MỘT số đặc điểm DỊCH tễ BỆNH TAY CHÂN MIỆNG và SINH học PHÂN tử VÙNG GEN VP1 của EV a71, CV a16 CV a6 lưu HÀNH tại hà nội, năm 2015 2018

Sự hướng dẫn tận tình và những kiến thức quý báu củacác cô đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình học tập, nghiên cứu khoahọc để em hoàn thành luận văn này.Em xin gửi cám ơn toà

TRẦN THỊ NGỌC ÁNH

MéT Sè §ÆC §IÓM DÞCH TÔ BÖNH TAY CH¢N MIÖNG

Vµ SINH HäC PH¢N Tö VïNG GEN VP1 CñA EV-A71, CV-A16 & CV-A6 L¦U HµNH T¹I Hµ NéI, N¡M 2015-2018

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI, 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRẦN THỊ NGỌC ÁNH

MéT Sè §ÆC §IÓM DÞCH TÔ BÖNH TAY CH¢N MIÖNG

Vµ SINH HäC PH¢N Tö VïNG GEN VP1 CñA EV-A71, CV-A16 & CV-A6 L¦U HµNH T¹I Hµ NéI, N¡M 2015-2018

Chuyên ngành: Vi sinh y học

Mã số : 60720115

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1.TS.BS Nguyễn Thị Kiều Anh 2.TS.BS Phạm Hồng Nhung

HÀ NỘI - 2019

Với tấm lòng của người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâusắc tới TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Phạm Hồng Nhung đã hướng dẫn tận tình,giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình học tập và nghiêncứu để thực hiện đề tài này Sự hướng dẫn tận tình và những kiến thức quý báu củacác cô đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình học tập, nghiên cứu khoahọc để em hoàn thành luận văn này.

Em xin gửi cám ơn toàn thể các anh chị nhân viên, kỹ thuật viên tại khoa Xétnghiệm- Chẩn đoán hình ảnh & Thăm dò chức năng, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tậtThành phố Hà Nội, TS Trần Thị Nguyễn Hòa và các anh chị - Khoa Vi rút đường ruột

- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện về mọi mặttrong quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, các chị kỹ thuật viên đã luôn giúp đỡ, tạo điềukiện, và động viên em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, các phòng banchức năng của Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho emhoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân trong gia đình vàbạn bè đã luôn ủng hộ em trong suốt quá trình làm đề tài

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019

Trần Thị Ngọc Ánh

Tôi là Trần Thị Ngọc Ánh, cao học khóa 26, trường đại học Y Hà Nội, chuyênngành Vi sinh y học Tôi xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS Phạm Hồng Nhung

2 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được sự chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin cam đoan những điều trình bày ở trên là hoàn toàn trung thực và chính xác

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019

Trần Thị Ngọc Ánh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương bệnh tay chân miệng 3

1.1.1 Sơ lược về bệnh tay chân miệng 3

1.1.2 Tác nhân gây bệnh tay chân miệng 5

1.1.3 Điều trị và phòng bệnh 5

1.2 Dịch tễ học bệnh tay chân miệng 5

1.2.1 Tình hình bệnh tay chân miệng trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình bệnh tay chân miệng ở Việt Nam 6

1.2.3 Một số nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng trên thế giới và Việt Nam 7

1.3 Vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng 9

1.3.1 Phân loại 9

1.3.2 Hình thái cấu trúc và đặc điểm phân tử của vi rút đường ruột 12

1.3.3 Các kỹ thuật chẩn đoán tác nhân gây bệnh tay chân miệng 14

1.3.4 Một số nghiên cứu về đặc điểm phân tử của một số týp VRĐR gây bệnh tay chân miệng trên thế giới và Việt Nam 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.3 Vật liệu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả kết hợp phân tích 24

2.4.2 Quy trình nghiên cứu 24

2.4.3 Các chỉ số nghiên cứu 26

A16 từ mẫu năm 2015-2018 27

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng tại Hà Nội, năm 2015-2018 32

3.1.1 Một số đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng tại Hà Nội, năm 2015-2018 32

3.1.2 Tỷ lệ các týp vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng tại Hà Nội, năm 2015- 2018 36

3.1.3 Một số yếu tố dịch tễ học về sự lưu hành các týp vi rút đường ruột ở bệnh nhân tay chân miệng, 2015-2018 39

3.2 Đặc điểm phân tử vùng gen VP1 của một số chủng EV-A71, A6, CV-A16 lưu hành tại Hà Nội từ năm 2015 đến năm 2018 43

3.2.1 Đặc điểm cây di truyền phả hệ của EV-A71, CV-A6, CV-A16 lưu hành tại Hà Nội, năm 2015-2018 45

3.2.2 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của một số chủng EV-A71, CV-A16, CV-A6 lưu hành tại Hà Nội, năm 2015 - 2018 với các chủng chuẩn ở Việt Nam và thế giới 50

3.2.3 Sự xuất hiện đột biến nucleotide và acid amin ở chủng EV-A71, CV-A16 và CV-A6 lưu hành tại Hà Nội từ 2015-2018 51

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 61

4.1 Đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng tại Hà Nội từ năm 2015-2018 61

4.1.1 Một số đặc điểm dịch tễ học của mẫu nghiên cứu 61

4.1.2 Tỷ lệ các týp vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng tại Hà Nội, năm 2015- 2018 66

4.1.3 Một số yếu tố dịch tễ học về sự lưu hành các týp vi rút đường ruột ở bệnh nhân tay chân miệng, 2015-2018 69

4.2.1 Đặc điểm cây di truyền phả hệ của EV-A71, CV-A6, CV-A16 lưu hành tại Hà Nội, năm 2015-2018 75 4.2.2 Mức độ tương đồng nucleotide, acid amin và các đột biến về nucleotide, acid amin của EV-A71, CV-A16, CV-A6 tại Hà Nội, năm

2015 - 2018 với các chủng chuẩn ở Việt Nam và thế giới 79

KẾT LUẬN 83 KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

aa Acid amin

ADN Acid Deoxyribose Nucleic

ARN Acid Ribonucleic

RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

rRT-PCR Realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SHPT Sinh học phân tử

TCM Tay chân miệng

TTYT Trung tâm Y tế

Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới tính, nhóm tuổi và tính chất đi học 33 Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân TCM tại Hà Nội từ 2015-2018 theo phân độ

lâm sàng 35 Bảng 3.3 Tỷ lệ các týp VRĐR gây bệnh TCM tại Hà Nội, 2015-2018 37 Bảng 3.4 Sự phân bố theo phân độ lâm sàng do các týp VRĐR gây bệnh

TCM 42 Bảng 3.5 Kết quả thực hiện giải trình tự vùng gen VP1 44

Biểu đồ 3.1 Phân bố số ca mắc bệnh tay chân miệng tại Hà Nội, từ

2015-2018 32 Biểu đồ 3.2 Phân bố ca bệnh mắc TCM tại Hà Nội từ 2015-2018 theo

tháng mắc 32 Biểu đồ 3.3 Phân bố ca bệnh tay chân miệng theo quận, huyện, thị xã tại

Hà Nội, năm 2015-2018 34 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ca bệnh tay chân miệng chẩn đoán xác định tại Hà Nội, 36 Biểu đồ 3.5 Phân bố týp VRĐR gây bệnh TCM tại Hà Nội theo năm,

2015-2018 38 Biểu đồ 3.6 Sự phân bố các týp VRĐR gây bệnh TCM theo thời gian,

2015-2018 39 Biểu đồ 3.7 Phân bố theo nhóm tuổi mắc bệnh của các týp VRĐR gây

bệnh TCM tại Hà Nội, 2015-2018 40

Hình 1.2 Cấu trúc chung của các vi rút đường ruột 12

Hình 1.3 Mô hình gen của vi rút đường ruột 13

Hình 1.4 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100 15

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25

Hình 3.1 Bản đồ phân bố theo quận, huyện các týp VRĐR lưu hành tài Hà Nội, 41

Hình 3.2 Cây di truyền phả hệ dựa trên trình tự nucleotide gen VP1 của một số chủng EV-A71 lưu hành tại Hà Nội, năm 2015-2018 46

Hình 3.3 Cây di truyền phả hệ dựa trên trình tự nucleotide gen VP1 của các chủng CV-A6 lưu hành tại Hà Nội, năm 2015-2018 47

Hình 3.4 Cây di truyền phả hệ dựa trên trình tự nucleotide gen VP1 của một số chủng CV-A16 lưu hành tại Hà Nội, năm 2015-2018 .49 Hình 3.5 Đột biến nucleotide của chủng EV-A71 _C4a 51

