Mục đích của nghiên cứu là nhằm đánh giá ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên khả năng tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên và đồng thời tăng cường sức đề kháng của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.
Trang 11 Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 Email: sonvm.ria2@mard.gov.vn
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất kích thích miễn dịch (immunostimulant)
là các hợp chất hóa học hay sinh học, có khả
năng làm tăng cường đáp ứng miễn dịch tự
nhiên (innate immune responses) và có thể làm
cho các động vật tăng khả năng kháng bệnh vi
khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng (Anderson,
1992) Theo Bricknell và Dalmo (2005) diễn
tả immunostimulant là hợp chất từ tự nhiên có
khả năng điều chỉnh hệ miễn dịch bằng cách gia tăng sức đề kháng của vật chủ chống lại bệnh
mà hầu hết các trường hợp gây ra bởi mầm bệnh Theo Sakai (1999) phân loại chất kích thích hệ miễn dịch (immunostimulant) thành các nhóm khác nhau tùy thuộc vào nguồn góc: nhóm hóa chất tổng hợp (Levamisole, FK-565, Muramyl dipeptide, CpG oligodeoxynucleotides, )
và nhóm hoạt chất sinh học từ thành tế bào nấm, vi khuẩn Gram âm và dương (β-glucan,
ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO Haematococcus pluvialis
LÊN HỆ MIỄN DỊCH TỰ NHIÊN VÀ SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) KHÁNG BỆNH GAN THẬN MỦ
Võ Minh Sơn1, Văn Thị Thuý1
TÓM TẮT
Astaxanthin không những ứng dụng dùng làm chất bổ sung vào thức ăn giúp tăng cường màu sắc của cá cảnh, tăng hàm lượng astaxanthin trong thịt cá hồi mà còn là một trong những chất tăng cường hệ miễn dịch cho các động vật thủy sản Mục đích của nghiên cứu là nhằm đánh giá ảnh
hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên khả năng tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên và đồng thời tăng cường sức đề kháng của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Các thông số đáp ứng miễn dịch tự nhiên (hoạt động thực bào, sản sinh oxy hoạt hoá, ly-sozyme), tính mẫn cảm với E ictaluri và màu sắc thịt của cá tra được xác định sau khi cho ăn thức
ăn trộn H pluvialis (HP) với hàm lượng 0,5% và 1% HP trong 28 ngày Kết quả thu được tỉ lệ thực
bào (PA) của cá tra được ăn với thức ăn trộn HP (0,5% và 1%) cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) và tăng 3,78 và 3,29 lần so với đối chứng, theo trình tự Tuy nhiên chỉ số thực bào (PI) khác biệt không
có ý nghĩa giữa các nghiệm thức có bổ sung HP và đối chứng Hoạt tính sản sinh oxy hoạt hóa của
tế bào bạch cầu của cá tra được cho ăn 1% HP tăng 1,84 lần và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với đối chứng Tuy nhiên hoạt tính lysozyme khác biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức có
bổ sung HP và đối chứng Tỉ lệ sống của cá tra ở nghiệm thức bổ sung HP (0,5% và 1%) cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) và tăng 26,6% và 23,3% cao hơn so với đối chứng theo thứ tự, sau khi cảm
nhiễm với E ictaluri Thêm nữa, sử dụng HP không ảnh hưởng đến màu sắc (đỏ và vàng) của thịt
cá tra sau 28 ngày cho ăn Tóm lại, thức ăn có bổ sung HP với hàm lượng 0,5% và 1% có khả năng
tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên và tăng tỉ lệ sống của cá tra sau khi cảm nhiễm với E ictaluri và
đồng thời không ảnh hưởng đến màu sắc thịt cá tra
Từ khoá: Haematococcus pluvialis, miễn dịch tự nhiên, bệnh gan thận mủ, astaxanthin, Edwardsi-ella ictaluri
Trang 2Peptidoglucan, lipopolysaccharide, ); dịch chết
từ động-thực vật (Ete, Hde, Glycyrrhizin );
chất dinh dưỡng (vitamin C và E); hormone
và cytokine (lactoferrin, interferon, growth
hormone ); polysaccharide (chitin, chitosan,
oligosaccharide ), beta-caroten và astaxanthin
được tách chiết từ vi tảo Haematococcus
pluvialis (Lorenz và Cysewski, 2000)
Astaxanthin hay ketocarotenoid là một
trong những chất chiếm ưu thế trong các động
vật thuỷ sản sống trong môi trường biển, chúng
là nguồn nguyên liệu tạo màu đỏ hồng cho thịt
các loài cá (salmon, trout, red sea bream), cá
cảnh và nhiều loài giáp xác khác (Cysewski
và Lorenz, 2004) Các loài động vật thủy sản
không có khả năng tổng hợp astaxanthin trong
tế bào, do đó chúng hấp thu astaxanthin từ thức
ăn (Goodwin, 1984) Trong môi trường biển,
