XÂY DỰNG QUY TRÌNH xác ĐỊNH đột BIẾN GEN CYP1B1 gây BỆNH GLÔCÔM bẩm SINH NGUYÊN PHÁT

ĐỖ THỊ HƯƠNG LANXÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Hà Nội - 2017... ĐỖ THỊ HƯƠNG LANXÂY DỰNG QUY TRÌNH

ĐỖ THỊ HƯƠNG LAN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN

CYP1B1 GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH

NGUYÊN PHÁT

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Hà Nội - 2017

ĐỖ THỊ HƯƠNG LAN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN

CYP1B1 GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH

NGUYÊN PHÁT

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số : 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Trần Huy Thịnh

Hà Nội - 2017

A Adenin

DNA Deoxyribonucleotid acid

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3

1.1.1.Khái niệm và phân loại glôcôm bẩm sinh 3

1.1.2 Dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát 4

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh và tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh 5

1.1.4 Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát 7

1.2 Cơ chế bệnh học phân tử 7

1.2.1 Cấu trúc và vị trí gen CYP1B1: 7

1.2.2 Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen CYP1B1 8

1.3.Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 11

1.4 Phương pháp phát hiện đột biến gen CYP1B1 16

1.4.1 Phương pháp PCR 16

1.4.2 Phương pháp giải trình tự gen 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1.Nhóm bệnh 20

2.1.2 Nhóm chứng 21

2.2 Phương tiện nghiên cứu 21

2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 21

2.2.2 Hoá chất 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: 23

2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 24

2.4 Nội dung nghiên cứu 25

2.5 Các bước tiến hành 25

2.5.1.Chẩn đoán và phân loại bệnh nhân: 25

2.5.2 Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân đã được chọn 26

2.5.3 Xác định đột biến gen CYP1B1 33

2.5.4 Xác định tỷ lệ đột biến gen trên các nhóm bệnh nhân, so sánh sự khác biệt 33

2.6 Xử lý kết quả 33

3.1 Kết quả phân tích đột biến gen CYP1B1 35

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA 35

3.2.2 Kết quả xác định đột biến gen CYP1B 35

3.2 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 35

3.2.1 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 35

3.2.2 Phân bố bệnh nhân theo tuổi phát hiện 35

3.2.3 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng lâm sàng 35

3.2.4 Một số đặc điểm khác 36

3.3 Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 36

3.4 Mối liên quan giữa đột biến gen và các đặc điểm đối tượng 36

3.4.1 So sánh tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo giới 36

3.4.2 So sánh tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo tuổi khởi phát 37

3.4.3 So sánh tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo triệu chứng 37

3.4.4 So sánh tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo tiền sử gia đình 38

3.4.5 So sánh tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo tiền sử thai nghén 38

3.4.6 So sánh tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo bệnh, tật bẩm sinh kèm theo 39

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 40

4.1 Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 40

4.2 Mục tiêu 2: Bước đầu xác định tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 40

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 41

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR 29 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.3 Thành phần master mix 32

Hình 1.1 Dấu hiệu lâm sàng glôcôm bẩm sinh nguyên phát 5

Hình 1.2 Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 8

Hình 1.3 Cấu trúc gen CYP1B1 8

Hình 1.4 Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1 10

Hình 1.5 Sự di truyền trong các thành viên 24 gia đình Saudi Arabian 13

Hình 1.6 Phân bố các loại đột biến CYP1B1 trên toàn thế giới 14

Hình 1.7 Giải trình từ gen CYP1B1, đột biến mới là p.V419GfsX11 15

Hình 1.8 Các bước cơ bản của phản ứng PCR 17

Hình 1.9 Phương pháp giải trình tự gen 19

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 24

và chuyển hóa Những tổn thương gen thường xảy ra sớm nhất, được lưu giữtrong bộ gen của người bệnh và có khả năng truyền lại cho các thế hệ sau.Mặc dù không phổ biến như một số nhóm các bệnh lý khác nhưng thực tế chothấy rằng hàng năm có một số lượng lớn trẻ sinh ra bị dị tật hoặc mắc cácbệnh lý di truyền Đây là nhóm bệnh lý gây rất nhiều khó khăn trong điều trị

và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thần cũng như chất lượng cuộcsống Y học hiện đại đang từng bước tìm ra phương hướng phát hiện sớm vàđiều trị can thiệp trúng đích nhằm giải quyết tận gốc căn nguyên của bệnh

