dưới đã tạo động lực rất lớn cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm đề tài

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận vẫn còn nhiều thiếu sót kính mong Quý thầy cô nhận xét và góp ý để khóa luận được hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn và lời chúc tốt đẹp nhất cho toàn thể Thầy cô và các bạn

Chân thành cảm ơn!

Tác giả

Mai Ngọc Anh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực, là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Trần Bữu Đăng

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đúng quy đi ̣nh

Tác giả

Mai Ngọc Anh

CÁC KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ CƯƠNG

A549 Human alveolar epithelial cells (ung thư phổi)

COSY 2D NMR Spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều proton)

proton-13C - NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13C)

DMSO Dimethyl sulfoxide

ESI MS electrospray ionisation mass spectrometry (phổ khối lượng ion hóa bằng dòng electron)

FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy (phổ hấp thụ hồng ngoại) HCT116 Human colon cancer cell line (ung thư đường ruột)

HepG2 Liver Hepatocellular carcinoma (ung thư biểu mô tế bào gan)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ cộng hưởng từ proton hai chiều proton-carbon, 3 nối)

1H - NMR Proton nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ proton)

HuCCA-1 Human cholangiocarcinoma (ung thư đường mật của con người )

HSQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (phổ cộng hưởng từ proton hai chiều proton-carbon, 1 nối)

IC50 Nồng độ hợp chất có thể giết chết 50% tế bào

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

UV-Vis Ultraviolet–visible spectroscopy (phổ hấp thụ electron)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng 15

Bảng 2.2 Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1 16

Bảng 2.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 17

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào xúc tác acid 21

Bảng 3.2 : Các giá trị hằng số a trong phương trình tính các hệ số hồi quy 25

Bảng 3.3 : Ma trận quy hoạch thực nghiệm kế hoạch tâm bậc 2 xoay 25

Bảng 3.4: Đánh giá thông kê các hệ số 27

Bảng 3.5: Kết quả ANOVA của mô hình bậc 2 28

Bảng 3.6 : Tín hiệu các dao động đặc trưng của các nhóm chức chính của HL1 28

Bảng 3.7 Đặc điểm độ chuyển dịch proton của HL1 trên NMR 30

Bảng 3.8 Một số đặc điểm cơ bản của phức chất 31

Bảng 3.9 Điều kiện tổng hợp phức chất 32

Bảng 3.10 Giá trị m/z của pic ion phân tử và công thức phân tử dự kiến của ba phức 33

Bảng 3.11 Đặc điểm các vân dao động các nhóm chức chính của phối tử và phức chất 40

Bảng 3.12 Các chuyển mức chủ yếu trên phổ UV-Vis của phối tử và phức chất 44

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của thiosemicarbazone 2

Hình 1.2 Cân bằng giữa hai dạng thione và thiol trong dung dịch 3

Hình 1.3 Cấu trúc tổng quát sự chuyển dịch cân bằng thione – thiol của thiosemicarbazone 3

Hình 1.4 Cách phối trí thông thường của thiosemicarbazone 4

Hình 1.5 Dạng phối trí khi tạo phức của hỗn hợp cân bằng thione và thiol trong dung dịch 4

Hình 1.6 Ion kim loại phối trí với thiosemicarbazone ở N(1) 5

Hình 1.7 Kiểu phối trí chelate vòng bốn cạnh 5

Hình 1.8 Khả năng phối trí khi có mặt dị tố O (a) và N (b) 5

Hình 1.9 Dung lượng phối trí 3 của thiosemicarbazone 6

Hình 1.10 Một số thiosemicarbazone chứa isoquinoline và pyridine 8

Hình 1.11 Một số thiosemicarbazone chứa dẫn xuất của quinoline 9

Hình 3.1 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào yếu tố tỉ lệ mol T 21

Hình 3.2 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào nhiệt độ nước cách thủy 22

Hình 3.3 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian 22

Hình 3.4 Mô hình 3D của phương trình(*) Hình 3.5 Mô hình 2D của phương trình (*) 28 Hình 3.6 Phổ IR của HL1 29

Hình 3.7 Công thức cấu tạo của HL1 29

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của HL1 31

Hình 3.9 Phổ MS của phức ZnL1 35

Hình 3.10 Phổ MS của phức CdL1 37

Hình 3.11 Phổ MS của phức CuL1 39

Hình 3.12 Một số tương quan chính trên HMBC của CdL1 41

Hình 3.13 Một số tương quan chính trên HSQC của CdL1 42

Hình 3.14 Phổ 13C-NMR của CuL1 53

Hình 3.15 Phổ 1H-NMR của CuL1 54

Hình 3.16 Phổ 13C-NMR của CdL1 55

Hình 3.17 Phổ 1H-NMR của CdL1 56

Hình 3.18 Phổ 13C-NMR của ZnL1 57

Hình 3.19 Phổ 1H-NMR của ZnL1 58

Hình 3.20 Một số tương quan chính trên HMBC của ZnL1 59

Hình 3.21 Một số tương quan chính trên HMBC của CuL1 60

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu cấu trúc thiosemicarbazone (TSC) và phức chất của thiosemicarbazone (M-TSC) 2

