Nghiên cứu này nhằm lựa chọn các điều kiện và môi trường lên men phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo bào tử của chủng Bacillus S5 để ứng dụng trong sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy sản. Mật độ tế bào OD550nm trong dịch nuôi cấy là thông số được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên men. Tối ưu các điều kiện lên men được sử dụng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM).
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NUÔI CẤY THU NHẬN BÀO TỬ
Bacillus S5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT (RSM)
Võ Hồng Phượng1*, Đặng Ngọc Thùy1, Nguyễn Thị Lan Chi1, Nguyễn Thanh Trúc1,
Chu Quang Trọng1, Phạm Thị Huyền Diệu2
TÓM TẮT
Chủng vi khuẩn Bacillus S5 là được phân lập từ bùn ao nuôi tôm quảng canh có khả năng ức chế vi khuẩn
V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND - acute hepatapancreatic necrosis disease)
trong điều kiện thí nghiệm Nghiên cứu này nhằm lựa chọn các điều kiện và môi trường lên men phù hợp cho
sự sinh trưởng và tạo bào tử của chủng Bacillus S5 để ứng dụng trong sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy
sản Mật độ tế bào OD550nm trong dịch nuôi cấy là thông số được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên men Tối ưu các điều kiện lên men được sử dụng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Môi
trường tối ưu để sản xuất sinh khối Bacillus S5 sau 48 giờ lên men đạt giá trị OD550nm 11,36 tương ứng 4,3x10 9 CFU/mL là: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L và tốc độ lắc 170 vòng/phút Ngoài
ra, 0,5 g/L ion Ca 2+ được bổ sung sau 30 giờ lên men có thể kích thích trên 90% tế bào dinh dưỡng Bacillus
S5 chuyển thành bào tử
Từ khóa: Sinh khối Bacillus S5, bào tử Bacillus S5, tối ưu các điều kiện nuôi cấy.
1 Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
2 Trường Đại học Sư phạm, Tp HCM.
*Email: vohongphuong@yahoo.com
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Khả năng kháng kháng sinh của các tác
nhân gây bệnh đã thúc đẩy phát triển nhiều công
trình nghiên cứu các giải pháp thay thế kháng
sinh trong trị bệnh do vi khuẩn gây ra (Gauri và
ctv., 2011) Các chủng Bacillus được xem là đối
tượng hàng đầu và được nhiều nhà nghiên cứu
khoa học quan tâm nhằm ứng dụng và sản xuất
probiotic với một số đặc tính như sản sinh một
số enzyme ngoại bào, tạo bào tử bền với nhiệt
thuận lợi trong quá trình sản xuất, bảo quản và
sử dụng (Duc và ctv., 2004) Lên men chìm được
xem là phương pháp hữu hiệu và được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp sản xuất probiotic
nhờ khả năng kiểm soát các thông số được dễ
dàng (Nguyễn Văn Thanh và ctv., 2009)
Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương,
khả năng tạo bào tử chúng được xem như là
những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực
công nghiệp (Harwood, 1992) Thể bào tử
của B subtilis được kích thích mạnh khi mật
độ tế bào vi khuẩn cao (Grossman và Losick,
1988), sự thiếu hụt về dinh dưỡng (Schaeffer
và ctv., 1965), thành phần muối khoáng cao,
pH môi trường nuôi cấy trung tính và nhiệt độ môi trường nuôi phù hợp với từng loài vi khuẩn
(Bernlohr và Leitzmann, 1969) Bào tử Bacillus
sp được hình thành sau pha tăng trưởng (log phage) của tế bào sinh dưỡng Trong điều kiện
lý tưởng, hiệu quả chuyển thành bào tử của vi
khuẩn Bacillus sp mật độ 108 tế bào ml-1 trong khoảng 30-100% (Nicholson và Setlow, 1990) Ngoài ra, muối được đưa vào môi trường lên men cũng tăng khả năng tạo bào tử của nhóm
Bacillus, nhưng với nồng độ ion kim loại nặng
cao có thể ảnh hưởng đáng kể đến quá trình tạo bào tử (Cho và ctv., 2009) Sáu ion kim loại,
Mn2+, Fe3+, Fe2+, Ca2+, Mg2+ và Zn2+ được xem
là những yếu tố quan trọng kích thích bào tử (Kolodziej và Slepecky, 1964, Granger và ctv., 2011) Đến nay, có nhiều công trình nghiên cứu
