Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát tỷ lệ nhiễm Vibrio parahaemolyticus và đánh giá hiện trạng kháng kháng sinh của V. parahaemolyticus tại ĐBSCL. Nghiên cứu được thực hiện qua điều tra việc sử dụng kháng sinh tại 76 ao tôm thẻ và tôm sú nuôi thương phẩm và xác định sự hiện diện của V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong tổng số 396 mẫu tôm, nước và bùn thu ở ĐBSCL.
Trang 1SỰ HIỆN DIỆN CỦA Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH
HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH VÀ HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG KHÁNG SINH VÀ KHÁNG KHÁNG SINH TRÊN TÔM
NUÔI TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
Nguyễn Diễm Thư1*, Lê Hồng Phước1, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Mã Tú Lan1 TÓM TẮT
Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) gây ra bởi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã gây thiệt hại kinh tế đáng kể trong nghề nuôi tôm tại Việt Nam Nghiên cứu trước cho thấy V
parahaemolyti-cus kháng với nhiều loại kháng sinh do việc lạm dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản Hiện tại có ít thông tin về hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và
tần số xuất hiện của V parahaemolyticus trong tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), Việt Nam Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát tỷ lệ nhiễm Vibrio parahaemolyticus và đánh giá hiện trạng kháng kháng sinh của V parahaemolyticus tại ĐBSCL Nghiên cứu được thực hiện
qua điều tra việc sử dụng kháng sinh tại 76 ao tôm thẻ và tôm sú nuôi thương phẩm và xác định
sự hiện diện của V parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong tổng số 396 mẫu tôm, nước và bùn thu ở ĐBSCL 47 chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập được thử kháng sinh đồ với 13 loại kháng sinh Kết quả cho thấy sự hiện diện của V parahaemolyticus gây bệnh AHPND
là 12,37% trong tổng số 396 mẫu (tôm, nước và bùn) Kết quả điều tra cho thấy oxytetracycline, doxycycline và enrofloxacin là ba loại kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất trong tôm nuôi Các
chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND có tỉ lệ kháng khá cao với amoxicillin (80,85%) và
ampicillin (78,72%), vì vậy không nên sử dụng hai loại kháng sinh này trong điều trị bệnh AHPND
do V parahaemolyticus.
Từ khóa: Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND, kháng sinh, kháng kháng sinh, tôm nuôi.
1 Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
* Email: thu_seven@yahoo.com
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Vibrio parahaemolyticus mang gen độc, tác
nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND)
hay hội chứng chết sớm (EMS), đã gây ra thiệt
hại kinh tế đáng kể trong các trang trại nuôi tôm
Bệnh thường xảy ra khoảng 8 ngày sau khi thả
giống, phát triển một cách nhanh chóng và gây
chết nghiêm trọng trong 20 đến 30 ngày nuôi
đầu (Han et al., 2015) Triệu chứng lâm sàng
tôm bệnh bao gồm tăng trưởng chậm, ruột rỗng
hoặc ruột bị đứt đoạn, bơi xoắn ốc, lỏng vỏ, màu sắc nhợt nhạt Tôm bệnh cũng cho thấy các dấu hiệu gan bất thường như gan teo, nhỏ, gan sưng, màu đen hoặc nhạt màu (Lightner et al., 2013; Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015) Tần suất nhiễm bệnh thường xảy ra nhiều hơn trong hệ thống nuôi tôm thâm canh nên thường đòi hỏi việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh Sử dụng kháng sinh không đúng liều lượng trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn
Trang 2trong nuôi trồng thủy sản được cho là có liên
quan dẫn đến sự kháng thuốc của vi khuẩn
(Elmahdi et al., 2016) Các thông tin hiện tại về
việc sử dụng thuốc kháng sinh trong tôm nuôi
và tần suất hiện diện của V parahaemolyticus
gây bệnh AHPND còn rất hạn chế ở ĐBSCL,
Việt Nam Nghiên cứu này nhằm xác định tần
suất xuất hiện của V parahaemolyticus gây
bệnh AHPND trên các mẫu tôm, mẫu nước và
mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm; đánh giá việc sử
dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho
tôm nuôi; ngoài ra việc thử kháng sinh đồ các
chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND
nhằm lựa chọn kháng sinh phù hợp cho việc
điều trị loại bệnh này trên tôm
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Điều tra việc sử dụng kháng sinh và
thu mẫu
Điều tra phỏng vấn được thực hiện với các
chủ trang trại hoặc nhân viên kỹ thuật của 76
ao nuôi tôm nuôi thương phẩm gồm 37 ao nuôi
tôm sú (Penaeus monodon) và 39 ao nuôi tôm
thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ở các tỉnh
Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Bến Tre vào
năm 2015 Điều tra phỏng vấn được tiến hành
qua việc sử dụng phiếu điều tra soạn sẵn gồm
hai phần: i) Đặc điểm ao nuôi và các kỹ thuật
quản lý ao, và ii) Dịch bệnh và việc sử dụng
thuốc kháng sinh
Tổng cộng 396 mẫu thu gồm 131 mẫu tôm,
131 mẫu nước và 134 mẫu bùn được thu tại
131 ao nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc
Liêu, Kiên Giang và Bến Tre trong năm 2015
Mẫu tôm đã được thu từ các ao nuôi tôm có dấu
hiệu chết nghi ngờ nhiễm V parahaemolyticus
Các ao có thu mẫu tôm được thu thêm mẫu
nước và mẫu bùn để kiểm tra sự hiện diện của V
parahaemolyticus
2.2 Phân lập và định danh vi khuẩn
Khuẩn lạc nghi ngờ V parahaemolyticus
với các đặc điểm màu tím hoa cà trên môi trường
CHROMagarTM Vibrio và màu xanh lá cây
trên môi trường TCBS (thiosulfate citrate bile salts sucrose agar) được lựa chọn và xác nhận
V parahaemolyticus gây bệnh AHPND bằng phương pháp duplex PCR Quy trình duplex PCR
sử dụng theo phương pháp của Han et al., (2015) nhằm phát hiện hai gen gây độc pirA và pirB với các cặp mồi VpPirA-284F/R (VpPirA-284F: 5’-TGACTATTCTCACGATTGGACTG-3’, VpPirA-284R: 5’-CACGACTAGCGCCATTG TTA-3’) và VpPirB-392F/R (VpPirB-392F: 5’-TGATGAAGTGATGGGTGCTC-3’, VpPirB-392R: 5’-TGTAAGCGCCGTTTAAC TCA-3’) Quy trình duplex PCR gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 94°C trong 3 phút, tiếp theo
là 35 chu kỳ của 94°C trong 30 giây, 60°C trong
30 giây, và 72°C trong 30 giây; và giai đoạn cuối ở 72°C trong 7 phút
2.3 Phương pháp thử kháng sinh đồ
Thử nghiệm kháng sinh đồ trên V parahaemolyticus được thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Tendencia, 2004),
và theo hướng dẫn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2014) Các kháng sinh được thử nghiệm là: ampicillin (AMP), amoxicillin (AM), gentamicin (GM), kanamycin (KA), oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC), doxycycline (DOX), ciprofloxacin (CIP), trimethoprim và sulfamethoxazol (bactrim), norfloxacin (NOR), florfenicol (FLO), neomycin (NEO), erythromycin (ERY)
2.4 Phương pháp phân tích số liệu
Dữ liệu được nhập và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA)
III KẾT QUẢ
3.1 Sự hiện diện của V parahaemolyticus
gây bệnh AHPND
Trong 396 mẫu thu, tổng cộng 226 khuẩn lạc
nghi ngờ V parahaemolyticus với đặc điểm màu
tím hoa cà trên môi trường CHROMagarTM
Vibrio và màu xanh lá cây trên môi trường TCBS
được phân lập và 49 mẫu V parahaemolyticus
Trang 3Bảng 1 Tần suất xuất hiện của V parahaemolyticus gây bệnh AHPND tại ĐBSCL
Tỉnh
Số khuẩn lạc/mẫu nghi ngờ
V parahaemolyticus parahaemolyticus gây bệnh AHPND Số khuẩn lạc/mẫu V
3.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh tại
ao nuôi tôm
Kết quả khảo sát tại các trang trại cho
thấy hơn 16 loại kháng sinh khác nhau được
sử dụng (Hình 1) 68,9% số nông hộ được báo
cáo là có sử dụng kháng sinh Hơn một nửa số
nông hộ (62%) cho biết sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh đang xảy ra, và 38% số nông hộ báo cáo sử dụng kháng sinh để phòng bệnh Oxytetracycline (31,7%), doxycycline (12,7%)
và enrofloxacin (7,9%) là ba loại kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất
Hình 1 Tỷ lệ sử dụng kháng sinh của 5 tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long
mang 2 gen độc pirA và gen pirB đã được xác
nhận bằng phương pháp duplex PCR (Bảng 1) Tỷ lệ V parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong 396 mẫu là 12,37% (49/396)
