Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Phân Đoạn Cao Ethyl Acetate EA4 Của Cây Ruột Gà Dạng Hóng

Thành phần hóa học các loài trong chi Spermacoce 3 2 Bảng 2.1.. Quy trình điều chế các cao phân đoạn và cô lập các hợp chất trên cao ethyl acetate của cây Ruột gà dạng hóng Spermacoce

và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện khoá luận Cám ơn cô đã chỉ dạy

em khi em mới chập chững bước vào làm đề tài tốt nghiệp và động viên em những lúc khó khăn

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Hoá, khoa Hoá trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM đã giảng dạy và truyền thụ kiến thức nền tảng để em có thể vận dụng để góp phần hoàn thiện khóa luận này

Bên cạnh em xin cảm ơn các anh, chị trong phòng thí nghiệm hóa học hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ em những lúc khó khăn, cùng những người bạn luôn bên cạnh động viên, chia sẻ niềm vui, nỗi buồn và cho em nghị lực để hoàn thành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Tp.HCM, tháng 4, năm 2019 Bùi Thiện Quang

COSY Tương quan H-H (COrrelation SpectroscopY)

dd Mũi đôi-đôi (doublet of doublet)

EA

H

Ethyl Acetate

Hexane HMBC Tương quan H-C qua nhiều nối (Heteronuclear Multiple Bond

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

ppm Phần triệu (part per million)

1D/2D-NMR 1 chiều/ 2 chiều-phổ Cộng hưởng từ hạt nhân (One/ Two

Dimensional-Nuclear Magnetic Resonance)

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1 Thành phần hóa học các loài trong chi Spermacoce 3

2 Bảng 2.1 Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate 17

3 Bảng 2.2 Kết quả sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 18

4 Bảng 2.3 Kết quả sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 19

1 Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các cao phân đoạn và cô

lập các hợp chất trên cao ethyl acetate của cây Ruột gà

dạng hóng Spermacoce ocymoides Burm.f

16

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất Q1

Phụ lục 1.1 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 1.2 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 1.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất Q1

Phụ lục 2.1 Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 2.2 Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất Q1

Phụ lục 3 Phổ COSY của hợp chất Q1

Phụ lục 3.1 Phổ COSY giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 4 Phổ HSQC của hợp chất Q1

Phụ lục 4.1 Phổ HSQC giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 5 Phổ HMBC của hợp chất Q1

Phụ lục 5.1 Phổ HMBC giãn rộng của hợp chất Q1

Phụ lục 6 Phổ 1H-NMR của hợp chất Q2

Phụ lục 6.1 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất Q2

Phụ lục 6.2 Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất Q2 Phụ lục 7 Phổ 13C-NMR của hợp chất Q2

Phụ lục 7.1 Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất Q2 Phụ lục 7.2 Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất Q2

Phụ lục 8 Phổ COSY của hợp chất Q2

Phụ lục 8.1 Phổ COSY giãn rộng của hợp chất Q2

MỤC LỤC  

LỜI CẢM ƠN i 

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT ii 

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii 

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv 

DANH MỤC SƠ ĐỒ iv 

DANH MỤC PHỤ LỤC v 

MỤC LỤC vii 

MỞ ĐẦU ix 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1 

1.1 Mô tả thực vật 1 

1.2 Các nghiên cứu dược tính 2 

1.2.1.Tác dụng bảo vệ dạ dày 2 

1.2.2.Tác dụng kháng viêm 2 

1.2.3.Tác dụng kháng ký sinh trùng và chống oxi hóa 2 

1.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học 3 

B capitata 3 

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 13 

2.1 Hóa chất, thiết bị 13 

2.1.1 Hóa chất 13 

2.1.2 Thiết bị 13 

2.1.3 Phương pháp tiến hành 14 

2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 14 

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 14 

2.2 Thu hái và xử lý mẫu 14 

2.3 Điều chế các loại cao 14 

2.4 Phân lập một số chất hữu cơ trong cao ethyl acetate 15 

2.4.1 Phân lập hợp chất hữu cơ ở phân đoạn EA4 16 

2.4.2 Phân lập hợp chất hữu cơ ở phân đoạn EA4.3 17 

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 

3.1 Khảo sát cấu trúc hợp chất Q1 19 

3.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất Q2 23 

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28 

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined. 

