NGUYÊN NHÂN và PHƯƠNG PHÁP KHẮC PHỤC HIỆN TƯỢNG KHÓ bóc TÁCH tấm BIỂU mô NIÊM mạc MIỆNG NUÔI cấy

Suy giảm tế bào gốc vùng rìa có thể được điều trị bằng nhiều phươngpháp khác nhau như ghép màng ối, liệu pháp oxy, liệu pháp corticoid, ghépmảnh mô vùng rìa trực tiếp hoặc tấm biểu mô nu

DIÊM THỊ YẾN

NGUYÊN NHÂN VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẮC PHỤC HIỆN TƯỢNG KHÓ BÓC TÁCH TẤM BIỂU MÔ

NIÊM MẠC MIỆNG NUÔI CẤY

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ

HÀ NỘI - 2015

DIÊM THỊ YẾN

NGUYÊN NHÂN VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẮC PHỤC HIỆN TƯỢNG KHÓ BÓC TÁCH TẤM BIỂU MÔ

NIÊM MẠC MIỆNG NUÔI CẤY

Chuyên ngành: Mô - Phôi Thai Học

Mã số: 62720101

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Nguyễn Thị Bình

2 ThS Đào Thị Thúy Phượng

HÀ NỘI - 2015

3T3 3-day transfer, inoculum 3x10 cells

ABCG ATP-binding cassette subfamily G

DMEM Dulbecco's modified eagle's medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EGF Epithelial growth factor Yếu tố phát triển biểu mô

FGF Fibroblast growth factor Yếu tố phát triển nguyên bào sợiGAG Glycosaminoglycan

HGF Hepatocyte growth factor Yếu tố phát triển tế bào ganHLA Human leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người

KGF Keratinocyte growth factor Yếu tố phát triển tế bào sừng

LSCD Limbal stem cell deficiency Suy giảm tế bào gốc vùng rìaOCT Optical coherence tomography

P.A.S Periodic acid Shiff

PBS Phosphate buffer saline

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗiPDGF Plate derive growth factor Yếu tố phát triển có nguồn gốc

tiểu cầuSEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét

SHEM Supplemental hormonal epithelial

medium

Môi trường nuôi cấy biểu mô

có bổ sung hormonTGF Transformer growth factor Yếu tố phát triển chuyển dạngHIV Human immunodeficiency virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch

ở người

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Cấu trúc niêm mạc khoang miệng 3

1.2 Ứng dụng lâm sàng của tấm biểu mô niêm mạc miệng 5

1.2.1 Ứng dụng lâm sàng trong lính vực nhãn khoa 5

1.2.2 Ứng dụng lâm sàng trong các lĩnh vực khác 7

1.3 Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng 8

1.3.1 Các phương pháp nuôi cấy 8

1.3.2 Các loại giá thể dùng trong nuôi cấy 13

1.3.3 Lớp tế bào nuôi 16

1.3.4 Môi trường nuôi cấy 19

1.3.5 Định danh tế bào của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy .20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Mô hình nghiên cứu 22

2.2.2 Phương pháp nuôi tạo tấm biểu mô 22

2.2.3 Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết cho nuôi cấy 23

2.2.4 Chuẩn bị màng ối 23

2.2.5 Chuẩn bị môi trường dùng trong nuôi cấy 24

2.2.6 Quy trình trích thủ và xử lý mảnh niêm mạc miệng cho nuôi cấy 25 2.2.7 Quy trình xử lý mảnh biểu mô niêm mạc miệng cho nuôi cấy 25 2.2.8 Quy trình xử lý mảnh mô nền cho nuôi cấy 25

2.2.9 Quy trình nuôi cấy và theo dõi 26

2.2.10 Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy 28

2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu 30

2.6 Đạo đức nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 32

3.1 Kết quả nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng bằng phương pháp nuôi mảnh biểu mô 32

3.1.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng 32

3.1.2 Chất lượng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 33

3.2 Hình thái và tốc độ phát triển của tế bào biểu mô niêm mạc miệng 33 3.3 Hình thái và tốc độ phát triển của lớp nguyên bào sợi 35

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 37

4.1 Vị trí đặt mảnh mô liên kết 37

4.2 Thời gian đồng nuôi cấy mảnh biểu mô và lớp tế bào nuôi 37

4.3 Chất lượng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy 37

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 38

KHUYẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng 32Bảng 3.2 Đánh giá khả năng bóc tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy ra

khỏi đáy lồng nuôi cấy 33Bảng 3.3 Thời điểm tế bào biểu mô niêm mạc miệng bắt đầu mọc ra khỏi

mảnh biểu mô 33Bảng 3.4 Thời điểm tế bào biểu mô niêm mạc miệng mọc kín đáy lồng nuôi cấy 34Bảng 3.5 Thời điểm nguyên bào sợi bắt đầu mọc 35Bảng 3.6 Thời điểm nguyên bào sợi mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 35

Hình 1.1 Quá trình biệt hóa của tế bào niêm mạc miệng 3

Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu 22

Hình 2.2 Mô hình nuôi cấy bằng mảnh biểu mô cùng mảnh mô liên kết 27

Hình 2.3 Mô hình nuôi cấy bằng mảnh biểu mô cùng lớp dịch treo nguyên bào sợi tự thân 27

Hình 3.1 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy của lô 1 32

Hình 3.2 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy của lô 2 32

Hình 3.3 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy của lô 3 32

Hình 3.4 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy của lô 4 32

Hình 3.5 Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy khó bóc ra khỏi đáy lồng nuôi cấy 33

Hình 3.6 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 1 bắt đầu mọc ra khỏi mảnh biểu mô 34

Hình 3.7 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 2 bắt đầu mọc ra khỏi mảnh biểu mô 34

Hình 3.8 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 3 bắt đầu mọc ra khỏi mảnh biểu mô 34

Hình 3.9 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 4 bắt đầu mọc ra khỏi mảnh biểu mô 34