Hình 3.6 Đột biến acid amin của chủng EV-A71 _C4a 52

Hình 3.7 Đột biến nucleotide của chủng EV-A71 _B5 53

Hình 3.8 Đột biến acid amin của chủng EV-A71 _B5 53

Hình 3.9 Đột biến nucleotide của chủng CV-A6 55

Hình 3.10 Đột biến acid amin của chủng CV-A6 56

Hình 3.11 Đột biến nucleotide của chủng CV-A16 58

Hình 3.12 Đột biến acid amin của chủng CV-A6 59

Hình 4.1 Sự biến đổi huyết thanh học của Kháng thể kháng EV-A71 64

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tay Chân Miệng (TCM) là bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, dễ gâythành dịch Từ những năm 90 của thế kỷ XX, bệnh đã xuất hiện phổ biến ở nhiềuquốc gia trên thế giới và một số nước trong khu vực [1] Biểu hiện đặc trưng củabệnh là tổn thương da, niêm mạc dưới dạng phỏng nước ở niêm mạc miệng, lòngbàn tay, lòng bàn chân, mông, gối Bệnh lây chủ yếu theo đường tiêu hóa, hay gặp ởtrẻ em dưới 5 tuổi Nguồn lây chính từ nước bọt, phỏng nước và phân của trẻ nhiễmbệnh Hiện nay, bệnh TCM chưa có vắc xin phòng bệnh cũng như thuốc điều trị đặchiệu Phần lớn các trường hợp bệnh TCM diễn biến tự khỏi, tuy nhiên có thể xuấthiện một số biến chứng nguy hiểm như viêm não - màng não, viêm cơ tim, phù phổicấp dẫn đến tử vong nếu không được phát hiện sớm và xử trí kịp thời Những biếnchứng này thường liên quan đến tác nhân gây bệnh Bệnh do một số vi rút đường

ruột (Enterovirus) gây ra, trong đó tác nhân gây dịch bệnh nổi trội là Coxsackievirus

A16 (CV-A16), Enterovirus type 71 (EV-A71) và gần đây là Coxsackievirus A6(CV-A6) và Coxsackievirus A10 (CV-A10) [1], [2]

Tình hình dịch bệnh tay chân miệng có dấu hiệu gia tăng tại các nước trongkhu vực Châu Á Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam khoảng 10 năm gần đây

Bộ Y tế đã đưa bệnh TCM vào hệ thống giám sát bệnh truyền nhiễm từ năm 2011.Bệnh TCM được phát hiện lần đầu ở khu vực miền Nam Việt Nam kể từ năm 2003

và bùng phát dịch năm 2005 [3] Ở miền Bắc Việt Nam, bệnh được xác định năm

2008 nhưng ở qui mô nhỏ và rải rác ở 10 tỉnh miền Bắc Một nghiên cứu ở các tỉnhphía Bắc năm 2012, kết quả có 51.618 trường hợp mắc bệnh và bệnh xuất hiện ở tất

cả các tỉnh/ thành miền Bắc, trong đó Hải Phòng, Hà Nội, Thanh Hóa có số mắc caonhất với hơn 3.000 trường hợp mắc/tỉnh [4], tác nhân chính ghi nhận EV-A71, CV-A16, CV-A6, CV-A10 [5]

Vài năm gần đây, Hà Nội luôn nằm trong những địa phương có số mắc TCMcao ở khu vực phía Bắc với hàng nghìn trường hợp mắc mỗi năm Từ năm 2011 đếnnăm 2014, Hà Nội luôn là một trong năm tỉnh phía Bắc có số ca mắc bệnh TCM cao

với khoảng >1000 (ca) mỗi năm [4], [6], [7], [8] Hiện nay, bệnh TCM thường diễnbiến phức tạp và gây biến chứng nặng không chỉ do EV-A71 mà còn do các týpVRĐR khác Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, đặc điểm phân tử sự lưuhành các týp vi rút gây bệnh tay chân miệng trên địa bàn Hà Nội là cần thiết gópphần cho dự báo và đưa ra các giải pháp can thiệp hiệu quả hơn phòng chống bệnh

TCM trên địa bàn Trước nhu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Một

số đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng và sinh học phân tử vùng gen VP1 của EV-A71, CV-A6 & CV-A16 lưu hành ở Hà Nội, năm 2015 - 2018” với hai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương bệnh tay chân miệng

1.1.1 Sơ lược về bệnh tay chân miệng

a Nguồn bệnh, thời kỳ ủ bệnh và thời kỳ lây truyền

Nguồn bệnh TCM là những người mắc bệnh, người mang vi rút không triệuchứng Bệnh TCM lây truyền qua đường tiêu hoá: nước uống, bàn tay của trẻ hoặccủa người chăm sóc trẻ, các đồ dùng, đặc biệt là đồ chơi và vật dụng sinh hoạt hàngngày bị nhiễm vi rút từ phân hoặc dịch nốt phỏng, vết loét hoặc dịch tiết đường hôhấp, nước bọt Ngoài ra, bệnh cũng có thể lây truyền do tiếp xúc trực tiếp người -người qua các dịch tiết đường hô hấp, hạt nước bọt Một số yếu tố có thể làm giatăng sự lây truyền và bùng phát dịch bao gồm: mật độ dân số cao, sống chật chội;điều kiện vệ sinh kém; thiếu nhà vệ sinh; thiếu hoặc không có nước sạch phục vụcho sinh hoạt hàng ngày [11]

Bệnh TCM có thời gian ủ bệnh trung bình từ 3 đến 7 ngày Đầu tiên, vi rútthường cư trú ở niêm mạc má hay niêm mạc hồi tràng và sau 24 giờ, vi rút lan đếncác hạch bạch huyết Nhiễm vi rút huyết thường xảy ra nhanh chóng sau đó và vi rút

di chuyển đến niêm mạc miệng và da Vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm bệnh, khángthể trung hòa tăng cao và vi rút bị thải loại [2], [11]

Thời kỳ lây truyền bệnh bắt đầu ngay từ vài ngày trước khi phát bệnh, mạnhnhất trong tuần đầu của bệnh và có thể kéo dài vài tuần sau đó, thậm chí sau khibệnh nhân hết triệu chứng Vi rút có khả năng đào thải qua phân trong vòng từ 2 đến

4 tuần, cá biệt có thể tới 12 tuần sau khi nhiễm Vi rút cũng tồn tại, nhân lên ở đường

hô hấp trên và đào thải qua dịch tiết từ hầu họng trong vòng 2 tuần Vi rút cũng cónhiều trong dịch tiết từ các nốt phỏng nước, vết loét của bệnh nhân [2], [11]

Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi nhưng thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi, đặc biệtdưới 3 tuổi Người lớn ít bị mắc bệnh có thể do đã có kháng thể từ những lần bịnhiễm hoặc mắc bệnh trước đây [2], [11]

- Định nghĩa ca bệnh xác định: Là ca bệnh lâm sàng có xét nghiệm dương tính

với vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng [11], [12]

- Phân độ lâm sàng [12]:

+ Độ 1: chỉ loét miệng và/hoặc tổn thương da

+ Độ 2a: có một trong các dấu hiệu sau:

Bệnh sử có giật mình dưới 2 lần/30 phút và không ghi nhận lúc khám

Sốt trên 2 ngày, hay sốt trên 39ºC, nôn, lừ đừ, khó ngủ, quấy khóc vô cớ

+ Độ 2b: có dấu hiệu thuộc nhóm 1 hoặc nhóm 2:

Nhóm 1: Có một trong các biểu hiện sau: Giật mình ghi nhận lúc khám; Bệnh

sử có giật mình ≥ 2 lần/30 phút; Bệnh sử có giật mình kèm theo một dấu hiệu sau:Ngủ gà, Mạch nhanh (khi trẻ nằm yên, không sốt); Sốt cao ≥ 39ºC không đáp ứngvới thuốc hạ sốt

Nhóm 2: có một trong các biểu hiện sau: Thất điều: run chi, run người, ngồikhông vững, đi loạng choạng; Rung giật nhãn cầu, lác mắt; Yếu chi hoặc liệt chi;Liệt thần kinh sọ: nuốt sặc, thay đổi giọng nói

+ Độ 3: có biến chứng nặng về thần kinh, hô hấp, tim mạch

Co giật, hôn mê (Glasgow < 10 điểm)

Khó thở: Thở nhanh, rút lõm ngực, SpO2 < 92% (không oxy hỗ trợ)

Mạch nhanh >170 lần/phút hoặc tăng huyết áp

+ Độ 4: Biến chứng rất nặng, khó hồi phục: Sốc ; Phù phổi cấp; Tím tái,SpO2 < 92%; Ngưng thở, thở nấc

1.1.2 Tác nhân gây bệnh tay chân miệng

Bệnh TCM do một số týp vi rút đường ruột (Enterovirus) gây nên Enterovirusgây bệnh cho người gồm các nhóm: Poliovirus (PV), Coxsackievirus A (CV-A),Coxsackievirus B (CV-B), Echovirus và Enterovirus 68 đến 71 Trong đó, tác nhânchủ yếu gây bệnh TCM là EV-A71, CV-A6 và CV-A16 EV-A71 có thể gây ra cácbiến chứng thần kinh nặng và dẫn đến tử vong, còn các vi rút đường ruột khácthường ở thể nhẹ [2]

1.1.3 Điều trị và phòng bệnh

Hiện nay chưa có vắc xin phòng bệnh đặc hiệu cho bệnh TCM Biện phápcách ly người bệnh, vệ sinh môi trường, vệ sinh đồ chơi trẻ em, vệ sinh cá nhân sẽlàm giảm nguy cơ nhiễm bệnh Các biện pháp vệ sinh cá nhân nên áp dụng thườngxuyên là rửa tay sau mỗi lần vệ sinh, sau thay tã cho trẻ Khử trùng nơi bị nhiễmbệnh như dụng cụ, đồ chơi của trẻ, nhà cửa, khu vệ sinh…

Rửa tay bằng xà phòng và khử trùng bằng dung dịch chlor sẽ làm giảm nguy

cơ nhiễm bệnh Tránh các tiếp xúc gần với người bệnh như hôn, vuốt ve, dùngchung dụng cụ [11]

1.2 Dịch tễ học bệnh tay chân miệng

1.2.1 Tình hình bệnh tay chân miệng trên thế giới

Bệnh TCM được mô tả lần đầu tại Toroto-Canada năm 1957 [13] Từ khiđược ghi nhận trong y văn, bệnh TCM đã gây ra nhiều vụ dịch ở các nước khu vựcTây Thái Bình Dương trong thập niên đầu tiên của thế kỷ 21 [1] Trong hơn 1 thập

kỷ vừa qua các vụ dịch TCM được báo cáo ở nhiều nước, đặc biệt là khu vựcChâu Á, Thái Bình Dương như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia,Brunei, Singapore, Australia… và Việt Nam [1] Bệnh này có xu hướng thànhtừng đợt bùng phát vào mùa xuân, mùa hè và mùa thu TCM phổ biến hơn ở khuvực nông thôn so với khu vực đô thị, có thể là do ảnh hưởng của tình trạng kinh tế

xã hội và mức độ vệ sinh [14]

Theo cập nhật gần nhất về tình hình bệnh TCM khu vực Tây Thái BìnhDương từ nguồn số liệu của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ngày 14/8/2018, tại

Trung Quốc, chỉ trong tháng 7/2018 có tổng cộng 377.629 trường hợp mắc bệnh

và 4 ca tử vong đã được báo cáo ở Trung Quốc, đây là mức tăng 27% so vớicùng kỳ năm 2017, nâng tổng số ca bệnh TCM của Trung Quốc từ đầu năm lên

>1.000.000 ca, tại Nhật Bản đã có tổng số 69.041 trường hợp, Singapore có

26252 trường hợp được báo cáo kể từ đầu năm 2018 [15]

Tại các nước khác ngoài khu vực Tây Thái Bình Dương, bệnh TCM cũngđược ghi nhận Tại Tây Ban Nha, năm 2015 một đợt bùng phát TCM với 99 camắc ghi nhận xảy ra tại một trung tâm giữ trẻ và 74 ca xảy ra tại cộng đồng ởthành phố Irun [16], năm 2016 một vụ dịch EV-A71 liên quan đến các trườnghợp thần kinh nghiêm trọng đã được báo cáo ở Catalonia và lan rộng ra các khuvực khác của Tây Ban Nha [17] Cùng năm 2016, Pháp cũng báo cáo 59 trườnghợp bệnh nhi nặng liên quan đến EV -A71 và EV-D68 [18] Mới đây, Đức cũngbáo cáo về sự gia tăng lưu hành của EV-A71 ở Đức vào năm 2019 ở những bệnhnhân nhập viện với nghi ngờ viêm màng não vô khuẩn/viêm não [19]

1.2.2 Tình hình bệnh tay chân miệng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh TCM lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1997 và năm

2003, vụ dịch TCM lần đầu được báo cáo tại miền Nam Việt Nam [3] Bệnh TCMthực sự được xem xét là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng tại ViệtNam khi dịch bệnh bùng phát khắp nước vào năm 2011-2012 với tỷ lệ ca bệnh nặng

và tử vong cao [20, 21] và chính thức được đưa vào hệ thống báo cáo thường quytheo quy định tại Thông tư số 48/2010/TT-BYT, ngày 31/12/2010 của Bộ trưởng

Bộ Y tế

Một báo cáo tổng kết giám sát, điều tra phòng chống dịch TCM năm 2018của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, số trường hợp mắc bệnh TCM tại ViệtNam được giám sát trên 63 tỉnh/thành phố, với 53.259 mắc; 25.845 nhập viện;

6 tử vong tại 5 tỉnh thành phố khu vực phía Nam Số mắc ghi nhận chủ yếu khuvực phía Nam (77%); miền Bắc (11,2%); 99,5% trẻ dưới 10 tuổi; từ 1-5 (79%);dưới 1 tuổi 17% [22]

1.2.3 Một số nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng trên thế giới

và Việt Nam

Rất nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đặc điểm của bệnh TCM phụ thuộcvào nhiều yếu tố như lứa tuổi mắc bệnh, giới tính, thời gian mắc bệnh, mật độ dâncư… Nghiên cứu của Xyeyong Huang và cộng sự về đặc điểm dịch tễ học bệnhTCM tại tỉnh Henan, Trung Quốc từ năm 2008-2013 cho kết quả tỷ lệ mắc cao nhấtvào giữa tháng Tư và tháng Năm Sự xuất hiện của TCM ở đây có liên quan mậtthiết đến phân bố mùa, tuổi và khu vực Trẻ em dưới năm tuổi là dân số bị ảnhhưởng nhiều nhất, gặp ở trẻ nam nhiều hơn trẻ nữ [23]

Nhóm tác giả Jiaojiao Wang và cộng sự nghiên cứu tổng cộng 157.7707trường hợp mắc bệnh TCM (60,25% là nam, 39,75% là nữ) được báo cáo tại BắcKinh từ năm 2008 đến 2012 bao gồm 1465 trường hợp nặng và 33 trường hợp tửvong Tỷ lệ mới mắc trung bình hàng năm là 164,3 trên 100.000 dân (dao động từ104,2/100.000 năm 2008 đến 231,5/100.000 năm 2010) Tỷ lệ nam cao hơn tỷ lệ nữtrong nhóm từ 0 đến 14 tuổi và 93,88% là trẻ em mẫu giáo hoặc sống ở nhà Cáckhu vực có nguy cơ tương đối cao chủ yếu nằm ở các khu vực chuyển tiếp thành thị

- nông thôn (tỷ lệ dân số có nguy cơ dao động từ 33,89% năm 2011 đến 39,58%năm 2012) Về mặt không gian có khả năng nhất nằm ở khu vực giữa phía đông củaquận Fang Sơn, phía tây nam Bắc Kinh [24]

Một nghiên cứu ở Miền Bắc Thái Lan về sự phân bố theo thời gian và cácđiểm nóng của bệnh TCM từ 2003-2012 của nhóm tác giả RatchaphonSamphutthanon, kết quả chỉ ra rằng căn bệnh này có thể xảy ra bất cứ lúc nào trongnăm, nhưng dường như lên đến đỉnh điểm vào mùa mưa và lạnh Sự phân bố củacác ổ dịch thường là tập trung thành cụm Khi được phân tách theo mùa, có một mốitương quan với hướng gió mùa tây nam cùng thời điểm [25]

Phân tích của Onozuka D, Hashizume M về ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩmđến tỷ lệ mắc bệnh tay, chân và miệng ở Nhật Bản cho thấy số trường hợp mắcbệnh TCM hàng tuần tăng 11,2% (95% CI: 3,2 19.8) cho mỗi mức tăng nhiệt độtrung bình 1°C và tăng 4,7% (95% CI: 2,4 trong độ ẩm tương đối Đáng chú ý, ảnhhưởng của nhiệt độ và độ ẩm lớn nhất ở trẻ em dưới 10 tuổi [26]

Tác giả Bending J.W., Fleming D.M nghiên cứu bệnh TCM trong vụ dịch lớnnhất xảy ra ở Anh và xứ Wales vào cuối năm 1994 kết quả là hầu hết bệnh nhân ở

độ tuổi từ 1 đến 4 tuổi và sống ở miền trung hoặc miền nam [27] Nghiên cứucủa tác giả Xiao-Fang WANG và cộng sự về đặc điểm dịch tễ họccủa bệnh tay chân miệng trên đối tượng là trẻ em mầm non năm2008-2015 tại Trung Quốc cho thấy lứa tuổi trẻ mắc bệnh nhiềunhất là 37-48 tháng, trẻ nam mắc bệnh nhiều hơn trẻ nữ, khu vựcthành thị có nguy cơ bùng phát dịch cao hơn nông thôn và đỉnhđiểm của bệnh vào tháng 4 – 7 trong năm [28]

Tại Việt Nam, bệnh TCM lần đầu tiên được phát hiện vào năm

1997 Năm 2003, vụ dịch TCM lần đầu được báo cáo tại miền NamViệt Nam Cũng năm 2003, một nghiên cứu bệnh TCM ở Hà Tâyđược Nguyễn Thị Hiền Thanh và cộng sự mô tả có liên quan đếnnhiễm EV-A71 kèm biến chứng viêm não nặng [29]

Một nghiên cứu tiến hành trên 2041 bệnh nhân TCM đượcnhập viện tại 5 bệnh viện lớn đại diện cho cả nước gồm bệnh việnNhi Đồng 1, Nhi Đồng 2, Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, NhiTrung ương và bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung Ương trong giaiđoạn 2011-2012 cho thấy 97,8% trường hợp mắc TCM dưới 5 tuổi(88,2% dưới 3 tuổi) Trong vụ dịch này, mặc dù số trường hợpbệnh TCM ở nhóm dưới 6 tháng là thấp nhất nhưng tỷ lệ bệnhnặng lúc nhập viện lại khá cao (13,5%) và các trường hợp nhẹtrong quá trình nằm viện ở nhóm này có tỷ lệ chuyển sang độnặng là cao nhất (15,4%) so với các nhóm khác Bé trai có nguy

cơ mắc bệnh cao gấp 1,3 lần bé gái [30]

Nghiên cứu của nhóm tác giả Trần Thị Nguyễn Hòa và cộng sựtrên 424 trường hợp dương tính với vi rút đường ruột từ 546 bệnhnhân mắc bệnh TCM ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam trong năm 2015-

2016 cho kết quả bệnh TCM xảy ra ở hầu hết các tháng của năm,tập trung cao vào các tháng thu đông Tuổi mắc bệnh thường ở trẻ

trong vòng 5 tuổi, tập trung chính ở trẻ từ 7 đến 36 tháng, đỉnh cao ởtrẻ 12-24 tháng [5].

Nghiên cứu về một số đặc điểm dịch tễ học bệnh tay chânmiệng tại Hà Nội từ năm 2011-2014 của tác giả Nguyễn NgọcQuỳnh và cộng sự kết quả cho thấy số trường hợp mắc/tử vongqua các năm từ 2011 – 2014 lần lượt là 1.576/3; 4.448/4; 2.726/1;1.169/0 và tỷ lệ tử vong/mắc lần lượt là: 0,2; 0,1; 0,04 và 0,0 Tất

cả các quận huyện đều ghi nhận ca bệnh trong đó các huyện ngoạithành ghi nhận số mắc nhiều hơn các quận nội thành Đỉnh dịchkhác nhau theo từng năm vào các tháng tháng 3, 5, 8, 9 và 11.Bệnh nhân chủ yếu là trẻ dưới 5 tuổi (96,6%), cao nhất là nhóm 1 -

4 tuổi (76,8%); trẻ nam (61,5%) nhiều hơn trẻ nữ (38,5%) [31]

1.3 Vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng

1.3.1 Phân loại

Bệnh TCM do vi rút đường ruột (VRĐR-Enterovirus) gây nên Chi này là 1

trong 7 chi thuộc họ Picornaviridae, bộ Picornavirales Vào năm 2012, các nhà

phân loại học đã thống nhất chia VRĐR thành hai nhóm chính là Enterovirus vàRhinovirus Enterovirus bao gồm 10 loài được đặt tên A-J trong đó gây bệnh ởngười có bốn loài Enterovirus A, B, C, D [32] Dựa vào trình tự vùng gen VP1 đểphân loại (Hình 1.2)

Hình 1.1: Phân loại của vi rút đường ruột [32]

Chú thích: CV- Coxsackievirus; EV- Enterovirus; SV- simian enteroviruses; E- Echovirrus

BA13- Baboon enterovirus A13; Sa5- simian enteroviruses 5; PV- Poliovirrus

Bệnh TCM do nhiều týp vi rút gây ra như EV-A71, A16, A6, A2, 4, 5, 6, 9 &10; CV-B2-5…, tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng EV-A71,CV-A6 và CV-A16 là những týp vi rút thường nổi trội gây dịch [33], [34], [35]

CV-a Enterovirus 71

Dựa trên cấu trúc vùng gen VP1, các EV-A71 đươc xếp vào cùng một kiểugen (genotype) nếu có trình tự vùng gen VP1 tương đồng 92% trở lên [36] Theocác công bố, EV-A71 đã được xác định gồm 7 nhóm gen: A, B, C, D, E, F và G.Nhóm gen A và D bao gồm 1 thành viên Thành viên duy nhất của nhóm A làchủng BrCr, được xác định ở một bệnh nhân bị viêm não ở California, Hoa Kỳ, vàonăm 1970 và cho đến giờ vẫn chưa quan sát thấy chủng nào khác trong nhómgenotype này [37]

Tất cả các chủng EV-A71 hiện tại thuộc về nhóm gen B và C, được phân loạithành nhiều kiểu gen, tức là B0, B1, B2, B3, B4 và B5, và C1, C2, C3, C4a, C4b và C5(Huang và cộng sự, 2011, Yip và cộng sự, 2013, Yee và Laa Poh, 2017) [38], [39] Trong nhóm gen B, giữa kiểu gen B1 và B2 có 12% khác biệt về nucleotide.Kiểu gen B1 và B2 là các chủng lưu hành mạnh vào những năm 1970 và 1980 [40].Kiểu gen B3, B4 và B5 được cho rằng lưu hành từ năm 1997 [41] Kiểu gen B0được mô tả phân lập ở Châu Âu từ 1963 đến 1967 [42] Kiểu gen B5 lần đầu tiênđược phân lập tại Nhật Bản và Sarawak (Malaysia) vào năm 2003 [43], [44] Kiểugen B5 là căn nguyên gây nên vụ dịch ở Brunei, Sarawak và Đài Loan năm 2006[45] Tại Việt Nam, kiểu gen B5 đầu tiên được phát hiện ở phía Nam Việt Nam năm

2011, gây dịch tay chân miệng năm 2012 và trở thành kiểu gen gây bệnh chính năm

2013 [46]

Từ giữa những năm 1980, ngoại trừ vụ dịch lớn xảy ra tại Sydney năm 1986,Kiểu gen C1 phân lập được chủ yếu từ các trường hợp lẻ tẻ Kiểu gen C2 gây ra vụdịch năm 1998 và 1999 tại Perth, Úc Kiểu gen C3 được phân lập tại Nhật Bản vàonăm 1994 và tại Hàn Quốc năm 2000 Kiểu gen C3 và C5 liên quan đến những vụdịch ở Nam Á từ năm 1997 [47] Trong vụ dịch TCM lớn nhất do EV-A71 gây ra ởTrung Quốc giữa năm 2008 có 201 chủng EV-A71_C4 được ghi nhận là lưu hànhrộng rãi Năm 2005 trong vụ dịch TCM tại thành phố Hồ Chí Minh, phân tích ditruyền phả hệ vùng VP1 trên các chủng EV-A71 đã phát hiện sự đồng lưu hành của

3 kiểu gen EV-A71 là C1, C4 và C5, trong đó C5 chiếm nổi trội [48] Kiểu gen C4cùng với B5 là hai kiểu gen chính của EV-A71 lưu hành gây bệnh TCM ở Việt Namtrong quá trình giai đoạn 2011-2013 [46]

Các kiểu gen B4, B5 và C4 chủ yếu được giới hạn ở các quốc gia ở châu Á,trong khi kiểu gen C1 và C2 lưu hành chủ yếu ở châu Âu và khu vực châu Á - TháiBình Dương [49]

Nhóm gen D có 1 chủng được phân lập ở Ấn Độ năm 2002 [50] Gần đây,nhóm gen E đã được xác định tại Sahara, châu Phi [51]; Bessaud M và cộng sự đãcông bố nhóm gen F được phát hiện ở Taolagnaro, miền nam Madagascar, châu Phi

[52] và trong một nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của EV-A71 tại Ấn Độ vàonăm 2015, nhóm tác giả Saxena VK đã phát hiện ra một nhóm gen mới (đề xuấtnhóm G) [53].

Kể từ lần đầu tiên được phân lập tại Mỹ năm 1969, cùng với CV-A16, A71 đã được xác định là căn nguyên phổ biến của bệnh TCM ở trẻ em và trẻ nhỏ.Mặc dù rất gần với CV-A16 về mặt di truyền và thường xuyên có mặt cùng CV-A16 trong các vụ dịch TCM, nhưng các nghiên cứu đã cho thấy sự khác biệt giữa 2nhóm vi rút về biểu hiện lâm sàng [40]

EV-b Các Enterovirus khác gây bệnh tay chân miệng

Bên cạnh EV-A71, các Enterovirus khác cũng được xác định lưu hành tại châu

Á trong thập kỷ gần đây và đóng vai trò tác nhân gây bệnh TCM như CV-A16 vàCV-A6, CV-A10 mới nổi gần đây Một số dịch bệnh TCM lớn do CV-A16 và CV-A6 gây ra được báo cáo hàng năm trên toàn thế giới và một số trường hợp nghiêmtrọng cũng được ghi nhận [54] Ngoài ra, có một số báo cáo lẻ tẻ về dịch TCM domột số loại coxsackieviruses và echovirus khác như CV-A10, E-11 và E30, v.v.[55], [56], [57]

Tương tự EV-A71, dựa trên các chuỗi VP1, CV-A16 được phân thành hai kiểugen A và B Nguyên mẫu G-10 là thành viên duy nhất của kiểu gen A, trong khikiểu gen B được chia thành các kiểu gen B1a, B1b, B1c và B2 [55], [58]

Dịch TCM do CV-A16 được ghi nhận lần đầu tiên tại Toronto vào năm 1957[13] CV-A16 được tìm thấy là một trong hai tác nhân gây bệnh chính của bệnhTCM Các đợt bùng phát TCM trên diện rộng do nhiễm CV-A16 đã được ghi nhận

ở Anh, Wales (1994), Đài Loan (1999-2006), Ấn Độ (2009), Bắc Kinh-Trung Quốc(2007) và năm 2011 - 2013 Sự đa dạng hàng năm của CV-A16 được thể hiện trongcác nghiên cứu ba năm được thực hiện tại Bắc Kinh và Quảng Châu, Trung Quốckhi tỷ lệ lưu hành CV-A16 hàng năm dao động từ 21% đến 75% Trong một nghiêncứu 7 năm khác được thực hiện tại Singapore, tỷ lệ phát hiện CV-A16 hàng năm là

từ 5,5% đến 76% và kiểu huyết thanh chiếm ưu thế vào năm 2002 (76%), 2004(66,8%) và 2007 (64,9%) [55], [59]

Gần đây, CV-A6 được phát hiện là một mầm bệnh mới nổi gây ra dịch bệnhTCM trên toàn thế giới [56] Ngoài ra, một số Coxsackies khác như A5, A7, A9,A10 cũng gây bệnh này [56], [35]

1.3.2 Hình thái cấu trúc và đặc điểm phân tử của vi rút đường ruột

Về cấu trúc, hạt vi rút đường ruột có hình khối cầu gồm 20 mặt đối xứng vớiđường kính 30nm, không có vỏ lipid bao ngoài Lớp vỏ protein capsid gồm 60 đơn

vị cấu trúc (protomers) hợp thành, mỗi đơn vị được hình thành bởi 4 polypeptidVP1, VP2, VP3, VP4 VP4 nằm ở mặt trong vỏ capsid [32] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc chung của các vi rút đường ruột [49]

Vật chất di truyền của vi rút là một chuỗi ARN (+) dài khoảng 7400 nucleotidchưa tính phần Poly A Bắt đầu bằng vùng không dịch mã 5’UTR, khung đọc mở mãhóa cho một chuỗi polyprotein gồm 3 vùng P1, P2, P3, vùng không dịch mã 3’-UTR vàphần PolyA (Hình 1.3)

Hình 1.3: Mô hình gen của vi rút đường ruột [1]

Vùng 5’-UTR gồm 742 nucleotid, tại đây có 6 cấu trúc mã hóa stem-loop trong

đó stem-loop I là stem-loop hình lá tham gia vào quá trình tổng hợp ARN của vi rútcòn stem-loop II đến VI gồm các các trình tự tiếp nhận ribosome ở bên trong (internalribosome entry site – IRES) liên quan đến quá trình dịch mã protein Vùng 5’-UTRcủa EV-A71 giống với polioviru và có thể chia thành 3 vùng: vùng 5′ terminalcloverleaf từ nucleotide 1 đến 89 hoặc 101 nucleotid, vùng IRES có kích thước từnucleotide 123–126 đến nucleotide 602–605, và vùng siêu biến đổi khoảng 120nucleotid [40]

Vùng không dịch mã 3’-UTRs (81nt) chứa 3 cấu trúc mã hóa stem-loop X,

Y, Z [32]

Khung đọc mở mã hóa một polyprotein gồm protein cấu trúc P1 dài 2586nucleotid, protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt), tham gia vào sựsao chép ARN của vi rút Polyprotein được chia thành 11 protein gồm 4 proteincapsid thuộc P1 là VP1, VP2, VP3, VP4 và 7 protein không cấu trúc gồm P2 có 2A,2B, 2C và P3 có 3A, 3B, 3C, 3D [32] VP1, VP2, VP3 tạo thành tiểu đơn vịpentamer, gồm 60 bản sao được kết nối để tạo thành capsid có cấu trúc khối đa diệnđều, các vùng này có nhiều các quyết định kháng nguyên tuy nhiên các kháng thểtrung hòa đã được xác định chủ yếu từ các kháng nguyên của vùng VP1, trong khi

đó VP4 gắn vào mặt trong của vỏ capsid Ở vùng 2A chứa gen mã hóa enzymeprotease đóng vai trò trong sự phân cắt protein của tế bào vật chủ [36].

Vùng VP1 có chiều dài khoảng 834 đến 951 nucleotide (tương ứng 278 đến 317acid amin), trong đó vùng gen VP1 của EV-A71 và CV-A16 trung bình là 891nucleotide (từ vị trí nucleotid 2446 đến 3336), của CV-A6 khoảng 915 nucleotide (từ vịtrí nucleotid 2441 đến 3355) [36], [60], [61] Vùng này gây ảnh hưởng đáng kể đến sựbiến đổi về gen, về đặc điểm hình thái và thích hợp cho quá trình phát sinh loài của virút Vùng gen mã hóa protein VP1 được chứng minh là vùng gen quyết định đến tínhkháng nguyên và tính độc lực của vi rút Những đột biến trong vùng VP1 dễ dẫn đếnthay đổi thành phần acid amin và đặc tính gây bệnh của vi rút, từ đó có thể hình thànhbiến chủng mới [49]

1.3.3 Các kỹ thuật chẩn đoán tác nhân gây bệnh tay chân miệng

a Nuôi cấy vi rút

Tiêu chuẩn vàng để xác định nhiễm EV là phân lập được vi rút Nuôi cấy vi rút

là kỹ thuật gây nhiễm vi rút (có trong mẫu bệnh phẩm) lên dòng tế bào nuôi thíchhợp nhằm tăng sinh phát triển, từ đó có thể xác định được vi rút Tuy nhiên nuôi cấy

vi rút không được áp dụng rộng rãi cho chẩn đoán do đòi hỏi cao về cơ sở vật chất

và hóa chất, môi trường sử dụng [1] Để xác định týp VRĐR, phương pháp phân lập

vi rút trên tế bào thường kết hợp phương pháp trung hòa vi lượng với các khánghuyết thanh đặc hiệu týp và phải mất khoảng 28 ngày mới có kết quả [62]

Hiện nay phân lập vi rút chủ yếu là dùng để lưu giữ chủng vi rút, không ápdụng cho chẩn đoán bệnh TCM

b Phương pháp sinh học phân tử

Các kỹ thuật sinh học phân tử có đặc điểm nổi trội là có độ nhạy và độ đặchiệu cao, cho kết quả nhanh chỉ sau 1 đến 3 ngày kể từ ngày nhận mẫu

- Kỹ thuật PCR bán tổ và giải trình tự gen (semi-nested PCR/Sequencing):

Năm 2008, kỹ thuật PCR bán tổ và giải trình tự gen (snPCR/Seq) được dùng để xácđịnh các týp VRĐR từ các mẫu nước nổi tế bào và phải mất ít nhất 2 tuần mới cókết quả [63] Năm 2009, kỹ thuật sinh học phân tử bán tổ xác định các týp VRĐR từ

các mẫu lâm sàng [62] Tuy nhiên kỹ thuật này phải giải trình gen nên rất tốn kém

và phải có máy Sequencer

Kỹ thuật Nested RT-PCR thường áp dụng đối với các mẫu có tải lượng vi rúttrong mẫu ít

Giải trình tự gen: Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã

được phát minh như: Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (AlanMaxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay phươngpháp Dideoxy (Frederick Sanger) Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặtlớn trong lịch sử phát triển của sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình

tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen củaSanger

Hình 1.4 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100

- RT-PCR: Kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán mẫu có vật liệu di truyền là ARN.