1.1.1 Cấu tạo chung TSC 2

1.1.2 Cấu tạo chung của phức M-TSC 4

1.2 Một số ứng dụng của TSC và phức chất của TSC với ion kim loại 6

1.2.1 Các ứng dụng phổ biến 6

1.2.2 Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư 7

1.3 Định hướng nghiên cứu về phức chất của thiosemicarbazone hiện nay 9

1.4 Mục tiêu nghiên cứu 11

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 12

2.1 Hóa chất và dụng cụ 12

2.2 Tổng hợp hỗn hợp Salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT 13

2.2.1 Quy trình tổng hợp SMT 13

2.3 Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp SMT 14

2.3.1 Xác định các mức cơ sở bằng phương pháp đơn biến 14

2.3.2 Mô hình bề mặt (RSM) tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp HL1 15

2.4 Tổng hợp phức chất đồng, kẽm, cadmi 17

2.4.1 Tổng hợp phức chất CuL1 17

2.4.2 Tổng hợp phức chất ZnL1 18

2.4.3 Tổng hợp phức chất CdL1 18

2.5 Phương pháp nghiên cứu 19

2.5.1 Quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao 19

2.5.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần và cấu trúc của phối tử và phức chất 19

2.5.3.2 Phổ hấp thu hồng ngoại FT- IR 19

2.5.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13 C-NMR 1D và 2D 19

2.5.3.4 Phổ khối lượng ESI MS 19

2.5.4 Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Đánh giá các mức của khảo sát đơn biến 21

3.2 Thiết lập phương trình hồi quy 23

3.3 Phân tích kết quả phổ của HL1 28

3.4.2 Xác định điều kiện tổng hợp phức chất 31

3.4.3 Phân tích kết quả các phổ của phức CuL1, CdL1, ZnL1 32

3.5 Phân tích kết quả phổ UV-Vis 44

3.6 Khảo sát hoạt tính sinh học 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

MỞ ĐẦU

Ung thư là căn bệnh thế kỉ khi phương thuốc chữa bệnh hiệu quả rất hiếm Trên thế giới đã có nhiều nhà nghiên cứu khoa học đã tìm ra loại hóa dược hiệu quả nhất trong việc ngăn chặn và tiêu diệt tế bào ung thư

Cisplatin là hợp chất đầu tiên được sử dụng để điều trị trong các bệnh viện,

tuy nhiên cisplatin có ái lực rất lớn với các protein có chứa các ion sulfide gây vô hiệu hóa các enzyme thiết yếu trong tế bào của cơ thể Để cải thiện những bất cập của

cisplatin, thiosemicarbazone (TSCs) và các phức của TSCs (M-TSCs) đã được nghiên

cứu về cơ chế cũng như khả năng ngăn chặn, tiêu diệt các tế bào ung thư Khi TSCs và M-TSCs được tiêm vào người bệnh, các phân tử này hoạt động như các chất ức chế, có thể tạo liên kết với DNA của tế bào ung thư bằng hệ thống liên hợp NNS, ngăn chặn sự phiên mã và dịch mã của DNA tế bào ung thư Nhiều báo cáo chỉ ra rằng thiosemicarbazone thế ở N(4) có thể khuếch tán dễ dàng qua màng tế bào

Salicylaldehyde-N(4)-nhóm thế thiosemicarbazone và phức chất của chúng với các ion kim loại được quan tâm rất nhiều so với các hợp chất dẫn xuất của thiourea

vì chúng thể hiện các hoạt tính sinh học ưu việt như kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng nấm và có tiềm năng kháng ung thư, chính hoạt tính sinh học đa dạng của chúng đã thu hút nhiều nghiên cứu hiện nay

Trong xu hướng đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu tổng hợp, xác định cấu trúc và thăm dò hoạt tính ức chế tế bào ung thư của một số phức ion kim loại chuyển tiếp với salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone

với mong muốn có được các chất có hoạt tính sinh học tốt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu cấu trúc thiosemicarbazone (TSC) và phức chất của thiosemicarbazone (M-TSC)

1.1.1 Cấu tạo chung TSC

Thiosemicarbazone là dẫn xuất của thiourea, được tạo thành khi ngưng tự thiosemicarbazide hay dẫn xuất thế N(4)-aminylthiosemicarbazide với aldehyde hoặc ketone thích hợp Theo IUPAC, tên của dẫn xuất thế N(4) thiosemicarbazone được thành lập bằng cách thêm “thiosemicarbazone” vào sau tên của aldehyde hay ketone tham gia ngưng tụ và cách đánh số khung thiosemicarbazone cũng tuân theo hệ thống đánh số quy ước cho hợp chất này Thiosemicarbazone có công thức cấu tạo (I), và khi ở N(4) xuất hiện nhóm thế thì nó lại có cấu tạo (II) [1]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của thiosemicarbazone