Trang 43.3 Hiện trạng kháng kháng sinh của
AHPND gây bệnh Vibrio parahaemolyticus
Khả năng nhạy cảm kháng sinh của 47
mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND
đã phân lập được thử kháng sinh đồ với 13
loại kháng sinh Tỉ lệ nhạy, kháng trung gian
và kháng của từng loại kháng sinh với các vi
khuẩn phân lập được trình bày trong Bảng 2
Hầu hết tất cả các chủng V parahaemolyticus
gây bệnh AHPND phân lập được tìm thấy có khả năng kháng với amoxicillin (80,85%), 78,72% kháng với ampicillin, 27,66% kháng với florfenicol, 23,40% kháng với kanamycin
và 21,28% kháng với oxytetracycline Norfloxacin là loại kháng sinh còn nhạy cao nhất (97,87%) trong số các mẫu vi khuẩn phân lập trong nghiên cứu này
Bảng 2 Tỉ lệ các mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND nhạy, kháng trung gian và kháng các loại kháng sinh (n = 47)
Kháng
45 mẫu trong tổng số 47 mẫu V parahaemolyticus
(95,7%) cho thấy kháng với ít nhất một loại
kháng sinh 42 mẫu (98,4%) cho thấy kháng
với hai loại kháng sinh trở lên 23 mẫu (70,2%)
kháng với ba loại kháng sinh trở lên và 6,4%
của các chủng phân lập được kháng với năm hoặc sáu loại thuốc kháng sinh Hai trong số các chủng gây bệnh AHPND (4,3%) còn nhạy với cả 13 loại kháng sinh đã thử kháng sinh đồ (Bảng 3)
Trang 5Bảng 3 Tần số kháng kháng sinh của các mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND
IV THẢO LUẬN
Nghiên cứu này cho thấy V
parahaemoly-ticus gây bệnh AHPND hiện diện với tỉ lệ
12,37% trên các mẫu thu ở 5 tỉnh ven biển
ĐBSCL Nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Trưởng
và ctv., (2015) cho thấy tần số xuất hiện của V
parahaemolyticus trên các mẫu cá và nước tại
Tiền Giang cũng chiếm tỉ lệ khá cao 13,97%
Oxytetracycline, doxycycline và
enrofloxacin là ba loại kháng sinh được sử
dụng nhiều nhất tại 4 tỉnh khảo sát ở Cà Mau,
Sóc Trăng, Bạc Liêu và Bến Tre Kết quả này
phù hợp với kết quả của Mai Văn Tài và ctv.,
(2004) cho thấy oxytetracycline và doxycycline
là các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến
nhất trong nuôi trồng thủy sản Đáng chú ý, việc
sử dụng enrofloxacin trong nuôi trồng thủy sản
đã bị cấm ở Việt Nam nhưng enrofloxacin vẫn
được sử dụng trong nuôi tôm ở ĐBSCL
Kết quả nghiên cứu này cho thấy hầu hết
các mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND
đã phân lập đều kháng với amoxicillin và
ampicillin Các nghiên cứu trước đã cho thấy V
parahaemolyticus đề kháng cao với ampicillin ở Malaysia (63,1%), Thái Lan (72%) và Indonesia (98%) (Al-Othruvi et al, 2014; Lesmana et
al, 2001; Yano et al., 2011) Đa số các mẫu V parahaemolyticus phân lập (95,7%) cho thấy là kháng với ít nhất một loại kháng sinh và một số
chủng V parahaemolyticus kháng với năm hoặc
sáu loại thuốc kháng sinh Kết quả nghiên cứu này tương tự với kết quả của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., (2006) và Huỳnh Ngọc Trưởng
và ctv., (2015) đã báo cáo V parahaemolyticus
kháng với bốn, năm hoặc sáu loại thuốc kháng sinh
V KẾT LUẬN
Sự hiện diện của V parahaemolyticus gây
bệnh hoại tử gan tụy là 12,37% trong tổng số mẫu 396 mẫu tôm, mẫu nước và mẫu bùn thu
ở 5 tỉnh ĐBSCL Oxytetracycline, doxycycline
và enrofloxacin được báo cáo là được sử dụng nhiều trong tôm nuôi Nghiên cứu cho thấy tỷ
lệ cao V parahaemolyticus gây bệnh AHPND
kháng với amoxicillin và ampicillin, vì vậy có thể khuyến cáo không nên sử dụng amoxicillin
và ampicillin trong điều trị bệnh này
Trang 6TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương,
Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh
Phương, 2006 Xác định vị trí phân loại và khả
năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio
phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú
(Penaeus monodon ) Tạp chí nghiên cứu khoa
học, tr 42 – 52.
Huỳnh Ngọc Trưởng, Trần Thị Ngọc Thanh,
Nguyễn Tiến Dũng, 2015 Tình hình nhiễm và
tỉ lệ kháng thuốc của Vibrio spp phân lập từ
thủy sản và nước nuôi tại Tiền Giang Tạp chí
Khoa học 2 (67): 157.
Mai Văn Tài và ctv., 2004 Báo cáo tóm tắt đề tài:
Đánh giá hiện trạng các loại thuốc, hóa chất và
chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy
sản nhằm đề xuất các giải pháp quản lý
Tài liệu tiếng Anh
Al-Othrubi, S M., Kqueen, C Y., Mirhosseini,
H., Hadi, Y A., & Radu, S., 2014 Antibiotic
resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated
from cockles and shrimp sea food marketed
in Selangor, Malaysia Clinical Microbiology:
Open Access , 2014.
Clinical and Laboratory Standards Institute,
2014 Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing, 24th informational
supplement Approved standard M100-S24
Clinical and Laboratory Standards Institute,
Wayne, PA, 226 pp
Elmahdi, S., DaSilva, L V., & Parveen,
S., 2016 Antibiotic resistance of Vibrio
parahaemolyticus and Vibrio vulnificus
in various countries: A review Food
microbiology, 57, 128-134.
Han, J E., Tang, K F., Tran, L H., & Lightner,
D V., 2015 Photorhabdus insect-related
(Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)
of shrimp Diseases of aquatic organisms, 113(1), 33-40.
Lesmana, M., Subekti, D., Simanjuntak, C H., Tjaniadi, P., Campbell, J R., & Oyofo, B A.,
2001 Vibrio parahaemolyticus associated with
cholera-like diarrhea among patients in North
Jakarta, Indonesia Diagnostic microbiology and infectious disease , 39(2), 71-75.
Lightner D.V., Redman C.R., Pantoja B.L., Noble L.M., Nunan, Loc Tran, 2013 Documentation of an Emerging Disease (Early Mortality Syndrome) in SE Asia & Mexico OIE Reference Laboratory for Shrimp Diseases, Department of Veterinary Science
& Microbiology, School of Animal and Comparative Biomedical Sciences
Ruangpan, L., & Tendencia, E A., 2004 Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment Southeast Asian Fisheries Development Center, Aquaculture Department
Yano, Y., Hamano, K., Satomi, M., Tsutsui, I., & Aue‐umneoy, D., 2011 Diversity and characterization of oxytetracycline‐resistant bacteria associated with non‐native species,
white‐leg shrimp (Litopenaeus vannamei), and native species, black tiger shrimp (Penaeus monodon), intensively cultured in Thailand
Journal of applied microbiology , 110(3),
713-722
Zorriehzahra, M J., & Banaederakhshan, R.,
2015 Early mortality syndrome (EMS) as new
emerging threat in shrimp industry Adv Anim Vet Sci , 3(2s), 64-72.
Trang 7OCCURRENCE, ANTIBIOTIC USAGE AND ANTIBIOTIC
RESISTANCE OF Vibrio parahaemolyticus FROM FARMED
SHRIMPS IN THE MEKONG DELTA, VIETNAM
Nguyen Diem Thu1*, Le Hong Phuoc1, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Ma Tu Lan1 ABSTRACT
Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus has resulted
in significant economic losses in shrimp production in Vietnam Previous studies reported that V
parahaemolyticus showed multiple-antibiotic resistance due to the misuse of antibiotics to control pathogenic infections in aquaculture There is a lack of information on the use of antibiotics by
shrimp farmers as well as knowledge regarding the presence of V parahaemolyticus in the Mekong Delta, Vietnam This study aimed to investigate the incidence of pathogenic Vibrio
parahaemolyti-cus and to assess the antibiotic resistance profile as well as to perform the antimicrobial
susceptibil-ity test in V parahaemolyticus isolates in the Mekong Delta The study was carried out through a survey on the use of antibiotics in 76 grow-out shrimp farms and identification of the occurrence of AHPND pathogenic V parahaemolyticus isolates in a total of 396 shrimp, water and mud samples collected in the Mekong Delta Forty seven AHPND-causing V parahaemolyticus isolates were tested for sensitivity to 13 antibiotics The results showed that the incidence of AHPND-causing V
parahaemolyticus isolates was 12.37% in the total of 396 samples Oxytetracycline, doxycycline and enrofloxacin were the most commonly used antibiotics in the shrimp farms The study showed high percentage of amoxicillin and ampicillin resistance (80.85% and 78.72%, respectively) by
AHPND-causing V parahaemolyticus isolates, suggesting these two antibiotics should be excluded
in the treatment of V parahaemolyticus.
Keywords: AHPND pathogenic Vibrio parahaemolyticus, antibiotic, antibiotic resistance, farmed
shrimps.
Người phản biện: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 27/6/2016 Ngày thông qua phản biện: 08/8/2016
Ngày duyệt đăng: 05/9/2016
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2.
*Email: thu_seven@yahoo.com