Hình 3.10 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 1 mọc kín đáy lồng nuôi cấy 34

Hình 3.11 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 2 mọc kín đáy lồng nuôi cấy 34

Hình 3.12 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 3 mọc kín đáy lồng nuôi cấy 34

Hình 3.13 Tế bào biểu mô niêm mạc miệng ở lô 4 mọc kín đáy lồng nuôi cấy 34

Hình 3.14 Nguyên bào sợi ở lô 1 bắt đầu mọc 35

Hình 3.15 Nguyên bào sợi ở lô 2 bắt đầu mọc 35

Hình 3.18 Nguyên bào sợi ở lô 1 mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 36 Hình 3.19 Nguyên bào sợi ở lô 2 mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 36 Hình 3.20 Nguyên bào sợi ở lô 3 mọc kín 1/2 đáy giếng nuôi cấy 36 Hình 3.21 Nguyên bào sợi ở lô 4 mọc thành một lớp mỏng trên đáy giếng nuôi cấy 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bề mặt nhãn cầu toàn vẹn và ổn định là điều kiện để đảm bảo cho thịlực tốt Sự toàn vẹn đó được duy trì nhờ sự sinh sản và di cư của các tế bàogốc vùng rìa Tuy nhiên, những tế bào này có thể bị tổn thương bởi các yếu tốbên ngoài (bỏng nhiệt, bỏng hóa chất, nhiễm vi sinh vật, tia cực tím, ), haycác bệnh lý của chính cơ thể bao gồm cả bệnh hệ thống (Hội chứng StevensJohnson) và các bệnh lý di truyền (tật không mống mắt) Tùy thuộc vào mức

độ tổn thương mà có thể dẫn đến thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa (LSCD-limbalstem cell deficiency) một hoặc hai bên [1] Hậu quả là chứng khô mắt, sự khóchịu cho bệnh nhân, kết mạc hóa bề mặt nhãn cầu, tăng sinh mạch, theo thờigian sẽ tiến triển đến mờ đục giác mạc và cuối cùng là mù lòa [2]

Suy giảm tế bào gốc vùng rìa có thể được điều trị bằng nhiều phươngpháp khác nhau như ghép màng ối, liệu pháp oxy, liệu pháp corticoid, ghépmảnh mô vùng rìa trực tiếp hoặc tấm biểu mô nuôi cấy từ vùng rìa, [1].Nhưng các biện pháp kể trên chỉ áp dụng được cho trường hợp LSCD nhẹhoặc ở một bên mắt Đối với trường hợp LSCD toàn bộ ở cả hai bên thì phải

sử dụng các mảnh ghép biểu mô vùng rìa có nguồn gốc đồng loại hoặc tử thi

Để tránh hiện tượng thải bỏ mảnh ghép, bệnh nhân cần được điều trị ức chếmiễn dịch trong thời gian dài Các tác dụng phụ của thuốc ức chế miễn dịch

có thể làm ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Ngoài ra, đây

là một biện pháp đòi hỏi chi phí điều trị khá cao, người được ghép có khảnăng nhiễm một số bệnh lây truyền từ mảnh ghép đồng loại mà vẫn có nguy

cơ bị thải bỏ mảnh ghép Vì vậy, việc sử dụng các mảnh ghép từ mô tự thân

đã được nghiên cứu và phát triển Do biểu mô giác mạc là loại biểu mô láttầng không sừng hóa, tương tự như cấu trúc biểu mô ở các vùng niêm mạcmiệng, mũi, thực quản, trực tràng, âm đạo, nên mảnh mô ở các vị trí này có

thể coi là một lựa chọn thay thế tốt cho các trường hợp không sử dụng đượcmảnh ghép từ vùng rìa đồng loại [2] Thực tế, hơn 10 năm qua, đã có nhiềunghiên cứu sử dụng các mô và tế bào gốc tự thân để điều trị LSCD, bao gồm

cả tế bào gốc phôi, tế bào biểu mô kết mạc, tế bào gốc biểu bì, tế bào gốc tủyrăng, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc nang lông, và tế bào gốc dây rốn Trong

số đó, tấm biểu mô nuôi cấy từ tế bào gốc niêm mạc miệng đã được sử dụngrộng rãi nhất trên toàn thế giới, bởi vì tính sẵn có của niêm mạc miệng và vìviệc lấy một mảnh niêm mạc miệng rất đơn giản mà không cần đến một cuộcphẫu thuật, vết sinh thiết liền nhanh và không để lại sẹo [1], [3] Để nuôi tạođược tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng các nghiên cứu đều

sử dụng lớp tế bào nuôi là 3T3 (3-day transfer, inoculum 3x105 cells) có nguồngốc từ chuột Tuy nhiên, một vấn đề đáng lo ngại là sự xuất hiện của yếu tố dịloài trong tấm biểu mô nuôi cấy Sau nhiều năm nghiên cứu bộ môn Mô - Phôitrường Đại học Y Hà Nội đã nghiên cứu thành công quy trình nuôi tạo tấm biểu

mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng và sử dụng lớp tế bào nuôi tự thân Trongquá trình nuôi cấy, đôi khi xảy ra hiện tượng khó bóc tách tấm biểu mô khỏiđáy lồng nuôi cấy, điều này ảnh hưởng tới chất lượng của tấm biểu mô khighép lại cho bệnh nhân [4] Vấn đề này cũng chưa từng được nhắc đến trongcác nghiên cứu trước đây Mong muốn khắc phục tồn tại đó, chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nguyên nhân và phương pháp khắc phục hiện tượng khó bóc tách tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy” với 2 mục tiêu:

1 Tìm nguyên nhân gây khó bóc tách tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy khỏi đáy lồng nuôi cấy.

2 Nghiên cứu phương pháp khắc phục hiện tượng khó bóc tách tấm biểu

mô niêm mạc miệng nuôi cấy.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.Cấu trúc niêm mạc khoang miệng