Trong đó R1, R2, R3, R4 có thể là H, ankyl, aryl, hay hệ thống vòng …

+ Dạng đồng phân E và Z:

Sự hiện diện của C=N, làm cho thiosemicarbazone tồn tại hai dạng đồng phân hình học E và Z Xét tính ổn định nhiệt động lực học, dạng đồng phân E sẽ chiếm ưu thế trong hỗn hợp Cấu trúc xương sống của C=N-NH-CS-N thường đồng phẳng với

nguyên tử S nằm ở vị trí trans của azomethine

+ Dạng đồng phân thione-thiol:

Sự có mặt của NH-C=S trong thiosemicarbazone có thể tạo ra hai dạng đồng phân thione-thiol trong hỗn hợp Trong dung dịch thiosemicarbazone tồn tại như một hỗn hợp cân bằng của thione (III) và thiol (IV) [1]

Hình 1.2 Cân bằng giữa hai dạng thione và thiol trong dung dịch

Quá trình thiol hóa xảy ra là do hiệu ứng cộng hưởng trải dài trên khung sườn thiosemicacbazone làm cho electron bất định xứ được giải tỏa mạnh trên toàn bộ hệ liên hợp Mặc dù dạng thione chiếm ưu thế hơn khi tồn tại trạng thái rắn ,tuy nhiên trong dung dịch thì vẫn có thể tồn đồng thời cả hai dạng thione và thiol [1]

Cân bằng thione-thiol có thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quá trình tổng hợp thiosemicarbazone như pH của môi trường, dung môi [1].Những dung môi có tính phân cực khác nhau cũng ảnh hưởng nhiều đến khả năng tự động chuyển dịch của thione –thiol trong hỗn hợp [2]-[5].Nhìn chung dung môi có tính phân cực càng cao, thì khả năng chuyển dạng cân bằng sang thione sẽ chiếm ưu thế [6]

Hình 1.3 Cấu trúc tổng quát sự chuyển dịch cân bằng thione – thiol của

thiosemicarbazone

1.1.2 Cấu tạo chung của phức M-TSC

Trong bộ khung của thiosemicarbazone chứa 2 nguyên tử nitrogen và một nguyên tử sunlfur là những nguyên tử còn cặp electron tự do có khả năng tham gia phối trí với ion kim loại Với dung lượng phối trí là 2, thiosemicarbazone đóng vai trò như một phối tử vòng càng Nguyên tử N(1) của nhóm azomethine và S của thione hay thiol tham gia tạo phức vòng càng, thường xảy ra khi phối tử này tạo thành anion bằng cách giải phóng proton của nhóm NH(2) nhờ quá trình tautomer hóa Quá trình này tiêu tốn nhiều năng lượng, song nó được bù đắp bởi sự hình thành thêm một liên kết và hiệu ứng chelate Hiệu ứng đóng vòng này giúp hệ liên hợp trải dài hơn, kết quả làm bền hóa phức tạo thành Do đó, trong cầu phối trí của ion kim loại chuyển tiếp, thường có sự phối trí

cơ bản sau:

Hình 1.4 Cách phối trí thông thường của thiosemicarbazone [1]

Trong dung dịch thiosemicarbazones có thể tồn tại dưới dạng hỗn hợp cân bằng tautomer thione (I) và thiol (II) Dạng thione khi phối trí với ion kim loại tạo phức có dạng (III)

và thiol có dạng (IV) [1]

Hình 1.5 Dạng phối trí khi tạo phức của hỗn hợp cân bằng thione và thiol trong

dung dịch [1]

Do đó phụ thuộc vào điều kiện phản ứng (đặc biệt là pH), phức chất tạo thành có thể là cation, trung tính hoặc anion Tuy nhiên, các báo cáo về phức chất của ion kim loại với thiosemicarbazone có thể tồn tại chủ yếu tồn tại ở dạng thione (III), trong khi

dữ liệu xác định về phức chất có chứa thiosemicarbazone ở dạng thiol còn thiếu, chưa

có nhiều nghiên cứu rõ rệt

Ngoài ra, trong quá trình tạo phức thiosemicarbazone cũng có thể chỉ phối trí với ion kim loại ở vị trí N(1) [7]

Hình 1.6 Ion kim loại phối trí với thiosemicarbazone ở N(1)

Thiosemicarbazone cũng có khả năng phối trí đồng thời tại hai vị trí N(2) và S tạo vòng bốn cạnh, tuy nhiên trường hợp này rất ít và không phổ biến, khi aldehyde hay ketone ở vị trí N(1) càng cồng kềnh thì khả năng tạo vòng bốn chiếm ưu thế hơn vòng năm.[8]

