Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định thành phần loài và phân lập một số loài tảo trong ống tiêu hóa của nghêu vân Meretix lusoria, nhằm góp phần trong nghiên cứu đa dạng nguồn thức ăn tươi trong nuôi trồng thủy sản.
Trang 1THÀNH PHẦN LOÀI VÀ ĐẶC ĐIỂM TĂNG TRƯỞNG CÁC LOÀI TẢO
PHÂN LẬP TỪ ỐNG TIÊU HÓA CỦA NGHÊU VÂN (Meretrix lusoria)
Đặng Ngọc Thùy1*
TÓM TẮT
Nghêu vân, Meretrix lusoria, là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ khá phổ biến trong khu vực Đông
và Đông Nam Á (Yoosukh & Matsukuma, 2001) Trong ống tiêu hóa của nghêu vân thu tại cảng Gomso, Hàn Quốc đã ghi nhận được tổng cộng có 34 loài vi tảo Trong đó, 32 loài vi tảo được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi quang học Tuy nhiên, chỉ có hai giống tảo thuần
là Neorhodella sp và Minutocellus sp được phân lập và nuôi thành công Tốc độ tăng trưởng và tỉ
lệ phân chia tế bào của cả hai loài tảo này đều đạt cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 18 o C cụ thể là 1,62
± 0,39 và 2,24 ở Neorhodella sp và 0,39 ± 0,01 và 0,56 ở Minutocellus sp
Từ khóa: Meretrix lusoria, Minutocellus, Neorhodella, nghêu vân, vi tảo.
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghêu vân, Meretrix lusoria, là loài nhuyễn
thể hai mảnh vỏ khá phổ biến trong khu vực
Đông và Đông Nam Á (Yoosukh & Matsukuma,
2001) Nó thường được tìm thấy trong các cửa
sông và vùng triều nơi có độ mặn từ 20 ‰ và 33
‰ và là sinh vật sống ở đáy ở độ sâu dưới 5 đến
10 cm trong điều kiện hiếu khí (Lee et al., 2007)
Nghêu vân được xem là loài nhuyễn thể
quan trọng trong nuôi trồng và phát triển tại
Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc, (Chung,
2007) Theo Karnjanapratum và ctv., (2013),
Meretrix lusoria giàu axit béo đa không bảo
hòa (46,84-49,18% tổng số axit béo) với tỉ lệ
cao của DHA (13,33-16,47% tổng số axit béo)
và EPA (4,75-7,11% của tổng số axit béo) và
khoáng vi lượng như Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Cu
và Cr Vì vậy, nghêu vân chính là nguồn dinh
dưỡng tuyệt vời có lợi cho sức khỏe của người
tiêu dùng
Vi tảo đóng một vai trò quan trọng
trong hệ sinh thái biển và là nguồn thức ăn
sơ cấp đối với các loài thủy sản đặc biệt là
ấu trùng hai mảnh vỏ và ấu trùng của một số
loài giáp xác và các loài cá trong nuôi trồng thủy sản Vi tảo được sử dụng cho việc nuôi dưỡng ấu trùng thường nằm trong kích thước (nanoplankton) khoảng từ 2-20μm (Brown
et al., 1997) Cho đến nay, việc nuôi thâm canh nhuyễn thể chủ yếu dựa vào việc sản xuất các loại tảo sống, thường chiếm khoảng 30% tổng chi phí sản xuất giống (Coutteau
và Sorgeloos, 1992) Một số nghiên cứu trước đây về sự phát triển của các chủng tảo
đã được thực hiện trong sản xuất giống thủy
sản như vẹm xanh Mytilus galloprovincialis
(Pettersen et al., 2010), hàu Thái Bình Dương
Crassostrea gigas (Knuckey et al., 2002;
Barille’ et al, 2003), trai Greenshell ™ Perna
canaliculus (Ragg et al., 2010), hàu Châu Âu Ostrea edulis (Ronquillo et al., 2012), bào
ngư Haliotis diversicolor (Chen, 2007)
Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định thành phần loài và phân lập một số loài tảo trong
ống tiêu hóa của nghêu vân Meretix lusoria,
nhằm góp phần trong nghiên cứu đa dạng nguồn thức ăn tươi trong nuôi trồng thủy sản
Trang 2II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Phân loại tảo thông qua đặc điểm
hình thái
Hình 1 Nghêu vân thu tại cảng Gomso
Nghêu vân được thu thập từ các cảng
Gomso, Buan-gun, Jeollabuk, Hàn Quốc vào
tháng 10 năm 2014
Vi tảo thu từ đường tiêu hóa của nghêu
được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái
thông qua việc sử dụng kính hiển vi quang học
kết nối với máy ảnh kỹ thuật số Khóa phân loại
tảo được thực hiện theo các phương pháp của
Tomas, 1997 và Presscott, 1951.
2.2 Phân lập tảo
Vi tảo được phân lập trong phòng thí
nghiệm bằng phương pháp Pasteur pipette dưới
kính hiển vi đảo ngược (Hoshaw và Rosowski,
1973) Vi tảo được nuôi trong môi trường f/2
(Guillard và Ryther, 1962; Fritz Industries, Inc
1997) ở 18oC dưới 12:12 giờ chu kỳ sáng/tối
dưới ánh sáng huỳnh quang màu trắng 90 mmol
photon
Để có giống tảo thuần, loài tảo được phân
lập được kiểm tra hàng ngày dưới kính hiển vi
đảo ngược và trên môi trường thạch LB nhằm
kiểm tra nhiễm khuẩn Trong trường hợp loài
tảo nuôi này vẫn còn xen tạp các loài tảo khác, thì việc phân lập sẽ phải thực hiện tiếp cho đến khi có được giống tảo thuần Và trong trường hợp vi tảo nuôi bị nhiễm khuẩn, chúng sẽ được
xử lý bằng Spenicillin 100µg/ml sau đó kiểm tra trên lại trên môi trường thạch LB để đảm bảo không còn khuẩn lạc vi khuẩn
2.3 Khảo sát tăng trưởng của tảo nuôi
Mỗi giống tảo sẻ được nuôi trong các giếng nuôi cấy mô, có chứa 5 ml môi trường nuôi cấy f/2 vô trùng với các điều kiện nuôi không thay đổi, ngoại trừ tại yếu tố nhiệt độ như 18, 22, 26,
30 oC Thí nghiệm cho mỗi giống tảo được lập lại 3 lần Số lượng tế bào được đếm mỗi 24 giờ trên buồng đếm hồng cầu Neubauer, và tất cả thí nghiệm sẽ được thu hoạch sau 1 tuần Tốc độ
tăng trưởng của tảo được tính như sau: µ
(ngày-1) = ln (F1/F0)/(t1-t0), trong đó F = sinh khối tại thời điểm thu hoạch t1 (tế bào/ml) và F0 = sinh khối tại thời điểm bắt đầu, t0 (tế bào/ml) (Guillard, 1973)
Từ tốc độ tăng trưởg (μ), tỉ lệ phân chia tế bào mỗi ngày (n) được ước tính bằng cách sử dụng phương trình sau: n = μ/[ln (2)], trong đó n là tỉ lệ phân chia tế bào mỗi ngày (Giovagnetti và ctv., 2012)
III KẾT QUẢ 3.1 Phân loại tảo thông qua đặc điểm hình thái
Thông qua đặc điểm hình thái của các vi tảo đã ghi nhận được thu tổng số 34 loài tảo hiện diện trong ống tiêu hóa của nghêu vân (Bảng 1), trong đó có 1 loài vi khuẩn lam
(Cyanobacteria), 8 loài tảo lục (Chorophyceae),
2 loài tảo hai roi (Dianophyceae), 21 loài tảo silic (Bacillariophyceae) và 2 loài chưa xác định
là U4 và U5
Trang 3Bảng 1 Thành phần loài tảo hiện diện trong ống tiêu hóa của nghêu vân Meretrix lusoria
Bacillariophyceae Cyanobacteria
Actinoptychus undulatus
Cyclotella striata
Cocconeis sp.
Coscinodiscus excentricus
Coscinodiscus oculus-iridis
Coscinodiscus radiatus
Coscinodiscus sp.
Coscinodiscus subtilis
Coscinodiscus wailesii
Cylindrotheca closterium
Diploneis crabro
Navicula rhynchocephala
Navicula sp1.
Navicula sp2.
Navicula sp3.
Nitzschia sp1.
Nitzschia sp2.
Paralia sulcata
Pleurosigma sp.
Triceratium favus
Trachyneis aspera
Merimopedia sp.
Chlorophyceae Botryococcus sp.
Chlorella sp.
Coelastrum sp.
Crucigenia tetrapedia Pandorina sp.
Pediastrum duplex Scenedesmus sp.
Tetrastrum sp.
Dinophyceae Diplosalis sp.
Prorocentrum micans
Chưa xác định U4 U5
3.2 Phân lập tảo
Trong 34 loài vi tảo được ghi nhận chỉ phân
lập thành công và nuôi thuần hai giống tảo U4
và U5 (Hình 2)
Sau khi có giống tảo thuần, hai tảo này đã
được phân loại bằng phương pháp sinh học phân
tử tại phòng thí nghiệm của khoa vi sinh của trường Đại học Pukyong, Hàn Quốc với U4 là
Neorhodella sp thuộc tảo đỏ Rhodellophyceae
và U5 là Minutocellus sp thuộc tảo silic
Bacillariophyceae
Trang 4Hình 2 Hai loài vi tảo phân lập thành công (U4 và U5).
3.3 Khảo sát tăng trưởng của tảo
Hình 3 Tăng trưởng của Neorhodella sp theo nhiệt độ Hình 3 cho thấy mật độ Neorhodella sp có
xu hướng tăng nhanh khi nuôi cấy ở nhiệt độ
cao như từ 0,17 x 104 tế bào/ml đến 2,96 ± 1,17
x 104 tế bào/ml ở 26oC và đạt tối đa mật độ tối đa
5,52 ± 0,23 x 104 tế bào/ml ở 30oC Tuy nhiên,
sau 5 ngày nuôi cấy, mật độ tế bào giảm mạnh ở nhiệt độ 30oC trong khi đó ở 18oC tiếp tục tăng lên với số lượng tế bào 5,65 ± 0,55x104 tế bào/
ml và kế đến là 5,34 ± 1,01 x 104 tế bào/ml ở
22oC
Trang 5Hình 4 Tăng trưởng của Minutocellus sp theo nhiệt độ Tương tự như Neorhodella sp., Minutocellus
sp cũng có xu hướng tăng mật độ tế bào trong
khoảng 4 ngày đầu (Hình 4), và sau đó sự giảm
mạnh từ 276,5 ± 0,54 x 104 tế bào/ml đến 210,5
± 0,79 x 104 tế bào/ml ở 26oC Và đến ngày
cuối thí nghiệm, mật độ của Minutocellus ở các
nhiệt độ nuôi vẫn ổn định với số lượng tế bào thấp nhất khoảng 150,5 ± 17,2 x 104 tế bào/ml
ở 30oC và cao nhất là 240,3 ± 12,2 x 104 tế bào/
ml ở 18oC
Bảng 2 Tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ phân chia tế bào của Neorhodella sp và Minutocellus sp
ở 4 nhiệt độ khác nhau (n = 3) Loài tảo Nhiệt độ (°C)
Tỉ lệ tăng trưởng μ (ngày–1)
Tỉ lệ phân chia tế bào (ngày–1)
Kết quả tính toán tốc độ tăng trưởng cho
thấy Neorhodella sp và Minutocellus sp nuôi
ở 18oC có tỷ lệ tăng trưởng cao nhất, lần lượt
là 1,62 ± 0,39 và 0,39 ± 0,01 Trong khi đó, tốc
độ tăng trưởng thấp nhất là cụ thể Neorhodella
sp ở 26oC (0,45 ± 0,13) , và Minutocellus sp
ở 30oC (0,32 ± 0,02) Điều này đồng nghĩa
với tỉ lệ phân chia tế bào cũng đạt cao nhất ở
18oC, với dao động của mỗi loài là 0,63 - 2,24
IV THẢO LUẬN
Các kết quả của 22 loài tảo silic đã trình bày trong đường tiêu hóa đã cho thấy tảo là
thức ăn chính của nghêu vân Meretrix lusoria
Điều này phù hợp với mục đích phân lập và sử dụng tảo làm thức ăn cho giai đoạn ấu trùng và
vị thành niên của hàu Thái Bình Dương , trai Greenshell™, bào ngư (Ragg và ctv., 2010; Barille’ và ctv., 2003, Knuckey và ctv., 2002,
Trang 6Trung tâm Nuôi trồng vi tảo nước mặn Hàn
Quốc Marine (KMMCC) cũng sử dụng các kỹ
thuật mao dẫn pipette và môi trường f/2 vừa để
phân lập và nuôi cấy các loài tảo tại Hàn Quốc
(Hur, 2008) Tuy nhiên, họ nuôi cấy vi tảo ở các
mức nhiệt độ 15, 20 và 25°C trong khi các mẫu
của chúng tôi đã được duy trì trong 18°C Ngoài
ra, một số loài được trình bày trong nghiên cứu
này cũng đã được nuôi cấy tại KMMCC, như
Cyclotella striata (Kützing Grunow), Paralia
sulcata (Ehrenberg Cleve), Trachyneis aspera
(Ehrenberg Cleve) và Prorocentrum micans
Ehrenberg
Hai loài Neorhodella sp và Minutocellus
sp tốc độ tăng trưởng tối đa đạt ở nhiệt độ 18oC,
và chúng có tốc độ tăng trưởng chậm hơn và
mật độ tế bào cũng giảm khi nuôi ở nhiệt độ trên
26oC Điều này cho thấy khoảng nhiệt độ tối ưu
cho sự phát triển tốt nhất của hai chủng trên là
từ 18oC đến 22oC Theo công bố của Giovagnetti
và ctv., (2012), Minutocellus RCC967 tăng
trưởng tối ưu trong điều kiện ánh sáng có cường
độ 100 mmol photon m-2 s-1 ở 20oC, với điều
kiện này nó đạt được tốc độ tăng trưởng cao nhất (0,82 ± 0,02) nhưng sau đó sẽ giảm nếu cường độ ánh sáng tăng cao hơn Ngược lại, tỷ
lệ tăng trưởng của Minutocellus RCC703 dần
dần tăng lên trong phạm vi ánh sáng là 500 mmol photon m-2 s-1 đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất (1,97 ± 0,15) Dựa trên kết quả của tốc
độ tăng trưởng, Minutocellus sp nuôi ở điều
kiện 90 m-2 s-1 ở 18oC tương ứng với giống
Minutocellus RCC967 Kết quả nghiên cứu cho
thấy Minutocellus sp có xu hướng giảm phân
chia tế bào khi nhiệt độ tăng lên Còn với hai
chủng Minutocellus RCC967 và RCC703 thì có
xu hướng tăng phân chia tế bào khi tăng cường
độ ánh sáng
V KẾT LUẬN
Từ ống tiêu hóa của nghêu vân, Meretrix
lusoria, đã ghi nhận được 34 loài vi tảo Trong
đó đã nuôi cấy thành công hai loài tảo thuần là
Neorhodella sp và Minutocellus sp Đồng thời
xác định được nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của hai loài tảo trên là từ 18ºC đến 22ºC
Trang 7TÀI LIỆU THAM KHẢO
Barille´, L., Haure, J., Pales-Espinosa, E., Morançais,
M., 2003 Finding new diatoms for intensive
rearing of the pacific oyster (Crassostrea gigas):
energy budget as a selective tool Aquaculture,
217: 501–514.
Brown, M.R., Jeffrey, S.W., Volkman, J.K., Dunstan,
G.A., 1997 Nutritional properties of microalgae
for mariculture Aquaculture, 151: 315-331.
Chen, Y C., 2007 Immobilization of twelve benthic
diatom species for long-term storage and as feed
for post-larval abalone Haliotis diversicolor
Aquaculture, 263: 97–106.
Chung, E Y., 2007 Oogenesis and sexual maturation
in Meretrix lusoria (Röding 1798) (Bivalvia:
Veneridae) in Western Korea Journal of Shellfish
Research, 26(1): 71–80.
Coutteau, P., Sorgeloos, P., 1992 The use of algal
substitutes and the requirement for live algae
in the hatchery and nursery rearing of bivalve
molluscs: an international survey J Shellfish
Res., 11: 467– 476.
Fritz Industries, Inc., 1997 Supplied Fritz f/2 Algae
Food Dallas, TX U.S.A 75217.
Giovagnetti, V., Cataldo, M L., Conversano, F.,
Bru-net, C., 2012 Growth and photophysiological
responses of two picoplanktonic Minutocellus
species, strains RCC967 and RCC703
(Bacillariophyceae) European Journal of
Phycology 47(4): 408–420
Guillard, R.R.L., 1973 Methods for microflagellates
and nanoplankton In: Stein, J (Ed.), Handbook
of Phycological Methods Cambridge Univ Press,
Cambridge: 80–81.
Guillard, R.R.L., and Ryther, J H., 1962 Studies on
marine planktonic diatoms I Cyclotella nana
Hustedt and Detonula confervacaea (Cleve) Gran
Canadian Journal of Microbiology, 8: 229-239.
Hoshaw, R.W., Rosowski, J.R., 1973 Methods for
microscopic algae In: Stein, J.R (Ed.), Handbook
of Phycological Methods Culture Method and
Growth Measurement Cambridge Univ Press,
Cambridge, 53– 68.
Hur, S.B., 2008 Korea Marine Microalgae Culture
Center - List of Strains Algae Volume 23(3): 1-68
Kirsten M.M., Michael D J L., Robert G S., 2010
Bangiophytes: From one Class to Six; Where Do
We Go from Here? Red Algae in the Genomic
Age Cellular Origin, Life in Extreme Habitats
Tsai, Y H., 2013 Chemical compositions and nutritional value of Asian hard clam (Meretrix lusoria) from the coast of Andaman Sea Food Chemistry, 141: 4138–4145.
Knuckey, R M., Brown, M R., Barrett, S M., Hallegraeff, G M., 2002 Isolation of new nanoplanktonic diatom strains and their evaluation
as diets for juvenile Pacific oysters (Crassostrea gigas) Aquaculture, 211: 253–274.
Lake Michigan Mass Balance (LMMB) Methods Compendium,1997 ESS Method 150.1: Chlorophyll – Spectrophotometric Volume 3, Chapter 4.
Lee, A.C., Lin, Y H., Lin, C R., Lee, M.C., Chen, Y.P., 2007 Effects of components in seawater on
the digging behavior of the hard clam (Meretrix
lusoria) Aquaculture, 272: 636–643.
Pettersen, A K., Turchini, G M., Jahangard, S., Ingram, B A., Sherman, A D H., 2010 Effects
of different dietary microalgae on survival, growth, settlement and fatty acid composition of
blue mussel (Mytilus galloprovincialis) larvae
Aquaculture, 309: 115–124.
Presscott, G W., 1951 Algae of the Western Great Lakes Area Cranbrook Institute of Science, Bloomfield Hills, MI Bulletin No 31.
Ragg, N L C., King, N., Watts, E., Morrish, J., 2010 Optimising the delivery of the key dietary diatom Chaetoceros calcitrans to intensively cultured Greenshell™ mussel larvae, Perna canaliculus Aquaculture, 306: 270–280.
Ronquillo, J D., Fraser, J., McConkey, A J., 2012 Effect of mixed microalgal diets on growth and polyunsaturated fatty acid profile of European oyster (Ostrea edulis) juveniles Aquaculture, 360-361: 64–68.
Sarno, D., Kooistra, W H C F., Medlin L K.,
Perco-po, I., Zingone, A., 2005 Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae): Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) consists of several genetically and morphologically distinct species with the description of four new species J Phycol, 41: 151–176.
Tomas, C R., 1997 Identifying Marine Phytoplankton Florida Marine Research Institute, St Petersburg, U.S.A Academic Press
Yoosukh, W., & Matsukuma, A., 2001 Taxonomic study on Meretrix (Mollusca: Bivalvia) from Thailand Phuket Marine Biological Center, 25(2): 451–460
Trang 8THE SPECIES COMPOSITION AND GROWTHS OF MICROALGAE ISOLATED FROM THE DIGESTIVE SYSTEM OF HARD CLAM
(Meretrix lusoria)
Dang Ngoc Thuy1*
ABSTRACT
Hard clam, Meretrix lusoria, is an abundant bivalve species in East and Southeast Asia (Yoosukh
& Matsukuma, 2001) A total of 34 microalgae species were isolated from the digestive tract of hard clam in Gomso, Korea Among them, 32 species were identified based on morphological
characteristics by microscopic observation Besides, Neorhodella sp and Minutocellus sp were successfully isolated to monospecies Both Neorhodella sp and Minutocellus sp showed the
highest growth at 18 o C with the specific growth rate and number of divisions per day of 1.62±0.39 and 2.24, and 0.39±0.01 and 0.56, respectively.
Keywords: Meretrix lusoria, Neorhodella, Minutocellus, microalgae, hard clam.
Người phản biện: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 18/11/2015 Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2
* Email: thdolly@yahoo.com