kết hợp phương pháp pcr và reverse dot blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người

Kết quả nghiên cứu: Nhóm sinh viên chúng tôi đã khảo sát thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ nhạy của 2 bộ mồi chung universal primer và 12 mẫu dò chuyên biệt nhằm phát hiện 12 loài vi khu

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CON NGƯỜI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CON NGƯỜI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA Nam, Nữ:

Lớp, khoa: SH10A3 – Khoa công nghệ sinh học

Ngành học: Công nghệ sinh học vi sinh – sinh học phân tử

Người hướng dẫn: ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4/2014

MỤC LỤC

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI v

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ix

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ x

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

I.1 SƠ LƯỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP 3

I.1.1 Bacillus cereus 3

I.1.1.1 Đặc điểm hình thái 3

I.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 3

I.1.1.3 Thông tin bộ gen 3

I.1.2 Brucella spp 3

I.1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

I.1.2.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 4

I.1.2.3 Thông tin bộ gen 4

I.1.3 Clostridium botulinum 4

I.1.3.1 Đặc điểm hình thái 4

I.1.3.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 4

I.1.3.3 Thông tin bộ gen 5

I.1.4 Clostridium perfringens 5

I.1.4.1 Đặc điểm hình thái 5

I.1.4.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 5

I.1.4.3 Thông tin bộ gen 6

I.1.5 Escherichia coli 6

I.1.5.1 Đặc điểm hình thái 6

I.1.5.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 6

I.1.5.3 Thông tin bộ gen 7

I.1.5.4 Phân loại 7

I.1.6 Listeria monocytogenes 8

I.1.6.1 Đặc điểm hình thái 8

I.1.6.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 8

I.1.6.3 Thông tin bộ gen 8

I.1.7 Staphylococcus aureus 9

I.1.7.1 Đặc điểm hình thái 9

I.1.7.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 9

I.1.7.3 Thông tin bộ gen 10

I.1.8 Salmonella spp 10

I.1.8.1 Đặc điểm hình thái 10

I.1.8.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 10

I.1.8.3 Thông tin bộ gen 11

I.1.9 Shigella spp 11

I.1.9.1 Đặc điểm hình thái 11

I.1.9.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 11

I.1.9.3 Thông tin bộ gen 12

I.1.10 Vibrio cholerae 12

I.1.10.1 Đặc điểm hình thái 12

I.1.10.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 12

I.1.10.3 Thông tin bộ gen 13

I.1.11 Vibrio parahaemolyticus 13

I.1.11.1 Đặc điểm hình thái 13

I.1.11.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 13

I.1.11.3 Thông tin bộ gen 14

I.1.12 Yersinia enterocolitica 14

I.1.12.1 Đặc điểm hình thái 14

I.1.12.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng 14

I.1.12.3 Thông tin bộ gen 15

I.2 THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA 15

I.2.1 Gen 16S rDNA 15

I.2.2 Gen 23S rDNA 16

I.3 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CON NGƯỜI

17

I.3.1 Kỹ thuật định danh truyền thống [27] 17

I.3.2 Kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại 19

I.3.2.1 Kỹ thuật PCR[2][14] 19

I.3.2.2 Multiplex PCR[14] 24

I.3.2.3 Phương pháp microarray [66][61] [14] 24

I.3.2.4 Phương pháp Reverse dot blot [14] 25

I.4 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NHANH CHÓNG VÀ ĐỒNG THỜI TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY BỆNH 26

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

II.1 VẬT LIỆU 29

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

II.2.1 Thu thập dữ liệu và khảo sát in silico 29

II.2.2 Thu thập dữ liệu 29

II.2.3 Khảo sát in silico 29

II.2.3.1 Thu thập tr nh tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA 29

II.2.3.2 Thu thập các cặp mồi 29

II.2.3.3 Phương pháp khảo sát các cặp mồi, thiết kế mồi 30

II.2.4 Khảo sát thực nghiệm 30

II.2.4.1 Tách chiết DNA 30

II.2.4.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo quang phổ 31

II.2.4.3 Phản ứng PCR: 32

II.2.4.4 Phương pháp điện di: 33

II.2.4.5 Phương pháp lai RDB 34

II.2.4.6 Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR-RDB 34

II.2.4.7 Khảo sát khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh cùng lúc 35

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

III.1 Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico 36

III.1.1 Thu thập dữ liệu 36

III.1.2 Kết quả khảo sát in silico 37

III.1.2.1 Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò 37

III.1.2.2 Khảo sát hệ cặp mồi 39

III.1.2.3 Khảo sát bộ mẫu dò 47

III.2 Kết quả thực nghiệm 69

III.2.1 Tách chiết DNA 69

III.2.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 16S rDNA 71

III.2.3 Kết quả khuếch đại của cặp mồi 16S_F – 16S_R trên các chủng vi khuẩn

đối chứng 72

III.2.4 Kết quả lai RDB trên các chủng vi khuẩn đối chứng 73

III.2.5 Kết quả thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm 75

III.2.6 Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR-RDB 77

III.2.7 Kết quả phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh 78

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80

IV.1 KẾT LUẬN 80

IV.2 ĐỀ NGHỊ 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHỤ LỤC 91

1 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: “ Kết hợp phương pháp PCR và Reverse Dot Blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu

- Sinh viên thực hiện 1 (Nhóm trưởng): NGUYỄN TRỌNG NGHĨA

- Sinh viên thực hiện 2: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

- Sinh viên thực hiện 3: NGUYỄN HOÀNG ANH TUẤN

- Sinh viên thực hiện 4: VÕ THẮNG THƯỞNG

- Sinh viên thực hiện 5: LÊ THỊ TỐ QUYÊN

- Người hướng dẫn: ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

2 Mục tiêu đề tài:

Xây dựng quy trình phát hiện 12 tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng kỹ thuật PCR kết hợp lai phân tử (Reverse dot blot) sử dụng vùng trình tự 16 -23S rDNA, nhằm t m ra phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác các tác nhân vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong các mẫu bệnh phẩm

3 Tính mới và sáng tạo:

Chúng tôi kết hợp phương pháp PCR và lai ngược dòng (PCR-Reverse Dot Blot) để phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột Cho đến nay có rất ít các công bố khoa học trong nước ứng dụng những kỹ thuật này trong việc phát hiện

các tác nhân vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung, nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột nói riêng Phương pháp mới này khắc phục những hạn chế của những phương pháp phân tích truyền thống (tiêu tốn thời gian, độ chính xác, khó phát hiện đồng thời trong cùng một thời gian, ).