Glôcôm là một bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ở hầuhết các nước là nguyên nhân thứ hai gây mù có thể phòng và chữa được, và làmối đe dọa nguy hiểm đối với sức khỏe cộng đồng [1]

Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là tình trạng tăng nhãn áp do sự pháttriển bất thường của hệ thống thoát lưu thủy dịch, gây tổn hại đến cấu trúcmắt, dẫn đến mất thị giác Bệnh xuất hiện ở trẻ từ khi sinh đến 3 năm tuổi.Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể cải thiện đáng kể thị lực của trẻ[2] Đây là bệnh hiếm gặp và là một thử thách chẩn đoán và điều trị cho cácbác sĩ nhãn khoa.Tỷ lệ bệnh thay đổi theo các quốc gia và nhóm dân tộc Tỷ

lệ mắc ở các nước phương Tây (Ireland, Anh, Mĩ) khoảng 1/10.000 đến1/70.000 Tại Ả Rập Xê-út, miền Nam Ấn Độ, và Slovakia, tỷ lệ mắc 1/ 1.250

và 1/3300 Ở Trung Quốc, tỷ lệ này chiếm 5 1% tất cả các rối loạn mắt bẩmsinh Tuổi trung bình của glôcôm bẩm sinh nguyên phát sớm hơn ở các chủng

có tỷ lệ cao hơn: khoảng từ 3 đến 4 tháng (người châu Á, người Arabians vàngười Ấn Độ); 11 tháng (các nước phương Tây) Mặc dù tỷ lệ và tuổi khácnhau, nhưng tỷ lệ phần trăm nam giới ở cả người châu Á và phương Tây làkhoảng 65% [3]

Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liênkết nhiễm sắc thể thường, phổ biến ở trẻ em [4] Những nghiên cứu ở mức độ invitro và in vivo đã chỉ ra rằng protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng nhấttrong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng của mắt Đột biến genCYP1B1 chủ yếu là đột biến điểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen; tỉ lệphát hiện đột biến CYP1B1 cũng mang tính đặc trưng cho từng chủng tộc, ởchâu Á khoảng 30% Bệnh biểu hiện bệnh ở cả hai mắt với các mức độ khácnhau [5], [6], [7] [8]

Hiện nay ở Việt Nam những nghiên cứu về đột biến gen CYP1B1 trênbệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát còn rất ít và chưa đồng bộ Việc pháthiện và xác định tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinhnguyên phát sẽ đưa ra nhìn nhận, đánh giá phù hợp về tình hình bệnh, giúpcác bác sĩ lâm sàng kịp thời phát hiện, tăng hiệu quả điều trị và nâng cao chất

lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Do vậy, đề tài: ”Xây dựng quy trình xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát”

được thực hiện với mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát.

2 Bước đầu xác định tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

1.1.1.Khái niệm và phân loại glôcôm bẩm sinh

Glôcôm bẩm sinh là một dị tật của nhãn cầu, gây ra hội chứng tăng nhãn

áp nghiêm trọng ở mắt trẻ từ lúc mới sinh đến tuổi thanh thiếu niên Bệnh có thểnguyên phát hoặc thứ phát phối hợp với một dị dạng toàn thân hoặc tại mắt Hậuquả của tăng nhãn áp là thể tích nhãn cầu, nhất là bán cầu trước tăng rất nhanh vàrối loạn trầm trọng đến chức năng thị giác Glôcôm bẩm sinhđược phân làm:

- Glôcôm bẩm sinh nguyên phát: liên quan bất thường hệ thống thoát lưuthể dịch (glôcôm do rối loạn góc tiền phòng): chiếm 50-70% glôcôm bẩm sinh

- Glôcôm bẩm sinh thứ phát: kèm theo những bất thường ở các phầnkhác của mắt)

* Glôcôm bẩm sinh nguyên phát:

Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát được Shaffer và Weissđịnh nghĩa:

“Glôcôm di truyền phổ biến nhất ở trẻ em, di truyền theo NST thường, lặn,với bất thường đặc biệt về góc gồm không có sự lùi điểm gắn chân mống tạogóc tại vùng bè và không kèm theo bất thường phát triển nào khác Tăng nhãn

áp là nguyên nhân gây giác mạc to, đục và chảy nước mắt do rạn màngDescemet.”

Việc phát hiện và điều trị sớm bệnh có thể ngăn ngừa dẫn đến mù lòaBệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát phần lớn được phát hiện muộn sau khisinh, tỉ lệ cao hơn ở con trai (65%) so với con gái (35%) Bệnh thường ở haimắt với mức độ khác nhau Triệu chứng thường gặp nhất là sợ ánh sáng, chảynước mắt, và co quắp mi Những triệu chứng này thường khiến cha mẹ bệnhnhân lưu ý [1]

1.1.2 Dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát

Tổng số bệnh nhân tăng nhãn áp trên thế giới khoảng 105 triệu người,trong đó tăng nhãn áp bẩm sinhảnh hưởng đến 300000 trẻ (1,3%) [9]

Tỷ lệ bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát có tần suất khoảng 1/10.000đến 1/20.000 trẻ sinh sống ở các nước châu Âu và Mỹ Trong khi đó tỷ lệ nàyrất cao ở cộng đồng có cha mẹ cùng huyết thống như Ấn Độ 1/3.300, TrungĐông 1/2.500 và 1/2.250 ở Slovakia hay Rumani Bệnh chiếm 55% tổng sốglôcôm nguyên phát trẻ em Ở Nhật Bản, trẻ nữ bị nhiều hơn nam trong khi ở

Mỹ và châu Âu thì trẻ nam mắc nhiều hơn với tỷ lệ 3:2 Bệnh xảy ra trên khắpthế giới không ưu thế rõ rệt về chủng tộc cũng như địa lý Tuy hiếm gặpnhưng đây là một trong hai nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở trẻ nhỏ [9],[10] Hầu hết các trường hợp glôcôm bẩm sinh nguyên phát xảy ra ở cả haimắt (65 - 80%) với mức độ bệnh thường không tương đương nhau Khoảng25% khởi bệnh lúc sinh, 60% trẻ được chẩn đoán dưới 6 tháng tuổi và 80%xuất hiện trong năm tuổi đầu tiên Khó khăn là ở chỗ bệnh thường phát hiệnmuộn, các phương pháp chỉ định không đúng, trẻ không được theo dõi hay tưvấn di truyền không hiệu quả [12]

Tại Hà Nội, trong khoảng 5-10 năm trở lại đây, có một số lượng lớn trẻsinh ra bị bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, tuy nhiên các trẻ này thường đượcphát hiện bệnh muộn, điều trị, tiên lượng, theo dõi không kịp thời, chặt chẽ dẫnđến mù lòa, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của trẻ và gia đình Cácnghiên cứu trước đây mới chỉ đề cập về tỉ lệ mắc bệnh, biểu hiện lâm sàng,kết quả điều trị phẫu thuật thành công rất thấp (trung bình khoảng 30%) vàcác biến chứng rất nặng nề Theo nghiên cứu “ Khảo sát các hình thái glôcômtrẻ em ở viện mắt TP HCM” của Phạm Chi Lan, tỷ lệ glôcôm bẩm sinh là41,7% ( phân tích trên 103 bệnh nhi glôcôm)

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh và tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh

* Cơ chế bệnh sinh:

Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gọi là glôcôm phát triển vì cơchế gây bệnh là do ngừng, kém phát triển của góc mống mắt – giác mạc ở giaiđoạn thai kỳ làm tăng kháng trở thoát lưu thủy dịch Đồng thời, sự di trú bấtthường và kém biệt hóa tế bào mào thần kinh đưa đến khiếm khuyết ở cácmức độ khác nhau của hệ thống lưới bè và ống Schlem gây ra sự phát triểnbất thường của hệ thống thoát lưu thủy dịch [1]

* Triệu chứng lâm sàng:

