ỨNG DỤNG kỹ THUẬT sắp xếp dãy mô TRONG NGHIÊN cứu các dấu ấn ER, PR, HER2, KI67 ở BỆNH NHÂN UNG THƯ vú

Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch bằng máy cho mẫu bệnh phẩm ung thư vú sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô...52 4.2.. So sánh tỷ lệ bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch trong ung thư vú bằng kỹ th

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮP XẾP DÃY MÔ TRONG NGHIÊN CỨU CÁC DẤU ẤN ER, PR, HER2, KI67

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮP XẾP DÃY MÔ TRONG NGHIÊN CỨU CÁC DẤU ẤN ER, PR, HER2, KI67

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

động viên tôi trong quá trình học tập, triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Phòng Quản lý và Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu.

Tôi xin được cảm ơn tập thể Trung tâm Giải phẫu bệnh – Sinh học phân

tử Bệnh viện K đã cho phép, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu và thu thập số liệu.

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng biết ơn và tình cảm yêu quý nhất đến Bố mẹ, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã hết lòng ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và là động lực giúp tôi vượt qua những khó khăn để hoàn thành khóa học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hương

Tôi là Nguyễn Thị Thu Hương, học viên Cao học khóa 26, chuyên ngànhXét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn củaPGS TS Tạ Văn Tờ

2 Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ công trìnhnghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hương

HMMD Hóa mô miễn dịch

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về ung thư vú 3

1.1.1 Giải phẫu tuyến vú 3

1.1.2 Sinh lý tuyến vú 3

1.1.3 Đặc điểm một số dấu ấn sinh học trong ung thư vú 4

1.2 Đại cương về hóa mô miễn dịch 8

1.2.1 Khái niệm hóa mô miễn dịch 8

1.2.2 Lịch sử hình thành và phát triển kỹ thuật nhuộm HMMD 8

1.2.3 Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm HMMD 10

1.2.4 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch 16

1.3 Đại cương về kỹ thuật sắp xếp dãy mô 23

1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật sắp xếp dãy mô 23

1.3.2 Lịch sử phát triển của kỹ thuật sắp xếp dãy mô 24

1.3.3 Kỹ thuật sắp xếp dãy mô 26

1.4 Một số nghiên cứu xác định dấu ấn ung thư vú thông qua kỹ thuật sắp xếp dãy mô 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng và thời gian nghiên cứu 33

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 33

2.2.2 Cỡ mẫu và kỹ thuật chọn mẫu 33

2.2.3 Các chỉ số/biến số nghiên cứu 34

2.2.6 Quản lý và phân tích số liệu 39

2.2.7 Đạo đức nghiên cứu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô 40

3.1.1 Về mặt kỹ thuật 40

3.1.2 Nhược điểm và một số lỗi khi thực hiện kỹ thuật sắp xếp dãy mô trong quá trình phân tích nghiên cứu 43

3.2 So sánh tỷ lệ bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch trong ung thư vú bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô miễn dịch với kỹ thuật truyền thống 45

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 52

4.1 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch bằng máy cho mẫu bệnh phẩm ung thư vú sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô 52

4.2 So sánh tỷ lệ bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch trong ung thư vú bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô miễn dịch với kỹ thuật truyền thống 57

KẾT LUẬN 66

KHUYẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ bộc lộ thụ thể nội tiết ER qua phương pháp nhuộm

HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống 45Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ bộc lộ thụ thể nội tiết PR qua phương pháp nhuộm

HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống 47Bảng 3.3 So sánh tỷ lệ bộc lộ thụ thể nội tiết Her2 qua phương pháp nhuộm

HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống 48Bảng 3.4 So sánh nhóm kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch các dấu ấn qua

phương pháp nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với

kỹ thuật truyền thống 50Bảng 3.5 So sánh tỷ lệ bộc lộ Ki67 trong ung thư vú qua phương pháp

nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô miễn với kỹ thuậttruyền thống 51

Biểu đồ 3.1 Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn ER qua qua phương pháp

nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuậttruyền thống 46Biểu đồ 3.2 Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn PR qua qua phương pháp

nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuậttruyền thống 47Biểu đồ 3.3 Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn Her2 qua qua phương pháp

nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuậttruyền thống 49Biểu đồ 3.4 Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn Ki67 qua qua phương pháp

nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuậttruyền thống 51

Hình 3.1 113 mẫu lấy bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô được đúc trong 6

khối nến, cắt nhuộm tiêu bản HE 40

Hình 3.2 113 mẫu lấy bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô được nhuộm các dấu ấn ER, PR, Her2, Ki67 40

Hình 3.3 Hình ảnh PR(+) độ phóng đại x100 42

Hình 3.4 Hình ảnh ER (+) độ phóng đại x100 42

Hình 3.5 Hình ảnh Her2 (3+) độ phóng đại x100 43

Hình 3.6 Hình ảnh Ki67 độ phóng đại x100 43

Hình 3.7 Các lõi mô bị lệch vị trí trong quá trình đúc khối nến 44

Hình 3.8 Khối nến ban đầu bị vỡ do lấy mẫu quá mạnh 44

Hình 3.9 Mẫu mô nhuộm Her2 nền vùng có chất hoại tử 44

Hình 3.10 Hình ảnh Ki67 bong 44

Hình 3.11 Hình ảnh không trình diện hết lõi mô trên tiêu bản nhuộm ER độ phóng đại x40 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư phổ biến nhất và cũng là nguyên nhânchính gây tử vong do ung thư đối với phụ nữ trên toàn thế giới Bệnh có tỷ lệmắc cao nhất ở các nước phát triển như ở Bắc Mỹ, Asutralia, Châu Âu vàchiếm 25% tỷ lệ tử vong do ung thư ở các nước này , Theo số liệu củaGLOBOCAN vào năm 2012, thế giới có 1.671.149 ca mới mắc, số ca tử vong

là 521.907 Tại Việt Nam, số ca mới mắc là 11.000 và số ca tử vong là gần5.000 ca

Mặc dù UTV đứng hàng đầu trong các bệnh ung thư ở phụ nữ nhưng tỷ

lệ tử vong do bệnh đang được giảm dần nhờ sự tiến bộ trong phòng bệnh,sàng lọc phát hiện sớm và điều trị, đặc biệt là điều trị bằng hóa chất, nội tiết

và sinh học ,

Một số yếu tố tiên lượng đã được xác định như giai đoạn bệnh, độ môhọc, loại mô học, tình trạng thụ thể nội tiết (TTNT), tình trạng bộ lộ yếu tốtăng trưởng biểu mô, Ki-67 Thụ thể hormon Estrogen Receptor (ER),Progesterol Receptor (PR) và bộc lộ yếu tố tăng trưởng biểu mô (Her2), Ki-67nằm trong tế bào đã được xác định là những yếu tố tiên lượng liên quan đếnđiều trị Hiện nay, xác định bộc lộ 4 dấu ấn này đối với ung thư vú được thựchiện thường quy bằng xét nghiệm hóa mô miễn dịch (HMMD) Tuy nhiên hóachất sử dụng cho kỹ thuật HMMD khá đắt, vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào

để làm xét nghiệm cho một số lượng lớn bệnh nhân ung thư vú với giá thànhthấp nhất mà vẫn đảm bảo đưa ra được kết quả chính xác để phục vụ cho côngtác điều trị Kỹ thuật sắp xếp dãy mô đã được một số nước trên thế giới như

