Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Cao Ethyl Acetate Của Loài Địa Y Roccella Montagnel

Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y .... Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Bảng 1.3.. Hoạt tính ức chế enzyme của mộ

CAO ETHYL ACETATE

CỦA LOÀI ĐỊA Y ROCCELLA MONTAGNEI

GVHD: TS DƯƠNG THÚC HUY

MSSV: K40.201.059

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2018

Xác nhận của Hội đồng phản biện:

KÍ TÊN VÀ DUYỆT

(Kí và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian được học tập và rèn luyện ở Khoa Hóa học, trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, bản thân em đã tiếp nhận được rất nhiều kiến thức và các

kĩ năng cần thiết để tự tìm tòi và phát triển bản thân

Em xin cảm ơn thầy Dương Thúc Huy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện cho đến lúc hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô và các anh chị, các bạn sinh viên Khoa Hóa học đã hỗ trợ cho em trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Tuy nghiên, do kinh nghiệm chưa thật sự dày dặn cùng thời gian có hạn và hạn chế

về mặt vật chất nên khóa luận này không thể tránh khỏi sai sót, em rất mong nhận được sự thông cảm và góp ý từ phía quý thầy cô và mọi người

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC PHỤ LỤC v

LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1. Định nghĩa và phân loại địa y 2

1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y 3

1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y 3

1.4. Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Roccella 4

1.5. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y 5

1.5.1. Hoạt tính đối với động vật 7

1.5.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao 7

1.5.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y 8

1.5.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y 9

1.5.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y 12

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 15

2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất 15

2.2. Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất DS 18

3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất R1 18

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 19

4.1. Kết luận 19

4.2. Đề xuất 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

AcOH Acid acetic

br Mũi dãn rộng (Broad)

DMSO Dimethyl sulfoxide

d Mũi đôi (Doublet)

J Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

s Mũi đơn (Singlet)

SKC Sắc ký cột

δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học)

DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y

Hình 1.2 Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Rocella

Hình 1.4 Một số hợp chất cô lập từ địa y

Hình 2.1 Địa y Rocella montagnei

Hình 3.1 Một số tương quan HMBC trong hợp chất DS

Hình 3.2 Một số tương quan HMBC trong hợp chất R1

Hình 4.1 Cấu trúc hai hợp chất đã cô lập

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ sắc ký cột trên cao n-hexane

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y

Bảng 1.3 Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y

Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y

Bảng 1.5 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y

Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y

Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất DS, acid lecanoric và acid

diorcinolic

Bảng 3.2 So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất R1 và lecanorin

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1 Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất DS

Phụ lục 2 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất DS

Phụ lục 3 Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất R1

Phụ lục 4 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất R1

LỜI MỞ ĐẦU

Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi như trên đất đá, thân cây, lá cây, trong những điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến khắc nghiệt Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân

bố phong phú và đa dạng

Từ xưa, con người đã biết sử dụng địa y vào nhiều mục đích khác nhau như làm

thực phẩm, men rượu, phẩm nhuộm Địa y Evernia prunastri hiện vẫn được sử dụng

trong ngành kỹ nghệ mỹ phẩm để làm chất định hương Một vài loại hợp chất polyphenol

có trong địa y có khả năng hấp thu tia UVB nên chúng được sử dụng làm kem chống nắng Quan trọng hơn hết là địa y đã được sử dụng để chữa một số bệnh như bệnh lao,

bệnh dại, cảm sốt, ho, vết thương ngoài da Địa y Lobaria pulmonaria được sử dụng để

chữa bệnh liên quan đến đường hô hấp, viêm khớp (Atalay 2011 [1], Suleyman 2003 [2]),

địa y Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não, loài Peltigera được sử dụng để chữa trị các bệnh dại (Barrington 1974 [3]) Địa y Cetraria islandica được sử dụng ở Thuỵ Điển

làm thuốc chữa bệnh đái tháo đường, viêm phổi (Ahmadjian 1963 [4]) Các nghiên cứu cho biết địa y thường chứa các loại hợp chất thơm như depside, depsidone, depsone, dẫn xuất dibenzofuran và các hợp chất có màu như xanthone, antraquinone và dẫn xuất acid usnic (Devehat 2007 [5]) Nhiều loại depsidone có đa dạng hoạt tính sinh học đặc biệt trong ức chế enzyme liên quan đến các bệnh chuyển hóa ở người [6]

Nhằm phát triển các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài địa y sinh trưởng

ở Việt Nam nói chung cũng như mở rộng các nghiên cứu trên loài địa y Roccella montagnei, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của loài địa y Roccella montagnei”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa và phân loại địa y

Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm

(mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium) Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được tìm thấy

Thông thường địa y chia làm 3 dạng: dạng khảm, dạng phiến và dạng sợi (Choi và cộng

sự, 2008)[7]:

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi và cộng sự, 2008)[7]

Ðể hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nấm Mặc dù cả hai thành phần được nuôi cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành địa y thật sự khó khăn

Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y

1.2 Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y

 Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao

 Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại

 Các acid carboxylic từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi và cộng sự, 2008)[7]

 Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng

1.3 Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y

Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và công sự đề nghị (Huneck 1997)[8]:

Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (Hình 1.2)

 Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic

 Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid

 Nguồn gốc acetate-malonate: các acid dây dài và các acid phenol

Tảo

Nấm

Hình 1.2 Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

1.4 Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Roccella

Địa y Roccella đã được nghiên cứu hóa học trong hơn 50 năm Nghiên cứu hóa thực vật trên chi Roccella được công bố trên một số loài Roccella fuciformis, R phycopis Ach., R capesis Follm., R galapagoensis, R hypomecha Bory., R montagnei, R portentosa và R capesis Follm D-Montagnetol và D-erythrin là các hợp chất chính, được

tìm thấy trên tất cả các loài địa y Roccella [9]

● Roccella capesis

9-Methyl pannarate (R10) được cô lập bởi Huneck S và cộng sự (1991) [10]

● Roccella fuciformis

D-Tagatose (R3) từ R fuciformis được cô lập bởi Culberson C F (1969) [11]

Ethyl orsellinate (R4) được ly trích từ R fuciformis (Huneck S., 1997) [8] Acid lepraric (R7) được cô lập từ R fuciformis bởi Aberhart D J (1969)[12].2-Methyl-5-hydroxy-6-

hydroxymethyl-7-methoxychromone (R8) được cô lập từ R fuciformis bởi Huneck S và

Năm 1969, D-(+)-montagnetol (R5) được cô lập từ R montagnei bởi Culberson C

F và cộng sự [11] Năm 2017, Duong T H và cộng sự đã cô lập được 5 hợp chất mới

orsellinylmontagnetol A–D và hydrofurylmontagnetol (R15-R19) cùng với (+)-D

-montagnetol (R5), (+)-D-erythrin (R6), 1-acetylerythritol (R20), acid lecanoric (R21), lecanorin (R22), acid orsellinic (R23), methyl orsellinate (R24)

1.5 Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y

Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên.Lê Hoàng Duy(2012)[16] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10% trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy

đủ của Boustie (2010)[6], Huneck (1999)[17], Muller (2001)[18] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …

Hình 1.3 Các hợp chất được cô lập từ loài địa y thuộc chi Roccella

1.5.1 Hoạt tính đối với động vật

Acid caperatic và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia

Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis

Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, acid evernic, acid psoromic, acid physodic, acid 3-hydroxyphysodic, acid fumarprotocetraric, acid stictic, acid norstictic, acid salazinic, acid vulpinic, acid rhizocarpic và acid usnic làm giảm sự tăng

trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống

còn của chúng

1.5.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao như Bảng 1.1

Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính

Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid

diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid

β-orcinolcarboxylic, acid orsellinic

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật

trong lá rau bina

gốc của cây Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực

1.5.3 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y

Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus Hypericin

có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV (antiretroviral) Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trong khi các anthraquinone thế monochloro có hoạt tính giảm hơn Hoạt tính dường như tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc (Muller 2001)[18]

Các hợp chất thơm cô lập từ các loài địa y như depsidone, depside và diphenyl ether thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhiều loại enzyme

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y

Depsidone: acid virensic và dẫn xuất

tương tự

Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV

Acid butyrolactone: acid

(+)-Acid usnic và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, 7-cloroemodin,

7-chloro-1-O-methylemodin, 5,7-dichloroemodin,

hypericin

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

Từ địa y Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm, thu hái trên núi Zelengora (Bosnia), hai

hợp chất depsidone đã được cô lập, đó là: diacid

4-formyl-8-hydroxy-1,9-dimethyl-3-methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-6,7-carboxylic và

7,8-diacetoxy-4-formyl-1,9-dimethyl-3-methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin [6] Thử nghiệm

hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy hợp chất diacid không có hoạt tính nhưng hợp chất mang hai nhóm acetate lại có hoạt tính khá ở nồng độ 1 g/ mL, so với chất đối chứng dương galanthamine hoạt tính ở

nồng độ 0,01 g/ mL [6]

Depsidone acid lobaric [9] ức chế mạnh được nhiều loại enzyme như

12(S)-lipoxygenase platelet-type (IC50 28,5 µM), 5-lipoxygenase (IC50 7,3 µM), protein tyrosine phosphate 1B (PTP1B, IC50 0,87 µM), cyclogenase (IC50 29,2 µM) Các hợp

chất diphenyl ether pseudodepsidone (H1) và (H2) [7] có khả năng ức chế mạnh dòng

enzyme PTP1B với giá trị lần lượt IC50 6,86 và 2,48 µM và depside acid baeomyceric ức chế enzyme 5-lipoxygenase với giá trị IC50 8,3 µM Một số hợp chất địa y khác ức chế vài loại enzyme được thống kê bởi Boustie (2010) [6] và Muller (2001) [15], lần lượt minh họa trong Bảng 1.1 và 1.2

1.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y

Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả

Acid protolichesterinic được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid

này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[18] Một số lượng lớn các hợp chất địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, acid evernic, acid leprapinic và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, acid puvinic và dẫn xuất, acid usnic và dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[18] Khả năng kháng nấm của các hợp chất địa y cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin, fallacinal, emodin (Boustie 2010) [6] Trong các hợp chất địa y, acid usnic và dẫn xuất của nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn