Nghiên cứu này được tiến hành nhằm so sánh hiệu quả của các chất đối kháng chọn lọc trên thụ thể CCK-A, CCK-B, các chất đối kháng không chọn lọc thụ thể CCK trên dòng tế bào ung thư phổi C38 và ung thư ruột kết MAC16.
Trang 1SO SÁNH TÁC ĐỘNG KHÁNG KHỐI U GIỮA CÁC CHẤT ĐỐI KHÁNG
THỤ THỂ CHOLECYSTOKININ (CCK) TRÊN DÒNG TẾ BÀO
UNG THƯ PHỔI BIỂU MÔ C38 VÀ UNG THƯ RUỘT KẾT MAC16
Nguyễn Thị Thùy Anh * , Eric Lattmann **
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Cholecystokinin (CCK) được biết đến như một hormon đường ruột giúp điều hoà sự tiết enzym
trong tuyến tụy CCK gây tăng sinh nhiều dòng tế bào ung thư (dạ dày, đại tràng, tụy, phổi, não) Vì vậy, nhiều nghiên cứu riêng lẻ về tác động chống ung thư của các chất đối kháng CCK đã được thực hiện Tuy nhiên, một bức tranh toàn cảnh về hiệu quả tác động của các chất đối kháng CCK trên các dòng tế bào ung thư khác nhau
vẫn chưa được hoàn thiện
Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm so sánh hiệu quả của các chất đối kháng chọn lọc trên thụ
thể CCK-A, CCK-B, các chất đối kháng không chọn lọc thụ thể CCK trên dòng tế bào ung thư phổi C38 và ung thư ruột kết MAC16
Phương pháp: Tỉ lệ tế bào sống được đánh giá bằng thử nghiệm MTT Chuột được cấy ghép khối u MAC16
và được uống các chất thử nghiệm Kích thước khối u được đo mỗi ngày trong 6 ngày
Kết quả: Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào ung thư phổi C38 cho thấy các giá trị IC 50 của chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-B (PNB-001) và không chọn lọc thụ thể CCK (Bz) không khác biệt nhau về mặt thống kê Đồng thời các giá trị này thấp hơn 3,3 lần so với chất chuẩn 5-fluorouracil Thử nghiệm in vivo cho thấy tính ức chế tăng trưởng khối u của chất đối kháng thụ thể CCK không chọn lọc (F-Bz) cao hơn các chất còn lại trên dòng
tế bào ung thư ruột kết MAC16
Kết luận: Các chất kháng CCK-B và chất kháng CCK không chọn lọc gây độc tế bào ung thư phổi C38 nhưng
chỉ có chất kháng CCK không chọn lọc có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u ruột kết MAC16 in vivo
Từ khoá: cholecystokinin, ung thư phổi, ung thư ruột kết
ABSTRACT
COMPARISON OF THE ANTI-TUMOR EFFECT AMONG CHOLECYSTOKININ RECEPTOR ANTAGONISTS (CCK) ON C38 LUNG CANCER CELL LINE AND MAC16 COLON CANCER CELL LINE
Nguyen Thi Thuy Anh, Eric Lattmann
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 24 - No 3 - 2020: 79 - 84
Background: Cholecystokinin (CCK) is known as an intestinal hormone that helps regulate pancreatic
enzyme secretion CCK induces the proliferation of cancer cell lines (stomach, colon, pancreas, lung, brain) Therefore, various individual studies on the anti-neoplastic effect of CCK antagonists have been conducted However, a comprehensive picture of the effect of CCK antagonists on different cancer cell
lines has not been completed
Objectives: The aim of this study was to compare the effectiveness of selective CCK-A, CCK-B receptor
antagonist, non-selective CCK receptor antagonist on C38 lung cancer cell line and MAC16 colon cancer cell line
Methods: Cell viability was determined by MTT test The mice were injected with MAC 16 tumor and were
administered test substances Tumor size was measured every day for 6 days
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
** Khoa Dược lý, Đại học Aston, Anh
Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Thị Thùy Anh ĐT: 0917934957 Email: thuyanh@ump.edu.vn
Trang 2Key words: cholecystokinin, lung cancer, colon cancer