được báo cáo giá trị tối đa tạo bào tử của B
subtilis trong lên men chìm dao động 109 bào tử
ml-1 đến 7,4 x109 bào tử ml-1(Monteiro và ctv., 2005) Sự điều chỉnh các chỉ số tạo bào tử trong quá trình lên men thường được giám sát chặt
Trang 246 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
chẽ nhằm kích thích tạo bào tử tốt nhất (Rao và
ctv., 2007)
Chủng Bacillus S5 được phân lập từ mẫu
bùn ao nuôi quảng canh tại Cà Mau, có khả
năng tạo vòng kháng Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh gan tụy cấp tính trên tôm (AHPND)
với đường kính 15 mm ở điều kiện in vitro và
ổn định trong 24 giờ khảo sát Bên cạnh đó,
mật độ ban đầu của Bacillus S5 ở giá trị 105
CFU/mL và 106 CFU/mL có khả năng ức chế
hoàn toàn V parahaemolyticus (mật độ ban đầu
tương ứng 104 và 105 CFU/mL) từ thời điểm 12
giờ khảo sát Tỉ lệ bảo hộ (RPS) trên tôm sú và
tôm thẻ tương ứng đạt 61,8% và 50,1% Kết quả
định danh sinh hóa bằng test kit API 50 CHB/E
cho thấy chủng Bacillus S5 thuộc loài Bacillus
subtilis (Võ Hồng Phượng và ctv., 2018)
Nhiều kỹ thuật đã được sử dụng trong việc
tối ưu các yếu tố trong quá trình lên men nhằm
tạo sinh khối tế bào cao nhất, như phân tích yếu
tố đơn, quy hoạch thực nghiệm (thống kê toán
học) Thiết kế đơn từng yếu tố là phương pháp
cổ điển dễ sử dụng đối với mô hình thí nghiệm
ít yếu tố và không xét đến sự tương tác qua lại
giữa các yếu tố lên sinh khối của vi sinh vật
lên men Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi sử
dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối
ưu hóa giá trị các yếu tố đang được nghiên cứu
Trong các thiết kế thí nghiệm như thiết kế thí
nghiệm theo Plackett- Burman (PBD) (Plackett
và Burman, 1946) và thiết kế cấu trúc tại tâm
Central Composite Design (CCD), được biết
đến là một trong những phương pháp đáp ứng
bề mặt (RSM), là thiết kế hữu ích nhằm tối ưu
các điều kiện dinh dưỡng và nuôi cấy trong quá
trình lên men (Xiao và ctv., 2007)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng
phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để khảo sát
ảnh hưởng của các nguồn carbon, nguồn nitơ,
và ion khoáng khác nhau đến khả năng hình
thành và tạo bào tử của chủng Bacillus S5, được
xem là chủng probiotic tiềm năng để ứng dụng trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản nhằm giảm thiểu thiệt hại do bệnh AHPND trên tôm
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
Chủng vi khuẩn Bacillus S5 được phân lập
từ bùn ao nuôi tôm quảng canh tại Cà Mau có
khả năng ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus
gây bệnh AHPND thuộc phạm vi của đề tài
“Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng
Vibrio spp gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên
tôm sú và tôm thẻ chân trắng”
Chủng Bacillus S5 được làm giàu trong
erlen 250 mL chứa 150 mL môi trường dinh dưỡng lỏng (Nutrient broth- NB) bổ sung 1,5% NaCl và pH môi trường 7,2±0,2 trong thời gian 18-24 giờ, nhiệt độ ủ 300 C đến khi đạt mật độ
108 CFU/mL Sau đó, 2% chủng giống được cấp vào các erlen 100 ml chứa 50 mL nguồn dinh dưỡng cần khảo sát
2.2 Phương pháp sàng lọc đơn nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối
Bacillus S5
Sàng lọc sáu nguồn nitơ và sáu nguồn carbon, thành phần môi trường lên men bao gồm 1,5% muối NaCl và pH môi trường 7,2±0,2 Bảng 1 thể hiện nồng độ và các nguồn dinh dưỡng khảo sát Mỗi công thức môi trường
được lặp lại 2 lần Giống vi khuẩn Bacillus S5
được cung cấp với mật độ ban đầu 103 CFU/
mL Các erlen được ủ lắc ở nhiệt độ 300C, 200 vòng/ phút, sau 48 giờ xác định giá trị mật độ
vi khuẩn thông qua chỉ số OD550nm (1 OD550nm tương đương 3,8x108 CFU/mL giá trị xây dựng đường chuẩn trong nghiên cứu này)
Trang 3Bảng 1 Thành phần và nồng độ nguồn dinh dưỡng khảo sát đơn lên men Bacillus S5
Nguồn Nitơ Nồng độ (g/L) Ghi chú Carbon Nguồn Nồng độ (g/L) Ghi chú