astaxathin được sinh tổng hợp từ các loài vi tảo
hay thực vật phù du Astaxanthin được ứng dụng
nhiều trong nuôi trồng thủy sản như là chất bổ
sung vào thức ăn nhằm mục đích cung cấp sắc
tố, cải thiện sức đề kháng, tăng khả năng sinh
sản, tăng trưởng, thành thục cho các động vật
thuỷ sản (Cysewski và Lorenz, 2004)
Trong nuôi trồng thủy sản, astaxanthin
được ứng dụng phổ biến và dùng làm thức
ăn cho các trang trại nuôi cá hồi, cá dìa và cá
cảnh nhằm tăng cường màu sắc thịt và ngoại
hình (Lorenz và Cysewski, 2000) Astaxanthin
và beta-carotene (100-200 mg/kg thức ăn) từ
tảo Dunaliella salina và nấm men đỏ Phaffia
rhodozyma có khả năng kích thích hệ miễn
dịch tự nhiên của cá hồi (Oncorhynchus mykiss
Walbaum) (Amar và ctv., 2004) Cùng tác giả
Amar và ctv (2000, 2001) cũng nghiên cứu sử
dụng beta-carotene và astaxanthin tổng hợp có
khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên
trên cá hồi Mới đây một nghiên cứu chứng
minh rằng astaxanthin có khả năng tăng cường
hệ miễn dịch tự nhiên và tăng sức đề kháng của
cá bơn Nhật bản (Paralichthys olivaceus) kháng
bệnh gây ra bởi Edwardsiella tarda (Kim và
ctv., 2012)
Tế bào bạch cầu (leucocyte) của cá rất
đa dạng bao gồm monocyte, macrophage, granulocyte và đóng góp trong hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá (Secombes, 1996) Tế bào thực bào bao gồm (neutrophil và macrophage) đóng vai trò quan trọng như là bức tường đầu tiên ngăn chặn lại các tấn công của các vi sinh vật gây bệnh (Ellis, 1999)
Respiratory burst được định nghĩa như là sự bùng nổ oxy hoá (oxidative burst) là quá trình sản sinh các chất oxy hoạt hoá ROS (reactive oxygen species) bởi tế bào thực bào phagocyte (hay tế bào bạch cầu, leucocyte) có tác dụng tiêu diệt mầm bệnh trong suốt quá trình thực bào, và
đó là một cơ bảo vệ vật chủ xảy ra thường xuyên nhằm chống lại khả năng xâm nhiễm của mầm bệnh Tuy nhiên, sự hoạt động quá mức của các chất oxy hóa mạnh (superoxide anion production
O2-, hydroxyl peroxide H2O2, hydroxy free radical OH-, hypoharous acids OCl-) dẫn xuất từ oxygen (reactive oxygen intermediates, ROIs)
có thể gây hại và độc cho tế bào vật chủ (Dalmo
và ctv., 1997; Ellis, 1999) Do đó, tế bào vật chủ có cơ chế bảo vệ và chuyển hóa các chất độc (như superoxide radicals) được tạo ra từ quá trình ROIs bằng các enzyme chống oxy hóa (antioxidants) như Superoxide dismutase (SOD) chuyển hóa O2- thành H2O2, glutathione peroxidase (GPx) và catalase (CAT) chuyển hóa
H2O2 thành nước có lợi cho tế bào (Sampaio và ctv., 2008; Scandalios, 2005)
Lysozyme là enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên
và nó được phân bố ở động vật có xương và không xương sống (Magnadóttir và ctv., 2005) Lysozyme được tìm thấy ở dịch nhầy (mucus),
mô lymphoid, huyết thanh, tế bào trứng, và trong dịch của cơ thể ở động vật thuỷ sản nước ngọt
và mặn (Magnadóttir và ctv., 2005; Yano, 1996) Lysozyme là enzyme có khả năng diệt khuẩn,
nó phân cắt nối β (1,4) giữa N-acetylmuramic acid và N-acetylglucosamine là hai phân tử cấu thành tế bào peptidoglycans của vi khuẩn gram dương (Ellis, 1999) và còn có khả năng phân
Trang 3giải vi khuẩn gram âm, ký sinh trùng và nấm
(Dalmo và ctv., 1997; Saurabh và Sahoo, 2008)
Do đó việc ứng dụng các hoạt chất sinh học có
khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên của
các loài động vật thuỷ sản đã nhận được sự quan
tâm của các nhà khoa học
Mục đích của nghiên cứu này là làm sáng
tỏ ảnh hưởng của Haematococcus pluvialis lên
đáp ứng hệ miễn dịch tự nhiên bao gồm các
thông số như hoạt động thực vào (phagocytic
activity), sản sinh oxy hoạt hoá (superoxide
anion production), lysozyme; và sức đề kháng
của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi E
ictaluri Đồng thời ảnh hưởng của HP lên màu
sắc thịt của cá tra
II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Tảo Haematococcus fluvialis (HP) chứa 2%
hàm lượng astaxanthin, được cung cấp từ phòng
Công nghệ tảo, Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Nghiên cứu KHCN Việt Nam Vi khuẩn
gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri
Gly09M) trên cá tra nhận từ Trung Tâm Quốc
Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng
Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ
Cá tra giống Pangasianodon hypophthalmus
(18,7±2,1 g/con) được chuyển từ Trung Tâm
Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thủy sản 2
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuẩn bị thức ăn thí nghiệm
Thức ăn tổng hợp Green Feed (protein 28%,
chất béo 5%, tro 12%, chất xơ 7%, độ ẩm 10%)
được sử dụng làm thức ăn cho tất cả các thí
nghiệm Tảo khô Haematococcus pluvialis được
trộn vào thức ăn với hàm lượng 0,5% (tương
đương astaxanthin 100 mg/kg thức ăn) và 1%
(tương đương astaxanthin 200 mg/kg thức ăn)
bằng cách hòa tan trong nước muối sinh lý NaCl
0,85%, trộn đều, sau đó trộn vào thức ăn và để
khô trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó áo
thức ăn bằng dầu mực (5% v/w lượng thức ăn) Thức ăn đối chứng sử dụng dầu mực với lượng thể tích tương đương với thức ăn thí nghiệm
2.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh
Vi khuẩn gây bệnh E ictaluri Gly09M
được nuôi trên môi trường thạch máu (bổ sung 5% máu cừu), ủ 28oC trong 30-36 giờ Dùng tăm bông gạt khuẩn lạc và huyền phù trong dung dịch đệm PBS (10mM sodium phosphate, 150mM sodium chloride, pH 7,2) Sau đó dựa vào đường chuẩn để xác định mật độ vi khuẩn
2.2.3 Phương pháp xác định LD50 Xác định mật độ vi khuẩn E ictaluri gây
chết 50% (LD50) cá tra dựa trên phương pháp của Reed và Muench (1938) Khảo sát tỉ lệ chết của cá sau khi gây nhiễm với vi khuẩn
E ictaluri Gly09M (tiêm vào xoang bụng)
với mật độ: 1x103, 1x104, 1x105, 1x106 cfu/cá (trọng lượng trung bình 18g/cá) Từ đó xác định liều gây chết gấp 2xLD50 cho thí nghiệm cảm nhiễm (Newaj-Fyzul và ctv., 2007)
2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng lên hệ miễn dịch tự nhiên và cảm nhiễm
Cá có trọng lượng trung bình 18,7±2,1 g/ con được thuần 2 tuần trong bể composite 20
m3, cho ăn bằng thức ăn Green Feed
Giai đoạn cho cá ăn thức ăn bổ sung HP trong 28 ngày: Thí nghiệm được tiến hành trong
bể kính 100 lít (dung tích 150 lít), mỗi bể chứa
30 cá, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần với nghiệm thức đối chứng dương (thức ăn không bổ sung HP), nghiệm thức bổ sung 0,5% HP (w/w) và 1% HP, và nghiệm thức đối chứng âm (thức ăn
bổ sung 1% HP) Cá được cho ăn theo tỉ lệ 5% trọng lượng thân, cho ăn 2 lần/ngày Nước thay 20-30%/tuần Sau 28 ngày cho ăn, cá được phân
bổ lại trong bể với 15 con/bể, dùng phương pháp tiêm vào xoang bụng tiêm 0,2ml dịch vi khuẩn (7,65x104 cfu/ml) tương đương với 1,53x104 cfu/
cá cho nghiệm thức đối chứng dương và nghiệm thức thử nghiệm, riêng nghiệm thức đối chứng
âm được tiêm NaCl 0,85% thay cho dịch vi khuẩn gây bệnh Hàng ngày đếm số cá chết trong mỗi
Trang 4bể và thu mẫu cá vừa chết kiểm tra vi khuẩn gây
bệnh trong thận và gan Thí nghiệm kết thúc khi
cá trong cá nghiệm thức không chết trong vòng 3
ngày liên tục Xác định tỉ lệ bảo hộ RPS (relative
percentage of survival) theo công thức sau:
RPS = [1 – (số cá chết ở nghiệm thức cho
ăn thức ăn thí nghiệm/số cá chết ở nghiệm thức
cho ăn thức ăn đối chứng)] x 100
2.2.5 Phương pháp đo các thông số miễn
dịch
Các thông số miễn dịch tự nhiên của cá tra
sau khi cho ăn bằng thức ăn có trộn HP được
xác định tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm và sau
28 ngày cho ăn
Máu của mỗi con cá được lấy bằng ống
tiêm 3ml (24-Gauge) để riêng biệt Mẫu máu
được để nhiệt độ phòng khoảng 30 phút và sau
đó giữ ở nhiệt độ 4oC Thu huyết thanh bằng
cách ly tâm ở 4000 ×g khoảng 15 phút ở 4oC
sau 2 giờ ủ đông, sau đó giữ trong tủ lạnh -80oC
cho đến khi sử dụng Huyết thanh được dùng để
đo lysozyme
2.2.5.1 Phương pháp tách tế bào bạch cầu
Thận trước (head kidney) của cá tra được
thu và rửa bằng L-15 (L1518, Sigma) hai lần và
nghiền trong 3ml dung dịch L-15 Dịch nghiền
của thận được lọc qua lưới (100µm) và nhỏ từ từ
vào ống ly tâm gradian tỉ trọng với 37% và 51%
Pecoll (P4937, Sigma), ly tâm 400 ×g khoảng
30 phút ở 4oC Tế bào bạch cầu (Leucocyte)
được thu hoạch ở khoảng giữa hai lớp Percoll
và rửa lại hai lần bằng L-15 ở 2000 rpm khoảng
10 phút ở 4oC Tế bào sống được kiểm tra bằng
dung dịch 0,1% trypan blue (T6146, Sigma),
tế bào sống sẽ không nhuộm màu xanh, tế bào
chết nhuộm màu xanh Mật độ tế bào được điều
chỉnh 2x106 tế bào/ml trong dung dịch L-15 và
được dùng tất cả các thông số đo như hoạt động
thực bào, oxy hoạt hóa (Yeh và ctv., 2008)
2.2.5.2 Hoạt động thực bào (phagocytic
activity)
Phương pháp xác định PA và PI được mô tả
bởi nghiên cứu trước bởi Yeh và ctv (2008) Cụ
thể, dịch tế bào bạch cầu thận trước (500 µl của 2x106 tế bào/ml trong dung dịch L-15) được hút vào đĩa nhựa nuôi cấy tế bào 12-giếng, và được
ly tâm 400×g khoảng 20 phút ở 4oC Loại bỏ tế bào không dính bằng cách rửa 3 lần với L-15 Nhỏ 500 µl dịch Fluorescent latex beat (mật
độ hạt 2x107 hạt/ml trong dung dịch L-15) vào giếng chứa tế bào bạch cầu và ủ 2 giờ ở 28oC Tiếp tục rửa 3 lần với PBS để loại bỏ các hạt không được thực bào bởi tế bào bạch cầu Sau
đó cố định các tế bào bằng dung dịch formalin (10%) khoảng 30 phút, sau đó rửa lại 3 lần với PBS Tế bào cố định được nhuộm với 0,1% propidium iodide (81845, Fluka) trong bóng tối Các tế bào bạch cầu có màu đỏ và hạt latex có màu xanh Phần trăm của tế bào thực bào (PA) được tính toán trên 100 tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus IX50, Tokyo, Japan) và chỉ số thực bào (PI) được định nghĩa như là số lượng trung bình của các hạt được thực bào bởi một tế bào
2.2.5.3 Sản sinh oxy hoạt hóa (superoxide anion production)
Hoạt động oxy hoạt hóa (respiratory burst activity or superoxide anion production) được sản sinh từ tế bào bạch cầu của thận trước được phân tích theo phương pháp Cook và ctv (2001) như đã mô tả nghiên cứu trước đây bởi Yeh và ctv (2008) bằng cách khử nitroblue tetrazolium (NBT) tạo thành formazan để đo hàm lượng superoxide Tóm tắt như sau: dung dịch tế bào bạch cầu thận trước (100 µl với mật độ 2x106 tế bào/ml trong dung dịch L-15) được cho vào dĩa nhựa (96-giếng, Flat bottom, Nunclon surface, Denmark) đã được phủ trước với 0,2% poly-L-lysine (P2636, Sigma) để cải thiện sự bám dính
tế bào lên bề mặt giếng Đĩa được ly tâm 700
×g khoảng 20 phút ở 4oC Sau đó những loại
bỏ những tế bào không bám dính và rửa lại với HBSS (H6648, Sigma) Zymozan (100 µl của 0,1% zymozan trong dung dịch HBSS) được cho vào giếng để cho phản ứng xảy ra khoảng
30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó rửa zymozan bằng 100 µl dung dịch HBSS Sau đó tế bào
Trang 5được nhuộm với 100 µl 0,3% NBT (N5514,
Sial) khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng NBT
được loại bỏ và dừng phản ứng bằng 100 µl
100% methanol Fomazan được hòa tan bằng
120 µl dung dịch 2M KOH và 140 µl dung dịch
DMSO (D2650, Sigma) Sau đó đo độ hấp thu
ở bước sóng 630 nm bằng máy ELISA reader
Oxy hoạt hóa (RBA) được tính như sau: RBA
= OD 630 mẫu kích thích (bổ sung zymosan) –
OD 630 mẫu trắng (không bổ sung zymosan)
2.2.5.4 Hoạt tính lysozyme
Hoạt động lysozyme (serum lysozyme
activity) trong huyết thanh được diễn tả bởi
Ellis (1990) và Obach và ctv (1993) Phương
pháp cụ thể được trình bày trong nghiên cứu
trước bởi Yeh và ctv (2008) Tóm tắt, 10 µl của
huyết thanh cá được trộn với 200 µl dung dịch
Micrococcus luteus (M3770, Sigma) (0,2mg/ml
trong dung dịch đệm 0,05M sodium phosphate,
pH 6,2) Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 27oC và
giá trị OD được đo sau 1 và 6 phút ở bước sóng
530nm bằng cách sử dụng ELISA reader Một
đơn vị lysozyme được định nghĩa như là lượng
enzyme làm giảm độ hấp thu OD 0,001/phút/ml
huyết thanh Hàm lượng lysozyme được tính dựa
vào đường chuẩn của lysozyme (L4631, Sigma)
2.2.6 Phương pháp đo màu sắc của thịt cá
tra
Cá ở các nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức bổ sung 0,5% và 1% HP vào thức ăn sau khi cho ăn 28 ngày, chọn 6 con cho mỗi nghiệm thức tiến hành phi lê và đo màu sắc của thịt Mỗi con cá được đo tại 2 vị trí ở phần gần đầu
và phần gần đuôi Xác định màu bằng thiết bị NIPPON DENSHOKU NR 300 Các giá trị đo
được thể hiện bằng hệ màu L*, a*, b* (CIE, 1976) trong đó L* biểu thị độ sáng (lighness)
với thang đo từ màu đen đến màu trắng (0-100), a* biểu thị tọa độ màu trên trục đỏ với giá trị dương (+) và lục với giá trị âm (-), b* tọa độ màu trên trục màu vàng với giá trị dương (+) và xanh với giá trị âm (-)
2.3 Xử lý số liệu
Multiple comparation (Tukey’s test) được
sử dụng để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức bằng phần mềm SPSS 13.0 (SPSS Inc., 1989-2004) Số liệu phần trăm (tỉ
lệ sống và tỉ lệ thực bào) được chuẩn hóa bằng hàm acrsin trước khi xử lý bằng SPSS Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là
p < 0,05.
III KẾT QUẢ 3.1 Ảnh hưởng của HP lên hệ miễn dịch
tự nhiên
3.1.1 Hoạt động thực bào
Hình 1 Tỉ lệ thực bào (A) và chỉ số thực bào (B) của cá tra được cho ăn thức ăn trộn HP sau 28 ngày Mỗi cột biểu thị số trung bình của 3 lần lặp lại và sai số chuẩn (SE) Số liệu ở cùng thời điểm
thu mẫu có kí hiệu chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05).
Trang 6Hoạt động thực bào (PA) của tế bào bạch
cầu (leucocyte) của cá tra được cho ăn với thức
ăn có bổ sung tảo HP với hàm lượng 0,5% và
1% tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so
với đối chứng sau 28 ngày cho ăn, và tăng 3,78
và 3,29 lần so với đối chứng (Hình 1A), theo
thứ tự Tuy nhiên, PA của các nghiệm thức có
bổ sung HP (0,5% và 1%) khác biệt không có ý
nghĩa (p > 0,05) Chỉ số thực bào (PI) của cá tra
ăn thức ăn có bổ sung HP khác biệt không có ý
nghĩa giữa các nghiệm thức (Hình 1B)
3.1.2 Sản sinh oxy hoạt hóa (superoxide
anion production)
Sản sinh oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu của cá tra sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung HP
ở nồng độ 1% tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p
< 0,05) và tăng 1,84 lần so với đối chứng (Hình 2A) Tuy nhiên, hoạt động oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu ở các nghiệm thức có bổ sung HP khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05)
3.1.3 Hoạt tính lysozyme (Lysozyme activity)
Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh của
cá tra sau khi cho ăn thức ăn bổ sung HP khác biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (Hình 2B)
Hình 2 Sản sinh oxy hoạt hoá (A) và hoạt tính lysozyme (B) của cá tra được cho ăn thức ăn trộn HP sau 28 ngày Mỗi cột biểu thị số trung bình của 3 lần lặp lại và sai số chuẩn (SE) Số liệu
ở cùng thời điểm thu mẫu có kí hiệu chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0.05)
3.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá tra giống bằng phương pháp tiêm
Bảng 1 Liều gây chết 50% (LD50) của cá tra sau khi gây nhiễm với E ictaluri
Liều gây nhiễm
(cfu/cá) Tổng số cá chết Tổng số cá sống chết cộng dồnTổng số cá sống cộng dồnTổng số cá Tỉ lệ chết cộng dồn (%)
Trang 7Sau khi cảm nhiễm E ictaluri ở nồng độ
103, 104, 105, 106 cfu/cá (trọng lượng trung bình
18,7g/con) Kết quả cho thấy liều gây chết 50%
(LD50) của E ictaluri là 1,53x103 cfu/cá sau 8
ngày cảm nhiễm (Bảng 1) Do đó liều vi khuẩn
gây bệnh E ictaluri dùng cho thí nghiệm cảm
nhiễm chính thức gấp 2 lần LD50, cụ thể là
1,53x104 cfu/cá
3.3 Khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh
gan thận mủ
Tất cả cá ở nghiệm thức đối chứng âm (tiêm
nước muối sinh lý) có tỉ lệ sống 100% sau 8 ngày (Hình 3) Tất cả cá ở những nghiệm thức
có tiêm E ictaluri sống sót 100% sau 2 ngày
Tuy nhiên, bắt đầu vào ngày thứ 3, cá chết được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng dương và nghiệm thức bổ sung 200 mg/kg thức ăn Từ ngày thứ 6 đến thứ 8, tỉ lệ sống của cá tra ở nghiệm thức bổ sung 0,5% HP (86,7 ± 3,3%)
và 1% HP (83,3 ± 3,3%) khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) và tăng 26,6% và 23,3% cao hơn so với đối chứng (60,0 ± 5,8%) và có tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 67% và 58% theo thứ tự
Hình 3 Tỉ lệ sống của cá tra được cho ăn thức ăn trộn HP (0,5% và 1%) trong 28 ngày sau khi
cảm nhiễm với E ictaluri Số liệu (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) ở cùng một thời điểm có ký tự
khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) giữa các nghiệm thức
3.4 Ảnh hưởng của HP lên màu sắc của
thịt cá tra
Giá trị L* biểu thị độ sáng của thịt cá tra,
kết quả ở Bảng 2 cho thấy khi cá tra được cho
ăn thức ăn có bổ sung 0,5% HP có thịt sáng
hơn và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác Tuy nhiên, giá trị a* (màu đỏ) và b* (màu vàng) khác biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức Do vậy khi sử dụng HP trộn vào thức ăn cho cá tra không ảnh hưởng đến màu sắc thịt cá tra
Trang 8IV THẢO LUẬN
Nhiều nghiên cứu chứng minh β-carotene
và astaxanthin có khả năng kích thích hệ miễn
dịch tự nhiên của động vật thuỷ sản Amar và
ctv (2001) nghiên cứu ảnh hưởng carotenoid
tổng hợp (sử dụng riêng lẻ astaxanthin,
canthaxanthin, β-carotene với hàm lượng 100
mg/kg) lên hệ miễn dịch cá hồi (Oncorhynchus
mykiss, 140g) và cho ăn trong 9 tuần, kết quả
cho thấy 3 loại carotenoid có khả năng tăng hoạt
động thực bào (PA) nhưng khác biệt không có
ý nghĩa so với đối chứng Trong khi đó chỉ có
β-carotene có khả năng tăng cường chỉ số thực
bào (PI) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng
Cùng tác giả Amar và ctv (2004) khi nghiên cứu
bổ sung β-carotene (tảo biển Dunaliella salina)
và astaxanthin (từ nấm đỏ Phaffia rhodozyma)
với hàm lượng 100 mg/kg và 200 mg/kg khoảng
9 tuần cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss, 50g)
Kết quả cho thấy hoạt động thực bào (PA) và
chỉ số thực bào (PI) tăng ở nghiệm thức bổ sung
β-carotene và astaxanthin khác biệt có ý nghĩa
so với đối chứng Điều này cũng được chứng
minh trong nghiên cứu này, hoạt động thực
bào tăng gấp 3,78 và 3,29 lần (0,5% và 1% HP
tương đương với astaxanthin 100 mg/kg và 200
mg/kg) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng
Tuy nhiên, chỉ số thực bào (PI) của tế bào bạch
cầu cá tra khác biệt không có ý nghĩa giữa các
nghiệm thức
Carotenoid tổng hợp (sử dụng riêng lẻ
astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene với hàm
lượng 100 mg/kg) được trộn vào thức ăn cho
cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss, 140g) ăn
trong thời gian 9 tuần, kết quả cho thấy oxy
hoạt hoá không khác biệt giữa các nghiệm thức (Amar và ctv., 2001) Kết quả tương tự khi sử dụng carotenoid tự nhiên (β-carotene từ tảo
biển Dunaliella salina và astaxanthin từ nấm đỏ Phaffia rhodozyma) dùng làm thức ăn bổ sung cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss Walbaum)
(Amar và ctv., 2004) Theo nghiên cứu gần đây nhất của Kim và ctv (2012) khi sử dụng bột astaxanthin trộn vào thức ăn cho cá bơn Nhật
bản (Paralichthys olivaceus) trong 15 ngày
Kết quả cho thấy sản sinh oxy hoạt hoá của tế bào bạch cầu của cá sau khi cho ăn 3 giờ và 24 giờ giảm khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng, nhưng sau thời gian cho ăn 6 giờ và 12 giờ thì tăng khác biệt có nghĩa so với đối chứng Trong nghiên cứu này, sản sinh oxy hoạt hóa của
tế bào bạch cầu của cá tra sau khi cho ăn thức
ăn có bổ sung HP ở nồng độ 1% (tương đương astaxanthin 200 mg/kg) tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với đối chứng Điều này có thể giải thích rằng ảnh hưởng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên của astaxanthin tuỳ thuộc vào vật chủ, trọng lượng, loại carotenoid và nguồn gốc, hàm lượng, thời gian cho ăn và thời gian thu mẫu sau khi cho ăn
Amar và ctv (2004) sử dụng carotenoid tự
nhiên (β-carotene 34,5% từ tảo biển Dunaliella salina; và astaxanthin 0,5% và xanthophyll 0,87% từ nấm đỏ Phaffia rhodozyma) dùng làm thức ăn bổ sung cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 125g) cho ăn trong 9 tuần, có
khả năng tăng hàm lượng lysozyme ở nghiệm thức bổ sung β-carotene khác biệt có nghĩa so với đối chứng Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chứng minh lysozyme không ảnh hưởng khi
Bảng 2 Màu sắc của thịt cá tra phi lê sau khi cho ăn thức ăn bổ sung HP (0,5% và 1%) sau 28 ngày
Nghiệm thức Màu sắc thịt của cá tra phi lê sau 28 ngày cho ăn với HP
Đối chứng 49,4 ± 2,4b 8,6 ± 2,2a 11,0 ± 2,5a
100 mg/kg 54,3 ± 3,4a 9,1 ± 2,1a 13,3 ± 3,2a
200 mg/kg 51,1 ± 2,9b 8,4 ± 3,3a 11,0 ± 1,5a
Trang 9bổ sung β-carotene/astaxanthin Hoạt tính
lysozyme tăng ở các nghiệm thức bổ sung
β-carotene (40-400mg/kg thức ăn) nhưng khác
biệt không có ý nghĩa so với đối chứng sau khi
bổ sung vào thức ăn cho cá hồi (Oncorhynchus
mykiss) cho ăn 12 tuần (Amar và ctv., 2000)
Theo Thompson và ctv (1995) nghiên cứu bổ
sung astaxanthin và vitamin A vào thức ăn cho
cá hồi (Oncorhynchus mykiss) khoảng 4 tháng,
kết quả cho thấy lysozyme huyết thanh không bị
ảnh hưởng Tuy nhiên, khi nghiên cứu sử dụng
kết hợp giữa astaxanthin và vitamin cho kết quả
dương tính lysozyme Amar và ctv (2001) thử
nghiệm bổ sung các loại carotenoid tổng hợp như
astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene (100mg/
kg) và vitamin A, C, E cho cá hồi (Oncorhynchus
mykiss) ăn trong 9 tuần Kết quả cho thấy
lysozyme huyết thanh ở nghiệm thức có bổ sung
vitamin và astaxanthin/β-carotene tăng cao khác
biệt có ý nghĩa so với đối chứng Tuy nhiên ở
nghiệm thức sử dụng astaxanthin/ β-carotene
không bổ sung vitamin, lysozyme huyết thanh
khác biệt không có nghĩa so với đối chứng
Tăng cường hệ miễn dịch và đồng thời
tăng cường tỉ lệ sống vật chủ sau khi cảm
nhiễm với các vi khuẩn gây bệnh thông qua
bổ sung các chất tăng cường hệ miễn dịch
(immunostimulator) trong đó có nhóm vitamin
B, vitamin C, vitamin E (Galaz và ctv., 2010;
Sakai, 1999) và β-carotene, astaxanthin (Kim
và ctv., 2012; Supamattaya và ctv., 2005) Theo
nghiên cứu gần đây nhất của Kim và ctv (2012)
khi sử dụng bột astaxanthin trộn vào thức ăn
cho cá bơn Nhật bản (Paralichthys olivaceus)
trong 15 ngày, kết quả cho thấy astaxanthin
có khả năng tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên
và tăng sức đề kháng của cá bơn Nhật bản
(Paralichthys olivaceus) kháng bệnh gây ra bởi
Edwardsiella tarda (Kim và ctv., 2012) Một
nghiên cứu khác sử dụng dịch chiết tảo biển
Dunaliella (chứa hàm lượng β-carotene 2%)
trên tôm sú (Penaeus monodon) có khả năng
tăng cường sức đề kháng và tỉ lệ sống của tôm
kháng virus gây hội chứng đốm trắng WSSV
(Supamattaya và ctv., 2005) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng, với RPS đạt 25% Kết quả tương tự khi tiêm astaxanthin cho tôm càng
xanh (Macrobrachium rosenbergii) làm tăng tỉ
lệ sống khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng sau khi cảm nhiễm với với vi khuẩn gây bệnh
Lactococcus garvieae với RPS đạt 35% Điều
này phù hợp trong nghiên cứu này, khi sử dụng
Haematococcus pluvialis trộn vào thức ăn cho
cá tra ăn 28 ngày làm tăng cường miễn dịch tự nhiên đồng thời tăng tỉ lệ sống của cá khác biệt
có ý nghĩa so với đối chứng sau khi cảm nhiễm
với E ictaluri và đạt RPS 58% ở nghiệm thức
1% HP (200 mg astaxanthin/kg thức ăn) và 67%
ở nghiệm thức 0,5% HP (100 mg astaxanthin/ kg) thức ăn
Nghiên cứu ảnh hưởng carotenoid (β-carotene, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin, astaxanthin) lên màu sắc của da và thịt phi lê, nồng độ carotenoid trong thịt của cá nheo Mỹ
(Ictalurus, punctatus) trong khoảng 12 tuần
cho ăn Kết quả cho thấy cá nheo Mỹ có thể tích luỹ sắc tố vàng (lutein và zeaxanthin), sắc
tố đỏ hay tím (canthaxanthin và astaxanthin) trong thịt và cho màu vàng (Li và ctv., 2007) Trong nghiên cứu này, khi thức ăn trộn với
Haematococcus pluvialis 0,5% và 1% (với hàm
lượng astaxanthin 100 và 200 mg/kg thức ăn) cho cá tra ăn trong thời gian 4 tuần không ảnh hưởng đến màu sắc của thịt cá tra Điều này có thể thời gian cho ăn ngắn nên cá tra chưa tích luỹ được màu của astaxanthin
V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Sử dụng Haematococcus pluvialis với
liều lượng 0,5% và 1% (100 mg và 200 mg astaxanthin/kg thức ăn) có khả năng tăng cường
hệ miễn dịch tự nhiên như tăng hoạt động thực bào gấp 3,78 và 3,29 lần so với đối chứng theo thứ tự, hoạt tính sản sinh oxy hoạt hóa của cá tra được cho ăn 1% HP tăng 1,84 lần và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và đồng thời
tỉ lệ sống của cá tra tăng 26,6% và 23,3% cao hơn so với đối chứng theo thứ tự, sau khi cảm
nhiễm với E ictaluri Ngoài ra sử dụng tảo H
Trang 10pluvialis ảnh hưởng đến màu sắc (đỏ và vàng)
sau khi cho ăn 28 ngày Tóm lại, H pluvialis có
tiềm năng dùng làm chất tăng cường hệ miễn
dịch tự nhiên và tăng cường sức đề kháng của
cá tra kháng bệnh gan thận mủ
Cần tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời
gian cho ăn, tần suất cho ăn lên chất lượng thịt
cá tra
PHẦN CẢM ƠN
Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ
kinh phí từ đề tài ″Nghiên cứu công nghệ nuôi
vi tảo Haematococcus pluvialis và công nghệ
chiết xuất astaxanthin″ cấp Bộ Nông Nghiệp
và Phát Triển Nông Thôn thuộc chương trình
công nghệ sinh học thuỷ sản năm 2010-2012
Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Sinh học thực
nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản
2 và các bạn bạn đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Amar, E C., Kiron, V., Satoh, S., Okamoto, N., and
Watanabe, T., 2000 Effects of dietary β-carotene
on the immune response of rainbow trout
Oncorhynchus mykiss Fisheries Science 66,
1068-1075.
Amar, E C., Kiron, V., Satoh, S., and Watanabe, T.,
2001 Influence of various dietary synthetic
carotenoids on bio-defence mechanisms in
rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum)
Aquaculture Research 32, 162-173.
Amar, E C., Kiron, V., Satoh, S., and Watanabe,
T., 2004 Enhancement of innate immunity in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum)
associated with dietary intake of carotenoids from
natural products Fish & Shellfish Immunology
16, 527-537.
Anderson, D P., 1992 Immunostimulants, adjuvants,
and vaccine carriers in fish: application to
aquaculture Anual Review of Fish Diseases 2,
281-307.
Bricknell, I., and Dalmo, R A., 2005 The use of
immunostimulants in fish larval aquaculture Fish
& Shellfish Immunology 19, 457-472.
CIE, 1976 Official Recommendations on Uniform
Color Space, Color Difference Equations
and Metric Color Terms Suppl No 2 to CIE
Publication No 15 Colorimetry Commission International de l’Eclairage Paris.
Cook, M T., Hayball, P J., Hutchinson, W., Nowak, B., and Hayball, J D., 2001 The efficacy of a commercial β-glucan preparation, EcoActiva™,
on stimulating respiratory burst activity of
head-kidney macrophages from pink snapper (Pagrus auratus), Sparidae Fish & Shellfish Immunology
11, 661-672.
Cysewski, G R., and Lorenz, R T., 2004 Industrial production of microalgal cell-mass and secondary
products-species of high potential Haematococcus
In: Richmond, A Handbook of microalgal culture: Biotechnology and applied phycology Blackwell Science Ltd, USA pp: 1-566
Dalmo, R A., Ingebrigtsen, K., and Bøgwald, J., 1997 Non-specific defence mechanisms
in fish, with particular reference to the reticuloendothelial system (RES) Journal of Fish Diseases 20, 241-273.
Ellis, A., 1990 Lysozyme assay p: 101-103 In: Stolen J.S., D.P Fletcher, B.S Anderson, and B.S Robertson (eds) Techniques in fish immunology USA: SOS Publication.
Ellis, A E., 1999 Immunity to bacteria in fish Fish & Shellfish Immunology 9, 291-308.
Reed, L J., and Muench, H., 1938 A simple method
of estimating fifty percent endpoints American Journal of Epidemiology 27, 493-497.
Galaz, G B., Kim, S S., and Lee, K J., 2010 Effects
of different dietary vitamin E levels on growth performance, non-specific immune responses,
and disease resistance against Vibrio anguillarum
in parrot fish (Oplegnathus fasciatus)
Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 23, 916-923
Goodwin, T W., 1984 In: The Biochemistry of the carotenoids Volume I & II Chapman & Hall, London.
Kim, S.-S., Song, J.-W., Kim, W., and Lee, K.-J., 2012 Effects of Dietary Astaxanthin on Innate Immunity and Disease Resistance against
Edwardsiella tarda in Olive Flounder Paralichthys olivaceus The Israeli Journal of Aquaculture -
Bamidgeh 740.
Li, M H., Robinson, E H., Oberle, D F., and Zimba, P V., 2007 Effects of Various Dietary Carotenoid Pigments on Fillet Appearance and
Pigment Absorption in Channel Catfish, Ictalurus punctatus Journal of the World Aquaculture
Society 38, 557-563.