Mỹ, Australia,… sử dụng từ nhiều năm trước trong nghiên cứu , , Ở ViệtNam, một số cơ sở giải phẫu bệnh tại Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh đã

sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu HMMD nhưng chưa có nghiên cứu

nào đánh giá đầy đủ về các yếu tố liên quan và chất lượng của xét nghiệm khi

sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô trong xét nghiệm đánh giá tình trạng thụ thểnội tiết, yếu tố phát triển biểu mô và Ki-67 trong ung thư biểu mô tuyến vú sovới xét nghiệm HMMD truyền thống Để giải đáp những câu hỏi này, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu: “Ứng dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô trong nghiên

cứu các dấu ấn ER, PR, Her2, Ki67 ở bệnh nhân ung thư vú” với hai mục

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về ung thư vú

1.1.1 Giải phẫu tuyến vú

Tuyến vú của phụ nữ trưởng thành nằm theo trục dọc từ xương sườn IIđến xương sườn VI, trục ngang nằm từ bờ bên xương ức cho đến đường náchgiữa, kích thước 10 - 12 cm, dày 5 - 7 cm Hình dạng tuyến vú thường hìnhchóp nhưng khác nhau theo từng cá thể, theo thời gian và sau khi sinh con Cấu trúc tuyến vú gồm 3 phần: da, mô dưới da và mô vú Phần mô tuyến

vú gồm nhiều thùy (có thể từ 12 - 20 thùy) Giữa các thùy ngăn cách nhau bởicác vách liên kết, mỗi thùy chia ra nhiều tiểu thùy, mỗi tiểu thùy tạo nên từcác nang tuyến dài hoặc tròn, đứng riêng rẽ hoặc đứng tập trung thành đámhoặc riêng rẽ Các túi 2 - 3 nang đổ chung vào nhánh cuối cùng của ống bàixuất trong tiểu thùy Các ống này sẽ đổi vào các nhánh gian tiểu thùy và hợplại thành ống lớn hơn, cuối cùng tất cả các ống của một tiểu thùy đều đổ vàomột ống duy nhất đưa đến núm vú và mở ra bề mặt núm vú ,

1.1.2 Sinh lý tuyến vú

Tuyến vú phát triển từ tuổi dậy thì dưới tác dụng của estrogen vàprogesterol, hai hormone này kích thích tuyến vú phát triển và chịu sự điềuhòa của FSH và LH từ tuyến yên ,

Estrogen làm tăng sinh biểu mô vú trong pha noãn của chu kỳ kinhnguyệt Trong pha này, biểu mô dài ra, tăng tổng hợp RNA, tăng tỷ trọngnhân, nở to các hạt nhân và những thay đổi các thành phần khác trong tế bào.Trong pha nang , ở thời điểm giữa chu kỳ, ở thời điểm estrogen được tổnghợp và tiết ra nhiều nhất thì sẽ xảy ra rụng trứng

Progesterol làm thay đổi biểu mô tuyến vú trong pha hoàng thể của chu

kỳ rụng trứng Các ống tuyến vú giãn ra, các tế bào viểu mô nang sẽ hoạt hóathành các tế bào chế tiết ,

1.1.3 Đặc điểm một số dấu ấn sinh học trong ung thư vú

1.1.3.1 Thụ thể nội tiết

Những thay đổi biểu mô vú do các hormone điều chỉnh qua các thụ thểsteroid trong tế bào hoặc thụ thể peptid gắn với màng tế bào Người ta đã tìmthấy các thụ thể của ER và PR trong dịch bào tương của biểu mô vú bìnhthường Khoảng 66% các bệnh nhân ung thư vú có ER và/hoặc PR dương tính

ở các tế bào u xâm nhập Chỉ có một số ít bệnh nhân có ER âm tính đáp ứngvới liệu pháp nội tiết UTV có thụ thể nội tiết dương tính thường đáp ứng tốtvới điều trị bằng hormon do đó tỷ lệ tái phát thấp hơn, thời gian sống thêm lâuhơn so với bệnh nhân thụ thể nội tiết âm tính Sự hiện diện của cả 2 thụ thể

ER và PR có tiên lượng tốt hơn so với hiện diện của một loại hormon Nhữngbệnh nhân có cả thụ thể ER và PR có khoảng thời gian ổn định dài hơn, thờigian sống thêm sau chẩn đoán tái phát cùng dài hơn ,

Các thụ thể nội tiết này được xác định và định lượng bằng kỹ thuậtHMMD HMMD là kỹ thuật xác định sự hiện diện và vị trí của kháng nguyêntrong các thành phần tế bào như bào tương, màng tế bào, nhân bằng các phảnứng miễn dịch và hóa học thông qua việc xác định phức hợp kháng nguyên(KN) - kháng thể(KT) nhờ một kháng thể đặc hiệu Sau đó, nhờ hệ trốngkhuếch đại bằng chất phát huỳnh quang (miễn dịch huỳnh quang) hoặc mộtloại men (miễn dịch men) để phóng đại hệ thống nhận biết, tăng độ nhạy và

độ đặc hiệu của phương pháp

1.1.3.2 Yếu tố phát triển biểu mô

Một số nghiên cứu cho thấy khoảng 15-20% UTV có sự bộc lộ quá mứcthụ thể yếu tố phát triển biểu mô Her2, điều này gây ra tình trạng tăng sinh tếbào biểu mô vô hạn độ

Họ Her gồm có 4 thụ thể là EGFR (erbB1 hay Her1), Her2 (erbB2 hoặcp185, neu hay còn được gọi cách khác là Her2/neu), Her3 (erbB3) và Her4(erbB4) Chúng là các thụ thể tyrosine kinase xuyên màng có liên quan chặtchẽ với nhau ,

Cấu trúc của các thành viên họ Her rất giống nhau gồm một vùng ngoạibào để gắn với phối tử, tiếp đó là vùng xuyên bào xoắn ốc và một vùng nộibào có hoạt tính men tyrosine kinase, nhưng phối tử gắn vào chúng khác nhaunên chức năng của mỗi loại trong tế bào là khác nhau Hiện nay có ít nhất 11phối tử liên quan với quá trình dẫn truyền tín hiệu tế bào của họ Her Mỗi loạithụ thể thuộc họ Her đều tồn tại ở dạng đơn trùng (monomer) khi bất hoạt Khigắn với các phối tử, chúng chuyển thành các đồng nhị trùng (homodinomer, nhưHer1/Her1) hoặc dị nhị trùng (heterodinomer, như Her1/Her2) có hoạt tính, và

từ đó hoạt hóa men tyrosine kinase Men tyrosine kinase là men xúc tác sựvận chuyển phosphate từ ATP đến tyrosine trong các polypeptide (quá trìnhphosphoryl hóa) Chính sự phosphoryl hóa là hoạt động sống của tế bào.Trong tế bào ung thư, sự phosphoryl hóa kích thích một loạt các con đườngđãn truyền tín hiệu, từ đó ảnh hưởng đến sự tăng sinh, tân tạo mạch máu vàngăn cản quá trình chết theo chương trình

EGFR là thụ thể đầu tiên trong họ Her được phát hiện vào năm 1978 Her2 là thụ thể thứ hai trong họ Her người được phát hiện vào năm 1984.Her2 mã hóa một thụ thể tyrosine kinase xuyên màng, tương đồng với EGFR.Cho đến nay, Her2 là thành viên duy nhất thuộc họ Her mà không có phối tửnào trong họ này có thể hoạt hóa sự đồng nhị trùng hóa của nó Thay vào đó,Her2 giữ chức năng đầu tiên như là một đối tác dị nhị trùng hóa đối với cácthành viên khác trong họ Her như EGFR, Her3 hoặc Her4 Her2 thường bộc

lộ quá mức trong UTV, buồng trứng, phổi và dạ dày Do vậy, Her2 là một dấu

ấn phân tử thường được dùng làm chỉ số tiên lượng cùng với EGFR trong

nhiều loại ung thư Trên cơ sở hiểu biết về con đường dẫn truyền tín hiệu này

và vai trò của thụ thể thuộc họ Her trong ung thư, người ta đã nghiên cứu vàphát triển các loại thuốc ức chế một hoặc nhiều trong số các con đường này 14

Các phương pháp đánh giá Her2:

Ngày nay, Her2 đã trở thành một yếu tố tiên lượng quan trọng trongUTV Có nhiều kỹ thuật đánh giá sự bộ lộ của Her2 được sử dụng:

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch – IHC:

Là phương pháp đã mô tả trong phần đánh giá ER và PR

Ưu điểm: có độ chính xác và độ nhạy cao Đây được coi là một xétnghiệm tiêu chuẩn và thường quy được áp dụng để phát hiện sự khuếch đạibất thường của gen Her2