Cao nấm men
5-15 Glucose 5 g/L
Glucose
5-15
Pepton 5 g/L
NaNO3
0,5 -2 5 g/L, Glucose 5 Bổ sung Pepton
g/L
Manitol
2.3 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng chính
đến sự phát triển của Bacillus S5
2.3.1 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến
việc tạo sinh khối Bacillus S5 trên ma trận
Plackett- Burman (PB)
Thiết kế Plackett- Burman (PBD) dựa trên
mô hình tuyến tính bậc nhất Y = β0 +Σ βi Xi là
cách hiệu quả để sàng lọc các thông số chính
trong một lượng lớn các yếu tố của quá trình
tối ưu (Plackett và Burman, 1946) Trong đó Y
là hàm đáp ứng (mật độ vi khuẩn), β0là hệ số
chặn và βilà hệ số tuyến tính và Xi là biến độc
lập Sàng lọc 11 yếu tố với tổng số thí nghiệm
được thiết lập theo thiết kế này là 15 thí nghiệm
trong đó có 3 thí nghiệm lặp lại tại tâm Mỗi yếu
tố được khảo sát ba mức giá trị là mức cao (+1), mức thấp (-1) và giá trị trung bình (0) Nguồn carbon và nguồn nitơ sẽ được lựa chọn trong thí nghiệm khảo sát yếu tố đơn Bên cạnh đó, một số chất khoáng, điều kiện nuôi cấy như tốc độ lắc, nhiệt độ cũng được xem như là các yếu tố cần thiết đánh giá mức ảnh hưởng quá trình lên men
vi sinh vật (Bảng 2) Thí nghiệm được thiết kế trong erlen 100mL và thể tích khảo sát 50 mL Sau thời gian 48 giờ thu mẫu và đo mật độ quang (OD) Kết quả mật độ quang (OD550nm) được phân tích bằng chương trình “Design Expert® 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA
Bảng 2 Các yếu tố và mức ảnh hưởng trong thiết kế Plackett-Burman (PB) đối với Bacillus S5
(-1) Cao (+1) Trung tâm (0) hưởng Ảnh Prob>F
Ghi chú: a khác biệt đáng kể α = 0,05; b không khác biệt đáng kể α = 0,05
-1, 0 và +1 là mã hóa giá trị khảo sát tương ứng mức thấp, trung bình và mức cao
Trang 448 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
2.3.2 Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng
chính sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh
hưởng
Sau quá trình sàng lọc 11 yếu tố ảnh hưởng
đến khả năng tạo sinh khối Bacillus S5, kết quả
ghi nhận có 5 yếu tố ảnh hưởng chính và 6 yếu
tố không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng âm Thí
nghiệm kiểm định nhằm đánh giá lại 5 yếu tố
trên có thật sự ảnh hưởng đến hàm mục tiêu
(sinh khối Bacillus S5) sau khi loại bỏ các yếu
tố không ảnh hưởng Để tiết kiệm thời gian và
chi phí, kiểm định các yếu tố được thực hiện qua
thiết kế nhân tố từng phần (Fractional factorial
designs) Thiết kế dựa vào chương trình “Design
Expert® 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA
(Bảng 5) Mỗi công thức được thực hiện 2 lần
lặp lại
2.4 Tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình lên men bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với kiểu tâm phức hợp (RSM-CCD)
Thí nghiệm PB sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến sinh khối của các chủng khảo sát Sau đó, tiến hành thí nghiệm với ma trận thực nghiệm RSM-CCD tối ưu các yếu tố với năm mức khảo sát (-α, -1, 0, +1, +α) trong
đó α =2, số thí nghiệm tại tâm (0) thực hiện
6 lần lặp và thiết kế 13 thí nghiệm dựa theo Castillo E Del (2007) Tính toán, lập phương trình hồi quy, chọn điểm tối ưu của các yếu
tố cho hàm đáp ứng là mật độ OD550nm bằng phần mềm Design expert 7.0® của Atat-Ease Inc USA, từ đó áp dụng vào thực nghiệm Mỗi thí nghiệm trong ma trận được bố trí 2 lần lặp lại, thể tích môi trường khảo sát 50 mL và thời gian thu mẫu 48 giờ
Bảng 3 Thiết kế thí nghiệm và kết quả mật độ quang tối ưu khi kết hợp các yếu tố khảo sát theo
phương pháp thiết kế cấu trúc tại tâm (CCD)
Thí
nghiệm
OD 550nm
48 giờ
Bột đậu nành
(g/L) (X1)
Cao nấm men (g/L) (X2)
Glucose (g/L) (X3)
Tốc độ lắc (vòng/phút) (X4)
Trang 518 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,36
Ghi chú: a số liệu được mã hóa [+1], [-1], [0], [+α], [-α] tương ứng với mức cao, thấp, trung bình
và mức mở rộng biên cao và thấp.
2.5 Đánh giá khả năng lên men giữa môi
trường tối ưu và các môi trường dinh dưỡng
Thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá
sự phát triển của Bacillus S5 trong môi trường
tối ưu, môi trường Brain heart infusion broth
(BHIB) and Nutrient broth (NB), Luria broth
(LB) Một khuẩn lạc Bacillus S5 (sau 24 giờ
ủ trên đĩa thạch nutrient agar (NA) có bổ sung
1,5% NaCl) được huyền phù vào trong các erlen
250 ml có chứa 150 mL công thức môi trường
cần khảo sát Thí nghiệm được lặp lại 2 lần cho
mỗi công thức môi trường và thu dịch nuôi cấy
đo OD550nmmỗi sáu giờ và kéo dài trong 48 giờ
khảo sát
2.6 Khảo sát thời điểm bổ sung khoáng
kích thích tạo bào tử
Dựa vào đường cong tăng trưởng của
Bacillus S5, bổ sung các ion kim loại tại các thời
điểm khác nhau: đầu pha log, giữa pha log, đầu
pha ổn định và giữa pha ổn định (Vũ Thanh Thảo
và ctv., 2018) Các ion được khảo sát bao gồm
Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ được bổ sung với nồng độ
0,5 g/L Số lượng bào tử S5 được xác định theo
phương pháp gia nhiệt mẫu đến 800C trong 15
phút trước khi làm mát và trãi đĩa trên môi trường
nutrient (NB) ủ 300C thời gian 48 giờ
III KẾT QUẢ 3.1 Sàng lọc đơn nguồn dinh dưỡng ảnh
hưởng đến sinh khối Bacillus S5
Chủng Bacillus S5 có khả năng tạo sinh
khối cao đáng kể khi lên men bằng nguồn cao nấm men (OD550nm tại thời điểm 48 giờ tăng từ 7,0 đến 7,8 khi nồng độ cao nấm men tăng từ 5 đến 15 g/L) Đối với pepton và bột đậu nành mật
độ S5 đạt giá trị OD550nm 7,0 khi pepton hoặc bột đậu nành ở nồng độ 15 g/L Trong khi đó, các nguồn nitơ có nguồn gốc khác như axit amin tổng hợp, nitơ vô cơ thì sinh khối S5 đạt giá trị thấp nhất OD550nm nhỏ hơn 2 (Hình 1)
Nguồn carbon khác nhau cũng ảnh hưởng đến mật độ trong quá trình lên men của chủng S5 Trong số các nguồn carbon được trình bày Hình 1, lactose được xem như nguồn carbon hiệu quả nhất cho quá trình lên men đối với
chủng Bacillus S5 Sinh khối S5 tăng một cách
đáng kể (p<0,05) khi tăng nồng độ lactose từ
5 đến 15 g/L, tương ứng giá trị OD550nm tăng trong khoảng từ 6,0 đến 9,0 Ngoài ra, glucose, dextrose cũng được xem như nguồn cung cấp carbon tốt trong môi trường lên men của chủng
Bacillus S5 D- xylose, mannitol, furtose có
ảnh hưởng thấp hơn khi so sánh với các nguồn carbon khác như lactose, dextrose, glucose
Trang 650 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
Hình 1 Mật độ quang OD550nm chủng S5 các nguồn nitơ và carbon khác nhau
Ghi chú: a, b, c, d, e, f, g, h, i thể hiện sự khác biệt giữa các cột trong biểu đồ với mức ý nghĩa α=0,05
7
Ghi chú: a, b, c, d, e, f, g, h, i thể hiện sự khác biệt giữa các cột trong biểu đồ với mức ý nghĩa α=0,05
3.2.1 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 bằng ma trận PB
Kết qua xử lý ANOVA (Bảng 2) cho thấy, năm yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và có ý
nghĩa thống kê đến mật độ tế bào chủng Bacillus S5 bao gồm tốc độ lắc (4,48), cao nấm men
(0,87), lactose (0,41), bột đậu nành (0,35) và đường glucose (0,28) (p < 0,05) Hơn nữa, giá trị
OD550nm của chủng S5 dao động từ 3,82 đến 9,84 khi nồng độ các yếu tố thay đổi trong công thức thí nghiệm
Hàm hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố có dạng phương trình đường thẳng: Y (OD)= 7,09 + 0,18X2+ 0,43X3+ 0,14X4+ 0,2X5+ 2,24X11 Trong đó, Y là hàm mục tiêu (mật độ quang OD550nm), X2, X3, X4,X5, X11 lần lượt là các yếu tố bột đậu nành, cao nấm men, glucose, lactose và tốc độ lắc Ngoài ra, khi phân tích phương sai cho thấy, giá trị p-value của mô hình bằng 0,0004 ứng với các yếu tố ảnh hưởng chính (main effects), do đó ảnh hưởng của các yếu tố
là có ý nghĩa thống kê
3.2.2 Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng chính sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh hưởng
Năm yếu tố được chọn lọc và kiểm định lại bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial Two level) sau khi loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng âm hoặc không ảnh hưởng đến công thức môi trường Mỗi yếu tố ảnh hưởng trên được khảo sát ở ba mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao (+1) và mức độ trung tâm (0) được thể hiện Bảng 4 Như vậy, nhiệt độ không ảnh hưởng trong sàng lọc PBD nên trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi duy trì nhiệt độ ủ ở mức 300C±20C,
pH môi trường dao động trong khoảng 7-7,5
c
d b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0, 2g/
0, 2g/
Pepton Cao nấm
men Bột đậu nành Casein NaNO3 Nh4Cl
D 550
Nguồn Nitơ
fg d i g c
b c a
h
e h f
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Glucose D- xylose Dextrose lactose Manitol Frurtose
D 550
Nguồn Carbon
3.2 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến
sinh trưởng của Bacillus S5
3.2.1 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến
sinh khối Bacillus S5 bằng ma trận PB
Kết qua xử lý ANOVA (Bảng 2) cho thấy,
năm yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và có
ý nghĩa thống kê đến mật độ tế bào chủng
Bacillus S5 bao gồm tốc độ lắc (4,48), cao nấm
men (0,87), lactose (0,41), bột đậu nành (0,35)
và đường glucose (0,28) (p < 0,05) Hơn nữa,
giá trị OD550nm của chủng S5 dao động từ 3,82
đến 9,84 khi nồng độ các yếu tố thay đổi trong
công thức thí nghiệm
Hàm hồi quy mô tả ảnh hưởng của các
yếu tố có dạng phương trình đường thẳng: Y
(OD)= 7,09 + 0,18X2+ 0,43X3+ 0,14X4+ 0,2X5+
2,24X11 Trong đó, Y là hàm mục tiêu (mật độ
quang OD550nm), X2, X3, X4,X5, X11 lần lượt là
các yếu tố bột đậu nành, cao nấm men, glucose,
lactose và tốc độ lắc Ngoài ra, khi phân tích
phương sai cho thấy, giá trị p-value của mô
hình bằng 0,0004 ứng với các yếu tố ảnh hưởng
chính (main effects), do đó ảnh hưởng của các
yếu tố là có ý nghĩa thống kê
3.2.2 Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng chính
sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh hưởng
Năm yếu tố được chọn lọc và kiểm định
lại bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial
Two level) sau khi loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng
âm hoặc không ảnh hưởng đến công thức môi trường Mỗi yếu tố ảnh hưởng trên được khảo sát ở ba mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao (+1) và mức độ trung tâm (0) được thể hiện Bảng
4 Như vậy, nhiệt độ không ảnh hưởng trong sàng lọc PBD nên trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi duy trì nhiệt độ ủ ở mức 300C±20C,
pH môi trường dao động trong khoảng 7-7,5 Kết quả kiểm định mức ảnh hưởng của năm yếu tố sàng lọc trong cho thấy các yếu tố bột đậu nành, cao nấm men, glucose, tốc độ lắc có giá trị
p < 0,0001 và mức ảnh hưởng dương, chứng tỏ
sự có mặt của các yếu tố này là có ý nghĩa trong phương trình hồi quy Trong đó, tốc độ lắc vẫn
là yếu tố ảnh hưởng nhất (2,31), tiếp theo là cao nấm men (0,85), glucose (0,72), bột đậu nành (0,51) Khi phân tích ANOVA đối với mức ảnh hưởng của lactose thì ở mức khảo sát 15 g/L đến 30 g/L, lactose không ảnh hưởng đến sinh
khối của chủng Bacillus S5 (p = 0,136 > 0,05)
Ngoài ra, khi phân tích mức độ phù hợp của mô hình thử nghiệm đạt p < 0,0001 và giá trị sự không tương thích (lack of fit) có p = 0,0509
> 0,05, điều này cho thấy mô hình hồi quy phù hợp nhưng giá trị vùng cực trị còn xa so với giá trị đang khảo sát
Trang 7Bảng 4 Kiểm định mức ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 của các yếu tố bằng thiết kế
từng phần (Fractional factorial Two level)
Thấp (-1) Cao (+1) tâm (0) Trung hưởng Ảnh (p-value) Prob>F
Ghi chú: a Có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05; b Không có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05
3.3 Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng chính
đến quá trình lên men bằng phương pháp
đáp ứng bề mặt với thiết kế cấu trúc tại tâm
(RSM-CCD)
Mật độ Bacillus S5 trong thiết kế thí
nghiệm tối ưu dao động ở mức OD550nm từ 7,15
đến 11,65 sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh
hưởng Ngoài ra, qua đánh giá sự phù hợp và sự
có ý nghĩa của mô hình qua phân tích ANOVA
(Bảng 5) cho thấy sự có ý nghĩa của các hệ số
hồi quy được kiểm định bởi phân phối Fisher
(F), với giá trị p < 0,05 cho biết các hệ số hồi
quy có ý nghĩa Như vậy, kết quả Bảng 5 thể
hiện mô hình bậc 2 hoàn toàn có ý nghĩa thống
kê với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001) Các yếu
tố bột đậu nành và glucose đều có khả năng ảnh
hưởng đáng kể đến sinh khối Bacillus S5 Bên
cạnh đó, các cặp yếu tố như bột đậu nành và cao nấm men và cao nấm men với glucose có sự tương tác thuận từng cặp có ý nghĩa (p<0,05) Trong khi đó, cặp yếu tố cao nấm men và tốc độ lắc và cặp yếu tố glucose và tốc độ lắc lại có sự tương tác nghịch có ý nghĩa (p<0,05) Thêm vào
đó, giá trị p cho sự không tương thích của mô hình là 0,075>0,05, thông số R2 (R-Squared) là 0,97 và R2 hiệu chuẩn (Adj-R squared) là 0,95, điều đó chứng tỏ mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm
Bảng 5 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu quá trình tổng hợp các yếu tố Yếu tố tuyến tính Hệ số Giá trị p Prob>F Yếu tố tuyến tính Hệ số Giá trị p Prob>F
Bột đậu nành (X1) 0,15 0,0015 a X2X4 -0,40 < 0,0001 a
Cao Nấm men (X2) 0,046 0,2515b X3X4 -0,27 < 0,0001 a
Glucose (X3) 0,73 < 0,0001 a X12 -0,21 < 0,0001 a
b
Ghi chú: a Có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05; b Không có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05
Trang 852 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
Từ các giá trị phân tích có ý nghĩa trên,
giá trị hàm mong đợi được phần mềm Expert
Design 7.0 biểu diễn theo phương trình:
Y (mật độ quang OD550nm)
=10,56+0,15X1+0,73X3+0,1X1X3+0,18X2X3
-0,40X2X4-0,27X3X4-0,21X12-0,17X22-0,49X32
-0,25X42
Trong đó X1, X2, X3, X4 là giá trị mã hóa hàm
lượng bột đậu nành, cao nấm men, glucose, tốc
độ lắc
Từ kết quả kiểm tra thực nghiệm các giá trị
tối ưu cho 4 biến khảo sát được xác định như
sau: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20
g/L, glucose 35 g/L và tốc độ lắc 170 vòng/phút,
giá trị OD550nm là 11,36 tương ướng 4,2x109
CFU/mL
3.4 Khảo sát các loại khoáng và thời
điểm bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử
3.4.1 Đường cong tăng trưởng chủng
Bacillus S5 trong môi trường tối ưu.
Từ một khuẩn lạc S5 ban đầu khi cho
vào các môi trường khảo sát khác nhau, cho
thấy tại thời điểm 15 giờ đầu nuôi cấy không
có sự khác biệt giữa môi trường tối ưu và các
môi trường thương mại như LB, BHI, NB
Tuy nhiên, sau thời điểm từ 15 giờ đến 48
giờ khảo sát thì mật độ S5 tăng dần và khác
biệt có ý nghĩa với ba môi trường còn lại
(p<0,05) Mật độ quang OD550nm S5 trong các
môi trường tối ưu, NB, BHI, LB sau 48 giờ
lên men lần lần lượt là 11,61; 4,81; 3,87 và
3,14 Điều này có thể cho thấy môi trường
tối ưu được xem là môi trường tiềm năng cho
việc ứng dụng trong sản xuất Bacillus S5 ở
quy mô lớn
Hình 2 Đường cong tăng trưởng của Bacillus
S5 trong các môi trường nuôi cấy khác nhau
3.4.2 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của khoáng đến sự hình thành bào tử của Bacillus S5
Theo số liệu đường cong tăng trưởng của
Bacillus S5 trong môi trường tối ưu, các mốc
thời điểm bổ sung khoáng được chọn là 12 giờ,
21 giờ, 30 giờ, 36 giờ tương ứng với đầu pha tăng trưởng, giữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn định và giữa pha ổn định
Khả năng chuyển từ tế bào dinh dưỡng
sang bào tử của chủng Bacillus S5 ảnh hưởng
đáng kể đến loại khoáng sử dụng và thời điểm
bổ sung loại khoáng đó Trong nghiệm thức đối chứng (Bảng 6) cho thấy tỷ lệ tạo bào tử sau
48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%) Trong khi đó, khả năng kích thích tạo bào tử của các ion kim loại Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ có xu hướng tăng dần khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha tăng trưởng đến pha ổn định Tỷ lệ chuyển bào
tử S5 cao nhất (93,09%) và có ý nghĩa khác biệt
so với các ion kim loại khác và nghiệm thức đối chứng khi sử dụng ion Ca2+ bổ sung sau 30 giờ lên men
10
Hình 2 Đường cong tăng trưởng của Bacillus S5 trong các môi trường nuôi cấy khác nhau
3.4.2 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của khoáng đến sự hình thành bào tử của Bacillus S5
Theo số liệu đường cong tăng trưởng của Bacillus S5 trong môi trường tối ưu, các mốc
thời điểm bổ sung khoáng được chọn là 12 giờ, 21 giờ, 30 giờ, 36 giờ tương ứng với đầu pha tăng trưởng, giữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn định và giữa pha ổn định
Khả năng chuyển từ tế bào dinh dưỡng sang bào tử của chủng Bacillus S5 ảnh hưởng
đáng kể đến loại khoáng sử dụng và thời điểm bổ sung loại khoáng đó Trong nghiệm thức đối chứng (Bảng 6) cho thấy tỷ lệ tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%) Trong khi đó, khả năng kích thích tạo bào tử của các ion kim loại Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ có xu hướng tăng dần khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha tăng trưởng đến pha ổn định Tỷ lệ chuyển bào tử S5 cao nhất (93,09%) và có ý nghĩa khác biệt so với các ion kim loại khác và nghiệm thức đối chứng khi
sử dụng ion Ca2+ bổ sung sau 30 giờ lên men
Bảng 6 Tỷ lệ chuyển bào tử của chủng Bacillus S5 tại các thời điểm khác nhau và bổ sung các
loại khoáng khác nhau
Thời điểm
bổ sung khoáng (giờ)
Danh mục khoáng
mục khoáng
Khảo sát sau 48 giờ Tổng
Tỷ lệ bào tử (%)
Tổng
Tỷ lệ bào tử (%)
12 Fe Mn 2+ 2+ 3,65 2,69 0,94 0,50 25,72 18,58 Ca Mg 2+ 2+ 3,00 0.94 1,00 0,20 33,27 21,39
21 Fe Mn 2+ 2+ 3,24 3,34 0.90 0.70 27,77 20,92 Ca Mg 2+ 2+ 2,67 1,67 1,20 0.67 44,85 40,00
30 Fe Mn 2+ 2+ 3,83 3,66 2,05 1,09 53,45 29,78 Ca Mg 2+ 2+ 3,11 2,54 2,90 1,22 93,09 47,83
36 Fe Mn 2+ 2+ 3,43 3,65 2,55 2,40 74,23 65,75 Ca Mg 2+ 2+ 3,45 3,24 3,10 2,05 89,85 63,27
0 2 4 6 8 10 12
6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 30h 36h 42h 48h
Thời gian khảo sát Môi trường tối ưu LB BHI NB
Trang 9Bảng 6 Tỷ lệ chuyển bào tử của chủng Bacillus S5 tại các thời điểm khác nhau và bổ sung các
loại khoáng khác nhau
Thời điểm
bổ sung
khoáng
(giờ)
Danh mục khoáng
Khảo sát sau 48 giờ Danh
mục khoáng
Khảo sát sau 48 giờ Tổng tế
bào * Bào
tử * Tỷ lệ bào
tử (%) Tổng tế bào * Bào
tử * Tỷ lệ bào
tử (%)
12 Mn Fe 2+ 2+ 3,652,69 0,940,50 25,7218,58 Mg Ca 2+ 2+ 3,000.94 1,000,20 33,2721,39
21 Mn Fe 2+ 2+ 3,243,34 0.900.70 27,7720,92 Mg Ca 2+ 2+ 2,671,67 1,200.67 44,8540,00
30 Mn Fe 2+ 2+ 3,833,66 2,051,09 53,4529,78 Mg Ca 2+ 2+ 2,543,11 2,901,22 93,0947,83
36 Mn Fe 2+ 2+ 3,433,65 2,552,40 74,2365,75 Mg Ca 2+ 2+ 3,453,24 3,102,05 89,8563,27
Ghi chú: *: x10 9 CFU/mL; Đối chứng: môi trường tối ưu không bổ sung khoáng kích thích bào tử
IV THẢO LUẬN
Các nghiên cứu về điều kiện môi trường lên
men lên sinh khối của nhóm Bacillus đã được
thực hiện bởi nhiều nhóm tác giả, trong đó Trần
Vũ Đình Nguyên (2014) đã công bố mật độ tế
bào của chủng Bacillus B3.10.2 bị ảnh hưởng
bởi nguồn nitơ thử nghiệm như bột đậu nành,
amoni sulfat, pepton Trong đó, pepton được
xem là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trưởng
của Bacillus B3.10.2 Ngoài ra Bacillus B3.10.2
còn phát triển tốt khi môi trường được cung cấp
thêm nguồn glucose hoặc mật rỉ đường Hơn nữa,
Dong và ctv., (2010) đã tìm ra môi trường phù
hợp đạt sinh khối cao của B licheniformis khi
sử dụng nguồn nitơ là pepton hoặc cao thịt bò và
nguồn carbon là sucrose, glucose hoặc lactose
Có nhiều công trình nghiên cứu được thực
hiện để tìm ra môi trường thích hợp tăng cường
khả năng tạo bào tử của các chủng Bacillus
Trong đó đáng chú ý với hai công thức môi
trường như sau: công thức 1 bao gồm 16,18
g/L bột bắp, 17,53 g/L bột đậu nành và 8,14 g/L
cao nấm men có khả năng tạo mật độ bào tử B
subtilis là 1,52x1010 CFU/mL sau 40 giờ (Chen
và ctv., 2010); công thức 2 bao gồm bột vỏ quýt
40g, pepton 8,0g, KH2PO4 1,0g, MgSO4.7H2O
0,5 g, polypropylene glycol 5 mL hòa tan trong
1L nước bột phô mai và lên men sau 97 giờ đạt
mật độ bào tử 6,5 x1010 CFU/mL (Khardziani
và ctv., 2017) Ngoài ra, nồng độ glucose giữ vai trò quan trọng trong quá trình tạo bào tử của
Bacillus Nồng độ glucose trong môi trường
lên men gia tăng là nguyên nhân dẫn đến giảm
lượng bào tử Bacillus Nồng độ glucose đạt 5
g/L có thể tăng tế bào dinh dưỡng và bào tử
B subtilis MB 24 Mặt khác, nồng độ glucose
tăng trên 5 g/L sẽ ức chế hiệu quả tạo bào tử của chúng (Monteiro và ctv., 2005, Khardziani
và ctv., 2017) Tuy nhiên, trong thí nghiệm của chúng tôi, nồng độ glucose có mối tương quan
thuận đến sinh khối của Bacillus S5 và lượng
sinh khối này ảnh hưởng đến số lượng bào tử thu được sau thời gian lên men 48 giờ Các ion kim loại giữ vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa hệ thống enzyme cần thiết cho quá trình hình thành bào tử (Kolodziej và
Slepecky, 1964) Ren và ctv., (2018) thử nghiệm
trong sáu ion kim loại thì có ba ion Mn2+, Fe2+
và Ca2+ với nồng độ theo thứ tự 1,0 mM, 3,0
mM, 2,1 mM tạo bào tử B amyloliquefaciens
với mật độ 8,05x109, cao gấp 8,8 lần so với môi trường không bổ sung các ion kim loại này Ngoài ra, nghiên cứu của Phương Thị Hương
và Vũ Văn Hạnh (2018) cho thấy với tỷ lệ cấp giống 7%, pH 7, nhiệt độ lên men 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút và thành phần môi trường
Trang 1054 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
chứa 1,5% glucose, 1% pepton và Ca2+ 50 mM,
sinh khối của chủng B subtilis BSVN 15 đạt