Xét nghiệm này áp dụng cho các bệnh phẩm dịch não tủy, các chất dịch cơ thể khácnhư phân, dịch tiết đường hô hấp và máu [1]

- Multiplex RT-PCR đã được phát triển để xác định EVs; EV-A71 và

CV-A6; CV-A16 và CV-A10, phương pháp này hiện đang được sử dụng tại phòng Xétnghiệm Vi rút Đường ruột – viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [5]

- Realtime RT-PCR (rRT-PCR): là kỹ thuật nhân bản gen đích trong ống

nghiệm thành hàng tỷ bản sao, kết quả khuếch đại AND đích hiển thị ngay sau mỗichu kỳ nhiệt của phản ứng, không phải làm tiếp các bước của giai đoạn sau PCR nên

hệ thống rRT-PCR giúp chẩn đoán phát hiện nhanh chóng và cụ thể một số bệnhtruyền nhiễm Hệ thống rRT-PCR có thể làm giảm nguy cơ nhiễm chéo khi so sánhvới RT-PCR thông thường, đặc biệt là hệ thống Nested PCR (kỹ thuật Nested RT-PCR phải thực hiện 2 vòng, tăng nguy cơ nhiễm chéo dẫn đến dương tính giả) [1]

1.3.4 Một số nghiên cứu về đặc điểm phân tử của một số týp VRĐR gây bệnh tay chân miệng trên thế giới và Việt Nam

a Một số nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc vùng gen VP1 của EV-A71, CV-A6, CV-A16

Một số nghiên cứu đặc điểm vùng gen VP1 của EV-A71 đã xác định một sốthay đổi vị trí acid amin quan trọng trong đoạn VP1 của EV-A71 có thể dẫn đếnbiến chủng mới hay tăng tính độc lực vi rút Như sự thay đổi K244E hoặc Q145Etrong VP1 của EV-A71 là rất quan trọng, yếu tố di truyền quyết định sự thích nghi

và độc lực của vi rút được xác định trên chuột [64], [65] Việc thay thế acid aminthành axit glutamic ở vị trí 145 (145E) trong trình tự VP1 đã được chứng minh là cóliên quan đến bệnh lý thần kinh trong mô hình thực nghiệm trên chuột và khỉ [64],[66] Hay sự thay thế A170V có thể liên quan tới sự tăng độc tính thần kinh của EV-A71 trong vụ dịch tại Perth [67] Vị trí aa 292 là vị trí quyết định tính xâm nhập vàsao chép của EV-A71 đối với tế bào chủ [36] Một nghiên cứu tại khu vực Châu Á –Thái Bình Dương dựa trên các phân tích phát sinh gen của vùng VP1 EV-A71 liênquan đến một số đợt bùng phát bệnh TCM từ năm 1994- 2013 Kết quả chỉ ra rằng 4kiểu gen, cụ thể là C4, C1, C2 và B4 là các chủng chiếm ưu thế, đặc biệt là ở cácnước Đông Nam Á Mười bốn vị trí thay thế đã được phát hiện trong trình tự genVP1, bao gồm các vị trí phổ liên quan đến trung hòa ở vị trí V249I và A289T;

Q22H và Q22R liên quan đến tăng độc lực; đột biến K43E, A58T, S184T và T240S

có thể làm thay đổi cấu trúc không gian; G145E và T240S ảnh hưởng đến tính kỵnước của VP1 do đó làm thay đổi khả năng miễn dịch EV-A71 dựa trên các phântích phát sinh gen của các chuỗi VP1[68]

VP1 là thành phần miễn dịch quan trọng của capsid CV-A16 trong tất cả bốnloại protein capsid (VP1, VP2, VP3 và VP4) [69] Gần đây, sáu vùng được bảo tồntrong protein VP1 đã được xác định bởi Shi và cộng sự, có thể dùng cho việc sảnxuất các kháng thể trung hòa chống lại nhiễm trùng CVA16, các vị trí acid amin(aa) là: aa 94-108 (Vùng 1), aa 109-123 (Vùng 2), aa 163-177 (Vùng 3), aa 187-201(Vùng 4), aa 211-225 (Vùng 5) và a 271-285 (Vùng 6) Nghiên cứu các chủng CV-A16 tại Nam Kinh, Trung Quốc của Wei Yong và cộng sự cho kết quả vùng khángnguyên 4 là trình tự được bảo tồn nhất trong tất cả các kiểu gen CVA16 không có

sự thay thế acid amin Đối với Vùng 2 và Vùng 5, so với chủng G-10 nguyên mẫu,năm đột biến được tìm thấy trong tất cả các kiểu gen khác ở các vị trí M119L,A213E, P215L, S217A và A220L [70] Tuy nhiên, chưa thấy công bố nào chỉ ramối liên quan giữa các đột biến ảnh hưởng đến độc tính hay làm xuất hiện biếnchủng mới của CV-A16

Những nghiên cứu trên mô hình chuột đã cho thấy CV-A6 bao gồm cả nhữngchủng gây tử vong và không gây tử vong [71] Điều thú vị là một số đột biến thaythế ở các vị trí của VP1 như A5T, V30A, S137N, I242V ở các chủng thu thập giaiđoạn 2010-2012 đều thuộc nhóm không gây tử vong Tuy nhiên những chủng CV-A6 mang các đột biến này thu thập vào giai đoạn 2013-2015 và 2016-2017 lại gây

tử vong Do vậy, CV-A6 có thể có độc tính cao hơn và liên quan đến các ca bệnh từnhẹ tới nặng ở Guangxi năm 2013 và cần những nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểumối liên quan giữa 4 đột biến thay thế này với độc tính vủa virut Hiện tượng cũngđược tìm thấy ở Vietnam, CV-A6 trở thành tác nhân gây bệnh phổ biến ở Việt Nam

từ năm 2011, 4 đột biến thay thế A5T, V30A, S137N, I242V cũng đã được pháthiện ở các chủng lưu hành tại Việt Nam từ năm 2011-2015 [72]

b Một số nghiên cứu về sự phân bố các nhóm gen

Các nghiên cứu đã cho thấy sự phân bố các nhóm và dưới nhóm gen của vi rútnày rất đa dạng, có thể khác nhau giữa các vùng và các vụ dịch Trong vụ dịch năm

2008 ở Đài Loan, nghiên cứu của Min-Hsiung Lee và cộng sự cho thấy EV-A71 là

vi rút được phát hiện phổ biến nhất, kiểu gen của các trường hợp EV-A71 trong đợtdịch này là dòng B5 [73] Cũng trong năm 2008, tại Singapore, Yan Wu và cáccộng sự nghiên cứu trên 51 mẫu lâm sàng phát hiện Enterovirus trong 34 mẫu(66,7%), với 11 mẫu (21,6%) dương tính với EV-A71 Các Enterovirus khác khôngphải EV-A71 (bao gồm coxsackievirus A4, A6, A10 và A16) Phân tích phát sinh loàicủa 10 chủng EV-A71 lưu hành thuộc về hai nhóm con B5 (80%) và C2 (20%) [74].Nghiên cứu của Jing Wang và cộng sự về đặc điểm dịch tễ học của bệnh TCM tạiSơn Đông, Trung Quốc từ 2009- 2016 thấy CV-A16 đã chiếm ưu thế và gây rakhoảng 30% trường hợp nặng [75]

Trong vụ dịch EV-A71 tại Perth (Úc) năm 1999, người ta nhận thấy vi rútdưới nhóm C2 đặc biệt được phân lập từ các ca bệnh lý thần kinh nặng và chỉ có 1

ca tay chân miệng không nặng phân lập được vi rút nhóm C2 Khi so sánh trình tựamino acid từ VP1 vi rút dưới nhóm C2 phân lập trong vụ dịch tại Perth với trình tựamino acid tương đồng của VP1 của các EV-A71 nhóm A, B và C và CV-A16 chothấy, có sự đột biến chuyển alanin thành valine tại vị trí 170 của VP1 trong cả 5 virút nhóm C2 phân lập được từ những trẻ có bệnh lý thần kinh nặng Ngược lại,những vi rút phân lập từ những trẻ bị TCM không biến chứng có alanin (chủnghoang dại) tại vị trí 170 của VP1 [76]

Nghiên cứu của nhóm tác giả Nital N Ganorkar và cộng sự về đặc điểm ditruyền của các chủng Enterovirus trong bệnh TCM tại Ấn Độ từ năm 2012-2014,nghiên cứu này giúp tìm hiểu sự phân bố kiểu gen, sự đa dạng di truyền của cácchủng EV liên quan đến TCM từ các khu vực Đông, Tây và Nam ở Ấn Độ Kết quảphát hiện sự lưu hành kiểu gen B1c của CVA16, E2 của CVA6 và C1 của chủngEV-A71 trong các trường hợp TCM [77]

Nghiên cứu về kiểu gen của các EV gây ra bệnh TCM tại Thượng Hải, TrungQuốc năm 2012-2013 của tác giả Menghua Xu và cộng sự kết quả tổng cộng có 13kiểu gen Enterovirus đã được xác định Các kiểu gen thường gặp nhất là CV-A6

(31,9%), A71 (30,6%), CV-A16 (8,8%) và CV-A10 (7,5%) Các chủng A71 thuộc phân nhóm C4a và CV-A16 được xác định là B1b phân nhóm Cácchủng CV-A6 là nhóm gen F, trong khi các chủng CV-A10 nhóm gen D [78].

