Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men Pichchia pastoris

Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi.

DÒNG HÓA VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRONG TẾ BÀO NẤM

MEN PICHCHIA PASTORIS

Ngô Thị Ngọc Thủy1, Nguyễn Viết Dũng2, Đặng Thị Trà My1

TÓM TẮT

Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus phổ biến và là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm he trên thế giới cũng như ở Việt Nam Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi Đoạn gen VP28 đã được khuếch đại bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction; sản phẩm khuếch đại sau đó được dòng hóa vào vector pPIC9K để tạo tái tổ hợp pPIC9K-VP28 rồi pPIC9K-VP28 được biến nạp vào tế bào nấm men

Pichia pastoris GS115 để biểu hiện protein mục tiêu và cảm ứng biểu hiện bằng methanol Quá trình sàng lọc

200 chủng nấm men sau biến nạp đã được thực hiện Kết quả thu được 5 chủng nấm men có mang pPICK9K-VP28 có khả năng cảm ứng biểu hiện protein pPICK9K-VP28 ngoại bào Áp dụng phương pháp Bradford để đo nồng

độ protein ngoại bào của 5 chủng nghiên cứu theo thời gian lên men P pastoris và lượng protein tổng số cao

nhất sau 72 giờ nuôi cấy là 106,9 μg/ml

Từ khóa: Pichia pastoris, protein, VP28, WSSV

1 Phân Viện Nghiên cứu Thuỷ sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2

Email: thuyngo8@yahoo.com

2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2

I MỞ ĐẦU

Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot

syndrome virus - WSSV) xuất hiện đầu tiên

năm 1992 tại Trung Quốc (Chou và ctv, 1995)

là loại virus gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến

nhất cho các loài tôm he Ở Việt Nam, virus

này được phát hiện năm 1993 và từ đó đến nay

chúng luôn là một trong những nguyên nhân

chủ yếu gây thiệt hại kinh tế lớn cho nghề nuôi

tôm Theo cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn, năm 2012, bệnh đốm trắng đã

xuất hiện ở vùng nuôi tôm của 19 tỉnh thành

trên cả nước với tổng diện tích bệnh là 8.108,5

ha Bảy tháng đầu năm 2013, dịch bệnh đốm

trắng đã xuất hiện và lây lan nhanh tại 23 tỉnh

với tổng diện tích bệnh là 7.030 ha Nhằm giảm

thiểu thiệt hại do dịch bệnh đốm trắng gây ra,

các biện pháp phòng bệnh bằng thảo dược,

bằng chất kích thích miễn dịch và đặc biệt bằng protein/DNA tái tổ hợp (vắc xin/tolerine), đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu nhất là sau khi hiện tượng “đáp ứng miễn dịch” (quasi-immune response) trên tôm (Venegas và ctv, 2000) được công bố

Việc sử dụng kỹ thuật tạo protein DNA tái

tổ hợp đã được nghiên cứu ở Việt Nam với mục tiêu phát triển kháng thể đa dòng trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (Nguyễn Quỳnh Anh 2006; Bùi Thị Bích Hằng, 2012) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật này trong việc nghiên cứu chế tạo vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm Nghiên cứu này là một phần của đề tài cấp Bộ: “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất tolerin có khả năng hạn chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm Sú nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông

Cửu Long” sẽ thực hiện việc dòng hóa và biểu

hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây

bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men để làm

nguyên liệu cho việc chế tạo vắc xin/tolerine

phòng bệnh cho tôm

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Chủng virus đốm trắng được sử dụng

trong nghiên cứu này là chủng thu được tại

tỉnh Quảng Ngãi trong thời gian dịch bệnh; là

loại virus đã dùng trong nghiên cứu của Dieu

(2010) được cung cấp bởi trường Đại học

Wageningen, Hà Lan

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Công việc được tiến hành tại Viện Nghiên

cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 từ tháng 4/2013 đến

tháng 12/2013

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tạo vector tái tổ hợp

pPick9K-VP28

(1) Chuẩn bị gen VP 28 và vector

 Khuếch đại và tinh sạch cấu trúc gen

VP28 (Jha và ctv, 2007)