Hình 1.7 Kiểu phối trí chelate vòng bốn cạnh

Tuy nhiên, dung lượng phối trí của thiosemicarbazone cũng có thể tăng lên khi trên R1 và R2 có các nhóm thể chứa nguyên tử có khả năng cho electron (hình 1.9) Thường xảy ra với nhóm thế -OH, những dị vòng nitrogen

Hình 1.8 Khả năng phối trí khi có mặt dị tố O (a) và N (b)

Hình 1.9 Dung lượng phối trí 3 của thiosemicarbazone

1.2 Một số ứng dụng của TSC và phức chất của TSC với ion kim loại

Hiện nay thiosemicarbazone đang nhận được nhiều sự chú ý một cách rộng rãi bởi khả năng kháng thể của nó, chống độc tố, kháng khuẩn hoặc kháng virus Đặc biệt rất quan tâm đến sự tương tác của nó với các ion kim loại khi xét đến hoạt tính của thiosemicarbazone [8]

1.2.1 Các ứng dụng phổ biến

• Trong lĩnh vực hóa phân tích

Thiosemicarbazone có khả năng tạo phức màu với các ion kim loại, nên được ứng dụng trong việc xác định vết các kim loại trong các mẫu sinh học và dược phẩm, trong khai thác kim loại, ức chế ăn mòn, [9]

Trong ngành dược phẩm, khi tách các ion Cu (Il), Co (II) và Fe (ll) trong dược phẩm có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký cột và dung môi giải ly với 2-acetylpyridine-4-phenyl-3-thiosemicarbazone để tạo thành phức chất như thuốc thử [10]

Ngoài ra một số dẫn xuất của thiosemicarbbazone như 2-acetylpyridine-4-phenyl thiosemicarbazone, 2-acetylpyridin-4-phenylisoetyl thiosemicarbazone được dùng để

ức chế quá trình ăn mòn của nhôm trong dung dịch HCl [11]

• Hoạt tính kháng động vật đơn bào

Ở châu Phi và Mỹ Latin, những loại bệnh về nhiễm trùng đe dọa một cách nghiệm trọng đến sức khỏe của con người như bệnh kí sinh trùng đơn bào do trùng roi (trypanosomiasis) và trùng sốt rét (malaria) vốn là vấn đề cần giải quyết hàng đầu của ngành y tế

Đối với bệnh kí trùng đơn bào do trùng roi, những loại thuốc có sẵn, không thật

sự hiệu quả Thuốc có hiệu quả tốt mà được sử dụng phổ biến là nifurtimox Trong những

dẫn xuất đầy hứa hẹn được phát triển, các nhóm nghiên cứu tìm thấy thiosemicarbazone, đặc biệt là dẫn xuất chứa nitro (NO2), và phức kim loại của chúng

Kang và cộng sự đã đánh giá một loạt các isatin-β-thiosemicarbazone cho hoạt

động chống Herpes simplex virus loại 1 (HSV-1) và loại 2 (HSV-2) Họ đã kết luận rằng

nhóm thiourea trong thiosemicarbazone và nhóm NH trong isatin có tính quyết định cho hoạt động chống virus của nó [12]

Họ đã kết luận rằng nhóm thiourea trong thiosemicarbazone và nhóm NH trong isatin có tính quyết định cho hoạt động chống virus của nó Karakucuk-iyidogan và cộng

sự [13] đã tổng hợp các phức Pd(II) và Pt(II) của thiophene-2-carboxaldehydes thiosemicarbazone và thử nghiệm hoạt động chống virus của chúng

Shebl và cộng sự (2010) nghiên cứu các hoạt tính kháng khuẩn của thiosemicarbazone, semicarbazone của các phối tử thiocarbohydrazone có nguồn gốc từ

4,6-diacetylresorcinol và phức chất kim loại của chúng chống lại vi khuẩn Rhizobium

[14]

1.2.2 Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư

a Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính sinh học

Thiosemicarbazone có khả năng ức chế tế bào ung thư trong cơ thể người theo

cơ chế: liên kết với các nucleotide thông qua hệ liên hợp N-N-CS, ngăn chặn quá trình dịch mã và tổ hợp DNA của tế bào ung thư [15]-[17]

Altun và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp Electron-Topological Method (ETM) để tìm ra đặc điểm quy định độc tính trong cấu trúc của thiosenicarbazone trên dòng HSV-1 Tác giả cho rằng độc tính của thiosemicarbazone chủ yếu nằm trên nhóm C=N(1) quy định khả năng gây độc tế bào Khi nhóm C=N(1) bị khử thành CH-N(1)H

thì hoạt tính hoàn toàn không còn

b Đặc điểm nhóm thế N(4) với các dòng tế bào u

Năm 2012 nhóm tác giả Amoussatou Sakirigui và cộng sự đã kết hợp citral có trong tinh dầu của loài cymbopogoncitratusis với thiosemicarbazide Trong số 5 chất được khảo sát, so với 4 hợp chất còn lại không có nhóm thế hay nhóm thế nhỏ ở N(4) thì chỉ có citral 4-phenyl-3-thiosemicarbazone có hoạt tính đáng kể nhất (IC50= 1,96

μM) Đây còn là bằng chứng cho thấy sự ảnh hưởng quan trọng của nhóm thế N(4) đối với khả năng hoạt động của thiosemicarbazone [18]

Nhóm N(4)-aminyl càng kém ưa nước thì độc tính càng cao Theo Jonathan R [19] và cộng sự, hoạt tính của thiosemicarbazone phụ thuộc chủ yếu vào tính “ưa lipit” (lipophilicity) hay còn gọi tính kị nước vì thuốc di chuyển qua màng sinh học theo cơ chế thụ động Theo nghiên cứu của Houssou [20] năm 2012, khi sử dụng các dẫn xuất

thiosemicarbazone để kháng lại dòng tế bào trypanosoma brucei Hoạt tính tăng lên khi

di chuyển nguyên tử halogen (Cl hoặc Br) từ vị trí ortho đến vị trí para của vòng benzene của acetophenone-thiosemicarbazone Qua đó cho thấy sự có mặt của các nhóm thế kị

nước ở vị trí para là có lợi cho hoạt tính này Việc thay thế nhóm metyl của

acetophenone-thiosemicarbazone bằng hydro đã làm giảm hoạt tính Khi vòng phenyl của acetophenone-thiosemicarbazone được thay thế bằng naphthyl, thì hoạt tính sẽ tăng lên đáng kể Theo [21], các thiosemicabazone chứa hợp phần quinoline có tính kị nước thấp hơn các hợp phần là các dẫn xuất của benzene Có thể sắp xếp tính kị nước của N(4)-aminyl theo thứ tự tăng dần theo hoạt tính: 2H<CH3<H, CH3<H, C2H5<H, C6H5

Năm 2010, nhóm tác giả [22] đã công bố một loạt dẫn xuất benzoyl thiosemicarbazone của isoquinoline và pyridine có khả năng chống một số dòng tế bào ung thư như HuCCA-1, HepG2, A549 và MOLT-3

Hình 1.10 Một số thiosemicarbazone chứa isoquinoline và pyridine

Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho rằng hợp chất 4 khi gắn nhóm thế phenyl vào N(4) hoạt động nhất với chỉ số IC50 = 0,004 μg/ml, nhạy gấp hàng ngàn lần so với N(3), cao hơn nhiều so với 1 và 2 Nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng hiệu ứng không gian của nhóm phenyl kị nước đóng góp quan trọng trong việc thay đổi hoạt tính của

loại hợp chất hữu cơ này Mặt khác, theo [1] các dẫn xuất của thiosemicarbazone được

tổng hợp từ quionline có khả năng chống lại dòng tế bào ung thư HCT116

Hình 1.11 Một số thiosemicarbazone chứa dẫn xuất của quinoline

Khi nhóm thế ở vị trí N (4) ở thiosemicarbazone là aldehyde hay ketone có chứa nhân thơm thì hoạt tính sinh học cao Nhóm thế càng cồng kềnh, chứa nhiều dị tố sẽ làm tăng hoạt tính sinh học của thiosemicarbazone [1],[23]

1.3 Định hướng nghiên cứu về phức chất của thiosemicarbazone hiện nay

Với mong muốn tạo ra những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao, người

ta có xu hướng sẽ chọn thiosemicarbazone có hợp phần dị vòng chứa N, do theo các tài liệu thì sự có mặt của hợp phần dị vòng có khả năng làm tăng hoạt tính của thiosemicarbazone Mặc khác cũng mong muốn tạo ra phức chất có cấu trúc bất đối xứng để cải thiện khả năng hòa tan của chúng Do đó chúng tôi chọn hợp phần morpholine với những tiêu chí phù hợp Hơn nữa, các nhà nghiên cứu trên thế giới cũng rất quan tâm đến morpholine, là một amin chứa cả nhóm amin và ete và thích hợp cho khai thác, chưng cất và dung môi cho ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa dầu [24] Các chất dẫn xuất morpholine được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ để sản xuất hoá chất nông nghiệp, thuốc diệt nấm và chất diệt khuẩn Nhiều hợp chất thuộc nhóm này được cho là có khả năng chống viêm, giảm đau, gây tê cục bộ, chống HIV, chống ung thư, chống trầm cảm, kháng nấm và kháng khuẩn [25]

Đối với hoạt tính kháng ung thư, Bacher và cộng sự năm 2015 [26], đã công bố phức chất Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone Kết quả cho thấy phức Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone có khả năng tan trong nước, trong khi phức Cu(II) của hợp phần piperazine- thiosemicarbazone không hòa tan trong nước được

Đó là điểm thú vị của phức Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone, cho phép kiểm tra độc tính hai dòng tế bào ung thư HeLa và A549 với giá trị IC50 từ