EV-Gần đây, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử về căn nguyên VRĐR gây dịchbệnh TCM ở Việt Nam cũng bắt đầu được tiến hành Nghiên cứu bài bản đầu tiên

do Phan Văn Tú và cộng sự thực hiện năm 2005 trong vụ dịch TCM tại thành phố

Hồ Chí Minh, EV-A71 chiếm 42.1% và trong tổng số ca mắc EV-A71 có 29% ca cótổn thương thần kinh và 1.7% ca tử vong Phân tích di truyền phả hệ vùng VP1 trêncác chủng EV-A71 đã phát hiện sự đồng lưu hành của 3 subgenogroup EV-A71 làC1, C4 và C5, C5 chiếm nổi trội [3] Một nghiên cứu về tay chân miệng thực hiệnnăm 2011-2012, tác nhân là EV-A71 (42,1%) và (52,1%) là CV-A16.Trong số những bệnh nhân bị nhiễm EV-A71, 29,3% trường hợpnặng và 3 trường hợp tử vong Phân tích phát sinh của 23 phân lậpEV-A71, vi rút thuộc 3 dưới nhóm là C1, C4, C5 [79]

Bệnh TCM thực sự được xem xét là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏecộng đồng tại Việt Nam khi dịch bệnh bùng phát khắp nước vào năm 2011-2012 với

tỷ lệ ca bệnh nặng và tử vong cao vọt Trong giai đoạn này, nhiều nghiên cứu đã đisâu phân tích di truyền cây phả hệ vùng gene VP1 cho thấy đã có sự thay đổi dướinhóm nổi trội của EV-A71 theo từng giai đoạn: C5 sang C4 của EV-A71 trong giaiđoạn 2011-2012, đến năm 2013, dưới nhóm lưu hành nổi trội của EV-A71 chuyểnsang B5 [46], [80]

Nghiên cứu đặc điểm di truyền tiến hóa của các chủng dưới nhóm B5 cho thấycác chủng vi rút B5 mới nổi tại miền Nam Việt Nam rất tương đồng với các biến thểgây các vụ dịch TCM lớn tại các nước trong khu vực, bao gồm Malaysia và ĐàiLoan Các nghiên cứu còn chứng minh các chủng EV-A71 lưu hành Việt Nam được

"xâm nhập" từ các nước lân cận [46]

Nghiên cứu các vi rút đường ruột gây bệnh TCM ở miền Bắc Việt Nam,

2015-2016 của Trần Thị Nguyễn Hòa và cộng sự kết quả xác định vi rút EV-A71 chiếm

tỷ lệ 31,2% và 29,3%; vi rút CV- A6 chiếm 58,7% và 33,6%; CV-A16 chiếm 4,3%

và 18,1%; vi rút CV-A10 chiếm 0,7% và 10% theo trình tự năm 2015-2016 Các virút đường ruột khác ở mức độ tản phát bao gồm CV-A4, CV-A5, CV-A8, CV-A14,echo 6 và Polio Sabin 3 chiếm tỷ lệ 3,5%; CV-A1, CV-A2, CV-A4, CV-A5 và CV-A8, coxsackievius B; echo 5, echo11, echo 18, Enterovirus týp 96; vẫn còn 11% và4% các vi rút đường ruột không xác định được týp vi rút, kiểu gen vi rút EV-71 làC4 và B5 [81]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các ca bệnh được chẩn đoán mắc bệnh tay chân miệng theo định nghĩa ca

bệnh thuộc địa bàn thành phố Hà Nội từ năm 2015-2018

* Định nghĩa ca bệnh lâm sàng: Theo hướng dẫn giám sát bệnh TCM của Bộ

Y tế [11], [12], dựa vào triệu chứng lâm sàng và yếu tố dịch tễ:

+ Lâm sàng: phỏng nước điển hình ở miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân,đầu gối, mông, miệng, có thể kèm sốt hoặc không

+ Yếu tố dịch tễ: Căn cứ vào tuổi, mùa, vùng lưu hành bệnh, số trẻ mắc bệnhtrong cùng thời gian

* Định nghĩa ca bệnh xác định: Là ca bệnh lâm sàng có xét nghiệm với vi rút

đường ruột gây bệnh tay chân miệng [11], [12]

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thu thập mẫu nghiên cứu:

+ Hồi cứu: 2015-2017+ Tiến cứu: 1/2018 - 12/2018

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm: Khoa Xét nghiệm – Trung tâm KSBT HàNội và PTN vi rút đường ruột – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

2.3 Vật liệu

- Phiếu điều tra các ca bệnh mắc bệnh tay chân miệng: 6066 phiếu điều tra

dịch tễ học ca bệnh của các bệnh nhân sinh sống trên địa bàn thành phố Hà Nội năm2015-2018 Bệnh nhân được chẩn đoán dựa vào định nghĩa ca bệnh theo hướng dẫncủa Bộ Y tế [11], [12]

- Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: 94 mẫu phân hoặc mẫu dịch họng năm 2018

(nếu không có mẫu phân thì dùng mẫu dịch ngoáy họng)

- Mẫu bệnh phẩm dương tính vi rút đường ruột năm 2015-2017: 110 mẫu

được giữ trong tủ âm 70oC

- Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu đặc điểm di truyền vi rút: EV-71 (8 mẫu);

CV-A6 ( 8 mẫu); mẫu CV-A16 (4 mẫu)

- Kít chẩn đoán vi rút:

+ Kit tách chiết RNA: Qiagen viral RNA mini Kit (Catalog 52906);

+ Bộ sinh phẩm realtime RT-PCR chẩn đoán Enterovirus chung: ab TESEnterovirus qPCR I KIT, Cat No G404-03, hãng AIT biotech (độ nhạy: 200copies/ml);

+ Bộ sinh phẩm realtime RT-PCR chẩn đoán EV-71: ab TES Enterovirus 71qPCR I KIT, Cat No G405-03, hãng AIT biotech biotech (độ nhạy: 200 copies/ml);+ Bộ sinh phẩm realtime RT-PCR chẩn đoán CV-A6: Coxsackie Virus A6 RealTime RT-PCR Kit, QR-0207-02, Shanghai ZJ Bio-Tech (Độ nhạy: 1×103

copies/ml);

+ Bộ sinh phẩm realtime RT-PCR chẩn đoán CV-A16: Coxsackie Virus A16Real Time RT-PCR Kit, QR-0083-02, Shanghai ZJ Bio-Tech (Độ nhạy: 1×103

copies/ml);

+ GoScript RT system (100), (Promega,Catalog A5001);

+ GoTaq® Green Master Mix (Promega, 201443)

- Sinh phẩm giải trình tự gen:

+ Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR-Sequencing: Kit PCR Purification:QiaGen – Cat No 28104;

+ Sinh phẩm PCR – sequencing: BigDye® Terminator v3.1, ABI, 4336917;+ Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide: Kit Dye Ex2.0 Spin, QiaGen – Cat No 63204;

+ Hidi Formamide, ABI, 4311320;

+ Sinh phẩm dùng cho máy Sequencer ABI 3100:

POP 7 (7 ml), ABI, 4352759;

Buffer 10X with EDTA (25ml), ABI, 402824

- Sinh phẩm điện di:

AGAROSE 500G, Promega, V3125;

TBE x 10 (1L), Promega, V4251;

SYBR ADN GEL STAIN 10,000x, Invitrogen;

ADN LADER 100 (300 ul), Promega, G8291

- Bộ mồi chẩn đoán CV-A10:

TT Tên mồi Trình tự mồi ( 5’-3’ ) Vị trí mồi Nguồn

1044bp [5],

[82]

4 CV-A16_3462R GAR GAR ACT AAC ARG TCY CT

5 CV-A6_3401R CAC TCT RAA GTT ACC YAC ATA GAT

CV-[83]

6 CV-A16_3105R TAA TCY AGG TCA YTT GCT TG

7 CV-A16_2895F AGT AYA TGT ATG TCC CRC G

8 CV-A16_3462R GAR GAR ACT AAC ARG TCY CT

9 CV-A6_2351F AYA TYA TAG CTC TTG GAG CRG C

A6

CV-[83]

10 CV-A6_3050R GGR TAR CCA TCA TAA AAC CA

11 CV-A6_2825F ART TCA CYT TYG TRT CCA

12 CV-A6_3401R CAC TCT RAA GTT ACC YAC ATA GAT

Chú ý: nucleotide ambiguity codes Y = C/T, R=A/G

- Hệ thống máy Realtime ABI 7500 Fast SDS (Applied Biosystems);

- Hệ thống máy PCR;

- Máy Sequencer ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystem, Mỹ);

- Tủ an toàn sinh học; Máy ly tâm siêu tốc; Tủ lạnh và tủ âm sâu;

- Một số vật tư và trang thiết bị khác sử dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả kết hợp phân tích.