Đoạn gen VP28 của virus được nhân lên về

số lượng bằng phương pháp polymerase chain

reaction (PCR) sử dụng cặp mồi VP28YE-FW

(5’-AAAGAATTCATGGATCTTTCTTTCA

CTCTTTCGGG-3’) mang trình tự

nhận biết enzyme cắt giới hạn EcoRI và

VP28YE-R-His (5’-GCGGCCGCATG

AT G AT G AT G AT G AT G C T C G G T C T C

AGTGCCAGAG-3’) có gắn trình tự nhận biết

của enzyme cắt giới hạn NotI và một trình tự mã

hóa liên tục 6 amino acid Histidine (phần gạch

chân) Điều kiện phản ứng: 94°C trong 3 phút

sau đó chu kỳ 95°C trong 30 giây, 55°C trong

45 giây, 72°C trong 60 giây được lặp lại 35 lần

và phản ứng được giữ ở 72°C trong 10 phút

trước khi kết thúc Sản phẩm phản ứng được

điện di trên gel agarose 1,5% và kiểm tra dưới

tia UV Sản phẩm PCR của gen VP28 là 650bp

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng cách

sử dụng bộ kit PCR purification (Invitrogen) và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Tinh sạch plasmid pPICK9K

Plasmid pPIC9K trong vi khuẩn E coli

DH5α được tinh sạch bằng bộ kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification (A1330,

Promega, Mỹ) Cụ thể, một khuẩn lạc E coli

DH5α mang vector pPIC9K trên môi trường

LB có ampicilin được chọn và nuôi sinh khối trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin (100µg/ml), nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) ở 37°C; sinh khối thu sau 18-24 giờ nuôi cấy Sau

đó, plasmid pPIC9K trong sinh khối vi khuẩn nuôi cấy được tinh sạch bằng kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất Plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C

 Xử lý DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch bằng enzyme cắt giới hạn

DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch được

xử lý với enzyme cắt giới hạn EcoRI và NotI

Thành phần hóa chất tham gia quá trình phân cắt bao gồm: 1,6μl nước cất; 30,0μl DNA (VP28) hoặc pPIC9K; 4,0μl NEB Buffer 3 (10X); 2,0μl EcoRI (10.000U/μl, NEB); 2,0μl NotI (10.000U/ μl, NEB) và 0,4μl BSA 100X Hỗn hợp cắt được ủ qua đêm ở 37°C Toàn bộ sản phẩm sau phản ứng được điện di trên gel agarose 1% và sau đó tinh sạch lại bằng bộ hóa chất Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Mỹ) Sản phẩm sau tinh sạch được bảo quản ở -20°C

(2) Tạo vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28

Gen VP28 và vector pPIC9K sau khi được

xử lý với 2 enzyme EcoRI và NotI sẽ được nối

bằng enzyme gắn kết T4 ligase (Promega, Mỹ) Phản ứng nối bao gồm các thành phần: 2μl nước cất, 1μl dung dịch đệm 10x, 1μl VP28/EcoRI-NotI, 5μl pPIC9K/EcoRI-VP28/EcoRI-NotI, 1,0μl T4 ligase,

ủ nhiệt độ phòng trong 2 giờ Bằng việc thiết lập pPICK9K-VP28 tại vị trí chèn của cặp enzyme EcoRI và NotI, hệ thống vector này sẽ cho phép biểu hiện protein VP28 tái tổ hợp mang trình

tự peptide α-factor, protein VP28 với 6xHis

gắn ở đầu C-terminal sẽ được P pastoris tiết

ra môi trường nuôi cấy Trong quá trình tiết ra

môi trường, trình tự peptide α-factor sẽ tự động

được cắt bỏ

(3) Phương pháp hóa biến nạp và chọn

dòng vi khuẩn tái tổ hợp

Sử dụng phương pháp biến nạp bằng sốc

nhiệt để chuyển sản phẩm nối pPIC9K-Vp28

vào các tế bào khả nạp E coli JM109 (L2001,

Promega, Mỹ) Quy trình tóm tắt như sau: lấy

2μl sản phẩm nối pPIC9K-VP28 cho vào 50 μl

E coli giữ lạnh, khuấy nhẹ và ủ 15 phút trong

đá lạnh; rồi cho vào bể nhiệt ở 42°C trong 45

giây và ủ ngay lại trên đá lạnh trong 2 phút

Dung dịch sau đó được bổ sung 950μl môi

trường SOC lạnh và nuôi cấy lắc (200 vòng/

phút) trong 1 giờ ở 37°C Chia đều 1000μl

hỗn hợp thành hai phần và trải trên 2 đĩa môi

trường LB Agar có ampiciline (100 μg/ml) và

ủ ở 37°C qua đêm Sự hiện diện của

pPIC9K-VP28 trong vi khuẩn được kiểm tra bằng

phương pháp PCR với mồi VP28YE-FW và

VP28YE-R-His Đồng thời, sự hiện diện của

gen VP28 trong vector tái tổ hợp

pPICK9k-VP28 được xác định bằng máy giải trình tự AB

system với mồi giải trình tự AOX1 Reverse

5’-GCAAATG GCATTCTGACATCC-3’ và α

factor 5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’

(Công ty Nam Khoa, Việt Nam)

2.3.2 Điện biến nạp pPICK9K-VP28 vào

tế bào nấm men

Vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 được mở

vòng bằng enzyme SalI nhằm tạo điều kiện cho

gene mục tiêu gắn chèn vào bộ gene P pastoris

GS115 ở vị trí gene HIS4 và giữ được gene

AOX1 nguyên vẹn Do đó, đa số các chủng nấm

men này là có kiểu hình Mut + - gen AOX1 tự

nhiên của nấm men còn nguyên vẹn - có thể

phát triển tốt trên môi trường có methanol Tuy

nhiên, do trong plasmid vẫn còn sự hiện diện

của trình tự AOX1 nên sự tái tổ hợp cũng có thể

xảy ra trên gene AOX1 làm bất hoạt gen, kết

quả các dòng nấm men này chỉ còn gene AOX2 nên quá trình biến dưỡng methanol sẽ kém đi và

được gọi là chủng Mut S Ngược lại, ở kiểu hình Muts gen AOX1 bị bất hoạt nên quá trình biến dưỡng methanol sẽ kém đi, làm nấm men phát triển kém trên môi trường có methanol

pPICK9K-VP28 và pPICK9K rỗng (không mang gen mục tiêu) ở dạng mạch thẳng sẽ

được điện biến nạp vào P pastoris GS115

(Invitrogen, Mỹ) Cụ thể, 10µg pPICK9K-VP28 hoặc pPICK9K mạch thẳng được trộn cùng 80µl tế bào nấm men khả biến đã tinh sạch trong cuvette điện biến nạp vô trùng Cuvette này được ủ đá trong 5 phút rồi tiến hành điện biến nạp ở 1500V trong 1,5 giây Sau đó, 100µl Sorbitol 1M lạnh được cho vào cuvette rồi tiến hành trải hỗn hợp tế bào sau điện nạp trên 2 đĩa môi trường MD, ủ đĩa ở 28°C Sau 2-3 ngày nuôi cấy, quan sát các khuẩn lạc mọc trên môi trường MD

2.3.3 Chọn lọc dòng P pastoris mang gen VP28 và có khả năng biểu hiện protein

(1) Chọn lọc dựa trên tốc độ tăng trưởng trên môi trường chứa methanol

Chuyển các chủng Pichia tái tổ hợp trên

môi trường Minimal dextrose (MD) sau điện biến nạp sang môi trường Minimal methanol (MM), MD và Yeast extract peptone dextrose (YPD), theo thứ tự Ủ các đĩa môi trường ở 28°C trong 2-3 ngày Các chủng Mut+ và MutS

được phân biệt dựa vào mức độ tăng sinh của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình thường trên cả MM và MD, trong khi, MutS chỉ tăng trưởng trên môi trường MD mà không hoặc tăng trưởng yếu trên MM

(2) Chọn lọc dòng nấm men mang gene mục tiêu bằng PCR

Sự hiện diện của plasmid pPIC9K-VP28

trong các dòng P pastoris được xác định

bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F ( 5 ’ G A C T G G T T C C A AT T G A C A A G C )

TGGCATTCTGACATCC) DNA từ các dòng

nấm men được tách chiết bằng bộ kit DNeasy

Plant Mini (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà

sản xuất Điều kiện phản ứng: 10ng DNA;

1,25µl mồi (10µM), 0,5µl dNTP mix (10mM),

2,5µl dung dịch đệm và MgCl2 (10x), 1µl Taq

polymerase (1U), ddH2O cho đủ 25µl Chế độ

nhiệt của phản ứng : 94°C trong 5 phút, sau đó

là 30 chu kỳ 94°C trong 5 giây, 55°C trong 30

giây, 72°C trong 2 phút 30 giây và cuối cùng là

chu kỳ 72°C trong 10 phút Kết quả được điện

di trên agarose gel 1%

(3) Chọn dòng P pastoris mang nhiều gen

VP28 trên môi trường YPD Geneticin

Vector pPICK9K có trình tự mã hóa cho

gen kanamycine, gen này không kháng kháng

sinh kanamycine mà kháng G418 Mức kháng

G418 phụ thuộc vào số lượng gen kanamycine

tích hợp trong P pastoris Giữa gen kanamycine

và “cassette biểu hiện” có một mối liên hệ di

truyền, dựa vào đó người ta có thể suy luận rằng

những dòng có khả năng kháng G418 ở nồng

độ cao thường chứa nhiều bản sao của gen được

biến nạp vào và do đó khả năng biểu hiện protein

cao hơn Do đó, các dòng P pastoris

pPIC9K-VP28 đã chọn lọc theo 2 phương pháp trên sẽ

được chuyển sang môi trường YPD có G418

nồng độ 2, 4, 6mg/ml Chọn dòng P pastoris

pPIC9K-VP28 có khả năng kháng G418 ở nồng

độ cao nhất

2.3.4 Biểu hiện protein

Các dòng P pastoris pPIC9K-VP28 mọc

tốt trên môi trường YPD Geneticin 6mg và dòng

đối chứng (mang plasmid rỗng) sẽ được chọn

để cảm ứng biểu hiện protein trong môi trường

có bổ sung 2% methanol Cụ thể, các khuẩn

lạc đơn của nấm men được nuôi cấy trong môi

trường BMGY ở 28°C có lắc (250 vòng/phút)

cho đến khi OD600nm đạt 2-6 được thu sinh khối

bằng cách ly tâm môi trường nuôi cấy ở 1500g

trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và được huyền

phù trong môi trường BMMY sao cho OD600nm

của dịch nuôi cấy bằng 1 Tiếp theo, môi trường

nuôi cấy sẽ được bổ sung methanol 100% để

đạt nồng độ cuối cùng là 2% rồi được ủ ở 28°C

có lắc (250 vòng/phút) Sau mỗi 24 giờ nuôi cấy, methanol 100% lại được bổ sung vào môi trường (nồng độ cuối cùng 2%) nhằm cảm ứng

sự biểu hiện protein Sau 24, 48, 72 giờ nuôi cấy tiến hành thu dịch nuôi cấy và xác tế bào bằng cách ly tâm; sản phẩm được bảo quản ở -80°C

Sự hiện diện của protein VP28 trong xác

tế bào và dịch nuôi cấy được kiểm tra bằng SDS-PAGE và khẳng định lại bằng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu VP28 (Invitrogen, Mỹ); hàm lượng protein được đo bằng phương pháp Bradford

III KẾT QUẢ 3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp

pPIC9K-VP28 trong tế bào E.coli JM109

Kết quả nhân dòng gen mã hóa protein VP28 được thể hiện trong Hình 1 Theo đó đoạn gen được khuyếch đại có độ dài khoảng

650 bp tương đương với độ dài của đối chứng dương là chủng virus WSSV nhận được từ

ĐH Arizone (Mỹ) và phù hợp với chiều dài

lý thuyết của sản phẩm khuếch đại là 645 bp Sau xử lý với enzyme cắt giới hạn, băng DNA VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K/EcoRI-NotI được phân tách trên gel agarose 1,2% và được cắt ra để tinh sạch nhằm loại bỏ những DNA tạp không mong muốn Kết quả kiểm tra kích thước, độ sạch của VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K /EcoRI-NotI được thể hiện ở Hình 2 Theo đó băng VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K/ EcoRI-NotI có kích thước tương ứng với

lý thuyết là 645bp và 9276bp và không tạp nhiễm với DNA có kích thước khác

Vector tái tổ hợp PIC9K-VP28 được chuyển

vào E coli JM109 bằng kỹ thuật sốc nhiệt và vi

khuẩn sau biến nạp được trải trên môi trường thạch LB bổ sung ampicilin 50µg.10-1ml Sáu khuẩn lạc được chọn để kiểm tra sự hiện diện của gen VP28 bằng phương pháp PCR với bộ mồi VP28YE-FW và VP28YE-R-His Kết quả

phân tích (Hình 3) cho thấy cả 6 dòng vi khuẩn

6-11 đều cho kết quả dương tính với gen VP28

Trong đó hai khuẩn lạc 7 và 11 cho kết quả

khuyếch đại tốt hơn nên được chọn cho phân

tích tiếp theo với enzyme cắt giới hạn

Hình 1 Kết quả khuyếch đại gen VP28 bằng

phương pháp PCR

Giếng M: Thang DNA 100bp Giếng Pos:

chứng dương; Giếng Neg: chứng âm; W: chủng

virus WSSV sử dụng làm khuôn mẫu.

Hình 2 VP28 và pPIC9K sau khi xử lý với

enzyme EcoRI và Not I

Giếng M1: thang DNA 1Kb Giếng M2:

thang DNA 100bp

Hình 3 Kết quả phân tính dòng vi khuẩn mang

vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28

Giếng 6-11: Khuẩn lạc E coli sau biến nạp

với pPIC9KVP28 Giếng M: Thang DNA Giếng Pos: Chứng dương với WSSV Giếng Neg: Chứng âm với vi khuẩn E.coli

Sự hiện diện của vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 trong hai khuẩn lạc 7 và 11 được kiểm

tra bằng cắt giới hạn với cặp enzyme EcoRI

và NotI Kết quả cho thấy vector tái tổ hợp

pPIC9K-VP28 của dòng vi khuẩn 7 và 11 sau khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn cho hai băng sản phẩm, băng có kích thước nhỏ tương

ứng với kích thước của gen VP28/EcoRI-NotI

và băng có kích thước lớn tương đương kích

thước của pPIC9K/EcoRI-NotI (Hình 4); ngoài

ra không có vạch phụ xuất hiện, vậy phản ứng cắt đã được thực hiện hoàn toàn

Hình 4 Kết quả cắt pPIC9K-VP28 với

EcoRI và NotI

Giếng M1, M2: thang DNA 1kb và 100bp Giếng 1, 2: Gen VP28/EcoRI-NotI; pPIC9K/EcoRI-NotI;

Giếng 3, 5, 4, 6: pPIC9K-VP28 của vi khuẩn 7 và 11 chưa và đã xử lý enzyme

Để kiểm tra độ chính xác của trình tự

gen VP28 và vị trí nối với vector pPIC9K,

plasmid tái tổ hợp tách từ hai dòng 7

và 11 được chọn giải trình tự tại công ty

Nam Khoa (Việt Nam) Kết quả cho thấy

giải trình tự gen VP28 của 2 dòng giống

nhau và tương đồng 100% với các chủng

WSSV được phân lập từ nhiều quốc gia

gồm Hàn quốc (JX515788.1), Trung Quốc

(AF332093.2), Nhật Bản (AY249443.1), Mỹ (AY249442.1), Indonesia (AY249441.1), Ấn Độ (DQ681069.1), Việt Nam (AY168644)

đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI Ngoài ra, phân tích dịch mã cho thấy gen VP28 đặt trong vector pPIC9K-VP28 cho phép mã hóa một protein tái tổ hợp có

204 a.a và được gắn thêm 6 Histidine vào đầu C-terminal của protein này (Hình 5)

Hình 5 Trình tự nucleotide và trình tự amino acid giả định protein VP28 được định mã từ

vector pPIC9K-VP28 của dòng vi khuẩn 7 và 11

Từ những kết quả trên, chúng tôi có thể

khẳng định đã tạo được hai dòng vi khuẩn E.coli

JM109 mang vector pPIC9k chứa gen mã hóa

protein VP28 của virus WSSV Trên vector

pPIC9K, đoạn gen mã hóa protein VP28 được

gắn thêm một trình tự nucleotide mã hóa 6xHis

ở đầu 3’ đã được chèn vào vị trí ngay sau trình

tự mã hóa peptide α-factor

3.2 Kết quả chuyển plasmid

pPIC9K-VP28 vào nấm men P pastoris GS115

Vector pPIC9K thuộc dạng vector sát nhập,

khi biến nạp sẽ sát nhập vào bộ gen của tế bào

chủ thông qua tái tổ hợp tương đồng Tế bào

nấm men sau điện biến nạp được trải trên môi

trường MD không có histidin và ủ trong 2-3

ngày Kết quả ghi nhận được có 400 khuẩn lạc

mọc trên môi trường MD sau điện biến nạp

3.3 Kết quả sàng lọc các dòng P pastoris

GS115 mang nhiều bản sao gen VP28

Hai trăm khuẩn lạc mọc tốt, to, tròn, rời

trên môi trường MD (trong đó có 100 khuẩn

lạc clone 7 và 100 khuẩn lạc clone 11) được chọn để kiểm tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy lần lượt trên 3 môi trường MM, MD và YPD ở 28°C trong 3 ngày Kết quả nuôi cấy cho thấy

182 khuẩn lạc có khả năng mọc tốt trên cả 3 môi trường chọn lọc; các khuẩn lạc này sẽ được dùng cho quá trình chọn lọc tiếp theo

Hình 6 Sự hiện diện của gene VP28 trong genome của 1 số chủng nấm men Giếng M: Thang DNA 100bp Giếng pPIC9K: plasmid pPIC9K

Giếng p-VP28: plasmid pPIC9K-VP28

Giếng P.P: Pichia pastoris

Giếng P.pPIC9K: P.pastoris –pPIC9K

Giếng 120, 120A, 125, 126, 179: chủng số 120,

120A, 125, 126, 179

Sự hiện diện của gen VP28 trong 182

khuẩn lạc nấm men chọn lọc được kiểm tra

bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F

và AOX1-R dựa trên khuôn mẫu là DNA tổng

số của tế bào nấm men Kết quả cho thấy các

chủng nghiên cứu đều cho 2 vạch: khoảng 1.117

bp (kích thước của gen VP28 thêm 492bp - kích

thước từ vị trí bắt cặp của mồi trên hệ gen P

pastoris đến vị trí gắn chèn) và khoảng 2,2

kb - kích thước của gen AOX1 (Hình 6) Như

vậy, tất cả các chủng nấm men kiểm tra đều

có chứa pPICK9K-VP28 trong genome; nói

cách khác, gen VP28 đã được biến nạp thành

công vào bộ gen của nấm men P pastoris với

kiểu hình Mut+

Sau khi tạo dòng thành công, quá trình sàng

lọc dòng P.pastoris có khả năng biểu hiện

pro-tein VP28 cao nhất được thực hiện bằng cách

cấy chuyển 182 khuẩn lạc sang môi trường YDP

có bổ sung G418 ở các nồng độ 4mg/l và 6mg/l

Kết quả sàng lọc đã xác định được 123/182 khuẩn

lạc có khả năng kháng Geneticin 418 ở nồng độ

4mg/l và 62 khuẩn lạc kháng G418 ở nồng độ

6mg/l (Hình 7) Theo lý thuyết, 62 khuẩn lạc này

có chứa 14-18 copy gene VP28 trong genome và

chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu

hiện protein VP28

Hình 7 Kết quả chọn lọc dòng P pastoris

mang tái tổ hợp pPIC9K-VP28 kháng 6ppm

Geneticin

3.4 Kết quả sàng lọc các dòng P

pastoris GS115 có khả năng tiết protein

VP28 ngoại bào

Sáu mươi hai chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm men mang pPICK9K (đối chứng âm) được cảm ứng biểu hiện protein trên môi trường nuôi cấy sinh khối BMGY và kích thích methanol 2% trên môi trường BMMY trong 72 giờ Sự hiện diện của protein VP28 trong dịch nuôi cấy được phân tích bằng kỹ thuật Western blot với kháng thể đặc hiệu của VP28 Kết quả biểu hiện protein đã xác định được 25 chủng có sự hiện diện của protein VP28 trong dịch nuôi cấy Tuy nhiên, chỉ 5 chủng: 120, 120A, 125, 126, 179 cho vạch rõ ràng ở kích thước khoảng 28 kDa trên bản gel chạy Western blot với kháng thể kháng VP28 được dùng để nghiên cứu tiếp theo

Hình 8 Protein VP28 trong dịch nuôi cấy

nấm men M: Thang protein;

120, 120A, 125, 126, 179: các chủng nấm men Ctrl(-): Chứng âm-nấm men có pPICK9K rỗng

3.5 Kết quả biểu hiện protein

Năm chủng nấm men có chứa pPICK9k-VP28 trong genome có khả năng tiết protein ngoại bào được cảm ứng biểu hiện và lượng protein tiết ra trong dịch nuôi cấy được xác định theo thời gian: 24, 48 và 72 giờ Kết quả đo hàm lượng protein theo thời gian trong quá trình nuôi cấy cho thấy cả 5 chủng nghiên cứu đều có khả năng tiết protein ngoại bào và lượng protein tiết

ra tăng dần theo thời gian lên men từ 24 đến 72

giờ (Đồ thị 1); Trong đó, chủng 126 có khả năng

tiết ra lượng protein cao nhất (106,9μg/ml) sau

72 giờ nuôi cấy

Đồ thị 1 Nồng độ protein tổng số của các

chủng nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau

trong quá trình lên men

IV THẢO LUẬN

Trên thế giới, nhiều tác giả đã dòng hóa và

biểu hiện protein VP28 trong tế bào vi khuẩn

khả biến E.coli để làm nguyên liệu để chế tạo

vắc xin/tolerine (Witteveldt và ctv., 2004; 2006;

Satoh và ctv., 2008) Ngoài E coli, một số nhà

nghiên cứu còn sử dụng các vi khuẩn khả biến

khác như: vi khuẩn gram dương Brevibacillus

brevis (Caipang et al., 2008), hoặc tế bào côn

trùng (Du et al., 2006) để dòng hóa các gen vỏ

của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi

Ở Việt Nam, Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Bùi

Thị Bích Hằng (2012) cũng đã thành công trong

việc dòng hóa gen VP28 của virus đốm trắng

vào tế bào khả biến E.coli để tạo kháng thể ứng

dụng trong việc chẩn đoán nhanh bệnh Việc

dùng tế bào nấm men để dòng hóa và biểu hiện

protein chỉ được 1 nhóm nhỏ các nhà nghiên

cứu quan tâm nhưng hiệu quả bảo vệ của loại

vắc xin/tolerine - sản phẩm của quá trình dòng

hóa này - mang lại cao hơn và cho thời gian

bảo hộ dài hơn các loại vắc xin/tolerine khác

Cụ thể, Jha và ctv (2006, 2007) đã xác định

dùng rVP28 biểu hiệu qua tế bào nấm men bằng

phương pháp tiêm hoặc cho ăn đều đem lại hiệu

quả bảo vệ cho crayfish trước bệnh đốm trắng sau 3 ngày và kéo dài tới 21 ngày sau khi dùng rVP28 Trong khi đó, thời gian bảo hộ của rVP28

biểu hiện bằng vi khuẩn gram âm E.coli hoặc vi khuẩn gram dương Brevibacillus choshinensis

và B brevis trên tôm lần lượt là 10 ngày, 7 ngày

và 14 ngày (Caipang et al., 2008; Mavichak

et al., 2009; Witteveldt et al., 2006) Chính vì vậy, việc tạo ra nguyên liệu là dòng nấm men có mang pPICK9K-VP28 có khả năng tiết protein ngoại bào là bước khởi đầu cho những nghiên cứu về vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi ở Việt Nam

V KẾT LUẬN

Đoạn gen VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm đã được nhân bản, gắn với plasmid pPICK9K và dòng hóa thành công vào

vi khuẩn khả nạp E coli JM109 và tế bào nấm men P pastoris GS 115

Năm chủng nấm men Pichia patoris có chứa

pPICK9K-VP28 trong bộ gen có khả năng biểu hiện được protein mục tiêu VP28 dạng ngoại bào trong điều kiện cảm ứng bằng methanol với nồng độ 2% và lượng protein tổng số tiết ra cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy là 106,9 μg/ml

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

Nguyễn Quỳnh Anh, 2006 Báo cáo đề tài: “Dòng hoá và biểu hiện Gen mã hoá Protein vỏ VP28 và VP281 của Virus gây hội chứng đốm trắng ( WSSV ) trong

E.coli”.

Bùi Thị Bích Hằng, 2012 Tạo tái tổ hợp DNA VP28 của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm

sú Tạp chí khoa học 2012:22a 1-7 Trường Đại Học Cần Thơ.

Cục Thúy Y- Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn,

2012 Báo cáo Hội nghị tổng kết nuôi tôm nước

lợ Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi năm 2012

và triển khai kế hoạch năm 2013.

Cục Thú Y - Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn,

2013 Báo cáo Tình hình dịch bệnh, dịch tễ

bệnh đốm trắng (WSD) và hoại tử gan tụy cấp

(AHPND) ở tôm nuôi 7 tháng đầu năm 2013 và

một số đề xuất quản lý rủi ro đối với AHPND Tài

liệu phục vụ Hội nghị tại Bạc Liêu – 6/8/2013.

Tài liệu tiếng Anh

Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo,

H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y.,

2008 Enhanced survival of shrimp, Penaeus

(Marsupenaeus) japonicus from white spot

syndrome disease after oral administration of

recombinant VP28 expressed in Brevibacillus

brevis Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.

Chou, H.Y., Huang, C.Y., Wang, C.H., Chiang, H.C

and Lo, C.F, 1995 Pathogenicity of a baculovirus

infection causing white spot syndrome in

cultured penaeid shrimp in Taiwan Diseases of

Aquatic Organisms 23(3):p 165-173.Du, H.H.,

Xu, Z R., Wu, X F., Li, W F., Dai, W., 2006

Increased resistance to white spot syndrome virus

in Procambarus clarkii by injection of envelope

protein VP28 expressed using recombinant

baculovirus Aquaculture, 2006 260(1-4), p 39-43.

Huang, J., Song, X.L., Yu, J., Yang, C.H., 1994

Baculoviral hypodermal and haematopoietic

necrosis-pathology of the shrimp explosive

epidermic disease Yellow Sea Fishery Research

Institute, Qingdae, P.R China.Jha, R.K., Xu, Z

R., Bai, S J., Sun, J Y., Li, W F., Shen, J., 2007

Protection of Procambarus clarkii against white

spot syndrome virus using recombinant oral

vac-cine expressed in Pichia pastoris Fish & Shellfish

Immunology, 2007 22(4), p 295-307.

Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006 The efficacy

of recombinant vaccines against white spot

syn-drome virus in Procambarus clarkii Immunology

Letters, 2006 105(1), p 68-76.

Mavichak, R K., Hirino, H., Aoki, I., Kiyono, T.,

Yuki, Y., 2009 Protection of pacific white shrimp,

Liptopenaeus vannamei against white spot virus

following administration of N-terminus truncated

recombinant VP28 protein expressed in Gram

positive bacteria, Brevibacillus choshinensis

Aquaculture Science 57:83-90 Satoh, J., T

Nishizawa, Yoshimizu, M., 2008 “Protection against white spot syndrome virus (WSSV) infection in kuruma shrimp orally vaccinated with WSSV rVP26 and rVP28.” Diseases of Aquatic Organisms 82(2), 89-96.

Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., Tomonaga S., Supamattaya K., Boonyaratpalin S.,

1994 Electron microscopy evidence of bacilliform

virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus

Japonicus) Fish Pathol 29:121-125.Venegas,

C A., L Nonaka, Mushiake, K., Nishizawa, T., Muroga, K., 2000 “Quasi-immune response of

Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA

virus (PRDV).” Diseases of Aquatic Organisms 42(2), 83-89.

Van Hulten M.C., Westenberg M., Goodall S.D., Vlak J.M., 2000 Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp Virology 266, 227-36.

Wang, C., Lo, C., Leu, J., Chou, C., Yeh, P., Chou, H., Tung, M., Chang, C., Su, M and Kou, G., 1995 Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV)

of Penaeus monodon Diseases of Aquatic

Organisms, 1995 23, 239-242.

Witteveldt, J., J M Vlak, van Hulten, M C W., 2004

“Protection of Penaeus monodon against white

spot syndrome virus using a WSSV subunit vác xin.” Fish & Shellfish Immunology 16(5), 571-579 Witteveldt, J., J M Vlak, van Hulten, M C W., 2006

“Increased tolerance of Litopenaeus vannamei

to white spot syndrome virus (WSSV) infection after oral application of the viral envelope protein VP28.” Diseases of Aquatic Organisms 70(1-2), 167-170.

Wongteerasupaya C., Vicker J.E., Sriurairatana S., Nash G.L., Akarajarmorn A., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B., Flegel T.W., 1995 A nonoccluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in

the black tiger prawn Penaeus monodon Disease

of Aquatic Organism 21, 69–77

DEVELOP DNA RECOMBINANT VP28 OF WHITE SPOT SYNDROME

VIRUS IN YEAST PICHIA PASTORIS

Ngo Thi Ngoc Thuy1, Nguyen Viet Dung2, Dang Thi Tra My1

ABSTRACT

White spot syndrome virus (WWSSV) is a popular and devastating virus to Penaeus shrimp-culture industry worldwide The aim of this study is to develope DNA recombinant VP28 of the virus in yeast P pastoris for

expressing protein VP28 extracellularly in order to make materials for recombinant protein vaccine/tolerine against WSSV in shrimp DNA fragment content of VP28 was amplified from WSSV and its product was

di-gested by restriction enzyme EcoRI and NotI; then cloned into plasmid pPICK9K to make recombinant vector pPICK9K-VP28 This vector, after that was transformed into Pichia pastoris GS115 to express protein VP28

The screening of 200 yeast clones after transformation was conducted and 5 yeast clones which expressed protein VP28 extracellular were selected for Bradford assay The results indicated that the total extracellular protein containing VP28 increased with fermentation periods of 24, 48 and 72 hours and the highest concen-tration of total protein reached to 106.9 μg.ml-1

Keywords: Pichia pastoris, protein, VP28 , WSSV

Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Hiền

Ngày nhận bài: 10/02/2014 Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014

Ngày duyệt đăng: 30/3/2014

1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research, Research Institute for Aquaculture No 2

Email: thuyngo8@yahoo.com

2 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No 2