4 Kết quả nghiên cứu:

Nhóm sinh viên chúng tôi đã khảo sát thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ nhạy của

2 bộ mồi chung (universal primer) và 12 mẫu dò chuyên biệt nhằm phát hiện 12 loài

vi khuẩn gây bệnh đường ruột Đồng thời nhóm sinh viên đã đạt được một số kết quả đáng ghi nhận:

− Thực hiện phản ứng PCR – RDB trên các mẫu DNA của vi khuẩn đối chứng

Chúng tôi đã thực hiện thành công trên 7 chủng vi khuẩn đối chứng: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica

− Áp dụng quy trình PCR – RDB trên 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu đã được xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm bằng phương pháp vi sinh thường quy ở bệnh viện) Chúng tôi ghi nhận 6/15 mẫu được phát hiện nhiễm chủng vi

khuẩn Staphylococcus aureus, kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả xét

nghiệm truyền thống

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

− Đề tài nghiên cứu đã hoàn thiện việc xây dựng quy trình phát hiện nhanh, nhạy

và xác định chính xác các vi khuẩn gây bệnh đường ruột Đề tài có ý nghĩa trong công tác xét nghiệm, kiểm nghiệm các bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi khuẩn gây nên cũng như trong công tác phòng chống ngộ độc thực phẩm

− Áp dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm trong thực tế, ghi nhận tính đặc hiệu, độ nhạy và độ chính xác của quy trình PCR-Reverse dot blot với 2 bộ mồi và 12 mẫu dò chuyên biệt của 12 vi khuẩn gây bệnh đường ruột

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài:

2013 Kết thúc giai đoạn này, các sinh viên đã thực hiện việc xác định thông số vật lý,

độ đặc hiệu, độ nhạy của 2 bộ mồi chung (universal primer) và 12 mẫu dò chuyên biệt nhằm phát hiện 12 loài vi khuẩn gây bệnh đường ruột Đồng thời nhóm sinh viên đã đạt được một số kết quả đáng ghi nhận:

- Xác định tính đặc hiệu của 2 bộ mồi và 12 mẫu dò trên 7 chủng vi khuẩn:

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica

- Xác định độ nhạy của quy trình PCR-Reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm

− Áp dụng thành công quy trình PCR-Reverse dot blot trên 15 mẫu bệnh phẩm (chai cấy máu) thu thập được tại thành phố Hồ Chí Minh Nhóm sinh viên thực hiện quy trình PCR – RDB trên 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu) đã được xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm bằng phương pháp vi sinh thường quy ở bệnh viện Kết quả ghi nhận 6/15 mẫu được phát hiện nhiễm chủng vi

khuẩn Staphylococcus aureus, kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả xét

nghiệm truyền thống

Ngày 07 tháng 4 năm 2014

ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

1 THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC

HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA

Sinh ngày: 26 tháng 12 năm 1992

Nơi sinh: Xã Mỹ Cát, Huyện Phù Mỹ, Tỉnh B nh Định

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ: 40/1 Đường Số 7 Khu phố 4, Phường Linh Xuân, Quận Thủ Đức, TP HCM

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

Năm thứ 1:

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lược thành tích:

* Năm thứ 2:

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lược thành tích:

Năm thứ 3:

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

1 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Bảng I.1 Bảng thử nghiệm sinh hóa phân biệt nhóm vi khuẩn gây bệnh đường

ruột[27] 19

Bảng II.1 – Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S F – 16S_R 32

Bảng II.2 – Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S F – 16S_R 32

Bảng II.3 – Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi S F – 23S_R 33

Bảng II.4 – Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi S F – 23S_R 33

Bảng III.1 – Các vùng gen sử dụng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh 36

Bảng III.2 – Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong xác định nhanh các vi khuẩn gây bệnh 37

Bảng III 3 – Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng III.4 – Bảng thống kê các mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu mẫu dò 39

Bảng III.5 – Bảng thông số vật lí của mồi dựa vào phân tích IDT 46

Bảng III.6 – Bảng chỉ số OD của 7 mẫu DNA tách chiết từ vi khuẩn đối chứng sử dụng trong nghiên cứu 70

Bảng III.7 – Bảng chỉ số OD của 20 mẫu DNA tách chiết sử dụng trong nghiên cứu 70

Bảng III.8 – Vị trí chấm mẫu dò trên màng lai 73

1 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình I.1 – Hình thái tế bào Bacillus cereus 3

Hình I.2 – Hình thái tế bào Brucella 4

Hình I.3 – Hình thái tế bào C botulinum 4

Hình I.4 – Hình thái tế bào C perfringenes 5

Hình I.5 – Hình thái tế bào E.coli 6

Hình I.6 – Hình thái tế bào L monocytogenes 8

Hình I.7 Hình thái tế bào Staphylococcus aureus 9

Hình I.8 Hình thái tế bào Salmonella 10

Hình I.9 Hình thái tế bào Shigella 11

Hình I.10 Hình thái tế bào Vibrio cholera 12

Hình I.11 Hình thái tế bào V parahaelyticus 13

Hình I.12 Hình thái tế bào Y enterocolitica 14

Hình II.1 Các bước trong một chu kỳ PCR 2

Hình II.2 Minh họa phương pháp RDB 26

Hình III.1 – Kết quả Blast mồi 16S_F 41

Hình III.2 – Kết quả Blast mồi 16S_R 42

Hình III.3 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của cặp mồi 16S_F – 16S_R bằng công cụ Annhyb 43

Hình III.4 – Kết quả Blast mồi 23S_R 44

Hình III.5 – Kết quả Blast mồi 23S_R 44

Hình III.6 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của cặp mồi 16S_F – 16S_R bằng công cụ Annhyb 46

Hình III.7 – Kết quả Blast mẫu dò BAC 47

Hình III.8 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò BAC bằng công cụ Annhyb 48

Hình III.9 – Kết quả Blast mẫu dò BRU 49

Hình III.10 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò BAC bằng công cụ Annhyb 50

Hình III.11 – Kết quả Blast mẫu dò CBO 51

Hình III.12 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CBO bằng công cụ Annhyb 52 Hình III.13 – Kết quả Blast mẫu dò CPF 53 Hình III.14 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CPF bằng công cụ Annhyb 54 Hình III.15 – Kết quả Blast mẫu dò LIS 55 Hình III.16 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò LIS bằng công cụ Annhyb 56 Hình III.17 – Kết quả Blast mẫu dò SAL 57 Hình III.18 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ Annhyb 57 Hình III.19 – Kết quả Blast mẫu dò SHI 58 Hình III.20 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng công cụ Annhyb 59 Hình III.21 – Kết quả Blast mẫu dò SAU 60 Hình III.22 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng công cụ Annhyb 61 Hình III.23 – Kết quả Blast mẫu dò VPA 62 Hình III.24 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VPA bằng công cụ Annhyb 63 Hình III.25 – Kết quả Blast mẫu dò VCH 64 Hình III.26 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VCH bằng công cụ Annhyb 65 Hình III.27 – Kết quả Blast mẫu dò YER 66 Hình III.28 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò YER bằng công cụ Annhyb 67 Hình III.29 – Kết quả Blast mẫu dò ECO 68 Hình III.30 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò ECO bằng công cụ Annhyb 69 Hình III.31 – Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi 16S_F – 16S_R 71 Hình III.32 – Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu vi khuẩn đại diện 72

Hình III.33 – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Staphylococcus aureus 74 Hình III.34 – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Bacillus cereus và Shigella spp 74 Hình III.35 – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Vibrio parahaemoliticus và