25,5- 65,1 μM sau 48 giờ thử nghiệm, đồng thời khi so sánh với phối tử tự do, phức chất

có hoạt tính tốt hơn.Năm 2016, nhóm tác giả người Trung Quốc, nghiên cứu một loạt các hợp chất thiosemicarbazone với hợp phần morpholine, piperazine hayN-(4-methoxyphenyl)piperazine với bảy dẫn xuất methyl hydrazin-carbodithioate của 5-acetyl-2-arylamino-4-methylthiazoles dưới bức xạ vi sóng Tất cả các hợp chất đã

được kiểm tra về hoạt động gây độc tế bào của chúng trong ống nghiệm (in vitro) đối

với tế bào ung thư dạ dày, phổi và ung thư vú ở người

Khi so sánh tính gây độc của tất cả các hợp chất trên, tác giả đã nhận thấy hợp phần morpholine có hoạt tính khá tốt, tùy thuộc vào các nhóm thế khác nhau Đặc biệt với nhóm thế cloro, hoạt động kháng ung thư cao nhất với các tế bào MCF-7 với IC50

có giá trị là 5,49 μM, tương đương với cisplatin (6,53 μM) [27]

Do đặc tính tan tốt trong nước của morpholine, mà morpholinylthiosemicarbazone (SMT) của chúng tôi hiện vẫn còn là đối tượng mới chưa được tổng hợp, nghiên cứu cấu trúc Điều đó có nghĩa là phức chất Cu(II), Zn(II),Cd(II) của SMT đều là những phức chất mới cần được nghiên cứu và thăm dò hoạt tính sơ bộ trước khi đưa vào ứng dụng trong ngành y tế

Salicylaldehyde-N(4)-Kết luận: Ở bài nghiên cứu này, Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone

(HL1) và các phức của HL1 được điều chế và dự đoán cấu trúc bằng phổ IR, UV-Vis,

MS, NMR, 1D và 2D Trong lần nghiên cứu này một loạt thí nghiệm được thực hiện để khảo sát từng yếu tố tác động lên hiệu suất tổng hợp HL1 Hơn thế nữa, mô hình Box-Hunter được áp dụng nhằm để xác định điểm tối ưu, giảm bớt đi số thí nghiệm cần phải thực hiện cũng như cải thiện những mặt hạn chế của phương pháp đơn biến mang lại Ngoài ra, HL1 và các phức của HL1 được khảo sát khả năng ức chế 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi)

1.4 Mục tiêu nghiên cứu

Với tất cả những kiến thức mà chúng tôi đã nghiên cứu và trình bày, trong nghiên cứu của đề tài này, chúng tôi tập trung vào các mục tiêu sau:

- Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất và dụng cụ

- Carbon disulfide CS2 (d = 1,26 g/ml) (độ

tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc)

- Bình cầu chịu nhiệt 100 ml, 500 ml,

1000 ml

- Ammonia NH3 (độ tinh khiết 99,5 %,

Xilong, Trung Quốc)

- Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, 500 ml,

1000 ml

- Erlen bình tam giác

- Morpholine C4H9NO (độ tinh khiết 98 %,

Merck, Đức)

- Ống đong 25 ml

- Sodium chloroacetate ClCH2COONa (độ

tinh khiết 98 %, Aldrich- Sigma, Mỹ)

- Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml

- Ethanol C2H5OH (độ tinh khiết 99,5 %,

Xilong, Trung Quốc)

- Nhiệt kế thủy ngân

- Hydrochloride HCl đặc (độ tinh khiết 99,5

%, Xilong, Trung Quốc)

- Đũa thủy tinh

- Acid acetic CH 3 COOH (độ tinh khiết

99%, Xilong, Trung Quốc)

- Bếp điện

- Copper (II) nitrate tryhydrate Cu(NO3)2

3H2O (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung

Quốc)

- Máy khuấy từ, cá từ

- Zinc (II) nitrate hexahydrate Zn(NO3)2

6H2O (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung

Quốc)

- Hệ thống lọc chân không

- Cadmium (II) nitrate tetrahydrate

Cd(NO3)2 4H2O (độ tinh khiết 99,5%,

Xilong, Trung Quốc)

- Hệ thống sinh hàn ngược

2.2 Tổng hợp hỗn hợp Salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT ( HL1)

2.2.1 Quy trình tổng hợp SMT

Sơ đồ tổng hợp SMT qua 3 giai đoạn như sau:

Giai đoạn 1: Tổng hợp Carboxymethyl-N(4)-morpholinyldithiocarbamate (CMT)

Cho vào cốc 12ml CS2 (0,2 mol) và 24 ml NH3 25% được khuấy đều trên máy khuấy từ ở 0-10oC Cho từ từ 0,2 mol morpholine (17,5 ml) vào hỗn hợp trên thật chậm từng giọt

Sau 30 phút, khi chất rắn màu vàng tách ra khỏi dung dịch, hỗn hợp được tiếp tục khuấy liên tục ở 0-100C trong 90 phút nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn Lọc nhanh thu được kết tủa vàng, hòa tan kết tủa vàng trong 300 ml nước cất, khuấy trên máy khuấy từ Sau

đó, nhỏ từ từ dung dịch chứa 23,3 g ClCH2COONa đến hết Dung dịch màu vàng nhanh chóng nhạt màu và tiếp tục được khuấy đều trong 5-6 giờ Cho khoảng 10 ml HCl 36% vào dung dịch không màu trên tạo ngay kết tủa trắng.Lọc lấy kết tủa trắng, dịch lọc tiếp tục được axit hóa từ từ cho đến khi không còn xuất hiện kết tủa trắng thì dừng.Sản phẩm được kết tinh lại trong ethanol, lọc lấy kết tủa hình kim bằng phểu lớn, cho vào cốc để khô tự nhiên Hiệu suất phản ứng đạt 82%

Giai đoạn 2: Tổng hợp N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT)

Cân 22,1 g sản phẩm giai đoạn 1 hòa vào 10 ml nước cất và 25 ml N2H4.H2O cho vào bình cầu Đun cách thủy ở 80oC khoảng 15 phút kết tủa tan tạo dung dịch đồng nhất

và chuyển sang màu tím, xuất hiện kết tủa màu trắng, tiếp tục đun cách thủy thêm 45 phút nữa.Kết tinh lại sản phẩm bằng ethanol, hiệu suất phản ứng đạt 65%

Giai đoạn 3 : Quy hoạch thực nghiệm

Tổng hợp Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT (HL1)

bằng cách ngưng tụ Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol Đun hồi lưu hỗn hợp gồm m(g) MT trong ethanol và 3 giọt acid acetic băng (hỗn hợp 1) Nhỏ từ từ V(ml) Salicylaldehyde vào hỗn hợp 1 ở nhiệt độ ToC Sau đó, kết tủa màu vàng SMT (HL1) bắt đều xuất hiện.Các giá trị m, V,

và T được khảo sát như mục 2.3

2.3 Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp SMT

2.3.1 Xác định các mức cơ sở bằng phương pháp đơn biến

- Sự ảnh hưởng của xúc tác acid đến hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun

hồi lưu trong ethanol ở 900C trong vòng 2 giờ với các xúc tác acid HCl đặc, H2SO4 đặc, HNO3 đặc, CH3COOH đặc

- Sự ảnh hưởng của yếu tố tỉ lệ mol SA : MT (T) lên hiệu suất: hỗn hợp SA với MT

với T lần lượt là 0,8; 1,0; 1,2 và 1,5 được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C trong vòng

2 giờ với xúc tác CH3COOH đặc

- Sự ảnh hưởng của nhiệt độ nước cách thủy (T) lên hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol

MT được đun hồi lưu trong ethanol lần lượt ở 60; 70; 80 và 900C trong vòng 2 giờ với xúc tác CH3COOH đặc

- Sự ảnh hưởng của yếu tố thời gian lên hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được

đun hồi lưu trong ethanol ở 900C ở trong vòng 30, 60, 90, 120, 150 phút với xúc tác

CH3COOH đặc

2.3.2 Mô hình bề mặt (RSM) tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp HL1

Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT (HL1) được tổng hợp bằng cách ngưng tụ Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol, có mặt của xúc tác acid acetic băng, chúng tôi đã chọn phương án trực giao cấp 1 và cấp 2 để mô tả bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của hai biến : tỉ lệ mol tác chất và thời gian phản ứng, vì theo khảo sát theo sự ảnh hưởng theo nhiệt

độ thì ở nhiệt độ 900C đã cho hiệu suất tương đối cao, ổn định và là nhiệt độ tối đa của phản ứng, nên ta bỏ qua việc tối ưu hóa nhiệt độ

Mô hình trực giao cấp 1

Gọi tỉ lệ mol SAL : MT và thời gian phản ứng lần lượt là x1 và x2

Bảng 2.1 trình bày các mức khảo sát của từng biến

Bảng 2.2 trình bày các thí nghiệm cần tiến hành N = 22 = 4 thí nghiệm theo mô hình trực giao cấp 1

Dựa trên kết quả khảo sát đơn biến, các mức của yếu tố ảnh hưởng được xác định

và trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng

Mức dưới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên +1

Bảng 2.2 Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1

Vậy tổng số thí nghiệm trong phương án là N = 2k + 2.k + N0 =13

Ma trận thực nghiệm cấp 2 được xây dựng theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao

Tìm điều kiện tối ưu nhất để tổng hợp Salicylaldehyde-N(4)–morpholinyl

2.5.3.2 Phổ hấp thu hồng ngoại FT- IR

Phân tích thành phần nhóm chức và sự biến đổi dao động của các nhóm chức đặc trưng trong cấu trúc của phối tử và phức chất tại Viện Công nghệ Hóa học Thành phố Hồ Chí Minh