Niêm mạc khoang miệng có cấu tạo gồm 2 phần chính: biểu mô và lớpđệm Ở nhiều vùng của miệng, niêm mạc gắn với cấu trúc mô phía dưới bởitầng dưới niêm mạc, trừ ở vùng vòm miệng và vùng lợi, lớp đệm của niêmmạc miệng dính chặt vào màng xương Ba lớp này có cấu trúc tương tự nhưcấu trúc của biểu mô, chân bì và hạ bì của da [5]

Biểu mô niêm mạc miệng là loại biểu mô tầng, có thể sừng hóa hoặckhông sừng hóa hoặc bán sừng hóa tùy thuộc từng vùng khác nhau [6] Biểu

mô bao phủ niêm mạc má thuộc loại lát tầng không sừng hóa, gồm các lớp:lớp đáy (chứa các tế bào gốc), lớp gai, lớp trung gian và lớp bề mặt Các tếbào bề mặt bong ra rời rạc chứ không thành mảng như ở da Sự đổi mới củacác tế bào biểu mô được thực hiện nhờ sự phân chia của các tế bào thuộc lớpđáy [7] Quá trình biệt hóa tế bào ở niêm mạc miệng diễn ra như sau:

Hình 1.1 Quá trình biệt hóa của tế bào niêm mạc miệng [11]

Biểu mô niêm mạc miệng có kiểu tăng sinh giống như biểu bì da.Nghiệm pháp đánh dấu cho thấy các tế bào gốc nằm ở đỉnh các nhú chân bì ởniêm mạc vòm miệng thỏ, và rải rác ở niêm mạc má [8]

Các tế bào gốc thường có dạng hình trụ nằm sát với màng đáy và cókhả năng phân chia để duy trì cấu trúc mô ổn định Có nhiều yếu tố có thể ảnhhưởng đến sự ổn định này, từ đó làm thay đổi chiều dày của lớp biểu mô [9]

Nhiều yếu tố tăng trưởng hay còn gọi là các cytokine có thể kích thíchhoặc ức chế tăng sinh biểu mô Các yếu tố kích thích tăng sinh biểu mô gồm:yếu tố phát triển biểu mô (EGF- Epithelial growth factor), yếu tố phát triểnchuyển dạng (TGF-Transformer growth factor), yếu tố phát triển có nguồngốc tiểu cầu (PDGF- Plate derive growth factor), chất tương tác tế bào (IL-1-Interleukin-1) Tốc độ tăng sinh là kết quả của việc tương tác giữa yếu tố kíchthích và yếu tố ức chế Hoạt động gián phân của tế bào cũng bị ảnh hưởng bởimột số các yếu tố như thời điểm trong ngày, stress và tình trạng viêm nhiễm.Sau một chu trình phân chia tế bào, mỗi tế bào con hoặc trở thành tế bào gốchoặc tiếp tục biệt hóa để đi vào quần thể tế bào trưởng thành Sự biến đổithành tế bào biệt hóa nhờ sự tác động của một số yếu tố sau: nồng độ Ca2+ngoại bào, phorbolesters, vitamin A và vitamin D3 [10] Các tế bào ở lớp đáyđược gắn với màng đáy bởi các protein integrin Quá trình biệt hóa của các tếbào gốc liên quan tới sự di cư, sự mất đi của integrin và sự tăng dần lên củacác cadherin [11]

Khi tế bào rời lớp đáy bước vào quá trình biệt hóa, nó lớn hơn và dẹtdần, tích lũy xơ keratin trong bào tương Keratin là một loại xơ trung gian cótrong tế bào biểu mô, hình thành một mạng lưới khắp tế bào Các xơ keratingắn với các thể liên kết và thể bán liên kết, neo các tế bào biểu mô vào vớinhau và vào màng đáy Biểu mô lát tầng không sừng hóa ở niêm mạc khoangmiệng thể hiện K4 và K13 [12]

1.2 Ứng dụng lâm sàng của tấm biểu mô niêm mạc miệng

Có 2 ứng dụng chính của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đó là:(1) ứng dụng lâm sàng; (2) ứng dụng trong phòng thí nghiệm để đánh giá việchàn gắn viết thương, độ độc tính và tính phù hợp sinh học của thuốc hoặc vậtliệu sinh học Các ứng dụng về mặt lâm sàng đang ngày càng được khai thácrộng rãi

1.2.1 Ứng dụng lâm sàng trong lính vực nhãn khoa

Đã có nhiều thông báo thành công trên thực nghiệm và lâm sàng về việc

sử dụng tấm biểu mô nuôi cấy từ niêm mạc miệng để tái tạo bề mặt nhãn cầu

Theo Kolli S (2014), trước đây, các nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu môđiều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc chủ yếu sử dụngmảnh ghép từ vùng rìa tự thân Phương pháp này mặc dù đem lại hiệu quả tốtnhưng không thực hiện được ở bệnh nhân bị LSCD cả hai bên Một thành tựumới đạt được gần đây trong lĩnh vực này là sử dụng tấm biểu mô nuôi cấy từniêm mạc miệng Phương pháp này được cho là phù hợp nhất vì các lý do: tếbào gốc ở biểu mô niêm mạc miệng có tiềm năng sinh sản, có khả năng pháttriển trong môi trường nuôi cấy lâu dài mà không bị sừng hóa, rất dễ lấy mẫu,không để lại sẹo sau khi sinh thiết [13]

Nakamura T và cộng sự (2003) là người đầu tiên nuôi tạo thành côngtấm biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng và ứng dụng trong điều trị LSCD[14] Tiếp theo đó nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật này[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23]

Hirayama M và cộng sự (2012) đã ghép thành công tấm biểu mô niêmmạc nuôi cấy cho 32 mắt bị suy giảm tế bào gốc vùng rìa do các nguyên nhânbỏng hóa chất, hội chứng Stevens-Johnson và pemphigoid [24]

Sotozono C (2013) nghiên cứu ghép tấm biểu mô nuôi cấy từ niêmmạc miệng trên 46 mắt của 40 bệnh nhân bị suy giảm tế bào gốc vùng rìa hai

bên Kết quả sau phẫu thuật, thị lực của bệnh nhân cải thiện rõ rệt trong thờigian theo dõi kéo dài hơn 28 tháng [25].

Nguyễn Thị Thu Thủy và cộng sự (2013) nghiên cứu điều trị rối loạn

bề mặt nhãn cầu nặng hai mắt bằng ghép tấm biểu mô nuôi cấy từ tế bào gốcniêm mạc miệng Trên thực nghiệm, tác giả đã tiến hành nuôi cấy thành côngtấm biểu mô niêm mạc miệng và ghép tự thân trên 15 thỏ Sau ghép có 14 thỏđược đánh giả là có kết quả tốt, 1 thỏ có kết quả khá. Trên lâm sàng, tác giảnuôi cấy và ghép tự thân cho 20 ca rối loạn bề mặt nhãn cầu 2 mắt, trong đó 3

ca phẫu thuật 2 lần, có 14 ca thành công, 2 ca tấm biểu mô bị tiêu hủy do tổnthương ngấm sâu vào nội nhãn, 4 ca tân mạch xâm lấn tới trung tâm giác mạc.Ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy là phương pháp an toàn, hiệuquả trong kiến tạo bề mặt nhãn cầu [26]

Kocaba V và cộng sự (2014) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng tấmbiểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy ghép tự thân trong điều trị khiếm thị cho

23 trong số 26 mắt bị LSCD Kết quả cho thấy có 17 bệnh nhân cải thiện thịlực (74%), tình trạng biểu mô giác mạc được cải thiện ở 15 bệnh nhân(62,5%), và chất lượng cuộc sống được cho là cải thiện ở 22 bệnh nhân 9 mắt

bị đục chất nền giác mạc, tuy nhiên việc ghép tấm biểu mô niêm mạc miệnggiúp làm giảm sự hình thành tân mạch, và tạo thuận lợi cho việc ghép giácmạc xuyên thì hai Ở nhóm này, thị lực tăng 66,7%, tình trạng biểu mô đượccải thiện 66,7%, và chất lượng cuộc sống được cải thiện 100% Từ đó, có thểkhẳng định rằng sự xuất hiện của tấm biểu mô niêm mạc nuôi cấy đã tạo ramột dấu ấn quan trọng, một cuộc cách mạng, và ghép tấm biểu mô niêm mạcmiệng là một biện pháp điều trị an toàn cho bệnh nhân LSCD [23]

Utheim T P (2015) đã tiến hành nghiên cứu thống kê trong vòng 10năm với 242 bệnh nhân được điều trị LSCD bằng tấm biểu mô nuôi cấy từniêm mạc miệng tự thân Kết quả có 72% mắt được ghép thành công, 68%

mắt cải thiện thị lực Nghiên cứu cho thấy việc điều trị hội chứng LSCD bằngtấm biểu mô nuôi tạo từ niêm mạc miệng là biện pháp điều trị hứa hẹn manglại hiệu quả lâm sàng cao và có thể áp dụng rộng rãi trên thế giới [1].

1.2.2 Ứng dụng lâm sàng trong các lĩnh vực khác

 Ứng dụng điều trị các bệnh trong khoang miệng

Yamamoto T và cộng sự (2007) đã báo cáo 1 ca bệnh ở bệnh nhân nữ

45 tuổi bị U đa hình tuyến nước bọt Bệnh nhân này đã được điều trị phẫuthuật cắt bỏ U và sau đó ghép lại tấm biểu mô nuôi cấy vào vị trí niêm mạcmiệng bị thiếu hụt 3 tháng sau phẫu thuật, tình trạng bệnh nhân ổn định,không thấy co kéo tại chỗ, không có dấu hiệu tái phát U [27]

Amemiya T và cộng sự (2015) nghiên cứu trên 5 bệnh nhân phải trảiqua các phẫu thuật vùng miệng (nguyên nhân do khối U hoặc chấn thương).Các mảnh niêm mạc miệng sinh thiết được từ các bệnh nhân này dùng để nuôitạo tấm biểu mô, và sau đó ghép lại vào các vùng bị thiếu hụt niêm mạc trênchính các bệnh nhân đó Sau phẫu thuật không thấy nhiễm trùng, chảy máu,thải ghép hay bong mảnh niêm mạc Theo dõi về sau (ít nhất 12 tháng), khôngthấy tái phát của bệnh [28]

 Ứng dụng điều trị các bệnh khác bên ngoài khoang miệng

Iida T và cộng sự (2005) đã tách tế bào từ mảnh niêm mạc miệng sau

đó nuôi cấy trên chất nền của da tự thân đã loại bỏ biểu bì, thấy tế bào tầnghóa và mang đặc điểm của tế bào biểu mô niêm mạc miệng Tấm biểu mô saunuôi cấy được ghép lại cho bệnh nhân bị bỏng nặng Kết quả cho thấy 30%miếng ghép tồn tại và sống sót, gợi ý cho việc sử dụng tấm biểu mô niêm mạcmiệng nuôi cấy trong điều trị các bệnh nhân bỏng trên diện rộng [29]

Bhargava và cộng sự (2004) đã thành công trong việc ghép tấm biểu

mô niêm nuôi cấy từ niêm mạc miệng cho các phẫu thuật đường tiết niệu[30]

Zimmerman W B và cộng sự (2011) đã sử dụng tấm biểu mô nuôi cấy

từ niêm mạc miệng cho hầu hết các ca phẫu thuật phục hồi cấu trúc giải phẫuđường niệu Các tác giả nhận thấy rằng kỹ thuật này có nhiều ưu điểm: dễ ápdụng, tỷ lệ biến chứng sau mổ thấp và cho kết quả trước mắt cũng như lâu dàitốt Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nâng cao nhận thức về việc sửdụng tấm biểu mô niêm mạc miệng trong các phẫu thuật đường niệu [31]

Watanabe E và cộng sự (2011) đã thành công trong việc tái cấu trúcbàng quang bằng cách sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy gắntrên vạt dạ dày đã loại bỏ biểu mô [32]

1.3 Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng

Khi tiến hành nuôi cấy, bên cạnh phương pháp nuôi và quy trình nuôi,khâu chuẩn bị tốt các nguyên liệu cần cho quá trình nuôi cấy cũng có ảnhhưởng tích cực đến chất lượng của sản phẩm Các nguyên liệu thiết yếu cầntrong nuôi tạo tấm biểu mô từ niêm mạc miệng là: nguồn tế bào biểu mô, giáthể, lớp tế bào nuôi, và môi trường nuôi cấy chuyên dụng

1.3.1 Các phương phá p nuôi cấy

1.3.1.1 Nuôi cấy bằng dịch treo

Phương pháp này sử dụng enzyme dispase để tách các tế bào biểu mô rakhỏi màng đáy và enzyme trypsin để ly giải những đám tế bào biểu mô thànhdạng dịch treo chứa những tế bào riêng rẽ Dịch treo này sẽ được xác địnhmật độ tế bào rồi gieo lên nền nuôi cấy Thêm môi trường chuyên biệt vàogiếng nuôi cấy Quá trình nuôi cấy trong khoảng từ 14-21 ngày Ở đây, tế bàobiểu mô thường được gieo trên một giá thể làm chất mang cho các tế bào pháttriển, và màng ối là loại giá thể được đa số các nhà nghiên cứu sử dụng

Ưu điểm của phương pháp này là tế bào biểu mô được giải đều trên bềmặt nền nuôi cấy, có thể kiểm soát được mật độ tế bào Qua đó gián tiếp kiểmsoát được sự phát triển của các tế bào nuôi cấy

Nhược điểm: so với kỹ thuật nuôi bằng mảnh mô thì kỹ thuật này tiếnhành phức tạp hơn Một số quy trình nuôi sử dụng lớp tế bào nuôi là 3T3 củachuột, sẽ làm cho tấm biểu mô chứa yếu tố dị loài, điều này ảnh hưởng khôngtốt đến việc ghép về sau Hơn thế nữa, khi sử dụng lớp tế bào nuôi 3T3 thìphải ức chế loại tế bào này bằng mitomycin-C, đây là một chất gây độc cho tếbào, cũng sẽ làm ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào biểu mô.

Utheim T P (2015) đã tổng quan về vấn đề nuôi tạo tấm biểu mô niêmmạc miệng ứng dụng điều trị LSCD, trong vòng 10 năm từ 2004 đến 2014.Tác giả rút ra kết luận: trong 20 nghiên cứu được tiến hành thì có 18 nghiêncứu áp dụng phương pháp nuôi cấy bằng dịch treo tế bào [1] Phương phápnuôi tạo được đề cập trong các nghiên cứu cũng rất đa dạng Kích thước củamảnh sinh thiết được các tác giả sử dụng cũng rất khác nhau: từ 2-3 mm2 [21],[33], [34], [35] cho đến 50 mm2 [16], [21], [25] Với mục tiêu tránh hoặcgiảm thiểu mức tối đa sử dụng các thành phần của động vật, huyết thanh bàothai bò có xu hướng được thay thế bằng huyết thanh người tự thân

Hầu hết các nghiên cứu đều áp dụng phương pháp tạo tầng bằng cách rútbớt lượng môi trường nuôi cấy để các tế bào biểu mô tiếp xúc trực tiếp vớikhông khí Tuy nhiên, số hàng tế bào tạo được lại rất khác nhau từ 1 đến 7hàng tế bào [22], [13], nhưng chủ yếu nhất là 4 đến 6 hàng tế bào [16], [17],[20], [21], [24], [25], [33], [34], [35], [36], [37], [38]

Thời gian nuôi cấy trung bình từ 2 đến 3 tuần, các nghiên cứu có thờigian ngắn nhất là 8 ngày và 9 ngày [19], [39], [40] Hầu hết các nghiên cứuđều sử dụng màng ối đã loại bỏ biểu mô làm nền nuôi cấy, [13], [16], [17],[19], [21], [20], [25], [24], [33], [34], [35], [38], [39], [40], [41] Rất ít nghiêncứu sử dụng giá thể fibrin [25] và nền polymer nhạy cảm nhiệt [37], [42]

Đã có rất nhiều tác giả áp dụng phương pháp nuôi bằng dịch treo tế bào

và thu được kết quả rất tốt

Amemiya T và cộng sự (2015) đã đồng nuôi cấy tế bào biểu mô niêmmạc miệng với lớp tế bào nuôi là 3T3 bị bất hoạt bởi mitomycin-C Mảnhniêm mạc miệng được sinh thiết ở vùng giữa má với kích thước 3mm, sau đó

xử lý qua enzyme Dịch treo tế bào được gieo lên giá thể là màng ối người vớimật độ 1x105 tế bào/cm2 Tấm biểu mô thu được có 6 hàng tế bào và biểu lộK3, K12 trên hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch [28]

Hirayama M và cộng sự (2012) xử lý mảnh mô sau sinh thiết bằng loại

bỏ mô liên kết phía dưới, sau đó cắt ra thành các mảnh nhỏ hơn, rồi xử lýbằng emzym Dịch tế bào được rửa và lọc Tế bào đáy thu được sẽ được gieotrên màng ối người với mật độ 1-2x105 tế bào/ml [24]

Priya và cộng sự (2011) xử lý mảnh mô trích thủ qua rửa 3 lần với PBS

có kháng sinh, sau đó cắt bỏ mô liên kết phía dưới và xử lý mảnh mô quadispase II ở 370C trong 45 phút, ức chế hoạt động của enzyme bằng môitrường dulbecco’s phosphate buffer saline, tiếp tục xử lý mảnh mô quatrypsin- ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) trong 45 phút, dịch tế bàođược ly tâm và nuôi cấy dưới dạng dịch treo [43]

1.3.1.2 Nuôi cấy bằng mảnh mô

Sau khi trích thủ, mảnh niêm mạc miệng được loại bỏ một phần môliên kết phía dưới bằng phương pháp cơ học rồi được đặt trực tiếp lên nềnnuôi cấy Đợi cho mảnh mô dính chặt thì thêm môi trường vào và tiếp tục quátrình nuôi Quy trình nuôi cũng thường kéo dài khoảng 14-21 ngày Màng ốithường được dùng làm giá thể trong phương pháp nuôi cấy này

Ưu điểm của phương pháp này là vẫn giữ được mô liên kết bên dướibiểu mô Điều này sẽ cung cấp sự hỗ trợ tốt nhất cho sự tăng sinh và biệt hóacủa các tế bào biểu mô Thao tác tiến hành cũng đơn giản hơn so với nuôi cấybằng dịch treo tế bào

Nhược điểm: sự tồn tại của mô liên kết bên dưới sẽ định hướng tế bàogốc biệt hóa thành dòng tế bào tại vị trí mô ban đầu Do đó, đôi khi tạo ra khókhăn trong việc biệt hóa tế bào theo hướng mong muốn Trong thành phầncủa tấm biểu mô nuôi tạo được ngoài tế bào biểu mô còn lẫn các tế bào liênkết Bề mặt tấm biểu mô vì thế mà gồ ghề, không thật sự bằng phẳng [4].

Theo tổng quan của Shortt và cộng sự (2007): trong số 17 nghiên cứu

về nuôi tạo tấm biểu mô thay thế cho giác mạc có tới 11 nghiên cứu sử dụngphương pháp mảnh mô [44]

Mỗi tác giả sử dụng một phương pháp nuôi cấy khác nhau phù hợp vớiđiều kiện và hoàn cảnh khác nhau

Madhira và cộng sự (2008) tiến hành phẫu tích dưới sự hỗ trợ của kínhhiển vi nhằm loại bỏ mô liên kết và mô mỡ bên dưới Mảnh sinh thiết sau

đó được rửa lại nhiều lần bằng dung dịch PBS (phosphate buffer saline) có

bổ sung kháng sinh, kháng nấm, rồi cắt thành các mảnh nhỏ và đặt lênmàng ối đã loại bỏ biểu mô Môi trường nuôi cấy được tác giả lựa chọngồm các thành phần dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) vàHam’s F12 với tỉ lệ 1:2, bổ sung yếu tố phát triển biểu mô, insulin,penicilin, streptomycin, amphotericin, gentamicin, và 10% huyết thanh bàothai bò (FBS-Fetal bovine serum) Thời gian nuôi cấy kéo dài 3 đến 4 tuần

ở điều kiện 370C với 5% CO2 [2]

Krishnan và cộng sự (2010) rửa mảnh mô sau trích thủ 3 lần với PBS,sau đó cắt thành các mảnh nhỏ rồi dính trực tiếp lên đĩa nuôi cấy Các đĩa nàysau khi được ủ ở điều kiện 370C và 5% CO2 trong vòng 5 phút để tăng cường

sự kết dính, sẽ được bổ sung 2ml môi trường gồm DMEM và F12 với tỉ lệ1:1, 50ng/ml streptomicin, 1,25ng/ml amphotericin B, 2ng/ml EGF, 5ng/mlinsulin, 5ng/ml transferrin, 5ng/ml selenium, 5mg yếu tố phát triển tế bàosừng, 0,5mg/ml hyrocortisone, 10% huyết thanh bào thai bò [45]

Cũng sử dụng phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô, Sen và cộng sự(2011) rửa mảnh mô 5 lần trong DMEM rồi cắt nhỏ thành các mảnh có kíchthước 1mm và dính trực tiếp vào màng ối [46].

1.3.1.3 Nuôi cấy bằng mảnh biểu mô và sử dụng lớp tế bào nuôi là nguyên bào sợi tự thân

Đây là phương pháp đã được nghiên cứu và công bố bởi bộ môn Mô Phôi trường đại học Y Hà Nội năm 2013 [4]

-Về cơ bản thì phương pháp này khá giống với nuôi cấy bằng mảnh mô.Chỉ khác ở chỗ, sau khi trích thủ, mảnh niêm mạc miệng được xử lý bằngenzym rồi loại bỏ hoàn toàn mô liên kết phía dưới bằng phương pháp cơ học.Mảnh biểu mô còn lại sẽ được đặt trực tiếp lên nền nuôi cấy Đợi mảnh biểu

mô dính chặt, cho môi trường nuôi cấy vào và tiếp tục quá trình nuôi cho đếnkhi thu hoạch Môi trường này bao gồm các chất dinh dưỡng và các tác nhânkích thích phân bào, giúp các tế bào gốc biểu mô tăng sinh rồi di cư ra khuvực xung quanh Trong phương pháp nuôi bằng mảnh biểu mô, loại giá thểhay được sử dụng hơn cả cũng là màng ối

Ưu điểm của phương pháp này là kỹ thuật đơn giản hơn so với nuôi cấybằng dịch treo tế bào Tấm biểu mô nuôi tạo được đơn thuần chỉ có tế bàobiểu mô, không bị lẫn với tế bào liên kết Bề mặt tấm biểu mô vì thế màphẳng và thuần nhất hơn so vơi phương pháp nuôi bằng mảnh mô [4]