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, mức sống con người ngày một nâng cao nên nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người đang là một trong những việc quan trọng hàng đầu Để đáp ứng nhu cầu đó, việc nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây cỏ đã và đang là vấn đề quan tâm của toàn xã hội Trên tinh thần đó, nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định thành phần hóa học và cô lập được nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, chống ung thư…góp phần vào sự phát triển của nền y học

Chi Spermacoce (thuộc họ Rubiaceae) có khoảng 280 loài phân bố ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Âu [1,2] Một số loài của các chi này có vai trò quan trọng trong y học cổ truyền dùng để điều trị sốt rét, tiêu chảy, các vấn đề tiêu hóa, bệnh ngoài da, sốt xuất huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu và đường hô hấp, đau đầu, viêm mắt và nướu răng,…[2]

Cây Ruột gà dạng hóng (Spermacoce ocymoides) là cây thuộc chi Spermacoce xuất hiện ở nhiều tỉnh của nước ta: Thừa Thiên-Huế, Đà Nẵng

(Tourane), Kon Tum (Đác Glây, Đác Món; Kong Plóng, Tân Lập), Lâm Đồng (Đức Trọng, Bảo Lộc), Đồng Nai (Biên Hòa), Bà Rịa-Vũng Tàu (Núi Dinh) Theo

y học cổ truyển, cây Ruột gà dạng hóng được sử dụng chữa đau đầu, nấm da, eczecma, vét loét, hắc lào, Tuy nhiên các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Ruột gà dạng hóng còn rất ít Chính vì vậy mà cây Ruột gà dạng

hóng được chọn trong đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn cao ethyl acetate EA4 của cây Ruột gà dạng hóng” với mong muốn làm rõ thêm

thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật

Tên khoa học Spermacoce ocymoides Burm.f

Thuộc họ: Cà phê (Rubiaceae), chi: Spermacoce

Spermacoce ocymoides Burm.f được phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Phi và châu Á [2] Ở Việt Nam cây phân bố ở Thừa Thiên-Huế, Đà Nẵng, Kon Tum (Đác Glây, Đác Món, Kong Plóng, Tân Lập), Lâm Đồng (Đức Trọng, Bảo Lộc), Đồng Nai (Biên Hòa), Bà Rịa-Vũng Tàu (Núi Dinh)

Cây còn có tên khác là Borreria ocymoides (Burm.f.) DC [1]

Ở Việt Nam cây được biết đến dưới tên gọi Ruột gà dạng hóng

Cây Ruột gà là một loại thảo mộc hàng năm, thân cây dựng lên hiếm khi nằm sát mặt đất Cây tương đối dễ dàng để phân biệt với các loài khác với lá hình elip rộng, không có lông hoặc với lông rải rác trên mạch dưới lá và lề Cây thường ra hoa từ tháng 3-8 hàng năm Cây thường được tìm thấy ở các đồng bằng, đất dọc theo đường, sườn đồi và ngoại vi rừng của các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới như: Châu Phi nhiệt đới, Mauritius, Ấn Độ, Myanmar, Java, bán đảo Malaysia và Philippines [2]

Cây Ruột gà dạng hóng có thân mọc sát mặt đất Lá nhỏ, với chiều dài khoảng 3 cm, chiều rộng từ 5 đếm 12 mm Quả dạng quả nang, mọc từ đài hoa có

4 thuỳ, luôn luôn nằm ở đỉnh Hoa có màu trắng, kết thành cụm, đường kính

2.5-6 mm, cánh hoa dài hơn nhiều so với ống Nhuỵ nhô ra, nhưng ngắn hơn nhiều so với cánh hoa [1]

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Spermacoce ocymoides Burm.f

1.2 Các nghiên cứu dược tính

1.2.1.Tác dụng bảo vệ dạ dày

Năm 2009, C.N Okwuosa và cộng sự đã nghiên cứu trên lá của cây

Spermacoce ocymoides Burm.f cho thấy dịch chiết nước và dịch chiết methanol

từ lá ở nồng độ 800 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng vận động dạ dày từ 6.1% đến 22.5% Thuốc nhuận tràng bisacodyl (5mg/ kg) có tác dụng làm tăng khả năng vận động của dạ dày thêm 17.4% Nếu dùng kết hợp bisacodyl (5 mg/kg) với dịch chiết nước hoặc dịch chiết methanol, khả năng vận động của dạ dày tăng lên đáng kể ở mức 67.8% -70.1% Ngoài ra dịch chiết nước và dịch chiết methanol còn thể hiện khả năng chống loét dạ dày 89.0-95.8% có thể xem như tương đương với khả năng bảo vệ loét của cimetidine (96.9%) [3]