Staphylococcus aureus 78

Hình III.40 – Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu hỗn hợp 4 loài vi khuẩn khác nhau 79 Hình III.41 Kết quả lai RDB trên mẫu hỗn hợp 4 loài vi khuẩn khác nhau 79

rRNA ribosomal Ribonucleic Acid

gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho sức khỏe con người với các loại bệnh: tiêu chảy, nhiễm trùng đường ruột, nhiễm trùng huyết, rối loạn thần kinh, viêm màng não, Hiện nay, tại các phòng xét nghiệm tại các bệnh viện ở Việt Nam, phương pháp truyền thống được sử dụng rất phổ biến như “tiêu chuẩn vàng” với ưu điểm là dễ thực hiện và chi phí thấp, tuy nhiên còn nhiều hạn chế như tốn nhiều thời gian thực hiện, độ chính xác chưa cao do dễ bị ngoại nhiễm trong quá trình nuôi cấy, gây khó khăn cho việc điều trị Vì vậy, việc phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng là điều cần thiết, giúp hạn chế được sự lây lan của chúng và hỗ trợ đắc lực cho các bác sĩ t m

ra hướng điều trị đúng đắn cho bệnh nhân Hiện nay, nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng đã được đưa vào sử dụng như PCR - điện di, Real time PCR, Multiplex PCR, PCR kết hợp giải trình tự… nhưng phương pháp PCR kết hợp lai Reverse Dot Blot (PCR - RDB) đã cho thấy những ưu điểm vượt trội

về thời gian, sự chính xác và phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cùng lúc (Fiss et al; 1992, Xing et al; 2009), điều này giúp các bác sĩ có phương pháp điều trị đúng đắn và kịp thời cho bệnh nhân, do đó làm giảm đáng kể chi phí điều trị cho bệnh nhân

Vì vậy, sự tìm hiểu và thiết lập quy trình phát hiện đồng thời 12 chủng vi khuẩn

gây bệnh đường ruột: Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella spp là cấp thiết Dựa trên những kết quả đạt được

của nhóm nghiên cứu “Xác định nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng phương

pháp PCR – Reverse Dot Blot”, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học: “ Kết

hợp phương pháp PCR và Reverse dot blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người” nhằm tiếp tục triển khai

việc ứng dụng kỹ thuật PCR – Reverse dot blot nhằm phát hiện đồng thời 12 chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột nêu trên với ưu điểm: khắc phục được những khuyết điểm của phương pháp truyền thống, rút ngắn thời gian phân tích, độ nhạy và độ chính xác cao

Nội dung thực hiện:

 Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên, chúng tôi kế thừa và đánh giá lại hệ mồi và mẫu dò dựa trên vùng gen mục tiêu 16S - 23S rDNA từ nhóm nghiên cứu “Xác định nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng phương pháp PCR-RDB” (Trần Thị Phúc) đã thiết kế nhằm chọn ra bộ mồi và mẫu dò để phát hiện cùng lúc nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng Nhóm tác nhân gây bệnh gồm:

Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella

spp.,

 Xác định độ nhạy của quy trình PCR – RDB thông qua khảo sát ngưỡng mật

độ tối thiểu của tế bào vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm

 Thực hiện phản ứng PCR kết hợp phương pháp lai Reverse Dot Blot RDB) phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng trên những mẫu bệnh phẩm như mẫu máu, mẫu phân…

(PCR-PHẦN I TỔNG QUAN

I.1 SƠ LƯỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP

I.1.1 Bacillus cereus

I.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Bacillus cereus thuộc họ Bacillaceae, là trực

khuẩn Gram dương (+), tế bào hình que, có khả năng

di động, xếp thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn, không

có vỏ và có khả năng h nh thành nha bào Đây là vi

khuẩn hiếu khí tùy nghi.[15]

I.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh

dưỡng

Bacillus cereus phát triển được trong khoảng nhiêt độ 4oC – 50oC và pH trong khoảng 4,9 – 9,3, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu trong khoảng 25oC – 37oC, pH 7 – 7,2 Ngoài ra vi khuẩn còn có thể sống trong môi trường có nồng độ muối NaCl 7.5%

Bacillus cereus có đặc điểm sinh hóa: catalase dương tính (+), ci01trate dương

tính (+) VP dương tính (+), …

Vi khuẩn sinh ra 4 loại hemolysin: Hemolysin I (cereolysin – O; CLO), Hemolysin II, Hemolysin III, Hemolysin IV Trong đó có 1 độc tố gây nôn (Emetic toxin) là Cereulide và 3 loại độc tố ruột (Diarrhoed toxin): Hemolysin BL (HBL1và HBL2), Nonhemolytic enterotoxin (NheA, NheB, và NheC), Cyto-toxin K (CytK)

Vi khuẩn B cereus thường nhiễm vào loại thực phẩm có nguồn gốc ngũ cốc và

sản phẩm của chúng như cơm, sữa trứng, nước xốt, súp, xôi, kem bánh,…được bảo quản ở nhiệt độ thường

Hossein Sanael – Zadeh (2012), đã phát hiện trong mì Ý có chứa Bacillus cereus

gây ngộ độc cho người

I.1.1.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Bacillus cereus có kích thước khoảng 5,55 Mb trong đó tỉ lệ %GC

khoảng 35,5%, vùng 16S rRNA có kích thước khoảng 1451bp và vùng 23S rRNA

khoảng 2906bp (Bacillus cereus ATCC 14579 ASM782v1)

I.1.2 Brucella spp

I.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình I.1 – Hình thái tế bào Bacillus cereus [77]

Brucella spp thuộc họ α-proteobacteria, thuộc

nhóm vi khuẩn Gram âm, có kích thước từ 0,5 – 1,7

µm, tế bào hình bầu dục, không di động [30][12]

I.1.2.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

Brucella spp là nhóm vi khuẩn hiếu khí,

chúng có khả năng sử dụng một số nguồn

carbohydrate như glucose, galactose… nhưng không sinh ra acid, chúng có khả năng tạo ra các enzyme như catalase, oxidase, urea….[29]

Brucella spp thường được tìm thấy ở một số loài gia súc như lợn, bò, cừu… Khi

xâm nhập vào cơ thể người chúng thường tồn tại trong máu và theo hệ tuần hoàn đi khắp cơ thể và làm ảnh hưởng đến quá trình thực bào của cơ thể.[30] [12]

I.1.2.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Brucella spp có kích thước khoảng 3,28 Mb, tỉ lệ GC% chiếm tỷ lệ

khoảng 57,2%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1485bp và 23S rRNA khoảng 2911bp

(Brucella melitensis bv 1 str 16M.)