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cholecystokinin (CCK) được phát hiện lần
đầu như một tác nhân gây co thắt túi mật vào
năm 1928 CCK không chỉ hoạt động như một
hormon đường ruột giúp điều hoà sự tiết enzym
trong tuyến tụy mà còn là yếu tố tăng trưởng và
chất điều biến thần kinh(1) CCK gây tăng sinh
nhiều dòng tế bào ung thư như ung thư dạ dày,
đại tràng, tụy, phổi, não(2,3) Vì vậy, các chất đối
kháng thụ thể CCK được xem như tác nhân
chống ung thư có triển vọng
Thụ thể CCK được phân loại do tập trung
chủ yếu ở đường tiêu hóa (CCK-A) và não
(CCK-B) Cả hai thụ thể CCK-A và B đều thuộc
họ G-Protein Coupled Receptor (GPCR) Các
GPCR tham gia vào nhiều quá trình khác nhau
trong ung thư như: tạo mạch máu, viêm và tăng
sinh tế bào Đáng chú ý hơn, GPCR còn là cầu
nối giữa ung thư và viêm Thật vậy, sự tăng biểu
hiện của COX-2 và viêm mạn tính liên quan chặt
chẽ đến sự tiến triển của khối u Ví dụ, chất ức
chế COX-2 có thể làm giảm nguy cơ và tỷ lệ mắc
bệnh ung thư đại tràng(4) Các chất đối kháng
CCK được sử dụng trong nghiên cứu này cũng
có tác động chống viêm, có thể đóng góp vào tác
dụng chống ung thư của chúng(5) Ding và cộng
sự (2002) đã phát hiện ra một biến thể quan
trọng của thụ thể CCK-B chỉ có trong mô ác tính,
không có trong mô bình thường Những thụ thể
này được gọi là thụ thể CCK-C/ cancer receptor,
sự hiện diện của chúng được tìm thấy trong mô
ung thư như đại tràng, tuỵ(6)
Liệu pháp kép sử dụng platinum và 5-fluorouracil
lần lượt là các liệu pháp hoá trị tiêu chuẩn cho
ung thư phổi và ruột kết Tuy nhiên, các liệu pháp này đều gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng(7) Gastrin là một yếu tố tăng trưởng có tác dụng sinh học tương tự với CCK và được phát hiện với nồng độ tăng cao trên cả ung thư phổi
và ung thư đại trực tràng Các thụ thể CCK-B được tìm thấy trong hầu hết các mẫu ung thư phổi nhưng không phát hiện được trong sinh thiết phổi khỏe mạnh Ngược lại, thụ thể CCK-A được tìm thấy nhiều trong ung thư ruột kết(8) Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm so sánh tác động chống khối u của các chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-A, CCK-B hoặc không chọn lọc thụ thể CCK trên dòng tế bào ung thư phổi C38 và ung thư ruột kết MAC16 hỗ trợ việc xác định mục tiêu nghiên cứu của thuốc
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các chất thử nghiệm
Các hợp chất với vòng pyrazolon giúp cải thiện khả dụng sinh học đường uống với trọng lượng phân tử thấp (xấp xỉ 300 Da) và log P khoảng 3, bao gồm IB là chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-A, PNB-001 là chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-B, Bz và F-Bz là các chất đối kháng không chọn lọc thụ thể CCK F-Bz và Bz đều đang được nghiên cứu trong quá trình tối
ưu hoá mối liên quan cấu trúc tác động Trong
đó, khi thêm nhóm halogen (F, Cl) lên vòng (Tại
vị trí X ở Hình 1) giúp tăng ái lực liên kết, có lẽ
do tăng tính thân dầu(9) Công thức của 4 hợp
chất này được trình bày ở Hình 1 Các chất này
được pha loãng từ dung dịch mẹ có nồng độ 10
mM trong DMSO/H2O (3:1) Chất đối chứng sử dụng là 5-fluorouracil
Trang 3IB PNB-001 Bz (X = H) hoặc F-Bz (X = F)
Hình 1 Các hợp chất vòng pyrazolon dùng trong thử nghiệm
Hoá chất – Dung môi
Môi trường Dulbecco's Modified Eagle's
Medium (DMEM) và Fetal Bovine Serum
(FBS), môi trường RPMI-1640, thuốc thử
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromua (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO),
5-fluorouracil (5-FU) từ Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ
NaCl 0,9%, penicilin, streptomycin, dầu ô liu
được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học và
Dược lý, Bộ môn Dược lý, Đại học Aston, Anh
Dòng tế bào
Dòng tế bào ung thư phổi biểu mô C38
(ATCC CRL-2779), là một dòng tế bào ổn
định có nguồn gốc từ các tế bào IB3-1, mua
từ American Type Culture Collection (ATCC)
Dòng tế bào này được nuôi cấy trong môi
trường DMEM bổ sung 10% (v/v) FBS, 1%
(Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) trong bình 75 cm2, 250 mlở
37°C, 5% CO2 và được cấy chuyền khi đạt độ bão
hòa 80%
Dòng tế bào MAC16 được nhận từ Tiến sĩ
Eric Lattmann (Bộ môn Dược lý, Đại học
Aston, Anh)
Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt Naval Medical Research Institute
(NMRI) thuần chủng (6 - 8 tuần tuổi) được nuôi
và cho lai cùng dòng tại phòng thí nghiệm dược
lý thuộc đại học Aston, Anh Chuột được nuôi
ổn định ở điều kiện bình thường với chu kỳ
sáng/tối = 12 giờ/12 giờ, nhiệt độ từ 18-23 oC, cho
ăn theo chế độ RM3E (Lillco-Anh) và uống nước
tự do
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư in vitro bằng thử nghiệm MTT
Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư in vitro bằng thử nghiệm MTT
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 24 giếng Cho 1 ml dịch chứa tế bào (10.000 tế bào) vào mỗi giếng và ủ trong 48 giờ Sau đó, thêm vào giếng các hợp chất thử nghiệm với nồng độ tăng dần (1 – 100 µM) và mẫu chứng với dung môi pha chất thử nghiệm (DMSO/H2O = 3/1) Mỗi nồng độ thực hiện trên 2 giếng Các tế bào trong giếng được ủ trong 24 giờ để đánh giá độc tính
tế bào của các hợp chất thử nghiệm Thuốc thử MTT 50 µL được bơm vào mỗi giếng và ủ trong
4 giờ Tiếp đó, 500 µL DMSO được cho vào từng giếng và ủ ít nhất 2 giờ Độ hấp thu mỗi giếng được đo ở bước sóng 570 nm bằng máy Elisa Plate Reader với đĩa 96 giếng(10)
Đánh giá tác động ức chế phát triển khối u in vivo
Tiêm khối u
Khối u MAC16 được lấy ra từ chuột cho, chia thành nhiều mảnh lập phương có kích thước khoảng 2 mm rồi nhúng vào NaCl 0,9% bổ sung streptomycin (2 mg/ml) và penicillin (2000 U/ml) Những mảnh này được cấy dưới da vào vùng bẹn bên phải của chuột thử nghiệm bằng tiêm trocar với thể tích 0,2 ml Tỉ lệ chuột mang khối u đạt 100% trên tổng số chuột được tiêm Tác dụng phụ thường gặp của cấy ghép khối u MAC16 là suy giảm trí nhớ và giảm cân dần ở chuột dù không giảm lượng thức ăn, hiện tượng loét khối u ít gặp hơn(11)
Trang 4nhóm 7 chuột) gồm nhóm chứng bệnh và các
nhóm được điều trị bằng các chất thử nghiệm
lần lượt như sau: F-Bz, IB, PNB-001 Các chất thử
nghiệm được phân tán đồng đều trong dầu ô liu
và cho chuột uống liều 200 mg/kg Chuột được
cân trọng lượng và đo kích thước khối u mỗi
ngày trong 6 ngày bằng thước kẹp điện tử Thể
tích khối u được suy ra từ công thức: (chiều dài ×
chiều rộng2)/ 2 Tác động chống khối u được xác
định bởi sự gia tăng về thể tích khối u theo thời
gian thử nghiệm giữa các nhóm điều trị bằng các
chất thử nghiệm so với nhóm chứng bệnh Thử
nghiệm được chấp thuận bởi Uỷ ban Đạo đức
sinh học của Đại học Aston
KẾT QUẢ
Độc tính tế bào của các chất đối kháng CCK trên dòng tế bào C38
Tất cả các hợp chất thử nghiệm đều gây độc
tế bào phụ thuộc liều, đặc biệt là PNB-001 và Bz
Tỉ lệ sống sót các tế bào tỉ lệ thuận với độ hấp thu Độc tính tế bào cao nhất của các hợp chất này đạt được tại nồng độ 100 µM với độ hấp thu thấp nhất (khoảng 0,3) và thấp hơn đáng kể so
với nhóm đối chứng (p < 0,05) (Hình 2)
Các giá trị IC50 của PNB-001 và Bz thấp hơn đáng kể so với 5-FU (3,3 lần) (p<0,05) Giá trị IC50
của PNB-001 và Bz không khác biệt nhau về mặt thống kê IC50 của IB không khác biệt về mặt
thống kê so với 5-FU (p > 0,05) (Bảng 1)
Hình 2 Độ hấp thu theo nồng độ các chất đối kháng CCK khảo sát Bảng 1 Các giá trị IC 50 cho các chất khảo sát sử dụng thử nghiệm MTT
IC 50 (μM, Khoảng tin cậy 95%) 60,1 ± 18,6 18,3 ± 7,4 18,3 ± 9,1 65,7 (KTC 95% rất rộng)
Thử nghiệm in vivo trên dòng tế bào ung thư
ruột kết MAC16
Trong thời gian 6 ngày, nhóm chuột điều trị
bằng chất đối kháng CCK-A chọn lọc (IB) không
gây bất kỳ sự ức chế rõ ràng nào về tỷ lệ tăng
trưởng khối u so với nhóm chứng bệnh Ngoài ra,
độc tính của thuốc có thể làm trầm trọng thêm sự
mất cân của chuột mang khối u (Hình 3)
Việc điều trị bằng chất đối kháng chọn lọc CCK-B (PNB-001) không có bất kỳ tác dụng ức chế nào trên sự tăng trưởng thể tích khối u mà còn làm giảm đáng kể trọng lượng cơ thể của chuột thử nghiệm Ngược lại, tỷ lệ tăng thể tích khối u của nhóm điều trị bằng chất đối kháng không chọn lọc (F-Bz) thấp hơn so với nhóm chứng bệnh cũng như nhóm PNB-001 và IB Đồng thời, sự mất cân ở chuột thử nghiệm trong
nhóm này cũng ít hơn các nhóm còn lại (Hình 3)
Trang 5Hình 3 Tỉ lệ % tăng trưởng thể tích khối u MAC16 và % giảm trọng lượng so với ban đầu dưới tác
động của các chất khảo sát
BÀN LUẬN
Độc tính tế bào của các chất đối kháng CCK
trên dòng tế bào C38
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng yếu tố tăng
trưởng hoặc chất đối kháng hormon có thể trực
tiếp gây ra tác dụng gây độc tế bào trên các tế
bào ung thư hoặc tác động hiệp đồng với các
thuốc chống ung thư khác Ở đây, chúng tôi chỉ
ra rằng tất cả các chất đối kháng CCK có thể gây
độc trực tiếp trên dòng tế bào ung thư phổi C38
phụ thuộc vào nồng độ (khoảng 1-100 µM) Hơn
nữa, giá trị IC50 của chất đối kháng CCK-B chọn
lọc (PNB-001) và không chọn lọc (Bz) thấp hơn
đáng kể so với 5-FU và chất đối kháng CCK-A
chọn lọc (IB) Do đó, hiệu ứng độc tế bào của
PNB-001 và Bz cao hơn so với 5-FU và IB Bên
cạnh đó, các thí nghiệm này được thực hiện
trong 24 giờ ủ với thuốc Do đó, tác động gây
độc trên các tế bào C38 có thể đến từ tác động
đối kháng CCK trên các thụ thể tương ứng của
chúng Thật vậy, chỉ có thụ thể CCK-B được tìm
thấy trên ung thư phổi(11) Hơn nữa, tác dụng
chống tăng sinh của PNB-001 và Bz cần được
nghiên cứu thêm vì trong nghiên cứu trước đó
Moody và Jensen (2001) đã chỉ ra rằng chất đối
kháng CCK-B chọn lọc (CI-988) có thể gây tác
dụng chống tăng sinh trên dòng tế bào ung thư
phổi tế bào nhỏ NCI-H209 cũng như tác dụng
chống khối u trên ghép ngoại lai NCI-H209(12)
Viêm có thể bảo vệ phổi khỏi các chất độc
bên ngoài Tuy nhiên, sự xâm nhập thường
xuyên của mầm bệnh có thể dẫn đến viêm mạn tính cùng với sự tăng sản xuất các gốc tự do oxy hóa cao Các tác nhân này sẽ ngăn chặn quá trình
tự gây chết tế bào, tăng cường phá hủy DNA và kích hoạt gen tiền ung thư dẫn đến ung thư phổi(13) PNB-001 không chỉ là tác nhân chống tăng sinh, mà còn là tác nhân kháng viêm hiệu quả có thể góp phần giải quyết các triệu chứng viêm của ung thư phổi(5)
Tóm lại, trong vòng 24 giờ, cả chất đối kháng CCK-B chọn lọc và đối kháng CCK không chọn lọc có tác dụng gây độc tế bào cao hơn so với chất đối kháng chọn lọc CCK-A trên dòng tế bào ung thư phổi C38
Thử nghiệm in vivo trên dòng tế bào ung thư
ruột kết MAC16
Kết quả của thí nghiệm này về tác động của chất đối kháng CCK-A chọn lọc (IB) trên dòng MAC16 không tương thích với các nghiên cứu trước đó Lattmann và cộng sự (2016) thực hiện thí nghiệm trên chuột ghép khối u MAC16 được điều trị bằng IB (Pyrolon 9) và cho thấy sự giảm đáng kể tốc độ tăng trưởng khối u trong giai đoạn 2-3 tuần so với nhóm chứng bệnh(10) Vì vậy, cần lặp lại thí nghiệm với IB và kéo dài thời gian ghi nhận kết quả trên chuột để có kết luận chính xác
Ngược lại, có sự tương thích về kết quả của thí nghiệm trên đối với chất đối kháng chọn lọc CCK-B (PNB-001) Gonza´lez-Puga và cộng sự (2005) cho thấy chất đối kháng CCK-B chọn lọc
Trang 6người; trong khi con số này là 75% đối với thụ
thể CCK-C(13) Cũng từ thí nghiệm này, chúng tôi
tìm thấy tác động ức chế sự tăng trưởng khối u
của của chất đối kháng không chọn lọc F-Bz cao
hơn so với PNB-001 và IB có lẽ đến từ tác động
ức chế của hợp chất này trên thụ thể CCK-C với
mức độ biểu hiện cao trên u đại tràng(14) và thụ
thể CCK-C có thể trở thành đích trị liệu mới cho
loại ung thư này
KẾT LUẬN
Kết quả thu được cho thấy các chất kháng
CCK-B và chất kháng CCK không chọn lọc gây
độc tế bào ung thư phổi C38 nhưng chỉ có chất
kháng CCK không chọn lọc có tác dụng ức chế
sự phát triển của khối u ruột kết MAC16 in vivo
Nghiên cứu góp phần phát triển các hợp chất
mới có tác dụng kháng khối u cũng như gợi ý
thêm các đích tác động mới trong nghiên cứu
phát triển các thuốc kháng ung thư
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Rehfeld JF (2004) Cholecystokinin Best Pract Res Clin
Endocrinol Metab 18(4):569-586
2 Lee HK, Lee HJ, Hur K, Lee HS, et al (2005) Growth effect
of gastrin on gastric cancer and its clinical implications for
gastric cancer surgery Oncol Rep, 14(2):383-388
3 Camby I, Salmon I, Danguy A, Pasteels JL, et al (1996)
Influence of gastrin on human astrocytic tumor cell
proliferation Journal of the National Cancer Institute
88(9):594-600
gastrin and CCK receptors in pancreatic cancer and other
malignancies Int J Biol Sci, 12(3):283-291
7 Socinski MA, Crowell R, Hensing TE, et al (2007) Treatment of non-small cell lung cancer, stage IV: ACCP evidence-based clinical practice guidelines (2 nd ed) Chest,
132(3S):277S-289S
8 Müerköster S, Isberner A, Arlt A,Witt M, Reimann B, et al (2005) Gastrin suppresses growth of CCK2 receptor
expressing colon cancer cells by inducing apoptosis in vitro and in vivo Gastroenterology, 129(3):952-968
9 Lattmann E, Russell ST, Schwalbe CH, Shortt A, et al (2016) Cholecystokinin-1 receptor antagonists:
5-hydroxy-5-aryl-pyrrol-2-ones as anticancer agents Med Chem Commun, 7(6):1138-1145
10 Reubi JC, Schaer JC, Waser B (1997) Cholecystokinin (CCK)-A and CCK-B gastrin receptors in human tumors
Cancer Research, 57(7):1377-1386
11 Bibby MC, Double JA, Ali SA, Fearon KC, et al (1987) Characterization of a transplantable adenocarcinoma of the
mouse colon producing cachexia in recipient animals J Natl Cancer Inst, 78(3):539-546
12 Moody TW, Jensen RT (2001) CI-988 inhibits growth of
small cell lung cancer cells J Pharmacol Exp Ther,
299(3):1154-1160
13 Azad N, Rojanasakul Y, Vallyathan V (2008) Inflammation
and lung cancer: roles of reactive oxygen/nitrogen species J Toxicol Environ Health B Crit Rev, 11(1):1-15
14 Imdahl A, Mantamadiotis T, Eggstein S, Farthmann EH, Baldwin GS (1995) Expression of gastrin, gastrin/CCK-B and gastrin/CCK-C receptors in human colorectal
carcinomas J Cancer Res Clin Oncol, 121(11):661-666
Ngày nhận bài báo: 15/05/2020 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/05/2020 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2020