Nghiên cứu quy trình thủy phân tế bào nấm men thu nhận beta glucan từ bã men bia khô

β-glucan là hợp chất tự nhiên có tác dụng kích thích miễn dịch một cách hiệu quả lên động vật thủy sản. Trong các nguồn thu nhận thì tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae được xem là nguồn β-glucan dồi dào từ công nghiệp sản xuất rượu bia. Các phương pháp trích ly đã được áp dụng sao cho sản phẩm đạt được hàm lượng β-glucan cao nhất.

Trang 1

88 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THỦY PHÂN TẾ BÀO NẤM MEN THU

NHẬN BETA GLUCAN TỪ BÃ MEN BIA KHÔ

Phạm Duy Hải1*, Nguyễn Quốc Cường1, Lý Hữu Toàn1, Nguyễn Văn Nguyện1 TÓM TẮT

β-glucan là hợp chất tự nhiên có tác dụng kích thích miễn dịch một cách hiệu quả lên động vật thủy

sản Trong các nguồn thu nhận thì tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae được xem là nguồn

β-glucan dồi dào từ công nghiệp sản xuất rượu bia Các phương pháp trích ly đã được áp dụng sao cho sản phẩm đạt được hàm lượng β-glucan cao nhất Phương pháp enzyme được sử dụng trong bài báo này dùng để tinh sạch β-glucan từ các thành phần trong bã men bia Hai loại enzyme gồm protease PA 3.000 và α-amylase Licuamil được sử dụng trong thí nghiệm lần lượt thủy phân protein

và α-glucan sau công đoạn phá vỡ vách tế bào Kết quả thủy phân cho thấy hàm lượng protein giảm đáng kể khoảng 6 lần so với trước khi thủy phân Nồng độ protease tối ưu là 15 U/ml Đối với quá trình thủy phân α-glucan, nồng độ α-amylase tối ưu là 3 U/ml khi hàm lượng α-glucan giảm khoảng

8 lần so với trước khi thủy phân Các kết quả trên dẫn đến hàm lượng β-glucan tăng lên đáng kể với hàm lượng cao nhất là 67,70 % tính theo vật chất khô

Từ khóa: bã men bia, β-glucan, phương pháp enzyme, quy trình thủy phân.

1 Trung tâm Công nghệ Thức ăn và Sau thu hoạch Thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.

*Email: duyhaipp@gmail.com

I MỞ ĐẦU

β-glucan là hợp chất tự nhiên được tìm

thấy trong vách tế bào một số loài vi sinh vật

β-glucan được chứng minh có khả năng tạo kích

thích miễn dịch hiệu quả cho các loài động vật

thủy sản và có thể thay thế cho kháng sinh trong

ngành nuôi trồng thủy sản (Suphantharika và

ctv., 2003; Lage Cerenius và Kenneth Soderhall,

2004; Yang và ctv., 2014) β-glucan không chỉ

đa dạng về cấu tạo hóa học với các tên gọi khác

nhau như pullulan, curdlan, scleroglucan mà còn

đa dạng về nguồn khai thác trong tự nhiên từ các

loài vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, vi tảo) đến

các loài thực vật (yến mạch, lúa mì, nấm ăn)

(Meena và ctv., 2013; Zhu và ctv., 2016) Trong

đó, Saccharomyces cerevisiae là tế bào nấm

men được sử dụng phổ biến trong công nghiệp

sản xuất rượu bia Bã men bia thu được từ các

nhà máy bia là nguồn thu β-glucan do thành

phần glucan trong vách tế bào chiếm đến

50-55% (Asare, 2015) Bã men bia (spent brewer’s

yeast) là phụ phẩm của ngành công nghiệp bia,

là sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae

sinh ra trong quá trình lên men ethanol nhưng hoạt tính lên men bị yếu dần, khi kết thúc giai đoạn lên men, nấm men chìm dưới đáy phải được lấy ra ở đáy bồn để tránh cho nấm men tự phân trong bồn lên men (Clare Kerby và Frank Vriesekoop, 2017) Bã men bia phần lớn được bất hoạt bằng nhiệt và được tận dụng là nguyên liệu bổ sung trong thức ăn chăn nuôi hay đơn giản thải bỏ ra ngoài môi trường Tuy nhiên điều

đó lại gây ô nhiễm nguồn nước (Vesna Zechner-Krpan và ctv., 2010; Tran Minh Tam và ctv., 2013) Tuy tăng trưởng ngành bia trên thế giới đang trong giai đoạn bão hòa nhưng Việt Nam là 1 trong những nước có sản lượng bia lớn thứ 8 thế giới, chiếm 2,42% sản lượng bia trên thế giới (Đỗ Phương Thảo, Báo cáo ngành bia, 2017) Lượng bã nấm men bia thải ra từ công nghiệp bia vào khoảng 2,1 triệu tấn/năm (Mathias và ctv., 2014) Do đó, việc nghiên cứu

xử lý lượng bã men bia rất lớn từ ngành công nghiệp bia là rất cấp thiết nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng

Trang 2

Để thu nhận β-glucan từ bã men bia đòi hỏi phải nghiên cứu và xây dựng quy trình, các phương pháp trích ly, tinh sạch sao cho hàm lượng sản phẩm thu được đạt hàm lượng β-glucan cao nhất (> 60%) Các phương pháp thu nhận β-glucan từ tế bào nấm men khá đa dạng từ các phương pháp hóa học (Thammakiti

và ctv., 2004; Kim và Yun, 2006), phương pháp vật lý (Wenger và ctv., 2008; Liu và ctv., 2013) đến phương pháp enzyme (Milic và ctv., 2007;

Freimund và ctv., 2003; Jaehrig và ctv., 2008)

Trong đó, phương pháp enzyme có các

ưu điểm về hiệu quả trích ly, điều kiện phản ứng và thân thiện với môi trường so với các phương pháp khác như enzyme phân cắt có tính đặc hiệu, điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, nhiệt độ thấp, không gây ô nhiễm môi trường

Đã có các nghiên cứu về ứng dụng enzyme như tối ưu hóa trích ly polysaccharide từ lúa mạch trong nghiên cứu của Yong-guang Bi và Yu-min Li (2015) khi điều chỉnh các yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzyme, tỉ lệ enzyme-cơ chất theo thứ tự ưu tiên sao cho tối

ưu với tỉ lệ trích ly đạt 2,23% Artūras Javmen

và ctv., (2012) sử dụng enzyme phân giải nấm

men Actinomyces rutgersensis 88 với nhiệt

độ tối ưu 50OC và pH = 10 Trần Minh Tâm

và ctv., (2013) sử dụng phương trình tối ưu hóa trong trích ly β-glucan từ bã men bia kết hợp với sóng siêu âm Kết quả cho hàm lượng β-glucan đạt 72,06% hàm lượng chất khô

Do đó, nghiên cứu này sẽ trình bày về điều kiện thích hợp (nhiệt độ, thời gian, nồng

độ enzyme-cơ chất) trong phản ứng thủy phân bằng phương pháp enzyme sao cho sản phẩm thu được có hàm lượng β-glucan cao nhất Cụ thể, sử dụng enzyme protease để thủy phân protein, enzyme amylase thủy phân α-glucan lần lượt để tinh sạch thành phần tạp chất trong β-glucan

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm

Bã men bia là sinh khối nấm men

Saccharomyces cerevisiae lên men chìm đã qua

sử dụng Bã nấm men được thu lại và sấy khô

(Hình 1) và nghiền thành bột Bã men bia khô của nhà máy bia Sài Gòn (Sabeco) được cung cấp bởi công ty TNHH TM Đại Hùng Sáng Kết quả thành phần bã men bia thể hiện trong Bảng 1

Hình 1: Bã men bia

Các enzyme thương mại protease và ɑ-amylase có tên lần lượt là PA 3000 và Licuamil được cung cấp bởi công ty Dyadic International (Mỹ) Hoạt độ enzyme đối với PA 3.000 và Licuamil lần lượt là 10.000 U/g và 100.000 U/g

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu nhận vách tế bào nấm men từ

bã men bia

Hòa trộn bã men bia vào dung dịch 4% NaOH theo tỉ lệ 15% w/v và đun nóng lên 1210C trong nồi hấp thanh trùng trong thời gian 1 giờ sau đó để nguội, đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ dịch lỏng thu phần cặn và rửa

3 lần với nước cất, phần này được xem là vách

tế bào nấm men (SP1) bao gồm: glucan, protein

và lipid

2.2.2 Nghiên cứu loại bỏ protein

Sau khi thu nhận được SP1, phần cặn sẽ được hòa tan trong nước cất với tỉ lệ 10% (w/v) Sau đó, bổ sung dung dịch enzyme PA 3.000 đã được pha loãng với dung dịch đệm acetate pH 7,5 với 4 nồng độ enzyme khác nhau lần lượt 5 U/ml, 10 U/ml, 15 U/ml và 20 U/ml Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 370C trong thời gian 1,5 giờ, sau đó hỗn hợp được nâng nhiệt lên 1000C trong thời gian 15 phút nhằm bất hoạt enzyme và dung dịch được ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút

bỏ dịch lỏng thu cặn, phần cặn được gọi là SP2

Hình 1: Bã men bia

cứu xử lý lượng bã men bia rất lớn từ ngành công nghiệp bia là rất cấp thiết nhằm giảm thiểu ô

nhiễm môi trường và tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng

Để thu nhận β-glucan từ bã men bia đòi hỏi phải nghiên cứu và xây dựng quy trình, các

phương pháp trích ly, tinh sạch sao cho hàm lượng sản phẩm thu được đạt hàm lượng β-glucan

cao nhất (> 60%) Các phương pháp thu nhận β-glucan từ tế bào nấm men khá đa dạng từ các

phương pháp hóa học (Thammakiti và ctv., 2004; Kim và Yun, 2006), phương pháp vật lý

(Wenger và ctv., 2008; Liu và ctv., 2013) đến phương pháp enzyme (Milic và ctv., 2007;

Freimund và ctv., 2003; Jaehrig và ctv., 2008)

Trong đó, phương pháp enzyme có các ưu điểm về hiệu quả trích ly, điều kiện phản ứng và

thân thiện với môi trường so với các phương pháp khác như enzyme phân cắt có tính đặc hiệu,

điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, nhiệt độ thấp, không gây ô nhiễm môi trường Đã có các nghiên

cứu về ứng dụng enzyme như tối ưu hóa trích ly polysaccharide từ lúa mạch trong nghiên cứu

của Yong-guang Bi và Yu-min Li (2015) khi điều chỉnh các yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian, nồng

độ enzyme, tỉ lệ enzyme-cơ chất theo thứ tự ưu tiên sao cho tối ưu với tỉ lệ trích ly đạt 2,23%

Artūras Javmen và ctv., (2012) sử dụng enzyme phân giải nấm men Actinomyces rutgersensis 88

với nhiệt độ tối ưu 50OC và pH = 10 Trần Minh Tâm và ctv., (2013) sử dụng phương trình tối ưu

hóa trong trích ly glucan từ bã men bia kết hợp với sóng siêu âm Kết quả cho hàm lượng

β-glucan đạt 72,06% hàm lượng chất khô

Do đó, nghiên cứu này sẽ trình bày về điều kiện thích hợp (nhiệt độ, thời gian, nồng độ

enzyme-cơ chất) trong phản ứng thủy phân bằng phương pháp enzyme sao cho sản phẩm thu

được có hàm lượng β-glucan cao nhất Cụ thể, sử dụng enzyme protease để thủy phân protein,

enzyme amylase thủy phân α-glucan lần lượt để tinh sạch thành phần tạp chất trong β-glucan

2.1 Vật liệu thí nghiệm

Bã men bia là sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae lên

men chìm đã qua sử dụng Bã nấm men được thu lại và sấy khô

(Hình 1) và nghiền thành bột Bã men bia khô của nhà máy bia Sài

Gòn (Sabeco) được cung cấp bởi công ty TNHH TM Đại Hùng

Sáng Kết quả thành phần bã men bia thể hiện trong Bảng 1

Các enzyme thương mại protease và ɑ-amylase có tên lần lượt là

PA 3000 và Licuamil được cung cấp bởi công ty Dyadic

International (Mỹ) Hoạt độ enzyme đối với PA 3.000 và Licuamil

Trang 3

Hình 2: Quy trình thu nhận β-glucan

(Qui trình này được tham khảo từ Suphantharika

và ctv, 2003; Jaehrig và ctv., 2008)

2.2.3 Nghiên cứu loại bỏ ɑ-glucan

Thành phần glucan trong phần vách tế bào

nấm men (S Cerevisiae) thì ɑ-glucan chiếm 1 –

29% (Stefan Kwiatkowski và ctv., 2009) Do đó, nhằm thu được hàm lượng β-glucan tối đa, cần phải tiến hành loại bỏ ɑ-glucan bằng α-amylase (Andriy Synytsya và ctv., 2008) Phương pháp tiến hành tương tự như phần nghiên cứu loại

bỏ protein với enzyme ɑ-amylase sử dụng là Licuamind với các nồng khác nhau 1U/ml, 2 U/

ml, 3 U/ml, 5 U/ml và 7 U/ml tại nhiệt độ 370C trong thời gian 2,5 giờ Sau đó, dung dịch đem

ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ dịch lỏng thu cặn, phần cặn được gọi là SP3

2.2.4 Nghiên cứu loại bỏ lipid thô

Mẫu β-glucan được rửa 1 lần bằng cồn 960 Khuấy đều sao cho nấm men không bị vón cục Sau đó, ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút

2.3 Các phương pháp phân tích

2.3.1 Phân tích hàm lượng các chỉ tiêu

• Xác định hàm lượng Protein thô theo TCVN 4328 – 1 : 2007

• Xác định hàm lượng Lipid thô theo TCVN 4331 : 2001

• Xác định hàm lượng Xơ thô theo TCVN

4329 : 2007

• Xác định hàm lượng Tro tổng theo TCVN 4327 : 2007

• Xác định hàm lượng glucan tổng, α-glucan, β-glucan: bằng phương pháp

bộ kit của hãng Megazyme, Ireland

2.3.2 Phân tích thống kê

Số liệu được phân tích phương sai theo Duncan’s multiple range test dùng phần mềm SPSS version 16 và PASW Statistics 18 Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa khi P < 0,05

III KẾT QUẢ 3.1 Thu nhận vách tế bào nấm men từ

bã men bia

Từ kết quả Bảng 1 cho thấy khi sử dụng phương pháp thủy phân bằng NaOH loãng 4% với nhiệt độ 1210C trong thời gian 15 phút đạt hiệu quả thu hồi β-glucan đạt 19,12% Đồng thời khi sử dụng phương pháp thủy phân NaOH cũng giúp quá trình loại bỏ bớt protein trong sản phẩm thu được Với kết quả trên, nhóm thực hiện chọn phương pháp thủy phân bằng NaOH loãng

để tiến hành thu nhận vách tế bào nấm men Sản phẩm có tên gọi SP1, trong đó sản phẩm còn chủ yếu là: protein, lipid thô và glucan

lần lượt là 10.000 U/g và 100.000 U/g

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu nhận vách tế bào nấm men từ bã men

bia

Hòa trộn bã men bia vào dung dịch 4% NaOH theo

tỉ lệ 15% w/v và đun nóng lên 1210C trong nồi hấp

thanh trùng trong thời gian 1 giờ sau đó để nguội,

đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ

dịch lỏng thu phần cặn và rửa 3 lần với nước cất,

phần này được xem là vách tế bào nấm men (SP1)

bao gồm: glucan, protein và lipid

2.2.2 Nghiên cứu loại bỏ protein

Sau khi thu nhận được SP1, phần cặn sẽ

được hòa tan trong nước cất với tỉ lệ 10% (w/v)

Sau đó, bổ sung dung dịch enzyme PA 3.000 đã

được pha loãng với dung dịch đệm acetate pH 7,5

với 4 nồng độ enzyme khác nhau lần lượt 5 U/ml,

10 U/ml, 15 U/ml và 20 U/ml Hỗn hợp được ủ ở

nhiệt độ 370C trong thời gian 1,5 giờ, sau đó hỗn

hợp được nâng nhiệt lên 1000C trong thời gian 15

phút nhằm bất hoạt enzyme và dung dịch được ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ dịch

lỏng thu cặn, phần cặn được gọi là SP2

2.2.3 Nghiên cứu loại bỏ ɑ-glucan

Thành phần glucan trong phần vách tế bào nấm men (S Cerevisiae) thì ɑ-glucan chiếm 1 –

29% (Stefan Kwiatkowski và ctv., 2009) Do đó, nhằm thu được hàm lượng β-glucan tối đa, cần

phải tiến hành loại bỏ ɑ-glucan bằng α-amylase (Andriy Synytsya và ctv., 2008) Phương pháp

tiến hành tương tự như phần nghiên cứu loại bỏ protein với enzyme ɑ-amylase sử dụng là

Licuamind với các nồng khác nhau 1U/ml, 2 U/ml, 3 U/ml, 5 U/ml và 7 U/ml tại nhiệt độ 370C

trong thời gian 2,5 giờ Sau đó, dung dịch đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ dịch

lỏng thu cặn, phần cặn được gọi là SP3

2.2.4 Nghiên cứu loại bỏ lipid thô

Xử lý ɑ-glucan bằng enzyme ɑ-amylase, thu

nhận (SP3)

Thu nhận vách tế bào

Xử lý protein bằng enzyme protease, thu

nhận (SP2)

SP4

Bã men

SP1: glucan, protein và

lipid

SP2: glucan và lipid

SP3: β-glucan và lipid

Hình 2: Quy trình thu nhận β-glucan

(Qui trình này được tham khảo từ Suphantharika

và ctv, 2003; Jaehrig và ctv., 2008)

Trang 4

Bảng 1 Kết quả phân tích thu nhận vách tế bào nấm men

Các chỉ tiêu phân tích (%) theo VCK Protein Lipid Tro Xơ Glucan tổng α-glucan β-glucan

Bã men bia

b ±

a ±

b ±

a ±

c ±

a ± 0,16 Thủy phân

a ±

c ±

b ±

a ±

b ± 1,27

Ghi chú: các ký tự khác nhau trong cùng một cột cùng một chỉ tiêu chỉ mức độ khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05), số liệu thể hiện là giá trị trung bình và sai số chuẩn (SD) (n=5).

3.2 Nghiên cứu loại bỏ protein

Hình 3 Đồ thị thể hiện kết quả loại bỏ protein trong SP2 bằng enzyme protease

Từ kết quả trên chúng ta thấy rằng, nồng độ thích hợp sử dụng cho quá trình thủy phân loại

bỏ protein bằng phương pháp sử dụng enzyme protease mà nhóm nghiên cứu đang sử dụng với nồng độ là 15 U/ml là thích hợp và sau quá trình loại bỏ protein tạo ra được sản phẩm SP2

3.3 Nghiên cứu loại bỏ α-glucan

Theo như nghiên cứu của Andriy Synytsya

và ctv., (2008) thì α-glucan có khả năng sẽ được loại bỏ bằng enzyme α-amylase Quá trình thủy phân loại bỏ protein sử dụng nồng độ enzyme protease 15 U/ml Kết quả nghiên cứu với 05 nồng độ enzyme khác nhau lần lượt: 1 U/ml; 2 U/ml; 3 U/ml; 5 U/ml và 7 U/ml và kết quả thu được như Hình 4 (n=5)

Theo đồ thị trên Hình 1, trong thí nghiệm loại bỏ protein trong vách tế bào nấm men trong SP1 với bốn nồng độ enzyme khác nhau (n=5), ta thu được kết quả như trên Ở nồng độ enzyme

5 U/ml thì lượng protein ở khoảng 22% so với nguyên liệu ban đầu là 49,54%, glucan tổng ở mức 26%, gần gấp đôi so với nguyên liệu bã men bia Trong đó nồng độ enzyme 15 U/ml và 20 U/ml cho khả năng thủy phân protein cao nhất, lúc đó hàm lượng protein chỉ còn khoảng 3% Tỉ lệ nghịch với hàm lượng protein thì hàm lượng glucan tổng số và β-glucan cao nhất lần lượt là 41,15 ± 1,12 (%) và 37,01 ± 2,54 (%)

Theo như nghiên cứu của Andriy Synytsya và ctv., (2008) thì α-glucan có khả năng sẽ được loại bỏ bằng enzyme α-amylase Quá trình thủy phân loại bỏ protein sử dụng nồng độ enzyme protease 15 U/ml Kết quả nghiên cứu với 05 nồng độ enzyme khác nhau lần lượt: 1 U/ml; 2 U/ml; 3 U/ml; 5 U/ml và 7 U/ml và kết quả thu được như Hình 4 (n=5)

.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000

Nồng độ enzyme

Protein (% VCK) Glucan tổng (% VCK) Beta glucan (% VCK)

.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000

Nồng độ enzyme

Theo đồ thị trên Hình 1, trong thí nghiệm

loại bỏ protein trong vách tế bào nấm men

trong SP1 với bốn nồng độ enzyme khác nhau

(n=5), ta thu được kết quả như trên Ở nồng

độ enzyme 5 U/ml thì lượng protein ở khoảng

22% so với nguyên liệu ban đầu là 49,54%,

glucan tổng ở mức 26%, gần gấp đôi so với

nguyên liệu bã men bia Trong đó nồng độ

enzyme 15 U/ml và 20 U/ml cho khả năng

thủy phân protein cao nhất, lúc đó hàm lượng

protein chỉ còn khoảng 3% Tỉ lệ nghịch với

hàm lượng protein thì hàm lượng glucan tổng

số và β-glucan cao nhất lần lượt là 41,15 ± 1,12

(%) và 37,01 ± 2,54 (%)

Trang 5

Theo đồ thị trên Hình 1, trong thí nghiệm loại bỏ protein trong vách tế bào nấm men trong SP1 với bốn nồng độ enzyme khác nhau (n=5), ta thu được kết quả như trên Ở nồng độ enzyme

5 U/ml thì lượng protein ở khoảng 22% so với nguyên liệu ban đầu là 49,54%, glucan tổng ở mức 26%, gần gấp đôi so với nguyên liệu bã men bia Trong đó nồng độ enzyme 15 U/ml và 20 U/ml cho khả năng thủy phân protein cao nhất, lúc đó hàm lượng protein chỉ còn khoảng 3% Tỉ lệ nghịch với hàm lượng protein thì hàm lượng glucan tổng số và β-glucan cao nhất lần lượt là 41,15 ± 1,12 (%) và 37,01 ± 2,54 (%)

Theo như nghiên cứu của Andriy Synytsya và ctv., (2008) thì α-glucan có khả năng sẽ được loại bỏ bằng enzyme α-amylase Quá trình thủy phân loại bỏ protein sử dụng nồng độ enzyme protease 15 U/ml Kết quả nghiên cứu với 05 nồng độ enzyme khác nhau lần lượt: 1 U/ml; 2 U/ml; 3 U/ml; 5 U/ml và 7 U/ml và kết quả thu được như Hình 4 (n=5)

.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000

Nồng độ enzyme

Protein (% VCK) Glucan tổng (% VCK) Beta glucan (% VCK)

.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000

Nồng độ enzyme

α-glucan (% VCK) Glucan tổng (% VCK) β-glucan (% VCK)

Hình 4 Đồ thị thể hiện kết quả loại bỏ α-glucan trong SP3

Trong đồ thị Hình 4, kết quả nghiên cứu

với năm nồng độ enzyme khác nhau lần lượt:

1 U/ml; 2 U/ml; 3 U/ml; 5 U/ml và 7 U/ml

Khi sử dụng enzyme α-amylase để loại bỏ

α-glucan đạt hiệu quả khá cao từ sản phẩm

SP2, α-glucan chiếm 4,14 (%) xuống còn ở

mức 0,5% Nồng độ enzyme thích hợp cho

quá trình này là 3 U/ml Sau quá trình loại bỏ

α-glucan được sản phẩm SP3 và trong SP3 vẫn

còn chứa β-glucan, một ít protein và béo

3.4 Nghiên cứu loại bỏ béo thô

Trong sản phẩm SP3, thành phần béo chiếm khoảng 12%, đây là lượng rất lớn có khả năng sẽ gây ảnh hưởng cho quá trình tinh chế β-glucan

Do đó, cần phải rửa béo để tiến hành sử dụng phương pháp lọc Hiện nay, nhóm thực hiện sử dụng phương pháp rửa béo bằng ethanol và kết quả thu được hàm lượng béo trong sản phẩm SP4 còn lại khá thấp chỉ đạt 1,54% so với lúc chưa chiết béo 12,3%

Bảng 2 Kết quả các chỉ tiêu hóa học của các sản phẩm trong quá trình tách chiết.

Thành phần

Lipid

SP1 80,95 ± 0,09 20,63 ± 0,87b 22,56 ± 0,27c 7,11± 0,85 42,30 ± 0,38a

SP2 80,95 ± 0,09 3,60 ± 0,34a 13,30 ± 1,17b 5,47 ± 0,15 62,97 ± 0,42b

SP3 90,14 ± 0,33 3,41 ± 0,87a 12,30 ± 2,18b 5,11 ± 0,49 78,15 ± 6,54c

SP4 95,14 ± 0,47 3,11 ± 0,41a 1,54 ± 0,47 4,87 ± 0,23 90,15 ± 6,54d

Ghi chú: các ký tự khác nhau trong cùng một cột cùng một chỉ tiêu chỉ mức độ khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05), số liệu thể hiện là giá trị trung bình và sai số chuẩn (SD), n=5.