2.4.2 Quy trình nghiên cứu

Phân tích các yếu tố dịch tễ học bệnh TCM từ các phiếu điều tra dịch tễ cabệnh: 6066 phiếu điều tra của các trường hợp mắc bệnh TCM tại Hà Nội từ năm2015-2018 Thông tin về ca bệnh được ghi nhận qua hệ thống giám sát bệnh truyềnnhiễm Hà Nội (Hệ thống giám sát được triển khai tại 63 bệnh viện bao gồm cácbệnh viện tuyến Trung ương, Bộ, Ngành, các bệnh viện tuyến Thành phố, Huyện;các phòng khám đa khoa của trung tâm Y tế 30 quận/huyện, 584 Trạm Y tế xã,phường, thị trấn, cùng với các phòng khám đa khoa, chuyên khoa có khám chữa,điều trị bệnh truyền nhiễm trên địa bàn thành phố Hà Nội) và các phiếu điều tra lưutrữ tại trung tâm KSBT Hà Nội theo mẫu của Bộ Y tế (Phụ lục 1).

94 trường hợp được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh TCM tại Hà Nội năm 2018được lấy mẫu bệnh phẩm theo quyết định số 581/QĐ-BYT ngày 24/2/2012 Bộ Y tếnăm 2018 Mẫu được lấy bởi hệ thống giám sát bệnh truyền nhiễm Hà Nội và đượcvận chuyển tới khoa Xét nghiệm, trung tâm KSBT thành phố Hà Nội tiến hành xétnghiệm chẩn đoán tác nhân gây bệnh Kết quả 61 mẫu dương tính với EV năm 2018cùng với 110 mẫu bệnh phẩm chẩn đoán xác định từ 2015-2017 lưu trữ tại khoa Xétnghiệm, trung tâm KSBT Hà Nội được định týp EV-A71, CV-A6, CV-A16 bằngphương pháp realtime RT-PCR, và CV-A10 bằng phương pháp RT-PCR

Để xác định được đặc điểm kiểu gen VP1 của VRĐR lưu hành tại Hà Nội, một

số mẫu dương tính với EV-A71, CV-A6, CV-A16 (các mẫu có kết quả realtime PCR với Ct <28 và được thu thập tại các thời điểm khác nhau lần lượt theo thứ tự

RT-ưu tiên: theo nửa năm, theo quý, theo tháng) được chọn để khuếch đại vùng genVP1 bằng phương pháp PCR Kết quả khuếch đại, có 20 mẫu bệnh phẩm bao gồm 8mẫu dương tính EV-A71, 8 mẫu dương tính CV-A6 và 4 mẫu dương tính CV-A16đáp ứng đủ điều kiện về nồng độ ADN và độ đặc hiệu (thể hiện ở độ sáng, rõ củabăng điện di, không có băng phụ) cho giải trình tự gen Kết quả giải trình tự sau đóđược so sánh với các chủng EV đại diện (chủng lưu hành ở Việt Nam và trên thế

giới đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới – phụ lục 2).

Phiếu điều tra

Ca bệnh TCM lâm sàng

Đặc điểm dịch tễ

- Tuổi, giới, cư trú, thời gianmắc, độ lâm sàng, chẩnđoán xác định, định týp

Lấy mẫu chẩn đoán EV

Realtime RT-PCR EV-A71

Realtime RT-PCR CV-A6 2-3 mẫu/năm

Realtime RT-PCR CV-A16 2-3 mẫu/năm

Dương tính EV-A71

Âm tính EV-A71

Dương tính CV-A6

Âm tính CV-A6

- Phân bố bệnh nhân về: tuổi, giới, khu vực, thời gian xuất hiện bệnh trong năm.

- Tỷ lệ bệnh nhân theo phân độ lâm sàng

- Phân bố các trường hợp xác định bệnh tay chân miệng theo tác nhân gây bệnh

- Mối liên quan giữa tác nhân gây bệnh và độ lâm sàng

b Xác định tác nhân gây bệnh từ mẫu lâm sàng: EV, EV-71, CV-A6, CV-A16 và

CV-A10

c Phân tích vùng gen VP1 của EV-71, CV-A6, CV-A16: Cây phát sinh loài, bảng

nucleotid, bảng aa có so sánh với chủng chuẩn trên ngân hàng gen

2.4.4 Các bước thực hiện xác định týp vi rút và giải trình tự gen vùng VP1

2.4.4.1 Xử lý mẫu

- Bệnh phẩm là phân: Gạt khoảng 2g mẫu vào trong ống falcon 50 ml, bổ sung

10ml dung dịch PBS 1X, 5-10 hạt thuỷ tinh, 1ml chloroform Vặn chặt nắp ống, dánparafilm kín nắp ống

Lắc ống bằng máy lắc (800 vòng/phút) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm

4000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC Hút 1ml dịch nổi chia vào ống tube 1,5 ml vàbảo quản ở -70oC

- Bệnh phẩm là dịch ngoáy họng, dịch nốt phỏng: Bệnh phẩm đang được bảo

quản trong ống môi trường VTM Lắc ống bằng máy lắc (800 vòng/phút) trong 20phút ở nhiệt độ phòng Chia 1ml dịch vào ống tube 1,5 ml và bảo quản ở -70 oC

2.4.4.2 Tách chiết ARN vi rút

Sử dụng sinh phẩm Quiagen virak ARN mini kit, catalog 52906, gồm các bước:

- Cho 560 µl AVL có chứa 5,6µl carrier ARN vào ống có thể tích 1,5 ml

- Cho 140 µl mẫu vào ống đã có chứa hỗn hợp AVL và carrier ARN, trộn đều

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

- Thêm 560 μl cồn (96–100%) vào hỗn hợp trên, trộn đều.l cồn (96–100%) vào hỗn hợp trên, trộn đều

- Chuyển hỗn hợp lên cột lọc, ly tâm 8000v/1 phút, chuyển cột sang ống hứng mới

- Cho 500 AW1 vào cột, ly tâm 8000v/1 phút, chuyển cột lọc sang ống hứng mới

- Cho 500 AW2 vào cột lọc, ly tâm 14000v/3 phút, chuyển cột lọc sang ốnghứng mới Ly tâm khan với tốc độ 14000v/1 phút

- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml, cho 60 µl dung dịch AVE vào, ủ ở nhiệt độphòng trong 1 phút Ly tâm 8000 v/1 phút, vứt bỏ cột lọc, cất ARN trong tủ -70oC

2.4.4.3 Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút đường ruột chung và týp EV-A71, CV-A6, CV-A16

- Bộ sinh phẩm Coxsackie Virus A16 Real Time RT-PCR Kit, QR-0083-02,

hãng Shanghai ZJ Bio-Tech (Độ nhạy: 1×103 copies/ml);

Các sinh phẩm của bộ kít được giữ trong đá ướt trong suốt quá trình sử dụng

b Các bước thực hiện (Phụ lục 3a, 3b và 3c)

* Đọc kết quả: (với các mẫu chứng âm, dương, IC đạt)

- Dương tính EV/EV-A71 khi tín hiệu vượt ngưỡng có Ct < 37,5 [84], [85];

- Dương tính CV-A6 khi tín hiệu vượt ngưỡng có Ct < 35 [86];

- Dương tính CV-A16 khi tín hiệu vượt ngưỡng có Ct < 38 [87]

2.4.4.4 RT-PCR xác định A10: Các mẫu âm tính với EV-71, A61 và

CV-A16 được xét nghiệm xác định CV-A10 bằng kỹ thuật RT-PCR (Phụ lục 4)

Kit tinh sạch (Qiagen Purification kit Qiaquick 250 Cat.No 28104; Chú ý :

Thêm cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trước khi sử dụng)

- Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có (vd: 500 µl đệm

PB và 100 µl sản phẩm PCR) Đặt cột Qiaquick vào tube thu 2ml

- Dùng pipet cho sản phẩm đã trộn vào cột Qiaquick, ly tâm 60giây

13.000vòng/30 Loại bỏ nước ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube

- Dùng pipet cho 750ul đệm PE vào cột Qiaquick, ly tâm 60giây

13.000vòng/30 Loại bỏ nước ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube, ly tâm 13.000 vòng/60 giây

- Chuyển cột Qiaquick sang tube sạch 1.5ml

- Cho 30ul đệm EB hoặc nước tinh sạch vào chính giữa màng lọc của cộtQiaquick để tách lấy ADN, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 13.000vòng/60giây ADN tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC