NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO KHỐI U THỰC NGHIỆM  CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) VÀ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR.) MERR.)

MỞ ĐẦU Đã từ lâu, người ta biết được rằng, ung thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo, và sự di căn tế bào ung thư là nguyên nhân gây ra tử vong cho bệnh nhân. Thông thường, ung thư được điều trị bởi phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sau khi điều trị, các khối u vẫn tiếp tục phát triển và di căn do các tế bào ung thư không bị tiêu diệt hoàn toàn. Các tia phóng xạ và hầu hết các thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến các tế bào lành của cơ thể; chúng cũng thường gây ra những hậu quả nghiêm trọng như rụng tóc, ức chế sự hoạt động của tủy xương, gây nôn mửa... Vì thế, các loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư hữu hiệu vẫn đang được tìm kiếm. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u vẫn đang được sử dụng và cho kết quả điều trị tốt, chẳng hạn như các alkaloid từ cây dừa cạn, taxol từ cây thông đỏ, các alkaloid từ cây trinh nữ hoàng cung... Năm 2011, tác giả Marie Jensen và cộng sự cho biết trong những năm gần đây, các hợp chất dẫn xuất cardenolid và các hợp chất bán tổng hợp từ các dẫn xuất cardenolid được xem như là các “ứng cử viên” xuất sắc dùng để điều trị bệnh ung thư phổi. Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, luận án này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất cô lập được từ cây hà thủ ô trắng và cây tô mộc ; là hai cây thuốc đã được các nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản khảo sát sơ bộ, đã cho thấy là dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc đều có độc tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung… Nội dung chính của luận án bao gồm: - Cô lập các hợp chất tinh khiết từ rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được. - Thử nghiệm độc tính tế bào trên các hợp chất tinh khiết cô lập được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



BÙI XUÂN HÀO

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO KHỐI U THỰC NGHIỆM

Công trình được thực hiện tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP HCM

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp trường tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh

Vào hồi ……….giờ …….ngày ………tháng …… năm 2013

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM

DANH MỤC CÔNG TRÌNH

 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Bùi Xuân Hào, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Minh Đức, Trần

Lê Quan, Thành phần hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng, Tạp chí Phát triển KH  CN, Vol 12, No.10, 72-77 (2009)

2 Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần

hóa học cao etyl acetat của lõi gỗ cây tô mộc (Caesalpinia

sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.47 (4A), 343-346 (2009)

3 Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần

hóa học cao etyl acetat của lõi gỗ cây tô mộc (Caesalpinia

sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.48 (4B), 441-445 (2010)

4 Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần

hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.), Tạp chí Hóa học, T.49 (2ABC), 267-271 (2011)

5 Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần

hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng Tạp chí Phát triển KH  CN,

Vol 14, No.T2, 28-35(2011)

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, người ta biết được rằng, ung thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo, và sự di căn tế bào ung thư là nguyên nhân gây ra tử vong cho bệnh nhân Thông thường, ung thư được điều trị bởi phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sau khi điều trị, các khối u vẫn tiếp tục phát triển và di căn do các tế bào ung thư không bị tiêu diệt hoàn toàn Các tia phóng xạ và hầu hết các thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến các tế bào lành của cơ thể; chúng cũng thường gây ra những hậu quả nghiêm trọng như rụng tóc, ức chế sự hoạt

động của tủy xương, gây nôn mửa Vì thế, các loại thuốc hỗ trợ điều trị

ung thư hữu hiệu vẫn đang được tìm kiếm Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u vẫn đang được sử dụng và cho kết quả điều trị tốt, chẳng hạn như các alkaloid từ cây dừa cạn, taxol từ cây thông đỏ, các alkaloid từ cây trinh nữ hoàng cung Năm 2011, tác giả Marie Jensen và cộng sự cho biết trong những năm gần đây, các hợp chất dẫn xuất cardenolid và các hợp chất bán tổng hợp từ các dẫn xuất cardenolid được xem như là các “ứng cử viên” xuất sắc dùng để điều trị bệnh ung thư phổi

Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, luận án này giới thiệu một

số kết quả nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất cô lập được từ cây hà thủ ô trắng và cây tô mộc;

là hai cây thuốc đã được các nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản khảo sát

sơ bộ, đã cho thấy là dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc đều có độc tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung…

Nội dung chính của luận án bao gồm:

- Cô lập các hợp chất tinh khiết từ rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được

- Thử nghiệm độc tính tế bào trên các hợp chất tinh khiết cô lập được

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Trong phần cô lập các hợp chất cardenolid tinh khiết từ cao metanol của rễ cây hà thủ ô và cao etyl acetat của lõi gỗ thân cây tô mộc, chúng tôi đã đạt được các kết quả như sau:

Từ dịch chiết metanol của bột rễ thô cây hà thủ ô trắng, đã cô lập được 16 hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết, trong đó, có 3 hợp chất mới đã

được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 03 năm 2012 Các hợp chất mới là:

 14-Hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)-D-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid]

- 1,14-Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[(14)--D-digitalosid]

-D-glucopyranosyl- 5,14-Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[(16)--D-glucopyranosid]

-D-glucopyranosyl-Bốn hợp chất lần đầu tiên được cô lập từ dịch chiết metanol của bột rễ cây

hà thủ ô trắng là:

 Digitoxigenin 3-O--glucopyranosid

 Acovenosigenin A 3-O-β-D-glucopyranosid

 Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)--D-cymaropyranosid]

 Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)-

-D-2-O-acetyldigitalopyranosid]

Đã thử nghiệm sàng lọc sơ bộ độc tính tế bào của 20 hợp chất cô lập được, theo phương pháp SRB trên ba dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư vú MCF–7 Kết quả thử nghiệm sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, hầu hết các hợp chất cô lập được đều có độc tính tế bào đối với ba dòng ung thư trên Ngoài ra, với các hợp chất cô lập được có khối lượng đủ lớn, chúng tôi đã thử nghiệm độc tính tế bào của các chất này trên dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460 để tìm giá trị IC50 Các giá trị IC50 của các hợp chất cardenolid đều nhỏ cho thấy các hợp chất này có độc tính mạnh đối với dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460 Các thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất dẫn xuất cardenolid và homoisoflavonoid cô lập được trên ba dòng tế bào ung thư nói trên là các thử nghiệm mới, lần đầu tiên được thực hiện đối với các hợp chất này

BỐ CỤC LUẬN ÁN

Luận án gồm 155 trang với 4 chương, 68 tài liệu tham khảo, 1 trang danh mục công trình và phần phụ lục các phổ Trong đó, tổng quan 24 trang, thực nghiệm 15 trang, kết quả và thảo luận 101 trang, kết luận và kiến nghị

5 trang Ngoài ra, còn có phần mở đầu 1 trang

NỘI DUNG LUẬN ÁN

Chương 1 TỔNG QUAN

Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây Streptocaulon juventas (Lour.) Merr và cây Caesalpinia sappan Linn của các tác giả trong và ngoài nước

xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Mẫu cây được nhận danh bởi Tiến sĩ Hoàng Việt, Bộ môn Thực vật, khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Trong thực nghiệm, chúng tôi đã sử dụng các hóa chất tinh khiết thường được các nhà hóa thực vật dùng để chiết tách hợp chất thiên nhiên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Điều chế các loại cao

Đun hoàn lưu 8 kg bột thô rễ cây hà thủ ô trắng với metanol (30 lít, 3 giờ x

3 lần), lọc nóng và cô quay ở áp suất thấp, thu được 857 gam cao metanol ở dạng sệt Phần cao thô metanol tiếp tục được hòa tan bằng nước, sau đó chiết lỏng-lỏng với dung môi cloroform Dịch chiết được làm khan, cô quay dưới áp suất thấp, thu hồi dung môi thu được cao cloroform và cao nước

Đun hoàn lưu 2 kg bột thô lõi gỗ thân cây tô mộc với metanol (10 lít, 3 giờ

x 3 lần), lọc nóng và cô quay ở áp suất thấp, thu được 324 gam cao metanol

ở dạng sệt Phần cao thô metanol tiếp tục được hòa tan bằng nước sau đó chiết lỏng-lỏng với dung môi etyl acetat Dịch chiết được làm khan, cô quay dưới áp suất thấp, thu hồi dung môi thu được cao tương ứng

2.2.2 Trích ly, cô lập các hợp chất cardenolid và flavonoid

Việc trích ly và cô lập được thực hiện bằng sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường hoặc pha đảo RP-18, kết hợp với sắc ký bản mỏng Trong một

số trường hợp, khi các vết của chất có R f gần bằng nhau, các chất này được tách bằng kỹ thuật sắc ký điều chế khai triển nhiều lần

2.2.3 Xác định cấu trúc

Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng các phương pháp phổ nghiệm như 1

H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY, ROESY, LC-MS, ESI-MS và so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo

HR-2.2.4 Thử nghiệm độc tính tế bào

Việc xác định độc tính tế bào của hợp chất ở nồng độ 100 g/ml với dung môi hòa tan là DMSO trên các dòng tế bào ung thư người, đã được Viện ung thư Hoa Kỳ sử dụng cho chương trình sàng lọc của mình

Về nguyên tắc, thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một hợp chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học

Từ dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng, đã cô lập được mười sáu hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết Từ dịch chiết metanol của lõi gỗ thân cây tô mộc đã cô lập được năm hợp chất phenol tinh khiết và một hỗn

hợp gồm hai xuyên lập thể phân Trong phần này, chúng tôi chỉ trình bày tóm tắt những điểm mới của luận án

3.1.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất H9

Hợp chất H9 cô lập được là chất bột vô định hình không màu, tan hoàn

toàn trong metanol

Biện luận cấu trúc

Phổ LC-HRMS của H9 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 735,3569

[M+Na]+, phù hợp với công thức phân tử C36H56O14Na

Phổ 1

H-NMR của H9 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl

tại δH 1,00 (3H, s, H-18) và 1,21 (3H, s, H-19), hai proton carbinol cộng

hưởng tại δH 4,53 (1H, brps, H-3) và tại 3,87 (1H, brs, H-1); proton

metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,30 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) và 5,00 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin metin

cộng hưởng tại δH 6,12 (1H, brs, H-22), mũi triplet bầu của proton metin

cộng hưởng tại δH 2,77 (1H, brt, J 5,0 Hz; H-17) Trên phổ của H9 cho thấy

các tín hiệu đặc trưng của hai đơn vị đường là digitalose và glucose Tín hiệu đặc trưng của proton anomer trong đơn vị đường digitalose cộng hưởng tại δH 4,75 (1H, d J 8,0 Hz, H-1), proton metyl của đường này cộng hưởng dạng mũi đôi tại δH 1,58 (3H, d, J 6,5 Hz, H-6) và proton của nhóm metoxy cộng hưởng dạng mũi đơn tại δH 3,64 (3H, s, 3-OCH3) Tín hiệu cộng hưởng của proton anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại

δH 5,13 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′), hai proton metylen của đường này cộng

hưởng tại 4,53 (1H, m, H-6′) và 4,35 (1H, m, H-6′)

Phổ 13

C-NMR DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của

H9 gồm 36 carbon, trong đó có ba nhóm metyl, mười nhóm metylen, mười

bảy nhóm metin, một nhóm metoxy, tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 84,6 (C-14); một vòng γ-lacton bất bão hòa, gồm có tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC 117,7 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton tại δC 174,5 (C-23) Ngoài ra, phổ của H9 còn cho thấy các

tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường digitalose với carbon anomer cộng hưởng tại δC 101,3 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng tại δC 58,9 (3-OCH3), tín hiệu của nhóm metyl cộng hưởng tại δC 17,6 (C-6) Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC 105,4 (C-

1), nhóm metylen của đường này cộng hưởng tại δC 63,1 (C-6) Phổ

HMBC của H9 cho thấy proton tại δH 1,21 (3H, s, H-19) tương quan đến

tín hiệu carbon carbinol tại δC 72,1 (C-1), nên nhóm chức hydroxyl gắn tại C-1 Tương quan của proton H-2 với H-1 và H-3 trên phổ COSY cho thấy carbon metin gắn oxygen còn lại là C-3 Tương quan HMBC của proton tại

δH 1,00 (3H, s, H-18) đến carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 86,3 chứng minh

có sự hiện diện của nhóm OH tại C-14

Ngoài ra, phổ HMBC của H9 còn cho thấy tín hiệu proton anomer của

đường digitalose tại δH 4,75 (1H, d, 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại

δC 74,4 (C-3) nên carbon anomer của đường này gắn với oxygen tại C-3 Hằng số ghép 3

JHH của H-1 (J 8,0 Hz) cho thấy cấu hình β của proton

anomer Mặt khác, tín hiệu cộng hưởng tại H 4,33 (H-4) xuất hiện dạng

mũi đôi với hằng số ghép nhỏ, J 2,5 nên H-4 ở vị trí xích đạo, vậy oxygen gắn với C-4 ở vị trí trục Đơn vị đường còn lại của H9 được xác định là D-

glucose dựa vào độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu proton và carbon,

có so sánh với tài liệu tham khảo; trong đó tín hiệu proton tại H 5,13

(H-1) xuất hiện ở dạng mũi đôi có hằng số ghép J 8,0 Hz; tín hiệu tại H 4,23 (H-3) xuất hiện ở dạng triplet có hằng số ghép J 9,0 Hz, tín hiệu tại H

4,18 (H-4) xuất hiện với dạng mũi triplet có hằng số ghép J 9,0 Hz, cho

thấy các proton trong đơn vị đường thứ hai đều ở vị trí trục, phù hợp với cấu trúc của D-glucopyranose Phổ HMBC còn cho thấy tín hiệu proton anomer của đơn vị đường glucose tại H 5,13 (H-1) tương quan đến carbon tại δC 76,0 (C-4), đồng thời tín hiệu tại H 4,33 (brd, 2,5 Hz, H-4) tương quan đến carbon tại δC 105,4 (C-1) cho thấy C-1 của đơn vị đường này gắn với oxygen tại C-4 của đơn vị đường thứ nhất

Phổ COSY cho thấy tương quan 1

H-1H của chuỗi 6/H-7/H-8/H-9/H-11/H-12 và H-15/H-16/H-17 trong khung aglycon của

H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H-hợp chất H9, cũng như tương quan của các proton kế cận nhau trong hai

đơn vị đường Độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H9 là 19,1 (đo trong

pyridin-d 5 ) nên vòng A và B có cấu trạng cis, tín hiệu cộng hưởng proton

tại H-17 của H9 là 2,77 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Ngoài ra,

phổ 1

H-NMR của H9 cho thấy proton H-2 cộng hưởng dạng mũi đôi đôi

với hằng số ghép J 15,0; 2,5 Hz cho thấy proton H-1 và H-3 đều phải ở vị

trí xích đạo, vì vậy nhóm OH gắn tại C-1 và C-3 đều phải ở vị trí trục; mũi đơn bầu tại δH 4,53 (1H, brps, H-3) cũng chứng tỏ proton H-3 phải ở vị trí

xích đạo (cấu hình α); mũi đôi bầu tại δH 2,34 (1H, brd, 11,5 Hz, H-5) cho

thấy H-5 ở vị trí trục Như vậy, hóa học lập thể của hợp chất H9 được xác

định như sau:

Các phân tích phổ trên cho thấy H9 có cấu trúc phù hợp với hợp chất

1,14-dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)-D-digitalosid], có công thức phân tử C36H56O14 Đây là hợp chất mới đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 3 năm 2012 Hợp chất

-được đặt tên là acovenosigenin A 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)-digitalosid] Các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H9 được

3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất H12

Hợp chất H12 cô lập được từ phân đoạn III-4 (sơ đồ 2.1 trong luận án), là

chất bột vô định hình, không màu, tan hoàn toàn trong metanol

Biện luận cấu trúc

Khối phổ của H12 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 713,3389 [M-H]¯,

phù hợp với công thức phân tử C35H53O15

Phổ 1

H-NMR của H12 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl

tại δH 1,00 (3H, s, H-18) và 1,07 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng

tại δH 4,56 (1H, brps, H-3); proton metin cộng hưởng tại δH 2,80 (1H, m,

H-17); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,03 (1H,

d, J 18,0 Hz, H-21) và 5,29 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin

metin cộng hưởng tại δH 6,13 (1H, brs, H-22) Các tín hiệu cộng hưởng trên

phổ 1

H-NMR của H12 cho thấy tín hiệu hai proton anomer của hai đơn vị

đường glucose cộng hưởng tại δH 4,97 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1) và 5,12 (1H,

d, J 7,5 Hz, H-1); tín hiệu proton metylen của đơn vị đường thứ nhất cộng hưởng tại δH 4,33 (1H, m, H-6) và 4,84 (1H, d, J 11,0 Hz, H-6); của đơn vị

đường thứ hai cộng hưởng tại 4,34 (1H, m, H-6) và 4,51 (1H, dbr, J 11,0

Hz, H-6) Các đặc điểm về dữ liệu phổ như trên cho phép dự đoán H12 là

một glycosid có aglycon là periplogenin gắn với hai đơn vị đường glucose

Hằng số ghép J tại H-1 và H-1 lần lượt bằng 8,0 và 7,5 Hz cho thấy hai đơn vị đường đều có cấu hình -glucopyranose

Phổ 13

C-NMR DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của

H12 gồm 35 carbon, trong đó có hai nhóm metyl, mười hai nhóm metylen,

mười lăm nhóm metin, tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 84,7

Hình 3.18 Tương quan HMBC và H-H COSY quan trọng của H9

(C-14); một vòng γ-lacton bất bão hòa gồm có các tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC 117,6 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton tại

δC 174,6 (C-23) Ngoài ra, phổ của H12 còn cho thấy tín hiệu carbon anomer

của hai đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC 101,6 (C-1) và 105,3

Tín hiệu cộng hưởng proton và carbon của hai đơn vị đường và khung

aglycon của H12 được xác định chính xác nhờ vào tương quan 1

H-1H trong phổ COSY và 1

H-13C trong phổ HSQC, có so sánh với tài liệu tham khảo, cho thấy hoàn toàn phù hợp với khung periplogenin và hai đơn vị đường glucose.

Tương tác của các proton gần nhau trong không gian cho phép xác định cấu

trúc lập thể của H12 Phổ ROESY của H12 cho thấy tín hiệu tại δH 1,07

(3H, s, H-19) tương tác với tín hiệu tại 2,09 (1H, m, H-1); tín hiệu tại 1,54 (1H, m, H-9) tương tác với tín hiệu tại 2,02 (1H, m, H-2); tín hiệu tại 2,20 (1H, m, H-7) tương tác với tín hiệu tại 1,48 (1H, m, H-4) Các tương quan này xác nhận cấu trạng cis của vòng A và vòng B; phổ ROESY còn cho thấy tín hiệu tại 0,97 (1H, s, H-18) tương tác với tín hiệu tại 1,78 (1H, m,

Hình 3.24 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H12