Nhược điểm: giá thành cao, thiết bị đắt tiền

Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

Đây là phương pháp đánh giá mức độ khuếch đại của gen

Ưu điểm: đánh giá khách quan hơn, có độ nhạy và độ chính xác cao FISH

có độ tương hợp khá tốt về kết quả so với HMMD với các trường hợp Her2 3+nhưng chính xác hơn trong trường hợp Her2 2+ do đó giúp cho sự tiên lượng vàđiều trị tốt hơn

Nhược điểm: giá thành cao, thiết bị đắt tiền, việc đọc kết quả khó khănhơn, mất nhiều thời gian hơn, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang vàkhông bảo quản được lâu ,

Kỹ thuật lai tại chỗ cố định màu CISH (Chromogenic In Situ Hybridization)

Đây cũng là phương pháp đo mức độ khuếch đại gen, được coi là mộtphương pháp chọn lựa thay thế cho FISH Phương pháp này kết hợp ưu điểmcủa cả hai phương pháp HMMD và FISH Với kỹ thuật này, gen Her2 được

phát hiện bằng phản ứng peroxidase quan sát dưới kính hiển vi quang họcthường

Các kỹ thuật khác

+ Kỹ thuật khuếch đại gen RT-PCR (Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction): là kỹ thuật phát hiện RNA thông tin của gen HER-2/neutrong máu ngoại vi và trong tủy xương, cho thấy mức tương ứng với sựkhuếch đại gen cao hơn khi so với kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật này rất hữu ích trong việc đánh giá mức độ biểu hiện gen

+ Kỹ thuật ELISA (Enzym Link Immuno Sorbent Assays): thực hiệntrên dịch bào tương lấy từ bệnh phẩm tươi, tránh được những nguy cơ củaviệc tổn hại đến các kháng nguyên của quá trình xử lý và cố định bệnh phẩm.Tuy nhiên, ngày nay khi u được phát hiện ở giai đoạn càng ngày càng sớmhơn, kích thước u nhỏ hơn nên việc chiết xuất được dịch tế bào của u ngàycàng khó khăn hơn

số Ki-67 rất cần thiết để phân biệt typ phân tử của UTV, giữa typ lòng ống A

và typ lòng ống B, phục vụ cho tiên lượng và xác định hướng điều trị chobệnh nhân

Ki-67 còn được sử dụng là yếu tố tiên lượng trong UTV sớm được minhchứng bằng một nghiên cứu trên 12.155 bệnh nhân cho thấy Ki-67 dương tính

có liên quan đến xác suất tái phát cao hơn ở tất cả bệnh nhân (HR = 1,93(khoảng tin cậy 95% (CI): 1,74–2,14); P <0,001), ở bệnh nhân hạch âm (HR =2,31) (KTC 95%: 1,83-22,92), P <0,001) và ở bệnh nhân dương tính nút (HR

= 1,59 (KTC 95%: 1,35–1,87); P <0,001) Hơn nữa, Ki-67 có liên quan đến tỷ

lệ sống kém hơn ở tất cả các bệnh nhân (HR = 1,95 (KTC 95%: 1,70-2,24; P

<0,001)), bệnh nhân hạch âm (HR = 2,54 (KTC 95%: 1,65–3,91), P <0,001)

và bệnh nhân dương tính nút (HR = 2,33 (KTC 95%: 1,83–2,95); P <0,001).Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng dương tính Ki-67 có nguy cơ tái phát caohơn và tỷ lệ sống sót thấp hơn ở những bệnh nhân có UTV sớm

1.2 Đại cương về hóa mô miễn dịch

1.2.1 Khái niệm hóa mô miễn dịch (HMMD)

Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry, viết tắt là HMMD) làphương pháp xác định vị trí kháng nguyên (KN) đặc hiệu hiện diện trong môhoặc tế bào (bào tương, màng tế bào, nhân) dựa trên phản ứng miễn dịch(kháng nguyên - kháng thể) kết hợp với hóa chất

Vì KN không thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định sự

có mặt của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học Các vị trígắn kháng thể (KT) được xác định bằng cách đánh dấu trực tiếp lên chính KT,hoặc bằng cách sử dụng một phương pháp đánh dấu phụ

1.2.2 Lịch sử hình thành và phát triển kỹ thuật nhuộm HMMD

Với lịch sử hơn 70 năm, HMMD đã có một ảnh hưởng to lớn trong chẩnđoán Giải phẫu bệnh (GPB), là một trong những kỹ thuật đang được phát triểntrở thành thường quy trong đa số phòng xét nghiệm GPB ở các nước pháttriển hiện nay

Năm 1966, Graham và Karnosky phát triển phương phápHorseradish peroxidase Năm 1967, Nakane và Pierce đã báo cáo về việc

sử dụng KT được gắn enzyme peroxidase cùng với chất nền như DAB(3,3-diaminobenziden tetrahydrochlorid) Khi phương pháp enzyme rađời, rất nhiều nhược điểm của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang đã đượckhắc phục

Từ đó, nhiều kỹ thuật gắn enzyme đã được phát triển như kỹ thuật menchống men (PAP-Peroxidase-anti-peroxidase) được mô tả bởi Sterberger vàcộng sự (1970) , kỹ thuật sử dụng alkaline phosphatase của Engvall vàPerlman (1971), kỹ thuật cầu nối avidin-biotin (ABC) do Heitzman &Richards (1974)

Năm 1977, Ness và Ash đề xuất việc sử dụng avidin-biotin cho miễndịch huỳnh quang Kỹ thuật này đã bị biến đổi bởi Guesden (1979) và Hsu(1981), sử dụng đánh dấu peroxidase cải ngựa 33 Đánh dấu avidin-biotin

đã được thay thế bởi đánh dấu steptavidin-biotin, là kỹ thuật được sử dụngphổ biến trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán 29 Hiện nay, hệ thốngpolymer có đánh dấu được lựa chọn phổ biến cho hầu hết các phòng thínghiệm chẩn đoán

Năm 1975, Kohler và Milstein đã mô tả KT u lai - một phương pháp cảitiến lớn trong sản xuất KT đơn dòng Trong những năm gần đây, khả năng sảnxuất peptid tổng hợp cả KT đơn dòng và KT đa dòng đã được nâng cao nhờ

sự phát triển mạnh mẽ trong lĩnh vực sinh học phân tử

Năm 1970, Huang và cộng sự đã mô tả việc sử dụng enzyme trypsin trênmảnh cắt paraffin để bộc lộ một số KN đã bị che lấp trong quá trình cố định vàchuyển đúc do quá trình cố định, chuyển đúc thông thường đã che lấp một sốepitope, phương pháp bộc lộ KN trên mô vùi nến có những bước tiến quantrọng Năm 1991, Shi lần đầu tiên mô tả về quá trình tiền xử lý nhiệt bằng lò visóng để xử lý mảnh cắt đã khử paraffin trong một dung dịch kim loại nặng 36.Năm 1993, Cattoretti đã đề nghị thay thế dung dịch kim loại nặng thành dungdịch Citrate buffer pH 6 Năm 1994, Norton cho rằng việc sử dụng nồi áp suấthiệu quả hơn lò vi sóng trong việc bộc lộ một số KN Sau đó, một vài tác giả đãđưa ra một vài phương pháp bộc lộ khác như: để tủ ấm qua đêm ở 70 – 800Ctrong Citrat, trong Tris EDTA hay trong acid boric,…

Hiện nay, nhiều phương pháp nhuộm HMMD đã được thương mại hóa bởinhiều hãng như Dako, Leica, Thermo, Invitrogen, Cell Marque, Ventana,

1.2.3 Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm HMMD

Là sự kết hợp đặc hiệu giữa KN và KT đặc hiệu Phức hợp KN - KT nàyđược gắn với hệ thống nhận biết một cách trực tiếp hoặc gián tiếp để có thểquan sát được trên kính hiển vi