1.2.2.Tác dụng kháng viêm

Năm 2011, R Sundhararajan và V Ravichandiran đã tiến hành nghiên

cứu hoạt tính kháng viêm trên toàn bộ cây Spermacoce ocymoides Burm.f với dịch chiết n-hexan, ethyl acetate và ethanol được thử nghiệm trên chuột bị gây

viêm bởi carrageenan, chất đối chứng dương là indomethacin Kết quả khi thử nghiệm với liều lượng 100-200 mg/kg thể trọng chuột cho thấy dịch chiết ethanol

thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể hơn so với dịch chiết n-hexane và ethyl acetate, cụ thể phần trăm ức chế của các dịch chiết ethanol, ethyl acetate, n-

hexane lần lượt là 56.01; 16.70;10.84% và của chất đối chứng dương là 80.84% (với liều lượng 10 mg/kg) [3]

1.2.3.Tác dụng kháng ký sinh trùng và chống oxi hóa

Năm 2016, Sunday Adeleke Adesegun và các cộng sự đã nghiên cứu khả

năng chống sốt rét và chống oxy hóa của các dịch chiết methanol, n-hexane,

dichloromethane, ethyl acetate và nước [4]

Kết quả cho thấy rằng, dịch chiết có tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét

Plasmodium berghei NK65 Cụ thể khi thử nghiệm các dịch chiết trên ở nồng độ

250 và 500 mg/kg với chất đối chứng dương chloroquine (10 mg/kg) kết quả cho thấy rằng dịch chiết ethyl acetate có tác dụng ngăn chặn ký sinh trùng cao nhất là 87.31% (ở nồng độ 250 mg/kg), của chất đối chứng dương là 95.45% [4]

Ngoài ra, dịch chiết methanol được thử nghiệm về khả năng chống oxi hóa với phương pháp bắt gốc tự do DPPH, chất đối chứng dương là vitamin C Kết quả cho thấy dịch chiết methanol thể hiện tác dụng chống oxi hóa với

IC50=1.85 mg/ml [4]

1.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học

Năm 2013, M Jeyachandran và cộng sự đã thực hiện các phản ứng định

tính một số nhóm hợp chất có trong S ocymoides thu hái ở Alwarkurichi (Ấn

Độ) Các nhóm hợp chất được phát hiện bao gồm: Steroid, đường khử, phenolic, saponin và tannin [5]

Do các nghiên cứu về thành phần hóa học trên cây Ruột gà dạng hóng còn

ít nên chúng tôi xin trình bày thành phần hóa học của một số cây cùng chi (bảng 1.1) [6]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học các loài trong chi Spermacoce

B capitata Borrecarpine (1),

Borrecoxine (2), Borreline (3), Dehydroborrecapine (6)

S.latifolia Asperulosidic acid (13),

6-O-Acetylscandoside (14),

Daphylloside (16), Deacetylasperulosidic acid (18), 10-Hydroxyloganin (22),

Scandoside (24), Phytol (42)

B articularis 3α-Acetoxy-olean-12-en-29-oic acid (33),

β-Amyrin (34), Epikatonic acid (38), Erythrodiol (39),

3-Keto-olean-12-en-29-oic acid (41), β-Sitosterol (43),

Ursolic acid (45), Ursolic acid methyl ester (46), Uvaol (47),

6-Methyl-5-cyclodecen-1-ol (54), Hentriacontan-1-ol (60),

B hispida Isorhamnetin (26),

β-Sitosterol (43), Ursolic acid (45),

B laevis Asperuloside (12),

Asperulosidic acid (13), 6α-Hydroxyadoxoside (21),

Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (27), Kaempferol 3-O-rutinoside (28),

Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (30),

Quercetin

3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranoside (31), Rutin (32),

(1→6)-β-D-glucopyranoside (50),

(Z)-3-Hexenyl diglycoside (51), (Z)-3-Hexenyl O-β-D-glucopyranoside (52),

Scandoside (24), Phytol (42)

B pusilla Astragalin (25),

Quercetin (29), Rutin (32), Daucosterol (37), β-Sitosterol (43), Ursolic acid (45), Hexacosan-1-ol (59),

Linoleic acid (61), Stearic acid (64),

Alanine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine,leucine, lysine, methionine,

phenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine, valine, Galactose, glucose, mannitol, protein

B verticillata Borrerine (4),

Borreverine (5), (-)-Emetine (7), Isoborreverine (8), Spermacoceine (9), Verticillatine A (10), Verticillatine B (11), Asperuloside (12), Asperulosidic acid (13), Borreriagenin (15), Daphylloside (16), Deacetylasperuloside (17), Deacetylasperulosidic acid (18), Feretoside (19),

6’-O-(2-glyceryl)scandoside methyl ester(20), Methyl deacetylasperulosidate (23),

Campesterol (35), Cariophyllene (36), Guiaene (40),

β-Sitosterol (43), Stigmasterol (44),

S exilis stigmasterol (44),

Ursolic acid (45), Benzo[g]isoquinoline-5, 10-dione (65), Hexadecanoic acid (66)

Công thức hóa học các hợp chất trong chi Spermancoce (Borreria)

Alkaloid

1 R = CH = CMe2

N H

O

N R

19 R = OMe, R1 = OH, R2 = β-OH

23 R = OH, R1 = OMe, R2 = α-OH

21 R = α-OH 

22 R = β-OH

Flavonoid

25 5,7,4' –OH, 3-O β- D-Glc 26 3,5,7,4'–OH, 3'–OMe

27 5,7,4' –OH, 3-O-β- D-Glc 28 5,7,4'–OH, 3-O-Rut

29 3,5,7,3',4'–OH 30 5,7,3',4'–OH, 3-O-β- DGal

-31 5,7,3',4'–OH, 3-O-α- L -Rha-(1→6)-β- D-Gal 32 5,7,3',4'–OH, 3-O-Rut

3

23 24

Rut α-L -rhamnopyranosyl (1→6)-β- D-galactopyranoside

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, thiết bị

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR tại Phòng NMR, Viện Hóa Học, Viện KH-CN Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội và Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh

2.2 Thu hái và xử lý mẫu

Cây Ruột gà dạng hóng Spermacoce ocymoides Burm.f., họ Cà phê

(Rubiaceae) được thu hái tại Long An vào năm 2016 được định danh bởi TS Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học nhiệt đới

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn Bột này được sử dụng để điều chế các loại cao

2.3 Điều chế các loại cao

Các bộ phận cây Ruột gà dạng hóng (Spermacoce ocymoides) như rễ,

thân, lá được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối

lượng không đổi

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate

Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 96o bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô

Cao ethanol thô được chiết lỏng-lỏng lần lượt với n-hexane và ethyl acetate, thu

được cao hexane và cao ethyl acetate Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ

đồ 2.1

2.4 Phân lập một số chất hữu cơ trong cao ethyl acetate

Cao ethyl acetate của cây Ruột gà dạng hóng (98.5 g) được SKC silica gel

lần lượt với các hệ dung môi H–EA có độ phân cực tăng dần (20–40% EA), tiếp sau là hệ dung môi EA–Me (5–20%) và 100% Me Dịch giải ly qua cột được

hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 9

phân đoạn kí hiệu từ EA1–EA9 Kết quả được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 EA1 H–EA 4:1 8.36 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát

2 EA2 H–EA 35:15 10.23 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát

3 EA3 H–EA 3:2 6.31 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

4 EA4 EA–Me 95:5 18.03 Nhiều vết kéo vệt Khảo sát

5 EA5 EA–Me 90:10 7.33 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

6 EA6 EA–Me 85:15 4.93 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

7 EA7 EA–Me 80:20 4.57 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

8 EA8 EA–Me 80:20 6.25 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

9 EA9 Me 100% 7.11 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

2.4.1 Phân lập hợp chất hữu cơ ở phân đoạn EA4

Kết quả SKLM phân đoạn EA4 (18.03 g) cho nhiều vết, có vết tách rõ nên phân đoạn EA4 được thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần từ EA–Me 95:5, EA–Me 90:10, EA–Me 84:16, EA–Me 80:20

và Me 100% Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải

ly bằng SKLM Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành

một phân đoạn Kết quả thu được 6 phân đoạn EA4.1–EA4.6, được trình bày

Trọng lượng (g)

Sắc kí lớp mỏng Ghichú

2 EA4.2 EA–Me 90:10 1.88 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

3 EA4.3 EA–Me 84:16 3.92 Nhiều vết, có vết

tách rõ Khảo sát