Nguyễn Thị Bình và cộng sự (2013) đã nghiên cứu thành công quytrình nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng và sử dụng lớp tếbào nuôi tự thân Mảnh niêm mạc miệng được trích thủ có kích thước 3mm,sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ hơn rồi sử lý ngâm trong dispase Dưới

sự hỗ trợ của kính hiển vi, mảnh biểu mô được bóc tách ra khỏi mô liên kết

và dán lên màng ối Phần mô liên kết còn lại sẽ được sử dụng để tạo lớp tếbào nuôi [4]

Kolli S (2014) cũng áp dụng phương pháp nuôi bằng mảnh biểu mô.Mảnh niêm mạc sau sinh thiết có đường kính 3mm, được ngâm trong môitrường nuôi cấy cơ bản có bổ sung penicillin/ streptomycin (1%) vàamphotericin B (2.5mg/ml) Dưới sự hộ trợ của kính hiển vi, tác giả cắt mảnh

mô ra thành các mảnh nhỏ hơn rồi bóc tách biểu mô ra khỏi mô liên kết bêndưới Mảnh biểu mô được dán lên màng ối đã loại bỏ biểu mô, sau đó đồngnuôi cấy với lớp tế bào nuôi là 3T3 bất hoạt [13]

1.3.2 Các loại giá thể dùng trong nuôi cấy

Thành phần quan trọng trong cấu trúc của tấm biểu mô nuôi cấy đó làgiá thể Giá thể tạo nền cho các tế bào biểu mô bám vào, tăng sinh và biệthóa Một giá thể lý tưởng cho nuôi tạo tấm biểu mô phải đảm bảo các tiêuchuẩn về tính phù hợp sinh học, độ xốp, ổn định sinh học và đặc tính vật lý

Các loại giá thể được dùng chủ yếu trong nuôi cấy niêm mạc miệng gồm:

 Giá thể có nguồn gốc tự nhiên:

 Chân bì da không có tế bào

Loại giá thể này có độ bền tốt và tính kháng nguyên giảm; khả năng giữlại thuộc tính cấu trúc của nó, thậm chí sau khi được đông lạnh, đông khô, vàbảo quản trong glycerol [5] Các tấm biểu mô nuôi tạo trên giá thể là chân bì

da không tế bào đã được chứng minh là có cấu trúc mô học và đặc tính miễndịch khá giống với niêm mạc miệng người bình thường [47], [48]

 Màng ối:

Một trong những vật liệu sinh học đầu tiên được sử dụng làm giá thể

đó là màng ối, và cho đến nay thì đây cũng là loại giá thể được sử dụngrộng rãi nhất

Về mô học, màng ối là lớp trong cùng của màng bọc thai Nó bao gồmmột biểu mô lát đơn, một màng đáy dày, và một chất nền vô mạch [49]

Trong nuôi tạo tấm biểu mô, màng ối đóng vai trò quan trọng vì nó mang cácđặc tính vượt trội sau:

1-Tính chất vật lý: tính chun giãn, tính trong suốt, mềm mại, nhẵnbóng, mỏng, khó rách

2-Màng ối thúc đẩy tạo biểu mô sau khi cấy ghép qua các yếu tố tăngtrưởng như EGF, yếu tố phát triển tế bào sừng (KGF-Keratinocyte growthfactor), yếu tố phát triển tế bào gan (HGF-Hepatocyte growth factor) vàFGF [50]

3-Màng ối làm giảm TGF-β và sự biểu hiện receptor của nó trênnguyên bào sợi, nhờ đó làm giảm nguy cơ xơ hóa; ức chế hoạt độngproteinase [51] Vì vậy, màng ối có vai trò làm lành vết thương qua việc thúcđẩy tái tạo cấu trúc mô hơn là hình thành mô sẹo [52]

4-Mô đệm của màng ối có đặc tính kháng viêm do ức chế hoạt độngcủa các cytokine IL-1α và IL-1β trong các tế bào biểu mô [53], ngăn chặn sựxâm nhập của bạch cầu đa nhân và đại thực bào [54]

5-Tế bào biểu mô màng ối không biểu hiện kháng nguyên bạch cầungười (HLA-Human leukocyte antigen) -A,-B,-D và kháng nguyên -DR trên

bề mặt; vì thế, sau khi ghép, hiện tượng thải loại mảnh ghép cấp tính là khôngxảy ra [49]

6-Màng ối là một nguyên liệu dễ lấy, dễ xử lý, có thể bảo quản đượctrong thời gian dài ở -800C [14]

Cấu trúc bề mặt của màng ối giống với màng đáy của biểu mô kết mạc

vì có chứa fibronectin, collagen typ IV, V, laminin-1, laminin-5 [55], vàgần giống màng đáy của biểu mô giác mạc [56] Từ những nghiên cứu trênlâm sàng và trong phòng thí nghiệm đã cho thấy rằng màng ối chính là vậtliệu thích hợp nhất để sử dụng trong nuôi tạo tấm biểu mô dùng cho ghépgiác mạc

 Giá gieo nguyên bào sợi

Các nguyên bào sợi trong các giá thể này tổng hợp ra chất nền ngoại bào

và các yếu tố tăng trưởng trong vòng 2-3 tuần, tạo ra chất nền giống chân

bì [5]

 Giá thể nền collagen

Collagen nguyên chất: hỗ trợ cho nguyên bào sợi phát triển, từ đó tạo

ra môi trường thuận lợi cho sự phát triển của tế bào biểu mô Chất nềncollagen có tính phù hợp sinh học rất tốt, nhưng chúng lại bị giáng hóa khánhanh và có đặc tính lý học nghèo nàn Liên kết chéo của các collagen tronggiá thể tạo ra sự ổn định sinh học và hóa học, nhưng đồng thời lại làm tăngkhả năng canxi hóa không mong đợi [57]