Miễn dịch huỳnh quang: Cho KT đặc hiệu gắn với chất phát huỳnhquang và quan sát dưới kính hiển vi (KHV) huỳnh quang

Miễn dịch enzyme: Cho KT đặc hiệu gắn với một loại enzyme(Peroxidase hoặc Alkaline phosphatase) và chất gắn màu (Chromogen), quansát dưới KHV quang học ,

Ba thành phần chính tham gia vào HMMD là Kháng nguyên (Mô học),Kháng thể (Miễn dịch học), hệ thống nhận biết (Hóa học)

Cần bộc lộ epitope trước khi cho tiếp xúc với KT do những vùng có tínhđặc hiệu cao với từng loại KT này có thể bị che lấp trong quá trình cố định bằngformol và chuyển đúc paraffin ,

1.2.3.2 Kháng thể

Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (bản chất là glycoprotein) của

cơ thể tạo ra để đáp ứng với sự hiện diện của các phân tử, sinh vật hoặc các

tác nhân khác.Kháng thể được sản xuất bởi các tế bào Lympho B cũng nhưcác tương bào (biệt hóa từ lympho B) Một KT miễn dịch là một phân tửprotein hình chữ Y bao gồm chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Mỗi loại kháng thể đềukhác nhau về cấu trúc và chức năng Một KT chỉ có thể nhận diện một epitope

KN duy nhất Vị trí gắn với epitope của KN gọi là paratope IgG là kháng thểđược dùng phổ biến nhất trong HMMD

1.2.3.3 Sự kết hợp KN – KT

Sự kết hợp KN - KT có ba đặc điểm là: thuận nghịch, đặc hiệu và tỏanhiệt Sự kết hợp thuận nghịch không phải phản ứng hóa học, do vậy sau khikết hợp và phân ly thì cấu trúc hóa học của KN hoặc KT hầu như không thayđổi Tính đặc hiệu được hiểu là KT do KN nào tạo ra chỉ kết hợp đặc hiệu với

KN ấy Dựa vào sự tỏa nhiệt trong phản ứng có thể chia KT thành 2 loại KT

“nóng” và KT “lạnh” Các lực liên kết giữa một paratope với một epitope baogồm: lực hút tĩnh điện, lực liên kết yếu hydro, lực liên kết kỵ nước, lực Van deWalls Các lực này phải kết hợp với nhau thì liên kết KN - KT mới hình thành.Như vậy, cấu hình của paratope phải phù hợp cao độ với epitope sao cho các lựcnày đồng thời xuất hiện và đủ giá trị kết hợp

Có hai loại kháng thể là KT đơn dòng (monoclonal antibody) và KT đadòng (polyclonal antibody) KT đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu

KT đa dòng là tập hợp các KT đặc hiệu với các epitope khác nhau trên cùngmột KN

Hình 1.1: Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng

KT đơn dòng được tạo ra từ một dòng tế bào plasma nên chúng giống hệtnhau, đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng chỉ nhận biết một epitope của KN.Các KT đơn dòng được biết đến từ năm 1975 khi Cesar Milstein và GeorgesKohle khám phá ra một kỹ thuật tạo ra một số lượng lớn các tế bào bạchhuyết, có khả năng sản xuất một dạng KT duy nhất bằng kỹ thuật u lai 40.Loại KT này chỉ đáp ứng với một loại KN chuyên biệt, vì thế chúng đượcđặt tên là KT đơn dòng Để sản xuất KT đơn dòng, các tế bào bạch cầulymphocyte được kích thích đáp ứng miễn dịch sản sinh KT đặc hiệu Các tếbào lymphocyte sản sinh KT được lai với các tế bào ung thư có khả năngphân chia vĩnh viễn tạo ra các dòng tế bào lai gọi là hybridoma Dòng tế bàolai hybridoma có điểm đặc biệt là khả năng tăng sinh vĩnh viễn và sản sinhcùng loại KT trong môi trường nuôi cấy Ưu điểm của loại KT này là khôngcần một lượng lớn động vật mà vẫn thu được lượng KT nhiều bằng nuôi cấyinvitro, KT thu được tinh khiết, có tính đặc hiệu cao

Kháng thể đa dòng (Polyclonal) Kháng thể đơn dòng

(Monoclonal)

Kháng thể đa dòng được sản xuất bằng cách gây miễn dịch trên động vậtthường là thỏ, chuột lang, dê, bò, lợn với KN đặc hiệu cần quan tâm Độngvật đáp ứng miễn dịch và tạo ra nhiều loại KT khác nhau gồm cả KT đặc hiệu

và không đặc hiệu trong huyết thanh của chúng Trong suốt thời kỳ đáp ứngmiễn dịch, động vật luôn được duy trì miễn dịch bằng cách tiêm chất KN, sau

đó, thu thập máu để chắt lấy huyết thanh loại bỏ một số protein không cầnthiết bằng cách kết tủa với amonisulfat, sắc ký miễn dịch,… So với KT đơndòng thì KT đa dòng dễ sản xuất hơn và nhạy hơn

1.2.3.4 Hệ thống nhận biết

Phức hợp KN - KT không thể quan sát được bằng KHV quang học nêncần có một hệ thống tín hiệu để nhận biết vị trí xảy ra phản ứng KN - KT Hệthống này có thể gắn trực tiếp vào KT1 (kỹ thuật trực tiếp) hay thông qua mộthoặc nhiều hệ thống KT phụ (kỹ thuật gián tiếp)

a Nhận biết bằng enzyme

Trong HMMD, enzyme là chất nhận biết được dùng phổ biến nhất Bằngphản ứng enzyme - cơ chất sẽ tạo ra một sản phẩm màu ổn định và có thểquan sát dưới kính hiển vi quang học Trong kỹ thuật HMMD, enzyme được

sử dụng cần phải đảm bảo tạo ra một sản phẩm phản ứng không thể hòa tan,màu rõ ràng, kết tủa trực tiếp tại sản phẩm đó đồng thời phải bền vững ở nhiệt

độ phòng, có thể sản xuất được nhiều và có thể duy trì hầu hết các hoạt độngcủa nó sau khi đã kết nối 42 Có nhiều loại enzyme và chất màu thích hợp đểngười dùng lựa chọn màu sản phẩm phản ứng cuối cùng sao cho tạo ra sựtương phản nhất Hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi do dễ sản xuất và giáthành thấp là Peroxidase và Alkaline phosphatase

Horseradish peroxidase (HRP) được phân lập từ rễ cây cải ngựa: là loại

enzyme được sử dụng rộng rãi nhất và kết hợp với chất màu thích hợp nhất làDAB HRP được dùng nhiều do kích thước nhỏ nên nó sẽ không gây cản trở

việc gắn của những vị trí kháng thể liền kề, dễ dàng trong việc tinh sạch do đóhạn chế tối đa việc enzyme bị nhiễm, dễ dàng hạn chế sự hoạt động củaenzyme Peroxidase nội sinh 2943 Nó tạo ra sản phẩm phản ứng cuối cùngmàu nâu sẫm rõ nét, ổn định trong nhiều năm và không tan trong rượu và cácdung môi hữu cơ khác (Graham và Karnowky, 1966) DAB là một chất độcgây ung thư tiềm năng (Weisburger và cộng sự, 1978) Ngoài ra còn một sốchất màu khác có thể thay thế DAB để thể hiện Peroxidase, bao gồm:

- AEC (3-amino-9-ethylcarbazole): tạo sản phẩm phản ứng màu đỏ hồng.Màu đỏ do AEC tạo ra không bị nhầm với sắc tố melanin, vì vậy, AEC haydùng trong các bệnh của da Nhưng AEC dễ bị hòa tan trong các dung môihữu cơ, không bền vững, dễ bị phai màu theo thời gian và cũng là một chấtgây ung thư nên AEC ít được sử dụng hơn DAB , ,

- CN (4-chloro-1-1naphthol): tạo sản phẩn phản ứng màu xanh 29, 46 ,

- Hanker - Yates reagent (Hanker và cs 1977): tạo sản phẩm phản ứngmàu xanh đậm

- Alpha - naphthol pyronin: tạo sản phẩm phản ứng màu đỏ tím ,

Hoạt động của enzyme Peroxidase nội sinh cần được ngăn chặn đặc biệt

là ở các tế bào bạch cầu, hồng cầu, tủy xương, tế bào gan, cơ… Chất đượcdùng phổ biến nhất để khử Peroxidase nội sinh là hydrogen peroxid -methanol (H2O2)

Alkaline phosphatase chiết xuất từ ruột bê: cũng được sử dụng làm

enzyme đánh dấu thay thế cho Peroxidase, đặc biệt là kể từ khi phương phápphức hợp APAAP được phát triển bởi Cordell và cộng sự (1984) Phương phápnày sử dụng một số chất nền như: Naphthol AS - MX phosphat, naphthol AS -

BI phosphat, AS - TR phosphat, 5 - brom - 4 chloro - 3 - indoxyl phosphate(BCIP) Ưu điểm chính của phương pháp APAAP so với PAP (dùng enzymePeroxidase) là loại trừ được hoạt động của Peroxidase nội sinh do đó APAAP

khuyến khích sử dụng với máu và tủy xương ) Một số chất màu sử dụng vớiAlkaline phosphatase là: Đỏ TR, Xanh BB, Đỏ LB, GBC, Nitro BlueTetrazolium (NBT), Iodonitrotetrazolium (INT).

Hoạt động của Phosphatase nội sinh thường có ở xương, gan, thận vàmột số bạch cầu được ngăn chặn bằng việc bổ sung Levamisol vào dung dịchchất nền Levamisol 1nM có tác dụng ức chế chọn lọc một số loạiphosphatase kiềm không phải nguồn gốc ruột hoặc rau thai

b Nhận biết bằng huỳnh quang

Miễn dịch huỳnh quang là KN được phát hiện bằng KT đã gắn sẵn mộtchất màu huỳnh quang Chất huỳnh quang được sử dụng nhiều nhất làFlourescein Flourescein hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 494nm và phát ra ánhsang màu xanh nhạt đặc trưng ở 518nm, tetramethyl rhodamine isothiocyanatehấp thụ ánh sáng ở bước sóng 550nm và phát ra ánh sáng đỏ ở 580nm 48.Rhodamine hấp thụ ánh sáng cực đại ở vùng ánh sáng xanh và phát ra ánhsáng màu đỏ cam Đỏ Texas và Phycoerythrin (PE) là hai màu huỳnh quangkhác ngày càng được sử dụng Đỏ Texas hấp thụ và phát ra ánh sáng đặctrưng tương tự Rhodamine, trong khi PE có phổ hấp thụ cực đại ở vùng ánhsáng màu xanh và phát ra ánh sáng màu đỏ

Đánh dấu bằng huỳnh quang có độ nhạy cao hơn, nhanh hơn, hạn chếnhuộm nền và có thể định lượng so với đánh dấu bằng enzyme nhưng takhông thể quan sát được cấu trúc mô trên tiêu bản nhuộm huỳnh quang cũngnhư không quan sát được trên kính hiển vi quang học

c Nhận biết bằng kim loại gắn keo

Vàng keo là một dạng thủy dung thể của vàng, nghĩa là các hạt nanocủa vàng sẽ nằm lơ lửng trong một loại dung dịch thường là nước Nó có khảnăng gắn với protein rất nhanh và bền vững 4950 Do đó vàng keo là một kimloại lý tưởng để gắn với KT, được dùng như một dấu ấn nhận biết Nếu chỉ

dùng chất keo là vàng thì sẽ cho màu hồng khi quan sát dưới kính hiển viquang học Ngoài ra còn có ferritin nhưng ít được sử dụng.

d Nhận biết bằng đồng vị phóng xạ

Sử dụng đồng vị phóng xạ để đánh dấu yêu cầu phải có thiết bị để tựchụp tia phóng xạ Nó đáp ứng được nhu cầu định lượng trong HMMD KTđược gắn đồng vị phóng xạ không được sử dụng rộng rãi vì nó ảnh hưởng đếnhoạt động của chính KT (Hunt và cộng sự, 1986)

1.2.4 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch

1.2.4.1 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch chung

a Cố định và bộc lộ KN trong mô

* Dung dịch cố định lý tưởng cho hóa mô miễn dịch

Từ lâu, các nhà khoa học cố gắng tìm ra loại dung dịch cố định lý tưởngcho hóa mô miễn dịch, tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa tìm ra được loại dungdịch hoàn hảo nhất đó Như vậy, một dung dịch cố định lý tưởng là dung dịchbảo đảm tính ổn định và toàn vẹn của KN, không làm biến tính KN, khôngphá hủy KN và cũng không làm thay đổi vị trí của KN trong mô Cũng khôngkém phần quan trọng, dung dịch đó phải giữ nguyên vẹn hình thái tế bào, mô.Thông thường, dung dịch cố định trong giải phẫu bệnh gồm 2 loại:

- Dung dịch làm đông, ví dụ ethanol

- Dung dịch tạo liên kết chéo, như formaldehyde

Hai loại dung dịch này đều gây biến đổi trong cấu trúc ba chiều củaprotein, tạo “mặt nạ” che phủ lên bề mặt KN (hay bề măt epitope) làm ảnhhưởng đến quá trình gắn kết với KT Những dung dịch cố định loại tạo liênkết chéo làm ảnh hưởng nhiều đến kết quả hóa mô miễn dịch trên nhiều loại

KN mô khác nhau hơn loại dung dịch cố định loại làm đông, đặc biệt làethanol Do đó, có thể cố định bằng formalin trung tính đệm 10% và sau đó cốđịnh trong ethanol 100%, gọi là cố định đôi trong formalin và ethanol

Một thời gian dài người ta đã sử dụng formalin như là dung dịch cố định

mô tiêu chuẩn do có nhiều ưu điểm sau:

- Giữ được hình thái của nhiều loại mô, ngay cả khi cố định trong thờigian lâu

- Rẻ tiền hơn nhiều loại dung dịch cố định khác

- Sát khuẩn tốt hơn, đặc biệt đối với virus

Các loại dung dịch cố định loại không tạo liên kết chéo thường phá hủycác loại KN có trọng lượng phân tử thấp hơn loại tạo liên kết chéo và ngược lạiđối với loại KN có trọng lượng phân tử cao như siêu sợi trung gian và cácglobulin miễn dịch

Với những kỹ thuật bộc lô KN hiện có, hầu hết các tác giả đều côngnhận formalin đệm trung tính (Neutral Buffered Formalin – NBF) là dungdịch tốt nhất, vừa tốt cho hóa mô miễn dịch, đồng thời vừa bảo tồn tốt hìnhthái tế bào, mô

Công thức formalin đệm trung tính 10%

- Formalin (40% formaldehyde) 100ml

- Sodium dihydrogen phosphate monohydrate 4g

- Disodium dihydrogen phosphate (anhydrous) 6,5g

Chất đệm có tác dụng: (1) chống tính acid làm mô tự tiêu (2) Thấm vào

mô tốt, nhưng tương đối chậm (1mm/giờ), do đó nên cắt mô thành các lát có

bề dày từ 5 – 10mm và đặt các miếng gạc (hoặc giấy) giữa các lát mô để đạt

độ thấm mô tối ưu

Các dung dịch cố định khác cho kết quả nhuộm không ổn định:

- Alcohol/acetone làm giảm chất lượng nhuộm hóa mô miễn dịch vàlai tại chỗ

- Bouin làm mất nhiều loại KN trong mô

* Bộc lộ kháng nguyên mô

Kỹ thuật bộc lộ KN bằng nhiệt (dùng lò vi sóng hoặc nồi áp suất) hiệnđược sử dụng rộng rãi nhất Đặc biệt đối với các mô được cố định trongformalin đệm trung tính 10%, formalin kẽm 10% hoặc dung dịch nướcmuối 10%

Nhiệt độ rất quan trọng trong quá trình bộc lộ KN Quá trình nhuộmhóa mô miễn dịch được tăng cường khi dùng nhiệt độ cao trong quá trìnhbộc lộ KN

Nồng độ pH của dung dịch bộc lộ KN rất quan trọng đối với một số KN.

Hầu hết các KN đều không thay đổi đáng kể khi sử dụng pH của dung dịch bộc

lộ KN từ 1,0 đến 10 Một số KN, đặc biệt là KN nhân (MIB1, ER) bị giảm sốlượng nghiêm trọng khi bộc lộ KN với pH trung bình, và đạt kết quả tối ưu khi

pH thấp Và ngược lại, một sô ít loại KN (HMB45, MT1) âm tính hay dươngtính yếu, khu trú khi bộc lộ KN trong dung dịch có nồng độ pH thấp (1,0 – 2,0),đat kết quả cao ở nồng độ pH cao

Tóm lại, yếu tố chính ảnh hưởng đến kết quả nhuộm hóa mô miễn dịchphụ thuộc nhiệt độ, thời gian mô/tế bào chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và trị số

pH của dung dịch bộc lộ KN

- Quy trình bộc lộ KN bằng lò vi sóng:

+ Mô cắt mỏng được trải trên lam và đựng trong lọ Coplin, khử paraffinbằng xylen, alcohol, và cho vào dung dịch bộc lộ KN

+ Sau đó đặt lọ Coplin (đã đậy nắp) trong lò vi sóng 10 phút Tuy nhiên,

cứ sau mỗi 5 phút, ngừng 1 phút và kiểm tra lại lượng dung dịch bộc lộ KNxem có đủ thể tích hay không Nếu thiếu phải thêm dung dịch Lưu ý, thờigian (10 phút) bắt đầu được tính khi dung dịch đã sôi chứ không phải lúc bắtđầu để vào lò vi sóng

+ Để nguội lọ Coplin trong 15 phút.

+ Sau đó rửa 2 lần với nước cất và dung dịch phosphatebuffered saline(PBS) trong 5 phút

- Quy trình bộc lộ KN bằng nồi áp suất:

+ Nấu nước trong nồi áp suất đến khi sôi

+ Cho lam cần nhuộm vào lọ Coplin có chứa dung dịch đệm (Targetretrival solution pH=6 hoặc pH=9) vào nồi áp suất Tỷ lệ pha dung dịch: 1/10.Tùy loại KT mà dùng dung dịch pH=6 hay pH=9

+ Đun tiếp đến khi nhiệt độ dung dịch đệm trong lọ Coplin lên đến 900C.+ Đậy kín nắp nồi áp suất

+ Đun tiếp đến khi hơi xì ra ở van (khoảng từ 5 – 10 phút)

+ Tắt bếp, đem xuống xả van

+ Lấy lọ Coplin ra để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 20 phút)

+ Lấy lam ra nhanh ngâm vào nước cất (3 lần)

+ Cho vào dung dịch đệm TBS (pH=7,2 đến pH=7,6)

+ Bắt đầu quy trình nhuộm

b Ức chế men peroxidase và biotin nội sinh

Ức chế men peroxidase bằng dung dịch H2O2 và methanol Có thể ức chếbiotin nội sinh trước khi gắn biotin bằng dung dịch ức chế avidin-biotin hoặcbằng sữa không kem trong 10 phút

Nhiều tác giả khuyên nên sử dụng huyết thanh cùng loài như một KT thứhai để khóa các vị trí KN không đặc hiệu

c Giai đoạn rửa

Đây là một bước quan trọng Thông thường mô được rửa bằng dung dịchPBS 0,01M, pH=7,4 hai lần, mỗi lần 5 phút (tổng cộng 10 phút), cần để dungdịch PBS ngập lam.

d Ủ với KT1

Thời gian ủ KT phụ thuộc vào độ nhạy và nồng độ của KT1 cũng nhưchất lượng mô Nồng độ KT1 được xác định dựa trên đo lường và đượchướng dẫn bởi nhà sản xuất Đối với mẫu mô cắt lạnh thời gian ủ KT ít hơn

mô vùi trong paraffin Bình thường thời gian ử trung bình 30 phút ở nhiệt độphòng Có thể rút ngắn nhiệt độ ủ xuống 10 phút hay ít hơn bằng cách tăngnhiệt độ lên 370C trong điều kiện độ ẩm cũng cao một chút

Đối với máy nhuộm tự động, cài đăt nhiệt độ cho bước ủ KT là 370Choặc 420C Trong quá trình ủ cần chú ý không để lam bị khô do bay hơi nước,hoặc do nhiệt độ cao, làm tăng nồng độ KT1, có thể dẫn đến nhuộm nền cao

Vì vậy không được để khô lam

Phương pháp ủ KT1 qua đêm đã được chứng minh rất hiệu quả trongmột số tình huống cụ thể (ví dụ nhuộm hóa mô miễn dịch cho mục đíchnghiên cứu không cần phải trả kết quả sớm) Trong phương pháp này cũngcần lưu ý tránh để lam bị khô do bay hơi (phải thực hiện trong môi trườngẩm)

Ủ KT1 qua đêm có ưu điểm:

KT được pha loãng ở mức cao nhất (nồng độ KT có thể pha loãng từ 10– 100 lần so với nồng độ KT khi ủ ở 30 phút) Do đó tiết kiệm chi phí, đặcbiệt đối với KT mắc tiền

Với thời gian ủ lâu sẽ làm tăng hiệu quả của phản ứng KN – KT, giảmnhuộm nền do dư thừa KT

Ngoài thời gian dài ủ KT qua đêm Các bước khác được thực hiện bìnhthường

e Phủ kháng thể 2

Tiến hành tương tự như KT1 Thời gian ủ tiêu bản cũng khoảng 30phút, có thể điều chỉnh phù hợp với nhiệt độ ủ, cứ 10 phút lắc tiêu bản mộtlần KT2 dùng chung cho mọi dấu ấn

và cobalt chloride

Lưu ý: DAB là chất gây ung thư mạnh hơn so với AEC Do đó, nếu sử

dụng DAB phải đeo khẩu trang và mang găng

g Nhuộm nhân

Thường nhuộm nhân bằng hematoxylin (màu tím), methylene blue (màuxanh), hoặc nuclear fast red (màu đỏ), thời gian nhuộm phụ thuộc vào nồng

độ của hematoxlin

h Hoàn tất quy trình nhuộm

Nếu dùng DAB thì khử nước tiếp tục bằng cồn và làm trong sang môbằng xylen, dung màu AEC phải bỏ qua bước này vì cồn và xylen sẽ hủy màucủa AEC

Dán lamen bằng Gelton (nếu dung AEC) hoặc Resin (nếu dùng DAB)

1.2.4.2 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch bằng máy

a Ưu điểm

- Máy tự thực hiện các bước nhuộm, kỹ thuật viên không cần phải theosát như nhuộm tay.

- Kết quả ổn định, dễ tính toán hóa chất và KT

b Khuyết điểm

- Phải trang bị máy nhuộm đắt tiền

c Quy trình nhuộm bằng máy nhuộm hóa mô miễn dịch tự động

- Chuẩn bị tiêu bản: cắt mỏng mẫu mô 3 – 5µm và đặt vào lam mangđiện tích dương

- Quá trình nhuộm hóa mô miễn dịch tự động được thực hiện qua cácbước sau:

1 Khởi động máy vi tính, máy nhuộm hóa mô miễn dịch tự động,máy in mã vạch

2 Chạy chương trình điều khiển chung đã được cài đặt sẵn cho máy

3 Cài chương trình xử lý và quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch cho máy

4 Chọn KT1 để nhuộm

5 Khử paraffin bằng dung dịch Ezprep (dung dịch chuyên dụng)

6 Bộc lộ KN bằng dung dịch CC1 ở 950C trong thời gian 4-30 phút

7 Phủ KT1 trên mô với từng loại và tỷ lệ KT thích hợp

8 Phủ KT2 HRP

9 Khử men nội sinh bằng H2O2

10 Máy tự động nhuộm bằng DAB kit

11 Nhuộm nhân bằng Hematoxylin, làm xanh nhân bằng dung dịchBluing reagent

12 Sau khi máy kết thúc quy trình nhuộm, lấy tiêu bản ra loại nước, làmtrong và dán lamen

* Giữa các bước đều có quá trình rửa bằng dung dịch đệm với thời gian 5 phút.

d Kết quả nhuộm

Âm tính: chỉ có màu xanh tím của Hematoxylin nhuộm nhân

Dương tính: nếu có hiện diện KN trên tế bào, phức hợp KN – KT –streptavidine – màu sẽ cho màu đỏ (nếu dùng màu AEC) hoặc vàng nâu (nếudùng màu DAB)

e Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến Hóa mô miễn dịch

- Lấy bệnh phẩm không đạt yêu cầu: không trúng vùng u hoặc không đầy đủcác vị trí để đánh giá toàn bộ đặc điểm của khối u

- Bước cố định:

 Thời gian cố định không phù hợp (không đủ hoặc quá dài)

 BP không được cố định ngay sau khi lấy

 Chất cố định không thích hợp

 Bệnh phẩm pha quá dày, làm giập nát bệnh phẩm

- Bộc lộ kháng nguyên chưa đúng kỹ thuật:

Dung dịch bộc lộ không đảm bảo: không đúng tỷ lệ, hết hạn sử dụng

Thời gian bộc lộ quá ngắn gây dương tính yếu hoặc âm tính giả, thờigian bộc lộ quá dài gây tiêu bản bị nền

Nhiệt độ bộc lộ quá cao hoặc quá thấp

- Nhuộm nhân quá nhạt không có sự tương phản màu, nếu quá đậm làmche lấp mất một số kháng nguyên nhân dương tính yếu

1.3 Đại cương về kỹ thuật sắp xếp dãy mô

1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật sắp xếp dãy mô

Kỹ thuật sắp xếp dãy mô (TMA- Tisue Microarray) là một kỹ thuật mớiđược tạo ra để đánh giá sự biểu hiện của các protein hoặc các gen trên tập hợpcác mẫu mô lớn được sắp xếp trên cùng tiêu bản vi thể nhằm đem lại hiệu quả

và kinh tế 55

Trong vài năm qua, TMA đã được thiết lập như là một phương pháp tiêuchuẩn để đánh giá sự biểu hiện của protein hoặc gen trên các bộ mẫu mô lớn

Nó đang được áp dụng ngày càng nhiều trong số các tổ chức nghiên cứu hàngđầu trên thế giới và được sử dụng trong nghiên cứu ung thư.

1.3.2 Lịch sử phát triển của kỹ thuật sắp xếp dãy mô

Năm 1998, Kononen và các đồng nghiệp trong phòng thí nghiệm củaOllie Kallioniemi đã phát minh ra một phương pháp để xét nghiệm nhiều mẫu

mô bệnh học cùng một lúc bằng cách sắp xếp chúng trong một khối paraffin.Những mẫu mô được lấy bằng cách lấy lõi kim sinh thiết của các mẫu môđược vùi paraffin và sắp xếp lại chúng trong một khối paraffin mới Bằngcách này, mô từ hàng trăm mẫu có thể được sắp xếp trên một vài khối paraffin

và được phân tích bằng nhiều kỹ thuật, bao gồm cả HMMD và lai huỳnhquang tại chỗ (FISH) 55

Với nhu cầu áp dụng trong nhiều kỹ thuật ngày càng hiện đại nghiên cứu

về DNA, RNA và protein, trong khi các mảnh mô vùi paraffin phải được cốđịnh trong dung dịch cố định làm ảnh hưởng đến chất lượng của RNA Vì vậy

để đảm bảo mang lại kết quả tối ưu cho quá trình lai RNA, kỹ thuật TMA đãđược phát triển áp dụng cho các mảnh mẫu động lạnh dù cho có rất nhiều khókhăn, thách thức như việc lấy mẫu trên mảnh mô đông lạnh rất cứng và giòn,các mảnh mô rất dễ biến dạng về hình thái, khó thao tác trên các mảnh môđông lạnh này

Trái ngược với các kỹ thuật truyền thống, đòi hỏi việc xử lý và nhuộmhàng trăm tiêu bản, kỹ thuật sắp xếp dãy mô vi thể (Tissue MicroArray -TMA) cho phép nghiên cứu toàn bộ các trường hợp bằng cách phân tích chỉmột (hoặc một vài) mẫu, tiết kiệm được thời gian và kháng thể TMA có lợithế nhất là tất cả các mẫu thử được xử lý tại một thời điểm sử dụng các điềukiện giống hệt nhau như nồng độ thuốc thử nhất quán giữa các mẫu, thời gian

ủ, nhiệt độ và điều kiện ủ, vì vậy, kết quả nhuộm của các mẫu này có thể sosánh được Với ưu điểm có thể khảo sát nhiều mẫu cùng 1 thời điểm, tiết kiệm

thời gian và chi phí, TMA có một tiềm năng lớn trong xác định, phát hiện cácgen và protein, là công cụ sàng lọc đối với một số bệnh hoặc để định type cụthể trong bệnh Nishizuka và cộng sự đã sàng lọc các dòng tế bào sử dụngTMA để xác định gen Villin và Moesin có thể sử dụng để phân biệt đại tràngvới Adenocarcinoma ở buồng trứng Việc xác định các dấu ấn sinh học bằng

kỹ thuật TMA còn có ý nghĩ trong tiên lượng bệnh, như tác giả Khanna vàcộng sự đã chứng minh được sự biểu hiện Ezrin cao có liên quan đến di cănsớm và tiên lượng kém Cũng như vậy, Fong và cộng sự đã sử dụng TMAtrong nghiên cứu sự biểu hiện của TROP2 trong ung thư biểu mô tế bào vảycủa khoang miệng cho thấy sự biểu hiện quá mức của TROP2 có ý nghĩa đáng

kể với thời gian sống thêm của bệnh nhân

Hơn nữa, khi sử dụng TMA làm giảm đáng kể số lượng mô lưu trữ cầnthiết cho một nghiên cứu cụ thể, do đó bảo tồn mô dư thừa còn lại cho cácnhu cầu nghiên cứu hoặc chẩn đoán khác

Kỹ thuật TMA tiếp tục phát triển và cải tiến để đơn giản hóa quy trìnhthao tác kỹ thuật trong khi có nhiều mẫu vật hơn Mặc dù kỹ thuật TMA banđầu tập trung vào các mẫu mô được vùi parafin, Abbott và cộng sự đã thiếtlập kỹ thuật TMA dòng tế bào bao gồm các khối tế bào, được lấy từ khối u ởngười

Để đáp ứng với các câu hỏi đặt ra bởi nhiều nhà nghiên cứu về việc sửdụng lõi đường kính 0,6 mm có đủ đại diện cho hình thái không đồng nhấtcủa bất kỳ mẫu mô nào không, kỹ thuật TMA đã trải qua sự giám sát khắt khe

và được kiểm tra và xác nhận liên tục để sử dụng trong nghiên cứu ung thưgiai đoạn từ năm 1998 đến 2003 Theo Mucci và cộng sự, bằng cách tăng sốlượng mẫu được lấy từ các vùng khác nhau của mỗi khối mô hoặc tăng kíchthước lõi mô lên 1-2mm sẽ cung cấp đủ thông tin hình thái để đánh giá cácmẫu xét nghiệm đáng tin cậy

Mặc dù hiện nay TMA không được sử dụng là 1 kỹ thuật thường quyphục vụ cho chẩn đoán nhưng nó có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu về pháttriển ung thư, tiên lượng và điều trị.