2.5.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13 C-NMR 1D và 2D

Thành phẩn và cấu trúc phân tử phối tử và phức chất được xác nhận qua thông tin từ các phổ cộng hưởng từ một chiều 1H, 13C-NMR, và hai chiều COSY, HSQC, HMBC được ghi trên máy Brucker 500 MHz (trong DMSO) và HRMS trên máy FT-ICR-MS, Varian 910 tại phòng NMR, viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội

2.5.3.4 Phổ khối lượng ESI MS

Phổ khối lượng của phối tử và phức chất được xác định trên máy 1100-Series Trap- SL trong dung môi methanol, bằng phương pháp ion hóa bởi dòng phun ESI, viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội

LC-MSD-2.5.4 Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

Thử khả năng ức chế tề bào u của phối tử và phức chất tại phòng sinh học thực nghiệm Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên -Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam

Hà Nội trên hai dòng tế bào Hep-G2, A549

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đánh giá các mức của khảo sát đơn biến

Các kết quả của khảo sát từng yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây

a) Sự ảnh hưởng của xúc tác acid

Điều kiện phản ứng: tỷ lệ mol 1:1, nhiệt độ 900C, thời gian 2 giờ

Xúc tác Acid

HCl đặc H2SO4 đặc HNO3 đặc CH3COOH

đặc

Không xúc tác Hiệu suất %

là các acid mạnh nên ngoài việc proton hóa nguyên tử O của phân tử SA, còn proton hóa nguyên tử N của TM, dẫn đến làm giảm tính nucleophile của nhóm chức amine

Chính vì thế, CH 3 COOH đặc được chọn làm xúc tác acid cho các thí nghiệm sau

b) Sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol T = 𝒔ố 𝒎𝒐𝒍 𝑺𝑨𝑳

𝒔ố 𝒎𝒐𝒍 𝑴𝑻 đ ến hiệu suất

Hình 3.1 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào yếu tố tỉ lệ mol T

Dựa trên kết quả thu được từ hình 3.1 điểm cực đại của T=0,8, phản ứng đạt hiệu

suất cao nhất, nên ta chọn tỷ lệ 0.8:1 thực hiện phản ứng khảo sát tiếp theo

c) Sự ảnh hưởng của nhiệt độ nước cách thủy

Với tỉ lệ mol T = 0.8:1, xúc tác acid CH 3 COOH đặc, ta thấy ở 900C phản ứng đạt hiệu suất cao nhất

Hình 3.2 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào nhiệt độ nước cách thủy

d) Sự ảnh hưởng của thời gian

Với tỉ lệ mol T = 0.8:1 , ở 90 0 C , và với xúc tác acid CH 3 COOH đặc, ta thấy

ứng với thời gian t =120 phút phản ứng đạt hiệu suất cao nhất

Hình 3.3 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian

Dựa trên kết quả thu được từ bảng 3.1 và hình 3, hình 4, hình 5 Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol, có mặt của xúc tác acid acetic băng, chúng tôi đã chọn phương án trực giao cấp 1 và cấp 2 để

mô tả bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của hai biến : tỉ lệ mol tác chất và thời gian phản ứng, vì theo khảo sát theo sự ảnh hưởng theo nhiệt độ thì ở nhiệt độ 900C đã cho hiệu suất tương đối cao, ổn định và là nhiệt độ tối đa của phản ứng, nên ta bỏ qua việc tối ưu hóa nhiệt độ

3.2 Thiết lập phương trình hồi quy

Với số liệu thu được, chúng tôi tiến hành xử lý theo phương án trực giao cấp 1

Phương trình hồi quy theo toán học có dạng: y = b0+ b x1 1+ b x2 2+ b x x12 1 2

Các hệ số hồi quy bj được tính theo công thức:

t 0

là số thí nghiệm lặp ở tâm Thay vào được kết quả S = 1,335 2th

Hệ số b trong phương trình hồi quy cấp 1 độc lập nhau và xác định với độ chính xác (Sbj)

Ý nghĩa của các hệ số b được kiểm định theo chuẩn Student (t) xác định như sau:

Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm:

Phương sai dư tính theo công thức

N

2

tt lt

2 i 1 du

SFS

= = 0 Tra bảng phân vị phân bố Fisher với p = 0,05; f1 = N-L = 3; f2 = m – 1 = 2 thấy rằng F <

F0,05(3,2) = 19,2

Mô hình quy hoạch cấp 1 không phù hợp với thực nghiệm nên ta tiếp tục làm thêm các

thí nghiệm theo ma trận kế hoạch thực nghiệm cấp 2 Phương pháp quy hoạch cấp

2 đã xây dựng kế hoạch thí nghiệm và xử lý số liệu dựa trên một số tiêu chí giống quy hoạch cấp 1, nhưng là mô hình hồi quy dạng đa thức bậc 2 đầy đủ mô tả sự phụ thuộc của hàm y vào các thông số ảnh hưởng x 1 , x 2 , x 12

Phương trình hồi quy: 𝑦̂ = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + b11x1 + b22x2