Tam chứng kinh điển: chảy nước mắt; sợ ánh sáng và co quắp mi.Ngoài ra còn gặp mắt lồi to

- Giác mạc to, đường kính ngang > 12mm trong năm đầu

- Rạn màng Descemet (đường Haabs)

- Phù giác mạc: phù biểu mô giác mạc đơn thuần do tăng nhãn áp.Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tiến triển kéo dài có thể gây phù nhu mô giácmạc vĩnh viễn

Hình 1.1 Dấu hiệu lâm sàng glôcôm bẩm sinh nguyên phát

http://www.dieutri.vn/upload/mat34.gif

- Củng mạc: mỏng và dãn làm tăng khả năng thấy được màng bồ đàobên dưới ở trẻ sơ sinh, tạo nên củng mạc có màu xanh (Có thể xảy ra đền khitrẻ 10 tuổi)

- Chiều dài trục nhãn cầu ở trẻ sơ sinh bình thường từ 17,5 – 20mm, đạt22mm lúc 1 tuổi Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát, chiều dài trục nhãncầu tăng gây cận thị trục tiến triển

- Nhãn áp: bình thường nhãn áp trẻ sơ sinh là 11,4 ± 2,4 mmHg Trẻdưới một tuổi, nhãn áp < 21mmHg

- Chụp gai thị bằng máy chụp đáy mắt giúp đánh giá tình trạng bệnhglôcôm và tiến triển bệnh theo thời gian

* Tiêu chuẩn chẩn đoán:

+ Bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát điển hình khi có từ 4 triệuchứng trở lên:

 Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg

 Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng

 Đường kính giác mạc to bất thường ≥ 12 mm

 Giác mạc phù, mờ đục

 Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ chức bất thường

 Tổn hại lõm teo gai thị trong bệnh glôcôm

+ Bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát không điển hình: thuộc mộttrong các trường hợp sau đây:

 Nhãn áp cao và giác mạc to

 Nhãn áp cao và đục giác mạc

 Giác mạc to và đục

1.1.4 Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát

Mục tiêu điều trị là kiểm soát được nhãn áp bằng phẫu thuật hoặcthuốc, điều chỉnh tật khúc xạ và điều trị nhược thị

1.2 Cơ chế bệnh học phân tử

Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liênkết nhiễm sắc thể thường, phổ biến ở trẻ em [4] Những nghiên cứu ở mức độ invitro và in vivo đã chỉ ra rằng protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng nhấttrong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng của mắt Đột biến genCYP1B1 chủ yếu là đột biến điểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen; tỉ lệphát hiện đột biến CYP1B1 cũng mang tính đặc trưng cho từng chủng tộc, ởchâu Á khoảng 30% Theo Khan và cộng sự, 90% những người mang đột biếngen CYP1B1 sẽ biểu hiện bệnh ở cả hai mắt với các mức độ khác nhau [5], [6],[7] [8]

1.2.1 Cấu trúc và vị trí gen CYP1B1:

Tên khoa học chính thức của gen CYP1B1: "cytochrome P450, family

1, subfamily B, polypeptide 1”

Ngoài ra gen CYP1B1 còn được gọi với các tên khác như: arylhydrocarbon hydroxylase, CP1B, CP1B1_HUMAN, cytochrome P450 -subfamily I (dioxin - inducible) - polypeptide 1, flavoprotein - linkedmonooxygenas, microsomal monooxygenase, xenobiotic monooxygenase

Năm 1994, Sutter và cộng sự đã xác định được gen CYP1B1 gồm 543axit amin và là mộtphân họ gen mới của cytochrome P450, P4501B1 Bằngcách phân tích tế bào sinh dưỡng của người và động vật gặm nhấm, tác giả đãlập bản đồ gen CYP1B1 và xác định gen nằm trên NST 2 [13]

Hình 1.2 Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 [30]

https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP1B1/location.png

Năm 1996, Tang và cộng sự đã phát hiện ra gen CYP1B1 nằm trênnhánh ngắn NST 2 tại vị trí 2p22.2 và bao gồm 3 exon, phần mã hóa gen bắtđầu từ exon thứ 2, chiều dài gen là 1629 cặp base [14] Từ việc xác định vị trínối intron/exon của gen CYP1B1, Stoilov và cộng sự (1997) đã chỉ ra genCYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài12kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631base Cụ thể hơn ,các gen CYP1B1 nằm từ cặp base số 38.067.603 đến38.076.181 [15] Trong một loạt nghiên cứu về nhiễm sắc thể 2, vùng chứagen CYP1B1 đã được xác định là GLC3A [16]

Hình 1.3 Cấu trúc gen CYP1B1

Nguồn ảnh : http://images.slideplayer.com/16/5117288/slides/slide_8.jpg

1.2.2 Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen CYP1B1

Gen CYP1B1 là một phân họ của cytochrome P450.Cytochromes P450

là một nhóm monooxygenases heme-thiolate Trong microsome gan, enzym

này có liên quan đến con đường vận chuyển điện tử phụ thuộc NADPH Nóoxy hoá một loạt các hợp chất không liên quan cấu trúc, bao gồm steroid, axitbéo, retinoid và các chất bài tiết dục CYP1B1 oxy hóa 17beta-estradiol vớidẫn chất 4-hydroxy sinh ra chất gây ung thư, và một loạt các hợp chấtprocarcinogenic với các dạng hoạt hóa của chúng, bao gồm các hydrocarbonthơm đa vòng, tăng cường sự hình thành mạch bằng cách loại bỏ các sảnphẩm oxy hóa tế bào, do đó làm giảm stress oxy hóa, giải phóng ra yếu tốchống lại sự biến dưỡng Thrombospondin 2 (THBS2), sau đó cho phép dichuyển các tế bào nội mô, sự kết dính tế bào và hình thái mao dẫn Nhữngthay đổi này đi kèm với hoạt động tổng hợp nitric oxide nội bộ và tổng hợpnitric oxide CYP1B1 đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tăngtrưởng, di cư và sự sống còn của tế bào quanh mắt thông qua điều chế trạngthái oxy hoá nội bào biểu hiện và / hoặc hoạt động của NF-kappa-B trongquá trình hình thành mạch, đóng góp vào sự ổn định oxy hóa và sự tổ chức vàchức năng siêu cấu trúc của các mô lưới lưới chàm thông qua điều chế biểuhiện POSTN (Periostin) [31] Đột biến ảnh hưởng đến enzym thường tạo racác đột biến lặn Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường có khảnăng bù đắp chức năng cho alen bị đột biến Từ quan điểm này, một kiểu hìnhlặn như glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gây ra bởi đột biến trong một loạienzym như CYP1B1 là hợp lý.

Trong quá trình hình thành và phát triển nhãn cầu, chức năng củaCYP1B1 chưa rõ ràng, nhưng nó được giả thiết rằng đóng một vai trò trong việchình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng có thể tham gia vào mộtquá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch

Schwartzman và cộng sự năm 1987 đã xác định có mối liên quan giữaarachidonate phụ thuộc cytochromeP450 với ức chế Na+, K+-ATPase trong giácmạc trong việc điều chỉnh tính trong suốt của giác mạc và tiết thủy dịch Pháthiện này phù hợp với mờ đục của giác mạc và tăng nhãn áp, hai tiêu chuẩn chẩnđoán chính cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát [18]

Stoilov I (2000) đã đưa ra giả thuyết rằng CYP1B1 chuyển hóa một phân

tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hoặc hợp chất prostanoid) cầnthiết cho phát triển bình thường và chức năng của mắt Hoạt động của CYP1B1

có thể dưới hai dạng: tạo ra một hợp chất hoạt động trên một số mục tiêu hoặcngừng tác dụng của các hợp chất sinh học khác và chiếm vị trí của nó Tuy nhiêncác phân tử này được chuyển hóa bởi quá trình kích hoạt có tổ chức của cácenzym Vì vậy, CYP1B1 có thể thuộc về một con đường tín hiệu sinh hóa nộisinh chưa được biết rõ, liên quan đến trưởng thành cuối cùng của góc tiền phòng.Đột biến gen CYP1B1 sẽ gây ra rối loạn sản xuất enzym, làm bất thường cấutrúc mạng lưới vùng bè, nơi có các ống tuyến giúp lưu thoát thủy dịch khỏi mắt

Sự ứ trệ thủy dịch này làm tăng nhãn áp gây bệnh glôcôm [19]

Hình 1.4 Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1

Có sự khác biệt về đích tác động của thể hoang dại và thể đột biến củaphân tử CYP1B1 Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng củalưới nội nguyên sinh Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của

một số đối tác oxy hóa khử P450 reductase P450 reductase có khả năng đưamột nguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó Khi đó có 2 khả năng xảyra: (B) trường hợp cơ chất được hoạt hóa và tác động trên mục tiêu xuôi dòngchưa được biết Tuy nhiên, oxy phân tử có thể làm tăng khả năng ưa nước của

cơ chất và làm dễ dàng cho sự bài tiết và thanh lọc cơ chất từ trong tế bào.Bởi vậy, đột biến CYP1B1 có thể làm thay đổi 2 khả năng trên (C) sự điềuhòa không gian và thời gian của các gen kiểm soát phát triển của góc tiềnphòng sẽ bị thay đổi bởi sự vắng mặt của phân tử điều hòa (ví dụ như steroid)được sản sinh bởi CYP1B1 Bên cạnh đó, những dấu hiệu dừng phát triển củagóc tiền phòng được quan sát thấy trong góc tiền phòng của glôcôm bẩm sinhnguyên phát có thể phản ánh ảnh hưởng của một quá trình chuyển hóa có thểđược giới hạn và loại bỏ bởi phân tử CYP1B1 [19]

Một nghiên cứu khác đã chứng minh CYP1B1 chuyển hóa quá trìnhtổng hợp, oxy hóa 2 bước acid retinoic (RA) từ retinol RA là một phối tử chocác protein thụ thể điều chỉnh hình thái học CYP1B1 tham gia vào việc tạo ramột số morphogen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của lưới bè vàcác thành phần khác trong hệ thống thoát lưu thủy dịch bằng cách điều chỉnh

sự biểu hiện của các gen kiểm soát sự phát triển của góc tiền phòng, do đó độtbiến trong CYP1B1 sẽ làm thay đổi biểu hiện của các gen trên [32]

1.3.Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

* Lịch sử nghiên cứu:

Hippocrates (460-377 TCN), Celsius (thế kỷ thứ nhất) và Galen

(130-201 S) đã nhận ra sự mở rộng bẩm sinh của mắt, nhưng không liên quan đếntình trạng tăng nhãn áp Berger (1744) đề cập đến tăng nhãn áp, nhưng vàonăm 1869 Von Muralt đề cập đến buphthalmos cổ điển trong phạm vi giađình bệnh tăng nhãn áp Tuy nhiên, cả Von Muralt và Von Graefe đều chorằng tình trạng này là do viêm nội nhãn nguyên phát Vào cuối những năm

1800 và đầu những năm 1900 đã tiến hành các cuộc giải phẫu cơ thể chínhxác và bệnh lý học đã chỉ ra các dị dạng khác nhau của cấu trúc của góc tiềnphòng Những nghiên cứu như vậy được thực hiện bởi von Hippel (1897),Parsons (1904), Siegrist (1905), Gros (1897), Reis (1905-1911), Seefelder(1906-1920) và những người khác.

Vào đầu những năm 1900, glôcôm bẩm sinh dường như không thể chữatrị được và Anderson bình luận, "tương lai của bệnh nhân là bóng tối".Tiênlượng xấu của bệnh tăng nhãn áp trẻ sơ sinh Thay đổi đáng kể vào năm 1938với sự ra đời của Otto Barkan , người đã làm sống lại cuộc phẫu thuật người

Ý của Vincentis (1892), "bao gồm góc của mống mắt ở bệnh tăng nhãn áp" Năm 1949, Barkan miêu tả lưới bè (trabecular meshwork) Điều này đãđược xác nhận bởi Worst (1966), người gọi nó là màng Barkan Tuy nhiên,các nghiên cứu bệnh lý của Anderson, Hansson, Maul, Maumenee, và nhữngngười khác không thể tìm thấy sự tồn tại của bất kỳ màng như vậy bằng kínhhiển vi điện tử hoặc ánh sáng [11]

* Những nghiên cứu ngày nay về glôcôm bẩm sinh

Nghiên cứu của Basem A và cộng sự năm 1998 trên các gia đình Ả Rập

Xê Út có bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát cho kết quả sau

Gia đình / Gia đình (Số KKECG)

Đột biến trong Exon 2

Các đột biến trong Exon 3

35, 104, 107, 113, 116, 122 123, 125,

129, 132, 135, 137 139, 140, 148,

154, 157

3987G → A(G61E) a Loại hoang dã

(G61E)

7957G → A(D374N)

(G61E)

8242C → T(R469W)

Gia đình / Gia đình (Số KKECG)

Đột biến trong Exon 2

Các đột biến trong Exon 3

Theo nghiên cứu của Kiranpreet Kaur và cộng sự (2011), hơn 70 loạiđột biến trong CYP1B1 đã được mô tả (phụ lục 1) [32] Tỷ lệ này dao động từ20% ở Nhật Bản; 33,3% ở Indonexia; 44% ở Ấn Độ; 50% ở người Brazil Tỷ

lệ này tương đối cao (gần 100%) ở quần thể có giao phối cận huyết (Ả RậpArabian và Gypsy Slovakia) Phần lớn các đột biến này là đột biến sai nghĩa(misense mutation), rải rác trên suốt chiều dài gen, ảnh hưởng đến số lượngacid amin, do đó có thể can thiệp vào các tính chất cơ bản của protein nhưgấp, liên kết hem, chất nền và tương tác tác nhân oxy hóa

Hình 1.6 Phân bố các loại đột biến CYP1B1 trên toàn thế giới [32]

http://www.meajo.org/articles/2011/18/1/images/MiddleEastAfrJOphthalmolNhóm nghiên cứu Ni Li,Yong Zhou, Liang Du và các cộng sự đã thống kê(2011), trên thế giới đã tiến hành khoảng 655 nghiên cứu về đột biến genCYP1B1 trong bệnh glôcôm Cuối cùng, đột biến DNA trong gen CYP1B1 đãđược xác định trong 542 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát theo 52 bàibáo khoa học và 147 đột biến khác nhau đã được tìm thấy.Các loại đột biếngen xảy ra ở các chủng tộc trên thế giới là khác nhau [20]:

- Ở Trung Đông: các đột biến sai nghĩa 3987G>A (G61E)chiếm45,52% đột biến CYP1B1

- Tại Gypsies, đột biến sai nghĩa 7996G> A (E387K) chiếm 79,63%

Gần đây, ngày càng có nhiều nước tại châu Á nghiên cứu về đột biến genCYP1B1 nhằm phát hiện các đột biến gen hay gặp ở khu vực và góp phần tìm

ra cơ chế gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

Năm 2010, Nobuo Fuse và cộng sự nghiên cứu xác định vai trò của genCYP1B1 trên bệnh nhân Nhật nhận thấy có đột biến ở khoảng 20% bệnh nhânglôcôm bẩm sinh nguyên phát Đó là các đột biếnp Asp192Val, c.4776insAT,p.Val364Met, và p.Asp430Glu

Năm 2011, nghiên cứu tại Hàn Quốc đã phát hiện 22 bệnh nhânmang đột biến gen CYP1B1 trong số 85 bệnh nhân chẩn đoán bệnh glôcômbẩm sinh nguyên phát (25,9%) Trong tổng số 11 loại đột biến phát hiệntrong nghiên cứu này, đột biến hay gặp là đột biến lệch khung dịch mã(frameshift mutation) (c.970_971dupAT; p.T325SfsX104) và hai đột biến mới

Trong nghiên cứu tại Bắc Triều Tiên (2012) trên 85 bệnh nhân đã pháthiện 63 trường hợp mang đột biến gen (74,1%) Bên cạnh đó, có tác giả cũng

đề cập đến ảnh hưởng của gen với biểu hiện lâm sàng và kết quả điều trị Ởnhóm mang gen đột biến, bệnh thường biểu hiện sớm hơn, nặng hơn, xuấthiện ở cả hai mắt và kết quả điều trị kém hơn [23]

Trong nghiên cứu năm 2014 trên 238 bệnh nhân tại Trung Quốc, đã pháthiện 17,2% bệnh nhân mang gen CYP1B1 đột biến, trong đó có 9 đột biếnmới Tác giả cũng đưa ra kết luận tuổi xuất hiện bệnh trung bình ở nhóm có độtbiến gen sớm hơn (2 tháng tuổi) nhóm không có đột biến (6 tháng tuổi) [24]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu phát hiện đột biến gen trong một số bệnh lý

di truyền cũng đã bắt đầu được triển khai và thu được kết quả khá tốt như bệnhloạn dưỡng cơ Duchenne, thoái hóa cơ tủy, tăng sản thượng thận bẩm sinh, tạoxương bất toàn Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chính thức về đột biến gen gâybệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

1.4 Phương pháp phát hiện đột biến gen CYP1B1

PCR được dùng để khuếch đại gen CYP1B1trước khi tiến hành giảitrình tự gen xác định đột biến Kỹ thuật này đòi hỏi phải tối ưu điều kiện PCR

để có thể đưa ra sản phẩm PCR đặc hiệu, không có sản phẩm phụ, vạch rõ nét,giúp giải trình tự gen thu được kết quả tốt và không bị nhiễu

1.4.1 Phương pháp PCR

PCR là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm Nguyên tắc của phảnứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào: cần cóDNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác [25] Kỹ thuậtPCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp một mạch DNA mới

từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là bốn loại nucleotid Phản ứngđòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi, mồi ngược) có trình tự bổsung với hai đầu của trình tự DNA khuôn PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nốitiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn nhiệt độ khác nhau

Hình 1.8 Các bước cơ bản của phản ứng PCR

(Nguồn: Andy Vierstraete, 1999)

- Giai đoạn 1 (biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ cao(cao hơn nhiệt độ Tm) 94oC ÷ 95oC trong vòng từ 30 ÷ 60 giây

- Giai đoạn 2 (bắt cặp): nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm(temperature melting) của các mồi khoảng 40oC ÷ 70oCkhoảng 30 ÷ 60 giây

- Giai đoạn 3 (kéo dài): nhiệt độ tăng lên 72oC

1.4.2 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp của các nucleotid trong phân tử DNA

Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được cấu tạo

từ bốn loại nucletid khác nhau đó là: A (adenin), C (cytosin), G (guanin) và T(thymin) Các nucleotid này liên kết với nhau theo một thứ tự xác định Giảitrình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của bốn nucleotid này trên phân

Hiện nay phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến ở Việt Nam

và thế giới Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleotidetriphosphate) là các đồng phân của dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate),còn được gọi là “terminator” Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ có mộtđiểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở vị trí carbon 3 củadeoxyribose, là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào Do đó, phản ứng tổnghợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắn ngẫu nhiên vàothay cho dNTP [26],[27]

Hình 1.9 Phương pháp giải trình tự gen

Nguồn ảnh: http://mammoth.psu.edu/

Các phòng xét nghiệm hiện nay hầu hết đều giải trình tự bằng phản ứngenzym, nhưng khi làm giải trình tự thì dùng máy tự động chứ không dùng kỹthuật xạ ký tự ghi như trước đây nữa Tóm lại, sự ra đời của kỹ thuật PCR đãgiúp cho kỹ thuật giải trình tự có những tiến bộ vượt bậc về kỹ thuật cũng nhưphạm vi áp dụng, cho phép xác định trực tiếp trình tự của một DNA khuếchđại bằng PCR mà không qua tạo dòng.Kỹ thuật nhân bản DNA trong ốngnghiệm bằng PCR cũng giúp cải tiến phản ứng giải trình tự kém hiệu quảtrước đây trở nên hiệu quả hơn nhờ áp dụng polymerase giải trình tự bền vớinhiệt độ, để phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các chu kỳ nhiệt giốngnhư PCR, vì thế hiện nay gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự