NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REALTIME PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN ROTAVIRUS và NOROVIRUS gây TIÊU CHẢY cấp ở TRẺ EM

Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em...32 3.1.1.. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

VŨ THỊ HẢO

Nghiªn cøu øng dông kü thuËt Realtime PCR

®a måi trong ph¸t hiÖn Rotavirus vµ

Norovirus

g©y tiªu ch¶y cÊp ë trÎ em

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

VŨ THỊ HẢO

Nghiªn cøu øng dông kü thuËt Realtime PCR

®a måi trong ph¸t hiÖn Rotavirus vµ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

BPS Phosphate-buffered saline

Ct Chu kì ngưỡng phát hiện

dsRNA Double-stranded Ribonucleic acid

(+) ssRNA Positive-sense single-stranded Ribonucleic acidDNA Deoxyribonucleic acid

cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

ORF Open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain ReactionTCC Tiêu chảy cấp

VP Viral protein (protein cấu trúc)

NSP Non-Structure protein (protein phi cấu trúc)

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus 3

1.1.1 Tình hình trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam 5

1.2 Đặc điểm tính chất hệ gen của Rotavirus, Norovirus 6

1.2.1 Đặc điểm của Rotavirus 6

1.2.2 Đặc điểm của Norovirus 9

1.3 Các kỹ thuật phát hiện Rotavirus, Norovirus 10

1.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy 10

1.3.2 Phát hiện Rotavirus, Norovirus bằng kính hiển vi điện tử 11

1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch dùng để phát hiện Rotavirus, Norovirus 13

1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử 16

1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Thời gian nghiên cứu 22

2.3 Đối tượng nghiên cứu 22

2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 23

2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị 23

2.4.2 Hóa chất 23

2.5 Phương pháp nghiên cứu 26

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu: 26

2.5.2 Phương pháp realtime PCR đa mồi phát hiện Norovirus và Rotavirus.27 2.5.3 Phản ứng Realtime RT- PCR xác định Norovirus và Rotavirus 29

2.5.4 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR đa mồi với kit thương mại có chứng chỉ IVD 31

2.7 Đạo đức trong nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em 32

3.1.1 Kết quả xử lí bệnh phẩm và tách chiết RNA 32

3.1.2 Kết quả phản ứng Realtime PCR 33

3.1.3 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR đa mồi với kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng chỉ IVD 36

3.2 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em 38

3.2.1 Tỉ lệ phát hiện TCC do Rotavirus, Norovirus 38

3.2.2 Phân bố tỉ lệ TCC do Rotavirus, Norovirus theo giới 39

3.2.3 Phân bố tỉ lệ phát hiện TCC do Rotavirus, Norovirus theo nhóm tuổi 40 3.2.4 So sánh các chỉ số xét nghiệm trong máu, trong phân 43

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46

4.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em 46

4.1.1 Kết quả xử lí bệnh phẩm và tách chiết RNA 46

4.1.2 Phản ứng RealTime PCR đa mồi 48

4.2 Một số đặc điểm dịch tễ của Rotavirus, Norovirus 51

4.2.1 Tỉ lệ mắc tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus 51

4.2.2 Yếu tố giới của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus 53

4.2.3 Yếu tố tuổi của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus 54

4.2.4 Biến đổi các xét nghiệm 56

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Hình 1.1 Tỉ lệ tử vong của tiêu chảy cấp do Rotavirus 4

Hình 1.2 Hình ảnh minh họa cấu trúc của Rotavirus 6

Hình 1.3 Hình ảnh minh họa cấu trúc của Norovirus 9

Hình 1.4 Hình ảnh Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử 12

Hình 1.5 Hình ảnh Norovirus dưới kính hiển vi điện tử .12

Hình 1.6 Nguyên lí của phương pháp ELISA 14

Hình 1.7 Nguyên lí của kĩ thuật sắc kí miễn dịch 15

Hình 1.8 Biểu đồ quan hệ giữa chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang trong phản ứng realtime PCR .18

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của Taq Man Probe trong Realtime PCR 19 Hình 2.1 Nguyên lí hoạt động của hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0 .28

Bảng 1.1 Các đoạn gen của Rotavirus 7

Bảng 1.2 Cấu trúc và protein của Rotavirus 8

Bảng 2.1 Trình tự Primer, Probe của gen Rotavirus, Norovirus 25

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng 30

Bảng 3.1 Nồng độ RNA sau khi tiền xử lý mẫu và tách chiết nucleic acid 32

Bảng 3.2 Phân bố giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng phát hiện) của kỹ thuật realtime PCR đơn mồi và kỹ thuật cải tiến phát hiện cả Norovirus và Rotavirus 33

Bảng 3.3 Kêt quả giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng phát hiện) so sánh giữa kỹ thuật realtime RT-PCR đa mồi và kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng chỉ IVD 36

Bảng 3.4 Bảng phân bố các căn nguyên Norovirus và Rotavirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em 38

Bảng 3.5 Bảng phân bố tỉ lệ giới ở nhóm TCC do Rotavirus, TCC do Norovirus, nhóm đồng nhiễm và nhóm âm tính 39

Bảng 3.6 Tỉ lệ các nhóm tuổi trong nhóm bệnh nhân TCC do Rotavirus, TCC do Norovirus, đồng nhiễm và âm tính 40

Bảng 3.7 So sánh các chỉ số xét nghiệm máu của nhóm TCC do Rotavirus và nhóm âm tính Error! Bookmark not defined. Bảng 3.8 So sánh các chỉ số xét nghiệm của nhóm TCC do Norovirus và nhóm âm tính Error! Bookmark not defined. Bảng 3.9 Kết quả soi phân của nhóm TCC do Rotavirus, nhóm TCC do Norovirus và nhóm âm tính 45

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ các căn nguyên Rotavirus, Norovirus gây TCC ở trẻ em 39

Biểu đồ3.2 Tỉ lệ bệnh nhân mắc TCC do Rotavirus theo giới tính Error!

Bookmark not defined.

Biểu đồ 3.3 Phân bố tỉ lệ bệnh nhân TCC do Norovirus theo giới tínhError!

Bookmark not defined.

Biểu đồ 3.4 Phân bố tỉ lệ TCC do Rotavirus theo nhóm tuổi 41 Biều đồ 3.5 Phân bố tỉ lệ tiêu chảy cấp do Norovirus theo nhóm tuổi 42

Biểu đồ 3.6.So sánh sự thay đổi nồng độ Natri máu của nhómTCC do

Rotavirus, nhóm TCC do Norovirus và nhóm âm tính 43 Biểu đồ 3.7 So sánh sự thay đổi nồng độ Kali máu của nhóm TCC Rotavirus,

nhóm TCC do Norovirus và nhóm âm tính 44

Với tấm lòng của người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn

sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phủng và TS Phùng Thị Bích Thủy đã hướng

dẫn tận tình, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trìnhhọc tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài này Sự hướng dẫn tận tình vànhững kiến thức quý báu của các thầy đóng vai trò vô cùng quan trọng trongquá trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô trong hội đồng thôngqua đề cương và hội đồng chấm khóa luận đã dành thời gian đọc và đóng góp

ý kiến quý báu để em hoàn chỉnh luận văn này

Em xin cám ơn toàn thể các anh chị nhân viên, kỹ thuật viên tại khoanghiên cứu sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm Bệnh viện Nhi Trung ương đãgiúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện về mọi mặt trong quá trình thu thập, xử lí bệnhphẩm, cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, các chị kỹ thuật viên, các bác sỹ nội trú

vi sinh khóa 39, 40, 41 đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, và động viên em trongquá trình học tập và hoàn thiện luận văn

Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, các phòngban chức năng của Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện thuậnlợi cho em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người than trong giađình và bạn bè đã luôn ủng hộ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2018

Vũ Thị Hảo

Tôi là Vũ Thị Hảo, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyênngành Vi sinh Tôi xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa PGS.TS Lê Văn Phủng và TS Phùng Thị Bích Thủy

2 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được sự chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.Tôi xin cam đoan những điều trình bày ở trên là hoàn toàn trung thực vàchính xác

Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2018

Vũ Thị Hảo

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tiêu chảy là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 ở trẻ em dưới 5tuổi trên toàn thế giới sau bệnh lí đường hô hấp Trên thế giới, mỗi năm ướctính có khoảng 2,5 tỉ trường hợp trẻ tiêu chảy; 1,5 triệu trường hợp tử vong vìtiêu chảy cấp (TCC), con số này nhiều hơn số trẻ tử vong do AIDS, sốt rét vàsởi Bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em do nhiều căn nguyên như virus, vi khuẩn, kí

sinh trùng, trong đó, Rotavirus, Norovirus là căn nguyên gây tử vong hàng

đầu ở trẻ dưới 5 tuổi trên toàn thế giới Người ta ước tính mỗi năm có khoảng

47% các trường hợp TCC nhập viện được chẩn đoán là do Rotavirus và 12% các trường hợp là do Norovirus Tại Việt Nam, tỉ lệ TCC do Rotavirus dao động từ 31%-60% ,,, và tỉ lệ TCC do Norovirus dao động từ 6,6%-33% ở

nhóm trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do TCC ,, Hiện nay, các phương pháp chủ

yếu để chẩn đoán Rotavirus, Norovirus trong phòng xét nghiệm là phương

pháp nuôi cấy, phương pháp miễn dịch và phương pháp sinh học phân tử.Phương pháp nuôi cấy được xem là tiêu chuẩn vàng nhưng khó thực hiệntrong bệnh viện vì đòi hỏi kĩ thuật cao và trang thiết bị đầy đủ, thời gian nuôicấy kéo dài nhiều ngày Phương pháp miễn dịch hiện đang được sử dụng phổbiến tại bệnh viện do đơn giản, dễ thực hiện, nhưng độ nhạy của kỹ thuật cònchưa cao Gần đây, phương pháp sinh học phân tử ra đời và phát triển mạnh

đã khắc phục được phần nào nhược điểm của hai kỹ thuật trên Trong đó, PCR

là kỹ thuật phát hiện tác nhân thông qua khuếch đại đặc hiệu đoạn gen của tácnhân đó Cho đến nay, Realtime PCR gần như thay thế kỹ thuật PCR thường

do độ đặc hiệu của phản ứng cao hơn và thao tác đọc kết quả thuận tiện hơn.Đặc biệt, kỹ thuật Realtime PCR đa mồi đang là một hướng đi nhằm phát hiệnnhiều tác nhân đồng thời trong một phản ứng giúp tiết kiệm được sinh phẩm,hóa chất, hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng phát hiện sớm căn nguyên gây bệnh Vìvậy, để ứng dụng sớm trong sàng lọc tại bệnh viện, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện

Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em” với hai mục tiêu:

1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus

và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em.

2 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus

1.1.1 Tình hình trên thế giới

Tiêu chảy cấp là nguyên nhân thứ hai gây tử vong của trẻ em trên toàn

thế giới Trong các tác nhân gây tiêu chảy cấp ở trẻ em, Rotavirus, Norovirus

là hai tác nhân quan trọng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu Mỗi năm, Rotavirus

gây ra trung bình 440.000 trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi, chủ yếu tập

trung ở các nước đang phát triển Rotavirus có phạm vi lưu hành trên khắp các châu lục Ở Châu Á, Rotavirus gây ra 37,5% các trường hợp tiêu chảy

cấp, trong đó Bangladesh, Hàn Quốc, Taiwan, Thái Lan, Việt Nam là các quốcgia có tỉ lệ cao nhất Trong khi ở các quốc gia Châu Âu, tỉ lệ này dao động từ

25,3% đến 63,5% Người ta nhận thấy tỉ lệ TCC do Rotavirus ở các nước

phát triển cao hơn các nước đang phát triển, điều này cho thấy điều kiện vềkinh tế cũng như vệ sinh môi trường không làm giảm đáng kể tỉ lệ mắc

Rotavirus

Nghiên cứu gần đây của WHO tại Azerbaijan trên 3159 trẻ TCC dưới 5

tuổi từ năm 2011 đến năm 2016 cho thấy tỉ lệ TCC do Rotavirus dao động từ

13%-21%, trong đó 58% số trẻ mắc bệnh có độ tuổi trẻ từ 6 đến 23 tháng Một nghiên cứu khác của WHO trên 7562 trẻ TCC dưới 5 tuổi ở Bangladesh,

từ năm 2012 đến năm 2017 chỉ ra tỉ lệ TCC do Rotavirus là 64%, trong đó

57% trẻ mắc bệnh dưới 12 tháng tuổi Cùng với sự ra đời của vắc xin

Rotavirus và những nỗ lực không ngừng của WHO trong giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do TCC ở trẻ em thì cho đến nay Rotavirus vẫn là tác nhân phổ

biến gây TCC ở trẻ em trên toàn thế giới

Hình 1.1 Tỉ lệ tử vong của bệnh nhân tiêu chảy cấp do Rotavirus

(http://www.who.int/immunization/monitoring_surveillance/burden/estimates/

Rotavirus/en/) Cùng với Rotavirus, Norovirus đang được xem là một trong những

nguyên nhân phổ biến hàng đầu gây tiêu chảy cấp ở trẻ em dưới 5 tuổi trêntoàn thế giới Theo thống kê công bố năm 2008, người ta ước tính mỗi năm

Norovirus gây ra 64.000 trường hợp tiêu chảy nhập viện, 900.000 lượt khám

bệnh ở trẻ dưới 5 tuổi tại các nước công nghiệp hóa, chiếm 12% trong số cáccăn nguyên gây tiêu chảy nhập viện ở trẻ em tại các quốc gia này Căn nguyênnày cũng gây ra khoảng 218.000 trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi tại cácnước đang phát triển Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng trên 235.000 lượt khám

bệnh, 23.000 trường hợp nhập viện vì TCC do Norovirus Một thống kê gần đây trên 48 quốc gia công bố năm 2014 cho thấy Norovirus chiếm 18% trong

các căn nguyên gây TCC trẻ em Trong đó ở các nước đang phát triển tỉ lệ

TCC do Norovirus là 14%-19%, ở các nước phát triển tỉ lệ này là 20%

Tương tự như Rotavirus, tỉ lệ TCC do Norovirus ở các nước phát triển cao

hơn ở các nước đang phát triển Điều này cho thấy điều kiện kinh tế cũng như

môi trường không làm giảm thiểu đáng kể tỉ lệ mắc Norovirus Khác với Rotavirus, thế giới hiện chưa có vắc xin phòng Norovirus, trong khi Norovirus đang là căn nguyên quan trọng gây TCC ở trẻ em trên toàn thế giới

và có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam

Trong mô hình bệnh tật chung của toàn thế giới, Việt Nam, một nước

đang phát triển cũng chịu gánh nặng bệnh tật của TCC do Rotavirus, Norovirus gây ra Theo Nguyễn Văn Mẫn và cộng sự (năm 2005) tiến hành trên 6 bệnh viện ở cả miền Bắc và miền Nam, tỉ lệ TCC do Rotavirus dao

động từ 50% đến 70% Tại miền nam, nghiên cứu của Đoàn Thị Lan Phương

và cộng sự (năm 2003) cho thấy tỉ lệ trẻ TCC do Rotavirus là 65,6% Tại

miền bắc, nghiên cứu của Đỗ Phương Thảo (năm 2016) tại bệnh viện Nhi

Trung ương công bố tỉ lệ TCC do Rotavirus là 41,2% Như vậy, ở nước ta, TCC do Rotavirus có xu hướng giảm nhưng vẫn chiếm tỉ lệ cao trong các căn

nguyên gây TCC ở trẻ em

Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước cho thấy tỉ lệ TCC do

Norovirus khá dao động Theo nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự

(năm 2007) trên 1010 trẻ TCC nhập viện ở thành phố Hồ Chí Minh cho thấy

tỉ lệ TCC do Norovirus là 5,5% Nghiên cứu của Nguyễn Vân Trang (năm

2013) trên 501 trẻ tiêu chảy cấp tại bệnh viện Nhi Trung ương cho thấy tỉ lệ

TCC do Norovirus là 36%, trong đó 100% là nhóm GII Tỉ lệ trẻ TCC do Norovirus trong nước có sự dao động lớn như vậy do nhiều nguyên nhân như

địa lí, độ tuổi của trẻ tham gia nghiên cứu, kỹ thuật phát hiện virus

1.2 Đặc điểm tính chất hệ gen của Rotavirus, Norovirus

1.2.1 Đặc điểm của Rotavirus

Hình 1.2 Hình ảnh minh họa cấu trúc của Rotavirus

(Nguồn: Jayaram và cộng sự, 2004).

Rotavirus thuộc họ Reoviridae có hình khối cầu 20 mặt, đường kính trung bình 65-75nm Rotavirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 từ mảnh sinh thiết ruột non của bệnh nhân dưới kính hiển vi điện tử Rotavirus

có cấu trúc gồm capsid và acid nucleic Vật chất di truyền của Rotavirus là

ARN sợi kép (dsRNA) gồm 11 đoạn dsRNA, chứa khoảng 18.500 cặp base(bảng 1.1) Mỗi đoạn có chiều dài nằm trong khoảng từ 667 đến 3302 bp và

mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc protein phi cấu trúc, trừ đoạn gen 11 mã

hóa 2 protein , ARN của Rotavirus được bao bọc bởi 3 lớp protein đồng tâm

lần lượt là lớp ngoài, lớp trong và lớp lõi Lớp ngoài được cấu tạo gồm 780phân tử protein VP7 và 60 gai nhú dimer VP4 Lớp trong bao gồm 780 phân

tử protein VP6 phân bố đều trên 20 mặt của capsid Protein VP6 đóng vai tròkết nối giữa lớp ngoài và lớp lõi Lớp lõi chứa 120 phân tử protein VP2 sắpxếp đều trên 20 mặt của capsid và 12 phức hợp VP1/VP3 gắn bên trong bề

mặt của lớp VP2 Các phân tử protein được chia làm 2 nhóm là protein cấutrúc và protein phi cấu trúc Protein cấu trúc bao gồm 6 loại là: VP1, VP2,VP3, VP4, VP6, VP7 Protein phi cấu trúc bao gồm 6 loại là: NSP1, NSP2,NSP3, NSP4, NSP5, NSP6.

Bảng 1.1 Các đoạn gen của Rotavirus

NSP6

2112

Protein phi cấu trúcProtein phi cấu trúc -Quan sát trên kính hiển vi điện tử người ta thấy 3 loại hạt virus là hạtvirus hoàn chỉnh, virus có vỏ capsid đơn và lõi virus (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Cấu trúc và protein của Rotavirus

trẻ em nhưng hiếm gặp , Rotavirus lây truyền phổ biến qua đường phân miệng Ổ chứa chủ yếu là người bệnh nhiễm Rotavirus Số lượng virus thải ra

có thể đạt 1011 trong 1 gram phân Sau khi thải ra môi trường, Rotavirus tồn

tại bền vững sau nhiều ngày ở nhiệt độ 4C và duy trì được khả năng gâybệnh Nghiên cứu trên nhóm người tự nguyện cho thấy liều 10 virus đủ gây

mắc bệnh trên người Rotavirus là nguyên nhân hàng đầu gây TCC ở trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt ở trẻ từ 6 đến 24 tháng Ngoài ra, Rotavirus có thể gây ra

bệnh viêm phổi, viêm ruột hoại tử, lồng ruột, tắc mật ngoài gan, nhiễm trùng

huyết, viêm não… Rotavirus đi qua đường phân miệng bám vào rồi nhân lên

trong tế bào trưởng thành nằm ở đỉnh nhung mao niêm mạc ruột non Chúnglàm tổn thương các vi nhung mao đồng thời làm tăng sản các tế bào hẽmtuyến ở niêm mạc ruột Hậu quả gây ra thiếu hụt các enzyme tiêu hóa, rối loạnnhu động ruột, rối loạn hấp thu nước, điện giải và chất dinh dưỡng ,, Vì vậy,bệnh nhân tiêu chảy cấp có các triệu chứng tiêu chảy phân lỏng, sốt và nôn,dấu hiệu mất nước có thể từ nhẹ tới nặng

1.2.2 Đặc điểm của Norovirus

Norovirus là thành viên của họ Caliciviridae, có hình khối 20 mặt đường kính 27- 40nm Norovirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1972 khi Kapikian quan sát mẫu phân của bệnh nhân dưới kính hiển vi điện tử , Norovirus được cấu tạo gồm cấu trúc capsid đơn và acid nucleic Vật chất di truyền của Norovirus

là một sợi RNA dương (+ ss RNA), dài khoảng 7,7 kb Bộ gen mã hóa bakhung đọc mở ORF (open reading frame) gồm ORF1, ORF2, ORF3 ORF1

mã hóa cho các protein phi cấu trúc bao gồm p48 (p37), p41 (p40), NTPase,p22 (p20), VPg, CL pro, RdRp Protein VPg liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ củaRNA virus mang chức năng bắt đầu quá trình nhân lên của virus Chức năngcủa protein phi cấu trúc còn lại chưa được hiểu biết đầy đủ ORF2 mã hóaprotein cấu trúc chính (major) VP1 và ORF3 mã hóa protein cấu trúc nhỏ(minor) VP2 RNA của virus được bao bọc bởi cấu trúc capsid đơn gồm 90dimer protein VP1 và một hoặc hai protein cấu trúc VP2 Protein VP1 chứa530-555 amino acid, có trọng lượng phân tử 58-60 kDa Protein VP2 chứa

208-268 amino acid, có trọng lượng 22-29 kDa Hiện nay, Norovirus được phân chia thành 6 nhóm gen khác nhau từ GI đến GVI Trong đó, Norovirus

gây bệnh ở người chủ yếu thuộc nhóm GI, GII và GIV Theo chương trình

Hình 1.3 Hình ảnh minh họa cấu trúc của Norovirus (Nguồn: Hiroshi Ushijima và cộng sự, 2014)

giám sát dịch tễ của Norovirus trên thế giới, nhóm GII đang chiếm ưu thế,

ước tính chiếm 80% các trường hợp lây nhiễm Chúng có khả năng lâytruyền từ người sang người qua đường phân miệng với liều lây nhiễm từ 10

đến100 virus , Ổ chứa chủ yếu là người bệnh nhiễm Norovirus Chúng có khả

năng tồn tại bền vững ngoài môi trường trong nhiều ngày và bị bất hoạt ở

63°C trong 30 phút, 100°C trong vài giây Vì vậy, khả năng lây nhiễm từ

người bệnh sang người lành cao Norovirus là tác nhân gây TCC ở người đặc biệt là trẻ nhỏ Ngoài ra, Norovirus còn được xem là tác nhân liên quan đến

một số bệnh lý khác như: viêm ruột hoại tử ở trẻ đẻ non, hội chứng ruột kích

thích, bệnh lí não, đông máu rải rác lòng mạch Norovirus đi qua đường tiêu

hóa, bám vào biểu mô ruột non gây ra sự thay đổi mô học và chức năng của

ruột non tương tự như Rotavirus Hậu quả gây ra sự tổn thương của các vi

nhung mao ruột, sự rối loạn nhu động dạ dày ruột, sự rối loạn bài tiết cácenzyme tiêu hóa, gây ra sự kém hấp thu các chất dinh dưỡng như D-xylose,

lactose, chất béo Vì vậy, bệnh nhân tiêu chảy cấp có các triệu chứng tiêu

chảy phân lỏng, sốt và nôn, dấu hiệu mất nước có thể từ nhẹ tới nặng Gần

đây, người ta nhận thấy người bệnh nhiễm Norovirus phụ thuộc vào sự hiện

diện kháng nguyên nhóm máu Histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong ống tiêuhóa Sự mẫn cảm của người nhiễm khác nhau được giải thích dựa trên liênkết đặc hiệu của virus và sự biến đổi trên thụ thể HBGA ,

1.3 Các kỹ thuật phát hiện Rotavirus, Norovirus.

1.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy

Nuôi cấy luôn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán Kỹ thuậtnuôi cấy virus thường yêu cầu cao về kỹ thuật bao gồm: lựa chọn tế bào, lựachọn môi trường nuôi cấy tế bào thích hợp, gây nhiễm tế bào, quan sát bệnh

lý tế bào sau khi gây nhiễm Hiện nay, người ta hoàn toàn có thể tiến hành

nuôi cấy Rotavirus, Norovirus trong phòng thí nghiệm Rotavirus có thể nuôi

cấy trên tế bào HEK, CK, LLC-MK2 Norovirus được nuôi cấy trên tế bào

đại thực bào, tế bào trình diện kháng nguyên của chuột, của người , và tế bào

B của chuột, của người , Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy yêu cầu phòng xétnghiệm có đủ trang thiết bị và đặc biệt thời gian nuôi cấy kéo dài nhiều ngày

1.3.2 Kỹ thuật phát hiện bằng kính hiển vi điện tử

Phương pháp phát hiện Norovirus, Rotavirus bằng kính hiển vi điện tử ra

đời rất sớm từ những năm 1972, 1973 , , Kỹ thuật này chủ yếu dựa vào nhận

định về hình thái virus Các tiêu chuẩn chính nhận định Rotavirus dưới kính

hiển vi điện tử là hạt virus hình cầu đường kính 70 nm, lớp capsid ngoài

mỏng, mịn Tương tự, Norovirus dưới kính hiển vi điện tử có hình cầu, đường

kính từ 27-40 nm, không vỏ Theo nghiên cứu của Rabenau và cộng sự (năm

2003) khi so sánh 3 phương pháp phát hiện Norovirus: bằng kính hiển vi điện

tử, ELISA, PCR, độ nhạy của 3 phương pháp lần lượt là: 58,3%; 31,3%;94,1%; độ đặc hiệu của 3 phương pháp lần lượt là: 98%; 94,9%; 94,1% Nhưvậy, phương pháp phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử có ưu điểm tươngđối nhanh, đơn giản Nhưng nhược điểm chính là phụ thuộc nhiều vào kinhnghiệm của người quan sát và độ nhạy chưa cao

Hình 1.4 Hình ảnh Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử

(nguồn: Hans R Gelderblom/RKI)

Hình 1.5 Hình ảnh Norovirus dưới kính hiển vi điện tử

(nguồn: Kapikian và cộng sự).

1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch

1.3.3.1 Kỹ thuật miễn dịch ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Kỹ thuật ELISA phát hiện virus sử dụng nguyên lí dùng kháng thể đặc

hiệu để bắt giữ kháng nguyên Rotavirus, Norovirus Kháng nguyên virus được

phát hiện nhờ phản ứng màu bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu bậc 2 cógắn enzyme Hiện nay, trên thị trường có nhiều bộ kit thương mại sử dụng

nguyên lí này để phát hiện Rotavirus như Premier™ Rotaclone® (MeridianBioscience, Inc.), ProSpecT™ (Oxoid, Ltd.) và RIDASCREEN® (R-biopharmAG) Khi so sánh với kỹ thuật RT-PCR, ba bộ kit này có độ đặc hiệu là 100%

và độ nhạy lần lượt là 76,8%, 75% và 82,1% Một số bộ kit thương mại sử

dụng kĩ thuật ELISA để chẩn đoán Norovirus như IDEIA Norovirus EIA, SRSV(II)-AD, RIDASCREEN,… Các kỹ thuật ELISA chẩn đoán Norovirus

có độ nhạy của kỹ thuật dao động từ 35% - 52%, độ đặc hiệu thường trên 90% Như vậy, kỹ thuật ELISA có ưu điểm đơn giản, thời gian trả kết quả ngắndao động từ 2 đến 3 giờ, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm không cókính hiển vi điện tử Tuy nhiên, nhược điểm chính của kỹ thuật là độ nhạy còn hạnchế ,

Hình 1.6 Nguyên lí của phương pháp ELISA ( nguồn: http://www.kythuatysinh.net/ky-thuat-elisa) Kháng thể được cố định vào đáy giếng nhựa Kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm

sẽ kết hợp với kháng thể tạo phức hợp kháng nguyên - kháng thể Bước rửa loại bỏ thành phần không kết hợp với kháng thể Kháng thể bậc hai kết hợp với enzym gắn với phức hợp kháng nguyên – kháng thể Phức hợp này được nhận biết bằng phản ứng màu sau khi bổ sung cơ chất đặc hiệu với enzyme cộng hợp.

1.3.3.2 Kỹ thuật sắc kí miễn dịch

Kỹ thuật sắc kí miễn dịch dùng dạng que nhúng để phát hiện khángnguyên virus thông qua nhận định vạch màu Que nhúng có chứa kháng thểgắn cộng hợp với các hạt keo vàng được phân bố trên bản sắc kí Kháng thểđặc hiệu được cố định tại vị trí vạch kết quả Kháng nguyên trong bệnh phẩm

sẽ kết hợp với kháng thể gắn hạt keo vàng và di chuyển Phức hợp này sẽ kếthợp với kháng thể cố định trên bản sắc kí tạo vạch màu hồng tại vị trí vạch kếtquả Phần phức hợp còn lại không gắn với kháng nguyên di chuyển đến vạch

Kháng thể

Bước gắn Bước rửa Bước gắn

kháng enzyme

thể-Bước đọckết quả

Vị trí

gắn

Khángnguyên

Khángthể bậchai

Cơchất

Mẫu

chứng cho một vạch hồng Điều đó chứng tỏ que nhúng hoạt động bìnhthường và kết quả có giá trị Như vậy khi xuất hiện cả 2 vạch màu hồngchứng tỏ mẫu dương tính Khi chỉ có một vạch hồng tại vị trí vạch chứngnghĩa là âm tính So sánh với kĩ thuật ELISA, kỹ thuật sắc kí miễn dịch phát

hiện Rotavirus có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật ELISA Một

nghiên cứu của Park Sung Kwi (năm 2012) so sánh kỹ thuật sắc kí miễn dịch

với phương pháp RT-PCR, bộ kit thương mại SD BIOLINE Norovirus

(Standard Diagnostics, Korea) sử dụng nguyên lí sắc kí miễn dịch có độ nhạy,

độ đặc hiệu, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự đoán âm tính lần lượt là:76,5%; 99,7%; 98,1%; 95,5% Như vậy, kỹ thuật sắc kí miễn dịch giải quyếtđược vấn đề thời gian trả kết quả rất nhanh từ 30 phút đến 1 giờ, nhưng nhượcđiểm là độ nhạy còn hạn chế

Hình 1.7 Nguyên lí của kỹ thuật sắc kí miễn dịch (nguồn: Trung tâm thống tin và thống kê khoa học và công nghệ thành phố Hồ Chí Minh)

1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử

1.3.4.1 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiệm, sử dụng cặpmồi đặc hiệu gắn vào đoạn gen đích và khuếch đại đoạn gen này trong một sốchu kỳ lặp lại Gen đích sẽ được tăng theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ Do vật

chất di truyền của Rotavirus, Norovirus là RNA nên phương pháp sinh học

phân tử được áp dụng là Reverse transcription (RT-PCR) hay còn gọi là PCRphiên mã ngược Đây là kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổnghợp chuỗi DNA bổ sung (cDNA) Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 2 giai đoạn Giaiđoạn thứ nhất tổng hợp cDNA từ RNA nhờ enzyme sao mã ngược và các mồioligo-(T) hoặc các mồi ngẫu nhiên Giai đoạn thứ hai, cDNA sẽ được tách làmhai sợi đơn, hai mồi đặc hiệu được gắn vào hai sợi đơn và kéo dài mạch dướitác động của enzyme DNA polymerase. Sản phẩm khuếch đại sẽ được pháthiện sau khi điện di trên gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọcdưới ánh sáng đèn cực tím

Rotavirus được phát hiện bằng cách tách chiết RNA của virus từ các mẫu

bệnh phẩm phân, phân tích bằng RT-PCR với các mồi đặc hiệu cho các vùnggen khác nhau như vùng gen mã hóa VP7, VP4 , NSP 3 Sau đó sự có mặt củavirus được xác định bằng kích thước sản phẩm sau điện di trên gel agarose

Kỹ thuật RT-PCR phát hiện Norovirus được phát triển dựa trên các cặp mồi đặc hiệu cho các gen Norovirus khác nhau, chủ yếu ở vùng bảo thủ nằm trên

gen mã hóa RNA polymerase thuộc ORF1 , Ưu điểm của kỹ thuật này là có

độ nhạy cao phát hiện được virus ở nồng độ thấp, độ đặc hiệu cao, có thể trảkết quả trong ngày Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi các trang thiết bị chuyêndụng, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu và nguyên vật liệu đắt tiền

1.3.4.2 Kỹ thuật Realtime RT-PCR

Kỹ thuật Realtime PCR ra đời cho phép người làm thí nghiệm không cầnthực hiện tiếp các bước điện di sản phẩm trên gel agarose để đọc và phân tíchkết quả có sản phẩm khuếch đại đích hay không Kết quả được hiển thị cùnglúc với phản ứng khuếch đại xảy ra thông qua biểu đồ khuếch đại Thiết bịRealtime PCR có chức năng tạo ánh sáng kích thích, kích thích chất huỳnhquang phát quang khi có sản phẩm khuếch đại trong ống phản ứng Sau đóthiết bị thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra và thể hiện cường độ huỳnhquang sau mỗi chu kì nhiệt trên đồ thị khuếch đại Đồ thị khuếch đại được thểhiện qua hai giai đoạn Trong giai đoạn một theo hàm mũ, lượng sản phẩmPCR được tạo ra gần như gấp đôi sau mỗi chu kì Sau giai đoạn hàm mũ, phảnứng bước vào giai đoạn bão hòa, các thành phần phản ứng dần trở nên cạnkiệt (hình 1.6)

ơ Hình 1.8 Biểu đồ quan hệ giữa chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang trong phản

ứng realtime PCR

( Nguồn: http://technologyinscience.blogspot.com)

Ban đầu tín hiệu ở mức tín hiệu nền, các sản phẩn khuếch đại theo hàm

mũ nhưng ta chưa phát hiện được sự gia tăng tín hiệu Đến thời điểm sảnphẩm khuếch đại tạo ra tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu nền, ta gọi chu kì ởthời điểm đó là chu kỳ ngưỡng Ct Giá trị Ct nhỏ chứng tỏ lượng gen đíchtrong mẫu ban đầu lớn Ngược lại, giá trị Ct lớn chứng tỏ lượng gen đíchtrong mẫu ban đầu nhỏ

Các kỹ thuật Realtime PCR hiện nay có nhiều lựa chọn về chất pháthuỳnh quang Kỹ thuật TaqMan Probe sử dụng Probe phát huỳnh quang là kỹthuật có độ đặc hiệu cao TaqMan Probe là những oligonucleotides có trình tự

bổ sung với trên trình tự đặc hiệu trên DNA đích, trình tự này dài khoảng

24-30 bases, đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (Reporter), đầu 3’ gắn chất hấpthụ tương ứng (Quencher)

Cơ chế hoạt động của TaqMan Probe trong Realtime PCR: Khi chưa cósản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì TaqMan Probe vẫn nguyênvẹn, huỳnh quang từ reporter phát ra sẽ bị quencher hấp phụ, ống nghiệm sẽkhông phát huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích Khi có sản phẩmkhuếch đại đặc hiệu, ở nhiệt độ bắt cặp, TaqMan Probe sẽ bắt cặp vào sợikhuôn sản phẩm này và sẽ bị enzym Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồitổng hợp sợi bổ sung Vì vậy, reporter bị cắt rời xa quencher và phát đượchuỳnh quang khi nhận ánh sáng kích thích.

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của TaqMan Probe trong Realtime PCR

(nguồn http://www.e-oligos.com)

So với PCR thường, kỹ thuật Realtime PCR đã giúp người làm thínghiệm: tiết kiệm thời gian, giảm bớt thao tác, tăng độ nhạy, độ đặc hiệu

của phản ứng, hạn chế khả năng nhiễm tạp Tuy nhiên, kỹ thuật này yêucầu nguyên vật liệu đắt tiền, và người làm xét nghiệm có khả năng phântích kết quả.

1.3.4.3 Kỹ thuật Realtime PCR đa mồi

Trong Realtime PCR, người ta sử dụng một cặp mồi trong một phản ứngthì kỹ thuật Realtime PCR đa mồi dựa trên nguyên tắc của Realtime PCR,được thiết kế nhiều cặp mồi trong một phản ứng nhằm phát hiện nhiều genđích cùng lúc Để đảm bảo hiệu quả của phản ứng đa mồi tương đương hiệuquả của phản ứng đơn mồi, người làm cần phải tối ưu nồng độ mồi, thànhphần buffer của phản ứng, chu trình nhiệt Hiện nay, sự ra đời của các mastermix thương mại đã giúp người thực hiện giảm các bước thao tác kỹ thuật tối

ưu nồng độ Mg2+, dNTP, enzyme DNA polymerase, giúp tiết kiệm thời gian,hóa chất Như vậy, kỹ thuật Realtime PCR đa mồi được phát triển nhằm pháthiện nhiều tác nhân gây bệnh trên cùng một mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật này có

độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao, làm giảm thời gian, tiết kiệm hóa chất, đảm bảotiến độ công việc cho phòng xét nghiệm đồng thời mang lại lợi ích cao trongchẩn đoán và điều trị cũng như tiên lượng bệnh của bác sĩ lâm sàng ,

1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu

Rotavirus, Norovirus là những căn nguyên hàng đầy gây TCC ở trẻ em

trên toàn thế giới Tuy nhiên những công cụ chẩn đoán các căn nguyên nàynhư phương pháp nuôi cấy, phương pháp miễn dịch vẫn còn những hạn chếnhất định khi ứng dụng trong sàng lọc tại bệnh viện Phương pháp nuôi cấythường phù hợp với trung tâm nghiên cứu do yêu cầu cao về kĩ thuật, thờigian trả kết quả dài Phương pháp miễn dịch đang được sử dụng phổ biếntrong thực hành tại bệnh viện Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm độnhạy chưa cao Xuất phát từ vấn đề này, một câu hỏi đặt ra: cần ứng dụng một

phương pháp cho thời gian trả kết quả nhanh, độ nhạy cao, độ đặc hiệu caotrong phát hiện sớm căn nguyên gây TCC tại bệnh viện Sinh học phân tử là

kỹ thuật có thể đáp ứng phần nào những yêu cầu đó Đặc biệt, Realtime PCR

đa mồi là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép cùng lúc phát hiện cả hai tácnhân trong cùng một phản ứng giúp tiết kiệm thời gian và hóa chất xétnghiệm Kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong chẩn đoán các tác nhân gâyTCC đã từng được công bố trên thế giới Tại NertherLand, Maarseveen (năm

2010) đã sử dụng kỹ thuật này chẩn đoán Rotavirus (vùng gen NSP3), Norovirus nhóm II (vùng gen capsid junction) , Astrovirus, EAV - Equine

Arteritis Virus Tác giả cũng chỉ ra rằng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi có độnhạy và độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi Trong

những mẫu đồng nhiễm thì độ nhạy của kỹ thuật này phát hiện Norovirus

nhóm II có thể giảm 5% so với kỹ thuật đơn mồi Xuất phát từ tình hình TCC

do Rotavirus, Norovirus và sự ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong sàng

lọc sớm căn nguyên tại bệnh viện, chúng tôi tiến hành đề tài: ứng dụng kỹ

thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus, Norovirus gây tiêu

chảy cấp ở trẻ em

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Khoa Nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm – Bệnh việnNhi Trung ương

2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh phẩm phân của trẻ dưới 5 tuổi có chẩn đoán tiêu chảy cấp điều trịtại bệnh viện Nhi Trung ương

Tiêu chuẩn lựa chọn: Trẻ em mắc tiêu chảy cấp với các triệu chứng

được chẩn đoán xác định theo tiêu chuẩn của WHO: Đi ngoài phân lỏng, hoặctoàn nước, hoặc phân có máu ít nhất 3 lần trong vòng 24 giờ, gia đình trẻ hợptác nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ: Trẻ em không đảm bảo các tiêu chuẩn lựa chọn, gia

đình trẻ không tự nguyện cam kết hợp tác hoặc không chấp thuận tham gia

nghiên cứu

Thời điểm lấy bệnh phẩm: ngay sau khi bệnh nhân được khám và nhập

viện tại các khoa lâm sàng – bệnh viện Nhi Trung ương

Cách lấy bệnh phẩm: Lấy khoảng 5 ml chất lỏng (khoảng 1 thìa cà phê)

hoặc 5 gram chất rắn (bằng hạt lạc) cho vào tuýp đựng mẫu

Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập

được vận chuyển tới phòng xét nghiệm, bảo quản ở -80oC trước khi thực hiệnxét nghiệm

2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị

- Micropipette và đầu côn các loại 10l, 50l, 100l, 200l, 1000 l

- Ống eppendorf các cỡ: 0,5 ml, 1,5 ml

- Plate 96 giếng 100l, 200l Biosystem và film phủ (ABI)

- Máy tách chiết tự động MagNA Pure LC 2.0 (Roche)

- Safty cabinet class II Biohazard (Esco)

- ND-1000 Spectrophotometer (Nano Drop)

- QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit (Qiagen)

- Primer, Probe (IDT)

- Mẫu đối chứng dương: plasmid chèn trình tự đích Rotavirus và Norovirus của trường đại học Gothenburg, Thụy Điển.

- Mẫu đối chứng âm: nước cất sử dụng cho phản ứng PCR

- Hóa chất dùng cho bộ kit chuẩn dùng làm đối chứng: FTD viralgastroenteritis

Primer và Probe:

Trong số các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic để phát hiện Norovirus,

RT-PCR (Reverse trancription polymerase chain reaction) là kỹ thuật được sửdụng phổ biến hơn cả Đoạn gen mục tiêu được sử dụng để phát hiện

Norovirus trong các phương pháp RT-PCR là vùng gen mã hóa

RNA-dependent RNA polymerase trong vùng đọc mở ORF1 do có tính bảo thủ cao.Trong một nghiên cứu so sánh hiệu quả của 3 phương pháp phát hiện

Norovirus trên một tập hợp gồm 244 mẫu bệnh phẩm, Rabenau và các cộng

sự (năm 2003) đã chỉ ra phương pháp RT-PCR có độ nhạy cao nhất (94,1%),sau đó đến phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử (58,3%) và ELISA(31,3%) Gần đây, các phương pháp dựa trên kỹ thuật Realtime TaqMan PCR

đã cho phép cải thiện độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại, giảm thời gian phântích kết quả và hạn chế hiện tượng nhiễm tạp, trở thành phương pháp tiêu

chuẩn để phát hiện Norovirus trong các mẫu phân tích Đoạn gen chúng tôi

lựa chọn cho nghiên cứu phát hiện Norovirrus là Gen Polymerase-capsidjunction có tính bảo tồn cao

Rotaviruses là thành viên của họ Reoviridae, chi Rotavirus với bộ gen

bao gồm 11 phân đoạn RNA chuỗi kép (dsRNA), mã hóa sáu protein cấu trúc(VP1-VP4, VP6, vàVP7) và sáu protein phi cấu trúc (NSP1-NSP6) Ðoạn gen

số 4, 9 mã hoá cho các protein capsid lớp ngoài VP4 và VP7 Các gen số 1, 2,

3 và 6 lần lượt mã hoá cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6 Các gen cònlại mã hoá cho các protein phi cấu trúc, là những protein do virus tạo ra khixâm nhiễm vào tế bào Bên cạnh đó, các protein phi cấu trúc NSP1, NSP2,NSP3 và NSP4 có vai trò liên kết các RNA của virus có tính bảo thủ cao trong

đó NSP3 liên kết mRNA virut trong những tế bào nhiễm và làm ức chế quátrình tổng hợp protein tế bào NSP3 liên kết đặc hiệu với đầu 3’ của mRNAvirus và điều này giúp bảo vệ đầu 3’ khỏi các REase Trong nghiên cứu này,một đoạn gen dài 87 bp trong vùng bảo tồn cao của protein phi cấu trúc

3(NSP3) trong hệ gen Rotavirus được khuyếch đại.

Các vùng gen khuyếch đại cho Rotavirus, Norovirus là các vùng gen có

tính bảo tồn cao Việc xác định các trình tự bảo tồn cao trong khu vực 5’không mã hóa của bộ gen virut đã giúp thiết kế các mồi PCR cho phép phát

hiện các vi sinh vật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao Các trình tự mồi và probenày chúng tôi dựa trên công trình nghiên cứu do tác giả Kabayiza công bốtrên tạp chí BMC Infectious Diseases năm 2013 Các mồi và probe mục tiêu

đa số có nhiệt độ nóng chảy nằm quanh vùng 58-60°C đối với mồi, 68-70°Cđối với đầu dò .

Chúng tôi sử dụng gen GAPDH làm gen nội chứng để kiểm tra sự có mặtcủa tế bào người, đặc biệt gen này có mức độ biểu hiện cao ở các mô ruột Mụcđích để kiểm soát chất lượng quá trình thu mẫu, quá trình tách chiết acid nucleic,loại trừ khả năng có yếu tố ức chế phản ứng PCR khuếch đại vùng gen đích của

Rotavirus, Norovirus, gây ra kết quả âm tính giả.

Bảng 2.1 Trình tự Primer, Probe của gen GAPDH, Rotavirus, Norovirus

Tác nhân

Primer xuôi (F)- Primer ngược (R)-Probe (P)

Tài liệu tham khảo

Non-2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu mô tả tiến cứu.

Chọn mẫu: Cỡ mẫu thuận tiện.

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu:

Bệnh nhân được chẩn đoán tiêu chảy cấp (n=119)

Realtime PCR đa mồi

đa mồi

2.5.2 Phương pháp Realtime PCR đa mồi phát hiện Rotavirus và Norovirus.

Tiền xử lý mẫu phân:

Chuyển một lượng mẫu bệnh phẩm nhỏ khoảng 0.5 ml phân lỏng hoặc0.3-0.5 g phân sang ống eppendorf đã được ghi nhãn tương ứng

Thêm 0.5 ml dung dịch bảo quản (dung dịch đệm PBS và glycerol tỉ lệ1:1) vào ống eppendorf đã chứa mẫu Lắc đều sau đó ủ mẫu ở nhiệt độ 560Ctrong vòng 15 phút Spindown và hút 200 µl vào khay 32 mẫu để thực hiệntách chiết bằng hệ thống máy tách chiết vật chất di truyền của Roche (quytrình theo phụ lục II)

Tách chiết vật chất di truyền của Rotavirus và Norovirus trên hệ thống MagNA Pure LC 2.0:

Hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0 là thiết bị tách chiết tự độngnhanh và không có hiện tượng nhiễm chéo Hệ thống trang bị cánh tay robot

có thể xử lí 32 mẫu bệnh phẩm khác nhau trong cùng một lần chạy Hệ thốngtách chiết dựa trên công nghệ bi từ kết hợp với sử dụng hóa chất tinh sạch caođảm bảo việc tách chiết cho acid nucleic chất lượng cao và đồng nhất kết quả.Thời gian hoàn tất một lần chạy máy 32 mẫu là khoảng 90 phút Nguyên líhoạt động của máy được tóm tắt như sau:

Bước 1: Nhỏ mẫu vào ống tách

Bước 2: Phá hủy tế bào và phân hủy protein nhờ tác động của Lysis

Buffer và Protein K

Bước 3: Nucleic acid gắn vào bề mặt các hạt bi từ

Bước 4: Sử dụng từ trường để tách các phức hợp bi từ và acid nucleic.Bước 5: Loại bỏ mảnh vỡ tế bào bằng các bước rửa

Bước 6: Sử dụng từ trường để tách các phức hợp bi từ và acid nucleic.Bước 7: Lấy lại nucleic acid ở nhiệt độ cao trong quá trình loại bỏ các

hạt bi từ

Hình 2.1 Nguyên lí hoạt động của hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0

Xác định nồng độ RNA bằng phương pháp quang phổ kế

Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại

ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang ởbước sóng 260 nm (OD260nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phépxác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ là:

- 50 g/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi

- 40 g/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn

Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch

Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm(OD280nm) Các protein có mức hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, nhưngcũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid Do đó, làmsai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid đạttiêu chuẩn về độ sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/OD280nmnằm trong khoảng 1,8 - 2

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Dựa vào nguyên tắc đã mô tả ở trên, tất cả các mẫu RNA của chúng tôiđều được đo bằng phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ và đánhgiá độ tinh sạch, và chỉ những mẫu nào đạt được nồng độ tối ưu và có độ tinhsạch dao động từ 1,8 - 2 mới được sử dụng cho phản ứng Real time PCR (quytrình xem phụ lục III).

2.5.3 Phản ứng Realtime PCR xác định Norovirus và Rotavirus

Thực hiện chạy Realtime PCR cho các mẫu bệnh phẩm với gen GAPDH

để kiểm tra chất lượng sản phẩm theo thành phần phản ứng như sau:

Với kết quả thu được đảm bảo chất lượng chúng tôi tiến hành Realtime

PCR phát hiện Rotavirus và Norovirus.

Đề tài thực hiện tối ưu điều kiện phản ứng Realtime PCR phát hiện

Rotavirus và Norovirus theo hai cách:

Cách 1: Theo tài liệu tham khảo chúng tôi thực hiện Realtime PCR đơn

mồi cho từng tác nhân Rotavirus và Norovirus, hỗn hợp phản ứng bao gồm

thành phần hóa chất giống nhau, riêng thành phần primer và probe của tác

nhân tương ứng với từng ống riêng biệt cho Norovirus và Rotavirus

45 chu kì

Cách 2: Chúng tôi cải tiến kỹ thuật Realtime PCR bằng cách tiến hành xét

nghiệm cùng cho cả Norovirus và Rotavirus trong cùng một ống phản ứng

Kết quả quá trình Realtime PCR đa mồi cho kết quả định tính với cáccăn nguyên gây bệnh Dựa trên kết quả Ct và đồ thị khuếch đại phản ứng chokết quả dương tính và âm tính Với Ct >38 cho kết quả âm tính Với Ct  38cho kết quả dương tính

45 chu kì