6,3 x 1011 CFU/mL Tương tự trong nghiên
cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv., (2018), môi
trường thích hợp để sản xuất sinh khối của B
subtilis KP3 (4,46x109 CFU/mL) bao gồm 10
g/L glucose, 19,75 g/L đậu không dầu, amoni
citrate 1,7 g/L, mật rỉ 7,2 g/L, pepton từ thịt
11,13 g/L, MnCl2 16,58 mM, KH2PO4 4,58 g/L,
CaCl2 0,01 g/L, NaCl 4,04 g/L, FeSO4.7H2O 1
µM, MgSO4.7H2O 0,38 g/L, sau 8 giờ bổ sung
CaCl2 0,5 g/L và FeSO4.7H2O 35 µM có khả
năng kích thích mật độ bào tử tăng lên gấp 3
lần Ngoài ra, Yu và ctv., (1998) cho rằng mỗi
loại vi khuẩn khác nhau sẽ thích hợp với tỷ lệ
C/N trong môi trường sống nhất định
Ion Ca2+ là thành phần chủ yếu của lõi bào
tử và có khả năng gắn kết với thành phần đặc
biệt bào tử gọi là DPA (dipicolinic acid) giúp
bào tử có khả năng chịu đựng được nhiệt độ cao
(Levinson và ctv., 1961) Ngoài ra, Ca2+ tương
tác với các enzyme chịu trách nhiệm cho việc
tạo ra các kết nối giữa các protein bề mặt với
thành tế bào vi khuẩn, do đó ảnh hưởng đến khả
năng bám dính của vi khuẩn (Thomas và Rice,
2014)
V KẾT LUẬN
Trong điều kiện lên men quy mô phòng thí
nghiệm thể tích 50mL, thành phần môi trường
được lựa chọn nhằm tối ưu sinh khối của chủng
Bacillus S5 đã được xây dựng theo mô hình
Placket- Burman và phương pháp đáp ứng bề
mặt RSM bao gồm bột đậu nành 34,9 g/L, cao
nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L, tốc độ lắc 170
vòng/phút, pH môi trường 7,0 và nhiệt độ lên
men 300C, sau 48 giờ nuôi cấy giá trị OD550nm
đạt 11,36 tương ứng với mật độ 4,3x109 CFU/
mL Ngoài ra, bổ sung Ca2+ 0,5g/L sau 30 giờ
lên men, tế bào dinh dưỡng Bacillus S5 có khả
năng chuyển 93% sang dạng bào tử
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông và Trần Thu Hoa, 2009 Công nghệ Sinh học Dược, NXB Giáo Dục.
Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh, 2018 Lựa chọn điều kiện lên men cho sự sinh trưởng chủng
Bacillus subtilis BSVN 15 ứng dụng chế phẩm
probiotic trong chăn nuôi, Tạp chí Công Nghệ Sinh học 16(1): 167-172V.
Võ Hồng Phượng, Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và Đặng Ngọc Thùy, 2018 Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng, Báo cáo tổng kết năm 2018.
Vũ Thanh Thảo, Phan Cảnh Trình, Nguyễn Thị Linh Giang, Lê Văn Thanh và Trần Cát Đông, 2018 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử
Bacillus subtilis KP3, Y học TpHCM, Phụ bản
Tập 22(1): 453-459.
Tài liệu tiếng Anh
Bernlohr, R W và Leitzmann, C., 1969 Control of
sporulation London: Academic Press.
Castillo E Del (2007), Process Optimization A Statistical Approach., Springer Science New
York, USA, 118-122.
Chen, Z M., Li, Q., Liu, H M., Yu, N., Xie, T J., Yang, M Y., Shen, P và Chen, X D., 2010 Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged cultures by optimization of medium composition through statistical experimental
designs, Appl Microbiol Biotechnol, 85(5):
1353-60.
Duc, L H., Hong, H A., Barbosa, T M., Henriques,
A O và Cutting, S M., 2004 Characterization
of Bacillus probiotics available for human use,
Applied and environmental microbiology, 70(4):
2161-2171.
Granger, A C., Gaidamakova, E K., Matrosova, V Y., Daly, M J và Setlow, P., 2011 Effects of Mn and Fe levels on Bacillus subtilis spore resistance and effects of Mn2+, other divalent cations, orthophosphate, and dipicolinic acid on protein resistance to ionizing radiation, Appl Environ
Microbiol, 77(1): 32-40.
Cho, J.-H., Kim, Y.-B và Kim, E.-K., 2009 Optimization of culture media for Bacillus species
by statistical experimental design methods.