1.3.3 Kỹ thuật sắp xếp dãy mô

1.3.3.1 Trang thiết bị sử dụng cho kỹ thuật sắp xếp dãy mô

- Dụng cụ lấy mẫu mô:

Sắp xếp dãy mô là các khối paraffin được tạo ra bằng cách chiết các lõi

mô hình trụ từ các khối bệnh phẩm đã vùi paraffin khác nhau và sắp xếpchúng vào một khối paraffin mới và các vị trí của từng mẫu đã được xác địnhtheo sơ đồ

Khi ta sử dụng kỹ thuật này có thể lưu trữ lên đến 1000 mẫu mô đượcsắp xếp thành một khối parafin đơn lẻ Kích thước lõi thay đổi từ 0,6mm đến4mm Để tiến hành thực hiện kỹ thuật sắp xếp dãy mô chính xác nhất thiếtcần các trang thiết bị để lấy mẫu mô, tập trung trên một khối nến Thiết bịthường được sử dụng là máy lấy mẫu mô (Tissue arrayer) Thiết bị này chophép lấy lõi mẫu mô với nhiều kích thước khác nhau: 0,6mm, 1mm, 1,5mm,2mm, 3mm, 4mm Tùy thuộc vào kích thước lõi mẫu mô cần lấy mà ta sửdụng đầu lấy mẫu mô cho phù hợp

Riêng với những lõi mẫu mô có kích thước lớn (3-5mm) ta có thể sử dụng dụng cụ thủ công Khi lấy được mấu bệnh phẩm, ta đẩy mẫu lấy được ra ngoài bằng cách dùng lực lò xo đẩy thanh kim loại bên trong để mẫu được đưa ra ngoài.

Hình 1.2: Máy lẫy mẫu lõi mô (Trái) và dụng cụ lấy mẫu thủ công (phải).

- Khuôn đúc dành cho kỹ thuật sắp xếp dãy mô:

Khuôn đúc sử dụng trong kỹ thuật này có đặc điểm là có những vị trí để đưa mẫu

mô đã lấy vào vị trí đã định sẵn Tùy thuộc vào kích thước lõi mẫu mô mà có các loại khuôn tương ứng do nhà sản xuất cung cấp.

Hình 1.3: Khuôn đúc dành cho kỹ thuật sắp xếp dãy mô

Mỗi loại khuôn đúc sử dụng cho từng loại kích thước và số lượng lõibệnh phẩm mà ta cần nghiên cứu

Bảng 1.1: Kích thước và số lượng lõi mô trong mỗi khuôn đúc sắp xếp dãy mô

1.3.3.2 Các bước tiến hành kỹ thuật sắp xếp dãy mô

- Chọn mẫu và tiêu bản nhuộm Hematoxylin-Eosin, khoanh vùng vị tríung thư trên tiêu bản nhuộm H.E, so sánh với khối nến để đánh dấu vùng utrên khối nến

- Chuẩn bị máy lấy mẫu: Chọn kích thước và loại đầu lấy mẫu bệnhphẩm (0,6-1-1,5-2-3-4-5mm) Điều chỉnh độ sâu của lõi lấy mẫu Nới lỏngcác ốc vít và vặn đầu lấy mẫu mô vào máy Điều chỉnh đầu lấy mô di chuyểntheo trục dọc và trục ngang bằng nút XY

- Chuẩn bị khối nến:

Cách 1: Chọn khuôn dành cho kỹ thuật sắp xếp dãy mô có kíchthước các lỗ tương đương như đã chọn lõi lấy mô ở trên Tiến hành cácbước như sau:

1 Đặt cassette

vào khuôn

2 Đổ paraffin vàokhuôn

3 Để lạnh và tháokhuôn ra khỏi khối

nến

4 Hoàn thành khối

nến

Hình 1.4 Các bước chuẩn bị khối nến mẫu cho kỹ thuật sắp xếp dãy mô

Cách 2: Đúc 1 khối nến không có bệnh phẩm, sau đó sử dụng đầu lấymẫu mô đục các lỗ có kích thước tương đương với kích thước của mẫu mô.Khoảng cách giữa các lỗ tối thiểu là 2mm

- Tiến hành lấy mẫu mô: Sử dụng đầu lấy mẫu mô đã được chuẩn bị sẵnđặt vào vị trí cần lấy mẫu đã đánh dấu từ trước trên khối nến Giữ cố địnhkhối nến mẫu, dùng thanh ấn đầu lấy mẫu mô xuống vùng mô cần lấy, xoaytay cầm phía trên đầu lấy mẫu để lấy lõi mô rời khỏi khối nến mẫu

- Các mẫu mô này được đặt vào các lỗ trên khối nến trắng theo vị trí đãđược mã hóa và ghi trên sơ đồ Các vị trí đặt mẫu mô sẽ được mã hóa bằngcác mã số riêng biệt để tránh sự nhầm lẫn Điều quan trọng là làm thế nào để

có thể nhân biết được vị trí số 1 Có nhiều cách để mã hóa vị trí số 1 như:mảnh mô ở vị trí số 1 có kích thước lớn hơn, bỏ trống vị trí số 1, chọn mẫu số

1 có hình dạng khác (hình vuông, hình chữ nhật) hoặc chọn mẫu mô khác đặtvào vị trí số 1

- Đặt khối nến đã sắp xếp đủ các mẫu mô vào khuôn đúc, để vào tủ ấm ở

60 ° C trong 40 phút để paraffin lấp đầy các chỗ còn trống Để vào khay đá đểkhối paraffin cứng chắc lại

1.3.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật sắp xếp dãy mô

- Kích thước mảnh mẫu lấy không đủ đại diện cho toàn bộ khối u

- Làm tay nên gây ảnh hưởng không tốt đến khối mô ban đầu

- Mảnh mô không cùng nhiệt độ với paraffin xung quanh dễ gây bong,bật khỏi block khi cắt mảnh.

- Các mảnh mô được đúc không cùng trên 1 mặt phẳng nên khi cắt khótrình diện toàn bộ các mảnh cắt trên cùng 1 lát cắt

- Các mảnh mô bị nghiêng, xô lệch không còn nằm đúng vị trí sắp xếpban đầu gây khó khăn trong khâu đọc kết quả, dễ gây nhầm lẫn giữa các mẫu

1.4 Một số nghiên cứu xác định dấu ấn ung thư vú thông qua kỹ thuật sắp xếp dãy mô

Nghiên cứu của Abdulmohsen Alkushi được thực hiện vào năm 2009trên số 80 trường hợp ung thư vú thuộc các loại khác nhau đã được sử dụng

để xây dựng mô hình đánh giá dấu ấn sinh học ung thư vú Tác giả đã đánhgiá dấu ấn trên 4 kháng thể: ER, PR, HER2 và p53 Kết quả đã chỉ ra, cáckhối u đích được lấy mẫu chính xác bởi hai lõi trong 19 trên 26 khối củangười hiến và chỉ có một lõi trong 5 khối Thất bại trong mẫu khối u đã đượcnhìn thấy trong 2 khối Khả năng kết hợp giữa kết quả nhuộm của TMA vàtoàn bộ các phần là tốt cho PR (= 0,67) và ER (= 0,67) và rất tốtcho p53 (= 0,91) và HER2 (= 0,91), khi tất cả 26 khối người nhận đã đượcbao gồm Tỷ lệ được cải thiện thành xuất sắc cho p53 (= 1.0) và không thayđổi đối với các điểm đánh dấu khác khi phân tích sự phù hợp được giới hạn ởcác khối người nhận đã được lấy mẫu bởi hai lõi Nghiên cứu này đã kết luận,sắp xếp dãy mô là một kỹ thuật đáng tin cậy để kiểm tra một tập hợp lớn cáckhối u Nó cho thấy điểm số miễn dịch tương đương với điểm thu được từđánh giá toàn bộ phần thông thường trong ung thư vú Tuy nhiên, một số thayđổi không được phát hiện do sự không đồng nhất của biểu hiện dấu ấn sinhhọc vốn có trong các khối u này, nhưng sự thiếu hụt này có thể được cải thiện

Một nghiên cứu khác của Omilian và các cộng sự đã quan tâm đếnkhảo sát, đánh giá về “Điều kiện lưu trữ và khả năng miễn dịch của các dấu

ấn phân loại ung thư vú trong kỹ thuật sắp xếp dãy mô” vào năm 2019 đã chỉ