Bảng 3 Kết quả các chỉ tiêu glucan của các sản phẩm trong quá trình tách chiết.

Thành phần

Ghi chú: các ký tự khác nhau trong cùng một cột cùng một chỉ tiêu chỉ mức độ khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05), số liệu thể hiện là giá trị trung bình và sai số chuẩn (SD), n=5.

Trang 6

Theo Bảng 2 và 3 thì khi hàm lượng các

protein và α-glucan sau khi xử lý sẽ giảm đi thì

hàm lượng của β-glucan sẽ tăng lên trong quá

trình tinh sạch sản phẩm Hàm lượng protein

giảm đáng kể (khoảng 6 lần) dần theo thứ tự

SP1 > SP2, kéo theo hàm lượng carbohydrate

tăng theo 1,5 lần (Bảng 2) Đồng thời thu nhận

được hàm lượng β-glucan đạt 67,7%

IV THẢO LUẬN

Trong nghiên cứu của Xiao-Yong Liu và

ctv., (2008), hàm lượng mannanprotein trong

nấm men trước xử lý protein là 40% và glucan

chiếm 60% Sau khi thủy phân bằng enzyme

protamex ở điều kiện 55OC, pH = 7,5, thời

gian 5 giờ cho hàm lượng mannanprotein giảm

đáng kể 0,27% mannan và 2,99% protein, hàm

lượng β-glucan tăng lên 93,12% Protease

loại bỏ mananprotein theo cơ chế phá hủy

phức chất giữa mannan và protein làm cho

mannan và protein hòa tan trong dung dịch

Riêng β-glucan không tan được giữ lại Tương

tự trong nghiên cứu của Asif Ahmad và ctv.,

(2009) khi enzyme protease tỏ ra hiệu quả

trong loại bỏ protein trong lúa mạch khi cho

hàm lượng protein thấp nhất so với các phương

pháp trích ly acid, base và nước nóng Ở Hình

3, nồng độ enzyme 15 U/ml và 20 U/ml cho

khả năng thủy phân protein cao nhất, lúc đó

hàm lượng protein chỉ còn dưới 5%, thấp nhất

3,60 ± 0,34% ở 15 U/ml (Bảng 2) Tuy nhiên,

hàm lượng glucan ở 20 U/ml lại giảm dưới

40% so với 15 U/ml Tỉ lệ nghịch với hàm

lượng protein thì hàm lượng glucan tổng số và

β-glucan cao nhất ở nồng độ 15 U/ml lần lượt

là 41,15 ± 1,12 (%) và 37,01 ± 2,54 (Bảng 3)

Đối với thí nghiệm thủy phân α-glucan,

theo nghiên cứu của Andriy Synytsya và ctv.,

(2008), enzyme α-amylase có khả năng thủy

phân α-glucan Theo đó, với 2 mẫu nấm sò và

nấm bào ngư Nhật, Andriy Synytsya và ctv.,

(2008) nhận thấy sau khi xử lý α-glucan bằng

α-amylase ở điều kiện nồng độ 1/500 (v/v) ở

pH = 7 trong 30 phút thì hàm lượng tinh bột

(α-glucan) thấp nhất chỉ phát hiện hàm lượng

hầu như không có và chỉ theo dạng vết so với

nguyên liệu ban đầu là 1,2-2,6% Tương tự đối với nguyên liệu lúa mạch, sau khi xử lý α-amylase (40OC/3 giờ) trong phương pháp enzyme khi so sánh với các phương pháp trích ly acid, base và nước nóng Phương pháp enzyme cho hàm lượng tinh bột thấp nhất (Asif Ahmad và ctv., 2009) Do đó, trong Hình 4, nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình này là 3 U/ml Sau quá trình loại bỏ α-glucan được sản phẩm SP3 và trong SP3 vẫn còn chứa β-glucan, một ít protein và béo (Bảng 2 và 3)

Với số liệu từ Bảng 2 và 3, khi hàm lượng các thành phần tạp chất giảm đi và được loại

bỏ thì hàm lượng β-glucan trong sản phẩm đạt

độ tinh sạch càng cao Hàm lượng β-glucan cao nhất là SP3 với hàm lượng 54,12 ± 2,47 (Bảng 3) sau khi xử lý α-glucan α-Glucan giảm từ 4,14 đến 0,51% tương ứng với hàm lượng β-glucan tăng đáng kể khoảng 1,5 lần Khi khi sản phẩm được tách béo thì hàm lượng β-glucan đạt 67,7%

Theo Silke C Jaehrig và ctv., (2007), quá trình xử lý protein theo phương pháp enzyme cho thấy sự khác biệt đáng kể khi so sánh giữa trước và sau khi xử lý với enzyme Savinase khi hàm lượng protein giảm gần 9 lần, tỉ lệ nghịch với hàm lượng β-glucan theo khối lượng khô tăng gần gấp đôi Cũng theo Stefan Freimund và ctv., (2003) thì vách tế bào sau khi xử lý bằng enzyme protease trong

5 giờ, ở 45OC/ pH = 10,5 thu phần cặn thì hàm lượng protein xác định cho thấy hiệu quả của protease khi kết quả cho thấy lượng protein chỉ còn 5% Nghĩa là protease đã thủy phân hết 75% hàm lượng protein trong vách tế bào

và β-Glucan được tinh sạch lên đến 92%

V KẾT LUẬN

Phương pháp enzyme cho hiệu quả tinh sạch sản phẩm β-glucan khi loại bỏ phần lớn hàm lượng protein, α-glucan và béo trong mẫu Trong đó, nồng độ enzyme protease và α-amylase sử dụng lần lượt là 15 U/ml và 3 U/

ml Đồng thời loại bỏ béo bằng Ethanol 960 Kết quả là hàm lượng β-glucan cuối cùng tính

Trang 7

theo vật chất khô là 67,7 ± 1,52% Từ đó, đã xây dựng được qui trình thu nhận β-glucan đạt mức

>60% bằng enzyme (Hình 5)

Hình 5 β-glucan thu nhận từ bã men bia TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Đỗ Phương Thảo, 2017 Câu chuyện thoái vốn Nhà Nước và diện mạo mới cho ngành bia Việt Nam

Báo cáo ngành bia.

Tài liệu tiếng Anh

Andriy Synytsya, Katerina Mícková, Alla Synytsya, Ivan Jablonsky, Jirí Spevácekc, Vladimír Erban, Eliška Kováríková, Jana Copíková,

2009 Glucans from fruit bodies of cultivated

mushrooms Pleurotus ostreatus and Pleurotus

eryngii: Structure and potential prebiotic activity;

Carbohydrate Polymers, 76, 548–556.

Artūras Javmen, Saulius Grigiškis, Raimonda Gliebutė, 2012 β-glucan extraction from Saccharomyces cerevisiae yeast using Actinomyces rutgersensis 88 yeast lyzing

enzymatic complex; BIOLOGIJA, 58(2),51-59.

Asif Ahmad, Faqir Muhammad Anjum, Tahir Zahoor, Haq Nawaz & Ahmad Din, 2009

Physicochemical and functional properties

of barley β-glucan as affected by different

extraction procedures; International Journal of

Food Science and Technology, 44, 181–187.

Clare Kerby and Frank Vriesekoop, 2017 An Overview of the Utilisation of Brewery By-Products as Generated by British Craft Breweries;

Beverages, 3, 24, 1-12

Freimund S., Sauter M., Kappeli O and Dutler H.,

2003 A new non-degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity from baker’s

yeast Saccharomyces cerevisiae, Carbohydrate

Polymers, 54, 159–171.

Kim K.S and Yun H.S., (2006) Production

of soluble-glucan from the cell wall of

Saccharomyces cerevisiae; Enzyme and Microbial Technology, 39, 496–500.

Liu D., Zeng X.A., Sun D.W., Han Z., 2013 Disruption and protein release by ultrasonication of yeast

cells, Innovative Food Science and Emerging

Technologies, 18, 132–137.

Suphantharika, P Khunrae, P Thanardkit, C Verduyn,

2003 Preparation of spent brewers yeast β-glucans with a potential application as an immunostimulant for black tiger shrimp, Penaeus monodon

Bioresource Technology, 88, 55-60.

Meena D.K., Das P., Kumar S., Mandal S.C., Prusty A.K., Singh S.K., Akhtar M.S., Behera B.K., Kumar K., Pal A.K and Mukherjee S.C., 2013 Beta-glucan:

an ideal immunostimulant in aquaculture (a review)”,

Fish Physiology and Biochemistry, 39, 431-457.

Milic T.V., Rakin M and Marinkovic S.S., 2007

Utilization of baker’s yeast (Saccharomyces

cerevisiae) for the production of yeast extract: effects

of different enzymatic treatments on solid, protein

and carbohydrate recovery”, Journal of the Serbian

Chemical Society, 72(5), 451–457

Stefan Freimunda, Martin Sautera, Othmar Kappelib, Hans Dutler, 2003 A new non-degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity

from baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae,

Carbohydrate Polymers, 54, 159–171.

Stefan Kwiatkowski, Ursula Thielen, Phyllis Glenney

and Colm Moran, 2009 A Study of Saccharomyces

cerevisiae Cell Wall Glucans, The Institute of Brewing & Distilling, 115(2), 151-158.

Thammakiti S., Suphantharika M., Phaesuwan T and Verduyn C., 2004 Preparation of spent brewer’s yeast β-glucans for potential applications in the food

industry”, International Journal of Food Science

and Technology, 39, 21–29.

Wenger M.D., DePhillips P., and Bracewell D.G., 2008

A Microscale Yeast Cell Disruption Technique for Integrated Process Development Strategies”,

Biotechnology Progress, 24, 606-614.

Xiao-Yong Liua, Qiang Wang, Steve W Cuic, Hong-Zhi Liu, 2008 A new isolation method of

β-D-glucans from spent yeast Saccharomyces

cerevisiae”, Food Hydrocolloids, 22, 239–247.

Yong-guang Bi, Yu-min Li, 2015 Optimization of Enzymatic Extraction Barley Polysaccharides

Orthogonal Test Method”, International

Symposium on Material, Energy and Environment Engineering, 121-124.

Zhu F., Du B., Xu B., 2016 A critical review

on production and industrial applications of

betaglucans, Food Hydrocolloids, 52, 275-288.

Hình 5 β-glucan thu nhận từ

bã men bia

0,51% tương ứng với hàm lượng β-glucan tăng đáng kể khoảng 1,5 lần Khi khi sản phẩm được

tách béo thì hàm lượng β-glucan đạt 67,7%

Theo Silke C Jaehrig và ctv., (2007), quá trình xử lý protein theo phương pháp enzyme cho

thấy sự khác biệt đáng kể khi so sánh giữa trước và sau khi xử lý với enzyme Savinase khi hàm

lượng protein giảm gần 9 lần, tỉ lệ nghịch với hàm lượng β-glucan theo khối lượng khô tăng gần

gấp đôi Cũng theo Stefan Freimund và ctv., (2003) thì vách tế bào sau khi xử lý bằng enzyme

protease trong 5 giờ, ở 45OC/ pH = 10,5 thu phần cặn thì hàm lượng protein xác định cho thấy

hiệu quả của protease khi kết quả cho thấy lượng protein chỉ còn 5% Nghĩa là protease đã thủy

phân hết 75% hàm lượng protein trong vách tế bào và β-Glucan được tinh sạch lên đến 92%

Phương pháp enzyme cho hiệu quả tinh sạch sản phẩm

β-glucan khi loại bỏ phần lớn hàm lượng protein, α-β-glucan và béo

trong mẫu Trong đó, nồng độ enzyme protease và α-amylase

sử dụng lần lượt là 15 U/ml và 3 U/ml Đồng thời loại bỏ béo

bằng Ethanol 960 Kết quả là hàm lượng β-glucan cuối cùng

tính theo vật chất khô là 67,7 ± 1,52% Từ đó, đã xây dựng

được qui trình thu nhận β-glucan đạt mức >60% bằng enzyme

(Hình 5)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Đỗ Phương Thảo, 2017 Câu chuyện thoái vốn Nhà Nước và diện mạo mới cho ngành bia Việt Nam Báo cáo ngành

bia

Tài liệu tiếng Anh

Andriy Synytsya, Katerina Mícková, Alla Synytsya, Ivan Jablonsky, Jirí Spevácekc, Vladimír Erban, Eliška

Kováríková, Jana Copíková, 2009 Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms Pleurotus ostreatus and

Pleurotus eryngii: Structure and potential prebiotic activity; Carbohydrate Polymers, 76, 548–556

Artūras Javmen, Saulius Grigiškis, Raimonda Gliebutė, 2012 β-glucan extraction from Saccharomyces cerevisiae

yeast using Actinomyces rutgersensis 88 yeast lyzing enzymatic complex; BIOLOGIJA, 58(2),51-59

Asif Ahmad, Faqir Muhammad Anjum, Tahir Zahoor, Haq Nawaz & Ahmad Din, 2009 Physicochemical and

functional properties of barley β-glucan as affected by different extraction procedures; International Journal of

Food Science and Technology, 44, 181–187

Trang 8

OPTIMIZATION OF YEAST CELLS HYDROLYSATION TO OBTAIN BETA-GLUCAN FROM SPENT BREWER’S YEAST RESIDUE

Pham Duy Hai1*, Nguyen Quoc Cuong1, Ly Huu Toan1, Nguyen Van Nguyen1 ABSTRACT

β-glucan is a natural compound that stimulates non-specific immunity in aquatic animals Among

various sources of β-glucan, Saccharomyces cerevisiae is considered a rich and affordable source

of β-glucan from beverage industry Many methods of extraction have been applied to obtain the highest quantity of purified β-glucan In this study, enzyme method was used to purify β-glucan from other components in spent brewer’s yeast residue Two kinds of hydrolyzing enzymes, protease

PA 3000 and α-amylase Licuamil, were tested on the capacity to degrade protein and α-glucan molecule respectively, after cell wall destruction step The results showed that protein content after hydrolysation decreased about 6 times Optimal concentration of protease was 15 U/ml In addition, optimal α-amylase concentration was 3 U/ml when α-glucan content dropped about 8 times This treatment has lead to the final β-glucan content as high as 67.70 % on dry weight basis.

Keywords: β-glucan, enzyme method, hydrolysation, spent brewer’s yeast residue.

Người phản biện: TS Nguyễn Hoàng Nam Kha

Ngày nhận bài: 15/5/2019 Ngày thông qua phản biện: 26/6/2019

Ngày duyệt đăng: 28/6/2019

1 Research Center for Aqua-Feed Nutrition and Fishery Post-Harvest Technology, Research Institute for Aquaculture No.2

*Email: duyhaipp@gmail.com

Định dạng
Số trang	8
Dung lượng	779,88 KB