Collagen phức hợp: Có rất nhiều sản phẩm giá thể nền collagen được

biết đến như: giá collagen-chitosan [57], màng collagen-elastin [58], chất nềncollagen-glycosaminoglycan (C-GAG) [59] và collagen-GAG-chitosan (CGC)[60], [61] Nguyên bào sợi được nuôi trong CGC thì tổng hợp collagen mạnhhơn khi chỉ có nguyên bào sợi là lớp tế bào nuôi đơn độc

 Giá thể nền gelatin

Gelatin là dạng biến tính của collagen Các loại gelatin như glucan, gelatin-hyaluronate, gelatin-chitosan-hyaluronic acid đã được pháttriển trong công nghệ mô da Ưu điểm của loại giá thể này: không có tínhkháng nguyên, hấp dẫn nguyên bào sợi, hoạt hóa đại thực bào, thúc đẩy sựbiểu mô hóa và hình thành mô hạt Glucan kháng khuẩn, kháng virut, chốngđông và thúc đẩy làm lành vết thương Hyaluronic acid được thêm vào để cảithiện đặc tính sinh lý và sinh học của giá thể [62]

gelatin- Giá thể nền fibrin

Ưu điểm vượt trội của loại giá thể này là dễ ghép, giảm thời gian phẫuthuật bởi khi ghép không cần những đường khâu để cố định Tấm biểu mô

nhanh chóng tạo ra sự kết dính mạnh mẽ với mô đệm bên dưới trong giai đoạnsớm sau mổ [63], [64], [65] Tuy nhiên, nhược điểm là giá thành cao, chấtlượng khác nhau giữa các hãng, không thể sản xuất với số lượng lớn [5].

 Giá thể tổng hợp

Màng thấm polycarbonate đang được sử dụng trên thị trường dùng để tạocác tấm biểu mô có độ dày vừa phải Ưu điểm của loại giá thể này: có đặctính vật lý tốt và không sợ nguy cơ truyền bệnh Tuy nhiên, sự gắn kết giữacollagen và fibrin vào các lỗ của giá thể vẫn chưa được tốt [66]

 Giá thể lai

Vật liệu này là nền bán tổng hợp, tạo ra bởi este benzyl của hyaluronan

Nó có tính phù hợp sinh học và thoái hóa sinh học tốt trong thực tế cũng nhưtrong phòng thí nghiệm

 Nền polymer nhạy cảm nhiệt

Đây là phương pháp nuôi cấy không sử dụng giá thể để tạo tấm biểu mô.Phương pháp này lần đầu tiên được nhắc đến bởi Nishida và cộng sự 2004[67] Kỹ thuật này sử dụng đĩa nuôi cấy được phủ bởi polymer nhạy cảm vớinhiệt độ Khi thu hoạch, các tế bào nuôi cấy có thể được tách ra thành dạngtấm tế bào liên tục nhờ các mối liên kết giữa tế bào - tế bào mà vẫn giữ đượccác phân tử ngoại bào ở mặt dưới của tấm tế bào [68], [69]

1.3.3 Lớp tế bào nuôi

 Nguyên bào sợi

Nguyên bào sợi là tế bào có hình sao, nhân hình trứng, có nhiều nhánhbào tương dài ngắn khác nhau, nhưng không liên hệ với nhánh bào tương của

tế bào bên cạnh Trong bào tương giàu lưới nội bào có hạt, bộ Golgi pháttriển, giàu túi chế tiết và không bào Nguyên bào sợi tổng hợp procollagen,glycosaminoglycan và glycoprotein đưa vào khoảng gian bào, đây là các

nguyên liệu tạo thành sợi liên kết Ngoài ra, nguyên bào sợi còn tổng hợpcollagenase, enzyme tham gia vào quá trình thoái biến sinh học của collagentrong điều kiện pH khoảng 7,0 Nguyên bào sợi cùng với các tế bào biểu môtham gia vào tạo các thành phần của màng đáy [70] Khi mô tổn thương,nguyên bào sợi tăng sinh, di cư, cô lập và sửa chữa vết thương [11]

Nguyên bào sợi đóng vai trò quan trọng trong việc tạo kiểu hình biểu

mô, liên kết các tế bào và sự biểu hiện dấu ấn keratin của các tế bào [71],[72], [73] Nếu không có nguyên bào sợi ở trong chất nền, biểu mô sẽ dừngtăng sinh, trong khi sự biệt hóa vẫn tiếp tục Sự tăng sinh và biệt hóa biểu môphụ thuộc vào các yếu tố được sản xuất bởi nguyên bào sợi

Vì những ưu điểm đó, nguyên bào sợi là đối tượng được yêu thích trongnghiên cứu sinh học tế bào Trong nuôi cấy tế bào, nguyên bào sợi được sửdụng với vai trò là lớp tế bào nuôi để hỗ trợ cho sự tăng sinh, biệt hóa của các

tế bào biểu mô, duy trì tiềm năng của dòng tế bào gốc[11]

 Việc sử dụng lớp tế bào nuôi trong nuôi cấy

Tế bào nuôi có thể xuất phát từ nhiều nguồn gốc khác nhau: nguyên bàosợi 3T3 chuột, tế bào gốc trung mô chuột, nguyên bào sợi của người, tế bàogốc trung mô người Lý tưởng nhất vẫn là nguyên bào sợi tự thân ở đúngvùng mô liên kết tương ứng với biểu mô muốn nuôi cấy Điều này đảm bảocho tương tác biểu mô-mô liên kết hoàn hảo nhất, song điều này không phảiluôn dễ thực hiện

Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạcmiệng đều sử dụng lớp tế bào nuôi là 3T3 [13], , [39], [40], [42], [43] Đây làlớp nguyên bào sợi chuột bất hoạt

Nguyên bào sợi trước khi sử dụng phải được bất hoạt bằng chiếu xạ hoặcbằng mitomycin-C để tránh sự sinh sản thêm của tế bào này 3T3 làm tăngkhả năng sống của nhiều tế bào biểu mô bao gồm tế bào sừng, tế bào biểu mô