I.1.3 Clostridium botulinum

I.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Clostridum botulinum là vi khuẩn Gram

dương, hình que, có khả năng di động và có nha

bào Chúng thuộc nhóm vi khuẩn kị khí bắt buột

[12]

I.1.3.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

C botulinum tạo khóm khuẩn lạc màu đen trên môi trường ISA và SFP ở nhiệt

độ 37oC trong điều kiện kỵ khí [12]

Nhiệt độ phát triển thuận lợi nhất là 26-28oC [12] Nha bào có nhiều trong đất và

có sức đề kháng cao trên 100oC, nha bào bị diệt khi xử lý nhiệt ở 120oC/10 phút

Vi khuẩn Clostridium botulinum có đặc điểm sinh hóa: H2S dương tính (+), gelatinase dương tính (+), có khả năng lên men lactose, mantose,… [12]

Clostridium botulinum sinh độc tố gây ngộ độc: độc tố thần kinh botulinum

neurotoxin (BoNT) được phân loại thành các serotypes: A, B, C, D, E, F, G [23]

Hình I.3 – Hình thái tế bào C

botulinum[79]

Hình I.2 – Hình thái tế bào Brucella[78]

Trong đó, độc tố A thường thấy ở châu Mỹ; độc tố B thường thấy ở châu Âu và độc tố

E thường thấy ở Nhật Bản [46] Bên cạnh đó, vi khuẩn còn chứa độc tố đường ruột C2

và C3

Đồ hộp, thịt, cá, rau quả có nồng độ acid thấp để lâu, một số thức ăn bằng thịt chế

biến, ăn nguội như dăm bông, xúc xích… dễ bị nhiễm C botulinum [46]

Henrique Lecour và cộng sự (1988), đã t m thấy trong thịt xông khói, xúc xích

loài vi khuẩn Clostridium botulinum gây ngộ độc thực phẩm ở người

I.1.3.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của C botulinum (Clostridium botulinum A str ATCC 3502) có kích

thước khoảng 3,9Mb trong đó tỉ lệ % GC khoảng 28.2%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1524bp và 23S rRNA khoảng 2905bp

I.1.4 Clostridium perfringens

I.1.4.1 Đặc điểm hình thái

Clostridium perfringens là trực khuẩn Gram

dương, sống kỵ khí, có nha bào [12]

I.1.4.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

C perfringens phát triển thành các khuẩn lạc

có màu đen các trên môi trường

Sulfite-Polymyxin-Sulfadiazine,

Tryptose-Sulfite-Neomycin, Shahidi-Ferguson

Perfringens, Tryptose-sulfite- cycloserine agar (TSC) [12]

Vi khuẩn Clostridium perfringens có nhiệt độ tăng trưởng trong khoảng 33oC –

49oC, pH thích hợp khoảng 5 – 9 Vi khuẩn còn sinh trưởng được trong môi trường muối NaCl 4-6%

Clostridium perfringens có khả năng phân giải nitrat, gelatin, có khả năng lên

men lactose, …[12]

Clostridium perfringens sinh ra 6 serotypes: A, B, C, D, E ,F trong đó serotype A

và F là độc tố chủ yếu gây ra ngộ độc thực phẩm [39]

C perfringens phân bố rộng rãi trong đất, nước, phân người và động vật, sống ký

sinh trong ruột non động vật [12] Clostridium perfringens ưu nhiệt độ trung bình, Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất là 37 - 45oC Nha bào thường thấy nhiều ở các thực

Hình I.4 – Hình thái tế bào C perfringenes[80]

phẩm tươi sống và có sức đề kháng cao với nhiệt độ, trong quá trình bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thường hoặc trong hâm nóng thực phẩm có thể không diệt được các nha bào [40]

I.1.4.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của C perfringens có kích thước khoảng 3,26 Mb trong đó tỉ lệ % GC khoảng 28.4% (Clostridium perfringens ATCC 13124), vùng gen 16S rRNA khoảng

1522bp và 23S rRNA khoảng 2909bp

I.1.5 Escherichia coli

I.1.5.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ

Enterobateriaceae, E.coli là trực khuẩn ngắn từ

2-3µm, Gram âm, không tạo bào tử, có khả năng di

động nhờ tiên mao ở xung quanh.[12]

I.1.5.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

E.coli có khả năng sinh trưởng trong khoảng 5- 40oC và tối ưu ở 37oC pH trong khoảng 5,5 – 8 và thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 [12]

Chúng thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men sinh hơi một số loại đường như glucose, lactose, xylose…

 Lên men các đường glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose, manit kèm theo sinh hơi Không lên men đường adonit và inozit

 Thử nghiệm IMViC dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột

khác [12], gồm có các phản ứng:

o Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+)

o Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ metyl (+)

o Phản ứng Voges Proskauer (V): E.coli có phản ứng Voges Proskauer (-)

o Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (C): E.coli cho phản ứng

citrat âm tính

 Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm

 E.coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ

Trẩn Thị Hương và công sự (2012), đã phát hiện trong thịt (lợn, bò, gà) ở một số

huyện ngoại thành Hà Nội có chứa vi khuẩn E coli ( bao gồm E.coli O157: H7), gây

Hình I.5 – Hình thái tế bào E.coli[81]

ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy [9] Ngoài ra vi khuẩn này còn được tìm thấy trong mẫu phân của trâu bò,…

I.1.5.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Escherichia coli có kích thước khoảng 5,59 Mb, tỉ lệ %GC chiếm

khoảng 50,4%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1542bp, mã hóa cho 7 locus khác nhau: rrsA, rrsB, rrsC, rrsD, rrsE, rrsG, rrsH và 23S rRNA khoảng 2903bp

I.1.5.4 Phân loại

Vi khuẩn E coli được chia làm các serotype khác nhau dựa trên cấu trúc kháng

nguyên thân O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên bám dính F Bằng phản ứng ngưng kết các nhà khoa học đã t m ra được 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F [61]

Những chủng E.coli gây bệnh được xếp vào những nhóm sau: [60]

- EPEC ( enteropathogenic E.coli ) nhóm này có vùng đảo “pathogenicity” locus for enterocyte effacement (LEE) mang nhiều yếu tố độc lực, và có vùng gen eae (attaching and effacing, A/E) và tir (translocated intimin receptor) mã hóa cho intimin

và thụ thể intimin giúp cho sự bám dính lên niêm mạc ruột

- ETEC ( enterotoxigenic E.coli ) để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính

lên trên các tế bào biểu mô của ruột non Hầu hết các chủng ETEC đều có mang 1 hoặc nhiều yếu tố bám dính như : F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F17, F18, F41, F42, F165 và chúng tiết 2 loại độc tố LT (heat labile) và ST (heat stable) Những dòng này tiết ra 1 hoặc 2 loại độc tố tùy thuộc vào plasmid của chúng

- EIEC (enteroinvasive E.coli) gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào

niêm mạc đại tràng Khả năng xâm nhập được mã hòa bởi gen trên plasmid 140 MDa Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpA ( invasion

plasmid antigen) đến IpD) EIEC còn có khả năng xuất độc tố ruột giống Shigella được mã hóa bởi gen sen

- VTEC (verotoxigenic E.coli) sản xuất độc tố Shiaga-like toxin (Slt), còn gọi là

Shiga toxin hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stl gồm 2 nhóm chính là Stx1 và Stx2 một

dòng có thể có 1 hoặc 2 loại hoặc cả 2 Ngoài ra còn có gen eae và tir Trong nhóm

này serotype O157:H7 chiếm khoảng 75% các trường hợp gây bệnh từ VTEC trên toàn thế giới

I.1.6 Listeria monocytogenes

I.1.6.1 Đặc điểm hình thái

Listeria monocytogenes là trực khuẩn

Gram dương, h nh que, không tạo bào tử

Chiều dài 1-2 µm và có thể tồn tại dạng đơn

hoặc đôi, cũng có trường hợp ở dạng chuỗi

dài Là vi khẩn có khả năng phát triển trong tế

bào [12]

I.1.6.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

L monocytogenes phát triển ở khoảng nhiệt độ rộng 1oC-45oC, tốt nhất là quanh 45oC và ở pH 6-8, do đó nó có thể tồn tại thời gian dài trong thực phẩm Đa số các nhóm vi khuẩn khác có thể phát triển chậm ở nhiệt độ xuống thấp dưới 4oC, tuy

nhiên L monocytogenes là vi khuẩn ưa lạnh, vẫn có thể tồn tại ở nhiệt độ dưới -7oC và vẫn phát triển tốt từ -18oC đến 10o

C, sống được ở nhiệt độ trong tủ lạnh [12]

Listeria monocytogenes có đặc điểm sinh hóa: catalase dương tính (+), oxidase

âm tính (-), urease âm tính (-), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trên môi

trường thạch máu, có phản ứng CAMP (+) với S aureus và (-) với Rhodococcus equi

[12]

Listeria monocytgenes có kháng nguyên O (O-antigenic) và kháng nguyên H, 2

loại kháng nguyên này là căn cứ để chia vi khuẩn thành 13 chủng huyết thanh (serotypes) khác nhau: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4ab, và 7 Trong

đó 98% trường hợp gây bệnh cho người là serotype 1a, 1b và 4b Trong ba nhóm vừa

kể, th 4b là serotype độc hại nhất Vi khuẩn tiết ra nội độc tố gây hoại tử.[21]

Chính vì khả năng sống được ở môi trường khắc nghiệt nên vi khuẩn này có mặt khắp nơi: trong đất, nước, thảm thực vật, nước thải công nghiệp, trong các động

vật hoang dã, phân súc vật và cả phân người L monocytogenes thường hiện diện

trong phô mai, sữa, thịt, cá, rau quả, nước và các loại thức ăn gia súc

Nguyễn Minh Trực và cộng sự (2008), đã phát hiện Listeria monocytgenes

trong mẫu thực phẩm như thịt, sữa tại nhà máy hoặc cửa hàng ở Hà Nội [5]

I.1.6.3 Thông tin bộ gen

Hình I.6 – Hình thái tế bào L

monocytogenes[82]

Bộ gen có kích thước khoảng 2.9 Mb, tỉ lệ % GC là 38%, vùng 16S rRNA có

khích thước khoảng 1500bp và 23S rRNA khoảng 2900 bp (Listeria monocytogenes

EGD-e)

I.1.7 Staphylococcus aureus

I.1.7.1 Đặc điểm hình thái

Staphylococcus aureus thuộc nhóm vi

khuẩn Gram dương, h nh cầu, xếp đôi hoặc đám

nhỏ như chùm nho, không có khả năng di động,

sống trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi

[12]

I.1.7.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

Trên môi trường BP (Baird Parker) khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu

đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5

mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) [12].Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 7oC-48oC (thích hợp nhất là

Staphylococcus aureus có độc tố ruột Enterotoxin trong thực phẩm và gây hội

chứng shock độc tố do chúng tạo ra siêu kháng nguyên trong máu.[42]

Độc tố Enterotoxin của Staphylococcus aureus được gọi là Staphylococcal

enterotoxins (SEs) Bao gồm: SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ, được tổng hợp ở nhệt độ trên 15oC, đặc biệt tổng hợp nhiều khi vi khuẩn tăng trưởng ở 35-

37oC và TSST-1 (Toxic shock syndrom toxin) được tiết ra gây hội chứng sốc nhiễm độc tụ cầu (TSS) [76]

Hình I.7 Hình thái tế bào

Staphylococcus aureus[83]

Amit Kumar và cộng sự (2011), đã t m thấy Staphylococcus aureus trong thực phẩm

ở chợ Solan ở Ấn Độ, gây bệnh ở người.[10]

I.1.7.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Staphylococcus aureus có kích thước khoảng 2,84 Mb trong đó tỉ lệ

% GC khoảng 32,8%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1555bp và 23S rRNA khoảng

2923bp (Staphylococcus aureus subsp aureus NCTC 8325)

I.1.8 Salmonella spp

I.1.8.1 Đặc điểm hình thái

Salmonella ssp là trực khuẩn Gram âm,

kích thước từ 2-3µm, di động nhờ tiêm mao trừ S

gallimarum và S pullorum, sống kỵ khí tùy ý,

không tạo bào tử chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 6

– 42 oC, thích hợp nhất ở 37oC pH thích hợp từ 6 –

9 và tối ưu ở 7,2 [12]

I.1.8.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

Salmonella spp phát triển tốt ở nhiệt độ khoảng 6-42oC, pH trong khoảng 6 – 9, nhưng tối ưu nhất là ở 37oC, và pH 7,2

Salmonella spp có đặc điểm sinh hóa: nitrate dương tính (+), urease âm tính (-),

indol âm tính (-), VP âm tính (-), có khả năng thủy phân maltose, lactose, glucose, … Theo hệ thống của Kauffman White, dựa trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên

tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi, Salmonella spp được chia ra khoảng 2463 kiểu huyết thanh (serotypes) Ngoài ra giống Salmonella spp được chia làm hai loài:

S enterica và S bongori Trong đó S bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S enterica được chia làm 6 loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI Salmonella spp có thể tạo ra hai loại độc tố: Enterotoxin và

Cytoxin

Bệnh thương hàn do S typhi và S paratyphi А, B, C gây ra Bệnh viêm dạ dày ruột do các loài: S typhimurium; S enteritidis; S anatum; S budapest gây ra [12]

Trần Ngọc Bích (2012), đã nghiên cứu và thấy rằng Salmonella spp được tìm

thấy trong mẫu thịt, mẫu trứng, mẫu phân của vịt, vịt xiêm, ngỗng ,vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm ở tỉnh Hậu Giang, Việt Nam [8]

Hình I.8 Hình thái tế bào Salmonella[84]

I.1.8.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Salmonella spp có kích thước khoảng 4,59 Mb trong đó tỉ lệ % GC khoảng 52,2 (Salmonella enterica subsp enterica serovar Paratyphi A str ATCC

9150), vùng gen 16S rRNA khoảng 1366bp và 23S rRNA khoảng 2904bp

I.1.9 Shigella spp

I.1.9.1 Đặc điểm hình thái

Shigella spp hay còn gọi là trực khuẩn lỵ, là

nhóm vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, không

di động, kích thước tế bào từ 1 – 2 µl, hô hấp kỵ khí

không bắt buột [12]

I.1.9.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

Hình thái khuẩn lạc của chúng trên môi

trường SS nhỏ li ti, tròn, bờ đều, có màu hồng nhạt hoặc không màu, trong suốt Chúng sống trong điều kiện hiếu khí, kị khí tùy nghi, sống được ở nhiệt độ từ 8 –

40oC, pH 6,5 – 8,8, thích hợp nhất ở nhiệt độ 37oC, pH 7 – 8 Kém chịu đựng với điều kiện ngoại cảnh Điều kiện khô, nhiệt độ <5oC vi khuẩn khó tồn tại Nhiệt độ 100oC/2 phút hoặc 60oC/10 phút đã giết chết vi khuẩn [12]

Shigella spp có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi, hầu hết các

loài thuộc chi shigella không lên men đường lactose, chúng không khử được nitrate, không có khả năng sinh enzyme citochrome oxidase, lysine decarboxylase, không sinh

H2S, không có khả năng làm tan gelatin [12]

Chi Shigella được chia thành 4 nhóm loài: [25]

- S dysenteriae không lên men được manitol thuộc nhóm kháng huyết thanh A,

gồm có 1 kiểu huyết thanh

- S flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B, gồm có 6 kiểu huyết thanh

- S boydii có khả năng lên men đường manitol sinh acid, thuộc nhóm kháng

huyết thanh C và có 15 kiểu huyết thanh

S sonnei có khả năng sử dụng đường manitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh

D và chỉ có 1 kiểu huyết thanh

Nhóm vi khuẩn này thường hiện diện trong thực phẩm như các món salad, thịt bằm, thủy sản, dịch nhầy phân người

Hình I.9 Hình thái tế bào Shigella[85]

Hà Vinh (2011), phát hiện Shigella trong mẫu phân của các bệnh nhân nhi bị tiêu

chảy cấp ở bệnh viện thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp [1]

I.1.9.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Shigella spp có kích thước khoảng 4,83 Mb trong đó tỉ lệ % GC

khoảng 50,7, vùng gen 16S rRNA khoảng 1542bp và 23S rRNA khoảng 2904bp

(Shigella sonnei Ss046)

I.1.10 Vibrio cholerae

I.1.10.1 Đặc điểm hình thái

Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm (-),

h nh que hơi cong, không có vỏ, không sinh nha

bào, có chiều rộng khoảng 0.7-1.0 µm và dài

khoảng 1.5-3.0 µm, di động được nhờ một roi bơi,

hô hấp kỵ khí tùy nghi

I.1.10.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

Vi khuẩn V cholerae phát triển được ở

nhiệt độ 15oC đến 45oC và trong khoảng pH 6-10, tuy nhiện điều kiện cho vi khuẩn V cholerae tăng sinh tốt là nhiệt độ 35oC đến 37o

C và pH vào khoảng 8-9 Ngoài ra, vi khuẩn còn có thể phát triển trong môi trường muối (NaCl 6%)

Vibrio cholera có đặc điểm sinh hóa: dương tính với oxydase (+), không sinh

H2S, âm tính urease và sử dụng D-glucose làm nguồn C chính Sản xuất nhiều loại enzyme: amylase, gelatinase, chitinase và DNase

Vibrio cholera được chia thành 206 serotypes khác nhau và nổi bật là 2 serotypes O1 và O139, là hai tác nhân gây bệnh dịch tả hay được gọi là V cholerae - O1 và V.cholerae non - O1 [55] Có sự khác nhau cơ bản giữa 2 serotype này, giúp phân biệt

dễ dàng: Serotype O139 có một nan mỏng, còn O1 thì không có nan này O1 tạo khuẩn lạc trong còn O139 thì có khuẩn lạc đục [55] LPS (lippolysaccharide) của serotype O1 thì mềm và chuỗi dài hơn so với O139 thì semirough và ngắn hơn

Vi khuẩn Vibrio cholera có độc tố tả (choleragen) Đây là nội độc tố có cấu trúc

gồm hai đơn nguyên: đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng AMP vòng (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat)

Hình I.10 Hình thái tế bào Vibrio

cholera[86]

Dựa vào đặc điểm các quyết định kháng nguyên A, B, C của kháng nguyên thân

O, V cholerae - O1 được phân thành 3 type huyết thanh (serotype) sau:

- Serotype Ogawa (có quyết định kháng nguyên A, B)

- Serotype Inaba (có quyết định kháng nguyên A, C)

- Serotype Hikojima (có cả ba quyết định kháng nguyên A, B, C)

Serotype O139 là chủng huyết thanh mới có kháng nguyên O đặc thù

Phẩy khuẩn xâm nhập vào đường tiêu hóa, cư trú và phát triển ở màng nhày phủ

niêm mạc ruột non Nguồn nước bị nhiễm V cholerae, các loại rau sống không được

vệ sinh kỹ, ăn các loại hải sản không nấu kỹ là những nguồn lây nhiễm bệnh chính

Nguyễn Thị Xuân Trang và cộng sự (2012), tìm thấy V cholerae trong mẫu tôm

và nhuyễn thể thu thập ở Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam [6]

I.1.10.3 Thông tin bộ gen

V cholera có kích thước bộ gen khoảng 4.03 Mb, thành phần %GC là 47.5, vùng trình tự 16S rRNA có kích thước 1535 bp và 23S rRNA dài 2887 bp (Vibrio cholerae

O1 biovar El Tor str N16961)

I.1.11 Vibrio parahaemolyticus

I.1.11.1 Đặc điểm hình thái

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy, có tiêm mao ở

một đầu, có khả năng di động, sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi [54] Chúng thường sống ở các cửa sông [7]

I.1.11.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

V parahaemolyticus là loài vi khuẩn tồn tại và

phát triển trong môi trường có hàm lượng muối cao,

chúng thường xuyên được phân lập từ các sản phẩm

thủy sản, trong các vùng nước ấm ven bờ biển

Chúng sống ở điều kiện môi trường ở 37oC, pH

kiềm và mặn V parahaemolyticus bị chết ở

65oC sau 10 phút, chúng không phát triển

được ở nhiệt độ dưới 15oC [12]

V parahaemolyticus có khả năng sinh oxidase , lên men D-mannitol, maltose,

không lên men saccharose [25]

Hình I.11 Hình thái tế bào V

parahaelyticus[87]

Vibrio parahaemolyticus được phân loại dựa vào somatic (O) và capsular (K),

chia thành các serotypes O3:K6 (bao gồm O4:K12, O4:K68, O1:K41, O1:K25, O1:KUT) và một vài serotypes khác.[54]

V parahaemolyticus có thể gây bệnh ở thông qua việc tiêu thụ các nguồn hải sản chưa chín, hoặc qua tiếp xúc với các động vật biển V parahaemolyticus thường gây viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng huyết ở người V parahaemolyticus có khả năng sản sinh ra độc tố hemolysin – là loại độc tố phổ biến nhất ở các loài Vibrio spp gây bệnh Độc tố hemolysin thường bền với nhiệt và chúng

có khả năng phân hủy các tế bào hồng cầu [7]

Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012), phát hiện vi khuẩn V parahaemolyticus

trong hải sản tươi sống ở Nha Trang, Việt Nam, gây bệnh tiêu hóa cấp cho con người [7]

I.1.11.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của V parahaemolyticus có kích thước khoảng 5,17Mb trong đó tỉ lệ %

GC khoảng 45.4, vùng gen 16S rRNA khoảng 1471bp và 23S rRNA khoảng 2891bp (Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633)

I.1.12 Yersinia enterocolitica

I.1.12.1 Đặc điểm hình thái

Yersinia enterocolitica là vi khuẩn Gram âm,

h nh que ngắn, không sinh bào tử, kị khí tùy nghi Vi

khuẩn có khả năng di động ở 25oC nhưng ở 37oC thì

vi khuẩn bị bất động [16]

I.1.12.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng

Vi khuẩn sinh trưởng ở khoảng nhiệt

độ là 0 - 44 0C trong điều kiện hiếu khí và

yếm kí Chúng có khả năng tồn tại trong điều kiện lạnh, đất ẩm ướt và có thể sống trong điều kiện nồng độ muối cao (5% NaCl), sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 4 đến 10 [12]

Y Enterocolitica có khả năng sử dụng một số nguồn carbon như glucose,

trehalose,… nhưng không có khả năng lên men đường lactose Chúng có khả năng làm phân giải ure nhờ enzyme urease, không có khả năng sinh H2S [12]

Hình I.12 Hình thái tế bào Y enterocolitica[88]

Dựa trên khả năng gây bệnh, đặc điểm sinh thái và sự phân bố địa lý Yersinia enterocolitica được chia thành 5 nhóm: 1A, IB, 2, 3, 4, và 5 Yersinia enterocolitica

bao gồm 60 serotypes: IA (O:5; O:6, 30; O:7, 8; O:18; O:46), IB (O:8; O:4; O:13a, 13b; O:18; O:20; O:21), 2 (O:9; O:5, 27), 3 (O:1,2,3; O:5,27), 4 (O:3), và 5 (O:2,3) Trong đó gây nhiễm nhiều nhất là O:3 (biogroup 4) , O:8(biogroup 1B), O:9 (biogroup 2) , và O:5,27 (biogroups 2 và 3)

Vi khuẩn Yersinia enterocolitica được phát hiện trong thực phẩm bao gồm hải

sản, thịt gà, sữa chưa thanh trùng ở Việt Nam [4]

Nguyễn Hương Thủy và cộng sự (2011), phát hiện được vi khuẩn Y enterocolitica trong thực phẩm bao gồm hải sản, thịt gà, sữa chưa thanh trùng ở Việt

Nam [4]

I.1.12.3 Thông tin bộ gen

Bộ gen của Y enterocolitica có kích thước khoảng 4.68 Mb, %GC vào khoảng 47,3%, kích thước vùng 16S rRNA 1489 bp và 23S rRNA khoảng 2994 bp(Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica 8081)

I.2 THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA

I.2.1 Gen 16S rDNA

Vùng trình tự 16S rDNA là gen mã hóa cho trình tự 16S rRNA, có chiều dài khoảng 1540bp [63] Vùng gen này có cấu trúc đặc biệt do nó có thể hình thành cấu trúc bậc 2 và tạo thành 4 trung tâm chức năng (domains) và nó có cuộn gấp lại nhờ những liên kết bổ trợ từ những đoạn xa nhau thường nhỏ hơn 8 bp, những đoạn cặp đôi này thường không hoàn chỉnh và có những đoạn phồng, lồi lên [73] Vùng trình tự 16S rDNA được ghi nhận là “đồng hồ tiến hóa” (evolutionary clock) [66], thường được được sử dụng phổ biến trong những công trình nghiên cứu khoa học về hướng định danh [73][66], phân loại cũng như phát hiện các loài vi khuẩn mới [56] và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học

Hiện nay, gen 16S rRNA được xem là “chuẩn vàng” (gold standard) trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các cộng đồng vi sinh vật [23] Chúng có số lượng bản sao rất lớn trong bộ gen của vi sinh vật [31][73]

Trên vùng trình tự gen 16S rRNA, các nhà khoa học đã xác định được các vùng bất biến U (universal) là các vùng có sự biến đổi rất ít giữa các loài (bảo tồn ở cấp độ

loài) và các vùng siêu biến động V (hypervariable) là những vùng có sự khác nhau giữa các loài, các chủng thuộc loài hoặc nhóm loài [60] Vùng siêu biến động được chia thành 9 vùng khác nhau, mỗi vùng có chiều dài khoảng 18 - 20 bp, và giữa 2 vùng trên có những vùng có biến đổi ít được gọi là vùng bán bảo tồn S (semi-conserved) [18]

− Vùng V1 có kích thước khoảng 28 bp, thường được sử dụng để phân biệt các vi

khuẩn Streptococcus spp và sự khác nhau giữa Staphylococcus aureus và Staphylococcus không sinh enzyme coagulase

− Vùng V2 có thể phân biệt các chi Escherichia spp và Shigella spp Vùng này còn có thể phân biệt giữa Staphylococal và Streptococal, và giữa các loài trong chi Clostridium Vùng V2 có kích thước trung bình 100 bp và được chia ra làm

3 vùng có 13 – 35 bp, trong đó có vùng 13 bp (182 – 194) chứa nhiều biến thể

đơn đa h nh phân biệt giữa các loài vi khuẩn lao và Haemophilus Vùng từ

khoảng nucleotide thứ 205 – 242 chứa hầu hết các biến thể đơn đa h nh (single

nucleotide polymorphism –SNP) để phân biệt Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium và nhiều loài vi khuẩn khác

− Vùng V3 giúp xác định giữa Mycobacterium fortuitum, Nocardiasp., Propionibacterium acnes và Rhodococcus equi Vùng V3 cũng giúp phân biệt giữa Enterobacteriacea K pneumonia và E aerogenes

− Vùng V6 là vùng siêu biến động ngắn nhất, dài khoảng 58bp, có sự biến động

lớn và giúp phân biệt giữa Enterobacteriaceae Escherichia spp., Shigella spp

và Salmonella spp

− Vùng V4, V5, V7 và V8 mức độ bảo tồn cao hơn mức độ biến động, do đó không thích hợp là trình tự mục tiêu hỗ trợ cho việc định danh ở mức loài

I.2.2 Gen 23S rDNA

Vùng gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2900bp [37] Theo Uzuka và cộng

sự (2004), vùng 23S rRNA thể hiện sự biến động giữa các loài hơn vùng 16S rRNA [67] Theo đó, có thể thiết kế mồi chung (universal primer) dựa trên vùng bảo tồn và mồi/mẫu dò chuyên biệt (specific primer/probe) dựa trên vùng biến động của trình tự 23S rRNA để phân biệt được các nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột [37][67]

Theo Uzuka và cộng sự, vùng 23S rRNA thường liên quan đến việc kháng kháng sinh phân tử vòng lớn (macrolide antibiotic) [67].Việc thiết kế các mồi/mẫu dò chuyên biệt trên vùng 23S rRNA là rất hữu ích trong chẩn đoán các vi khuẩn kháng thuốc.[67]

I.3 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CON NGƯỜI

I.3.1 Kỹ thuật định danh truyền thống [27]

Việc định danh và phân loại vi sinh vật đều dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh

lý, sinh hóa vi sinh vật: nhuộm tế bào, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid,…

Dựa trên phản ứng sinh hóa: ngoài việc dựa trên các đặc điểm hình thái, áp dụng thêm các phản ứng sinh hóa để phân loại Những phản ứng sinh hóa thường dùng trong việc định danh:

 Thử nghiệm chuyển hóa citrate: xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn hydrocarbon duy nhất Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi chỉ thị màu Phản ứng dương tính màu xanh nước biển, phản ứng

âm tính: không đổi màu

 Thử nghiệm catalase: phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và

kỵ khí tùy nghi Phản ứng dương tính có bọt khí xuất hiện, phản ứng âm tính không có bọt khí

 Thử nghiệm Oxydase: phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome oxidase của

vi khuẩn Phản ứng dương tính có màu tím và chỉ xuất hiện trong 10s đầu

 Thử nghiệm phân giải Ure: phát hiện enzym urease phân giải urea thành NH4

và CO2 NH4 làm kiềm hóa môi trường Phản ứng dương tính môi trường có màu tím

đỏ, phản ứng âm tính môi trường không đổi màu

 Thử nghiệm Coagulase:phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng đông huyết tương Phản ứng dương tính xuất hiện khối đông máu, phản ứng âm tính không xuất hiện khối đông máu

 Thử nghiệm sinh Indol: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển hóa trypton tạo thành indol Phản ứng dương tính tạo màu hồng cánh sen, phản ứng âm tính có màu vàng

 Thử nghiệm MR (Methyl Red) : phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền Nhỏ methylred để đọc kết quả, phản ứng dương tính có màu đỏ, phản ứng âm tính có màu vàng

 Thử nghiệm VP (Voges – Proskeur): nhằm phát hiện các vi sinh có enzym chuyển hóa 2,3 – butanediol thành acetoin và khi có oxi chuyển hóa tiếp thành diacetyl Phản ứng dương tính có màu đỏ trên bề mặt môi trường, phản ứng âm tính có màu nâu đất

 Thử nghiệm khả năng khử nitrat: phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit, NH3,N2 Trước tiên cho α-napthylamine nếu tạo màu đỏ thì phản ứng dương tính nếu không chuyển màu thì cho tiếp bột kẽm vào nếu phản ứng có màu đỏ thì âm tính còn nếu không màu th dương tính

 Thử nghiệm phân giải hồng cầu: một số vi khuẩn cho khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy trên thạch máu Có 3 loại tan máu: tan máu β tạo vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc, tan máu α vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc, tan máu

γ không tan máu

 Thử nghiệm khả năng gelatin: phát hiện vi khuẩn có enzym gelatinase phân giải

và hóa lỏng gelatin, quan sát ở nhiệt độ thấp hơn 25oC

 Xác định khả năng di động: dùng để phát hiện các vi khuẩn có khả năng di động trên môi trường bán lỏng và làm đục môi trường Phản ứng dương tính vi khuẩn mọc lan ra trên đường cấy, phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy

Phân biệt theo serotype huyết thanh: nguyên tắc của phương pháp này dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ)

Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn: Bacteriocin bản chất là peptid kháng khẩn sinh ra để chống lại vi sinh vật

Các bước định danh vi khuẩn bao gồm:

- Xác định môi trường thích hợp để nuôi cấy

- Nghiên cứu hình thể học

- Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý - sinh hóa học

- Xếp loại vi khuẩn phân lập được vào giống, loài và tuýp huyết thanh cụ thể

Bảng I.1 Bảng thử nghiệm sinh hóa phân biệt nhóm vi khuẩn gây bệnh đường

I.3.2 Kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại

I.3.2.1 Kỹ thuật PCR[2][14]

I.3.2.1.1 Định nghĩa

PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng polymerase dây chuyền) là phương

pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA trong điều kiện in vitro theo

các chu kỳ nhiệt, không cần sự hiện diện của tế bào.[14]

Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật

di truyền.[2]

I.3.2.1.2 Nguyên tắc chung của phương pháp PCR

PCR là quá tr nh khuếch đại một đoạn tr nh tự DNA đặc hiệu trong điều kiện in vitro dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase [14]

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt: mồi xuôi (sense primer)

và mồi ngược (antisense primer) Mồi có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài để h nh thành mạch mới [14]

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: [2]

 Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường 94o

C – 95oC trong vòng 30 giây – 1 phút [2]

 Giai đoạn bắt cặp (annealing): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, thường là 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút [2]

 Giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của tr nh tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ

30 giây đến nhiều phút [2]

Một chu kỳ bao gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân [2]

Hình II.1 – Các bước trong một chu kỳ PCR.[89]

I.3.2.1.3 Thành phần phản ứng PCR

 Khuôn mẫu là đoạn DNA cần khuếch đại

 Các đoạn mồi xuôi và ngược

 DNA polymerase chịu nhiệt

 dNTP: các loại nucleotide triphosphate

 Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I V đây

là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải thêm enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính v enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại ký sinh càng cao ,…) [2]

Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt được đưa ra thị trường với nhiều chức

năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Taq DNA polymerase và Pfu DNA polymerase

được sử dụng thông dụng [2]

 Mồi và nhiệt độ lai:[2]

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

 Tr nh tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi

 Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

 Các mồi chọn phải đặc trưng cho tr nh tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các tr nh tự lặp lại trên gen

 Các thành phần khác của phản ứng PCR: [2]

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/ mỗi loại nucleotide Nồng độ cao hơn dễ dẫn tới sự khuếch đại ký sinh Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

Nồng độ ion Mg2+ cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của quá tr nh PCR Không có một quy luật chung cho vấn đề này Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nhưng thông thường, nồng

độ Mg quá thấp sẽ làm giảm hiệu quả nhân bản còn nồng độ quá cao sẽ tạo sản phẩm không đặc hiệu

 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR: [2][14]

Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR [14]

Sở dĩ như vậy là v phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn: trong giai đoạn đầu số

lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn v những nguyên nhân sau:

 Sự phân hủy và cạn kiệt những thành phần của phản ứng

 Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: [2]

Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác Các thiết bị hiện nay đã được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá tr nh phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào,… Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị

Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng một kiểu v đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá tr nh khuếch đại I.3.2.1.5 Ưu nhược điểm

Phương pháp này có ý nghĩa lớn v nhiều lý do:

 Thời gian thực hiện cực nhanh: Chỉ cần mất khoảng 3 giờ để khuếch đại một

tr nh tự DNA được quan tâm

 Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời

 Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu acid nucleic thô

Tuy nhiên phương pháp PCR vẫn còn một số mặt hạn chế:

 Phải biết tr nh tự nucleotide (hoặc ít nhất một phần) của đoạn cần khuếch đại

 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này