(Luận văn thạc sĩ) phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người việt nam bằng kỹ thuật PCR RFLP

Nghiên cứu các đột biến trong mtDNA là một trong những cách cho phép chúng ta hiểu được quá trình tiến hóa con người, cụ thể là về nguồn gốc, quan hệ họ hàng, khả năng giao phối với họ k

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội-2011

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ty thể và hệ gen của ty thể người 3

1.1.1 Cấu trúc của ty thể người 3

1.1.2 Chức năng của ty thể người 5

1.1.3 Hệ gen ty thể người 9

1.2 Các loại đột biến trong hệ gen ty thể người và các bệnh liên quan 12

1.2.1 Đột biến điểm 12

1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên tRNA và rRNA 13

1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến trên mRNA 14

1.2.2 Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA 15

1.2.3 Các loại đột biến khác của hệ gen ty thể 19

1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể 20

1.3.1 Lai DNA 20

1.3.2 PCR kết hợp RFLP (PCR-RFLP) 21

1.3.3 Xác định trình tự nucleotide 22

1.3.4 PCR định lượng 23

1.3.5 Một số phương pháp khác 25

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên liệu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Tách DNA tổng số từ máu theo kit của Qiagen 28

2.2.2 Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell 28

2.2.3 Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại 29

2.2.4 Điện di DNA trên gel agarose 29

2.2.5 Điện di DNA trên gel polyacrylamide 30

2.2.6 Nhân bản đoạn gen bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 30

2.2.8 Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 32

2.2.9 Giải trình tự nucleotide bằng máy tự động theo phương pháp của Sanger 34

2.2.10 Phân tích số liệu bằng phần mềm Genetyx 35

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thu thập mẫu máu bệnh nhân và tách chiết DNA tổng số 36

3.1.1 Một số đặc điểm của mẫu phân tích 36

3.1.2 Tách chiết DNA của các mẫu 36

3.2 Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP 37

3.2.1 Nhân đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR 37

3.2.2 Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP 38

3.2.3 Phân tích trình tự mất đoạn 9 bp trên gen ty thể 41

3.3 Phân tích đột biến A3243A 46

3.3.1 Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G 47

3.3.2 Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP 48

Kết luận và kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 1 59

PHỤ LỤC 2 62

Chữ viết

AID Bệnh điếc không hội chứng được

cảm ứng bởi aminoglycoside

Amino-glycoside-induced nonsyndronic deafness

APS Amonium persulphate Amonium persulphate

CPEO Hội chứng liệt mắt cơ ngoài tiến

triển kinh niên

Chronic progressive external ophthalmoplegia

dd H 2 O Nước cất khử trùng loại ion Deionnized distilled H2O

dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate

EDTA Axit ethylen Diamine Tetraacetic Ethylen Diamine Tetraacetic Acid

ETC Chuỗi vận chuyển điện tử Electron transport chain

IPTG Isopropylthio-β-D

Galactopyranoside

Isopropylthio-β-D Galactopyranoside

LB Môi trường Luria Betani Luria Betani

LHON Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền

Leber

Leber herteditary optic neuropathy

MCS Trình tự nhân dòng đa điểm cắt Multiple Cloning Sequence

MERRF Hội chứng động kinh giật cơ với

MT-TL Gen mã hóa cho RNA vận chuyển

NADH Nicotinamide-adenine

dinucleotide (dạng khử)

(Reduced) Nicotinamide-adenine dinucleotide

PCR Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase Chain Reaction

RFLP Sự đa hình các đoạn phân cắt giới

hạn

Restriction Fragment Length Polymorphism

RLCH Rối loạn chuyển hóa

ROS Dạng oxy phản ứng Reactive oxygen species

SSCP Stranded Conformational

Polymorphism

Sự đa hình về cấu hình chuỗi đơn

TAE (Đệm) Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA

TBE (Đệm) Tris- Borate-EDTA Tris- Borate-EDTA

TEMED

N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine

diamine

Hình 1: Các hình dạng khác nhau của ty thể 3

Hình 2: Cấu trúc màng trong ty thể 4

Hình 3: Sơ đồ minh hoạ cơ chế của sự lão hoá theo học thuyết ty thể 6

Hình 4: Sơ đồ minh họa cơ chế sản sinh các ROS trong ty thể 7

Hình 5: Cấu trúc hệ gen ty thể người 10

Hình 6: Các loại đột biến điểm phổ biến trên mtDNA 13

Hình 7: Vị trí trình tự lặp lại 9 bp trên mtDNA 16

Hình 8: Chu kỳ nhiệt của PCR để nhân bản đoạn mtDNA (8155-8366) 31

Hình 9:Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 36

Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 38

Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 38

Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide 39

Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR ở một số gia đình bệnh nhân cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide 40

Hình 14: Kết quả điện di sản phẩm PCR hai gia đình bệnh nhân trên gel polyacrylamide 41 Hình 15: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR và vector pGEM-T 41

vào E coli chủng DH5α 41

Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 42

Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch plasmid trên gel agarose 43

Hình 18: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và bố bệnh nhân gia đình III với trình tự chuẩn hệ gen ty thể công bố trên GenBank 44

Hình 19: Kết quả xác định trình tự của đoạn gen đích của gia đình III (A, B, C) 45

Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 47

Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide 48

Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide 50

Bảng 1: Một số mã di truyền của DNA ty thể khác DNA nhân 11

Bảng 2: Một số hội chứng bệnh kèm theo sự mất đoạn 9 bp 18

Bảng 3: Trình tự các cặp mồi dùng trong PCR 27

Bảng 4: Thành phần bản gel điện di polyacrylamide 30

Bảng 5: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn mtDNA (8155-8366) 31

Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn BanII 32

Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn HeaIII 32

Bảng 8: Thành phần phản ứng gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 33

Bảng 9 : Thành phần phản ứng PCR lần 2 34

Bảng 10: Danh sách bệnh nhân bị đột biến mất đoạn 9 bp 46

Bảng 11: Hàm lượng axit lactic trong máu bệnh nhân bị mất đoạn 9 bp 51

MỞ ĐẦU

Ty thể là một cơ quan tử của tế bào nhân thực có vai trò tạo năng lượng dưới

dạng ATP cho các hoạt động sống của tế bào

Ty thể có hê ̣ gen riêng với DNA dạng mạch vòng , kích thước 16,5 kb, chứa

37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển và 2 RNA ribosome của ty thể

Các gen trong ty thể di truyền từ mẹ sang con

Các protein do gen ty thể mã hóa tham gia vào quá trình trao đổi chất tr ong

ty thể cũng như chuỗi vận chuyển điê ̣n tử trên màng trong của ty thể

Ty thể là nơi xẩy ra quá trình oxy hóa phosphoryl hóa và nhiề u quá trình hóa

sinh khác Các quá trình này tạo ra các dạng oxy phả n ứng (reactive oxygen species)

và là nguyên nhân gây nên nhiều tổn thương trong cấu trúc DNA của ty thể

Tỷ lệ đột biến cao, có kiểu thừa kế khác nhau và số bản sao lớn trên mỗi tế

bào là những đặc trưng chính của DNA ty thể (mtDNA) Nghiên cứu các đột biến

trong mtDNA là một trong những cách cho phép chúng ta hiểu được quá trình tiến

hóa con người, cụ thể là về nguồn gốc, quan hệ họ hàng, khả năng giao phối với họ

khác, sự di cư và nhập cư tới những vùng mới của thế giới

Một loạt các loại hội chứng và bệnh tật, trong đó có quá trình già hóa ung

thư, hiện tượng chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) có nguyên nhân liên

quan đến đột biến trong hệ gen ty thể Các đột biến trong hệ gen ty thể, cho dù là

một đột biến điểm nucleotide, đứt đoạn hay đảo đoạn, thường xảy ra ở các loại mô

bào cần năng lượng như cơ, tim, thận, tuyến nội tiết và đều ảnh hưởng lớn đến chức

năng của chúng đối với cơ thể

Năm 1988, đột biến đầu tiên gây bệnh trên hệ gen ty thể người được biết đến

và ngày nay hơn 270 đột biến gây bệnh trên hệ gen ty thể người đã được phát hiện

Các đột biến trong mtDNA ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp ATP của tế bào

và từ đó ảnh hưởng đến hầu như tất cả các hệ thống cơ quan Tuy nhiên, các tế bào

và các cơ quan bị ảnh hưởng nhiều nhất là những bộ phận có mức tiêu thụ năng

lượng cao như não bộ, cơ xương và tim Nhiều đột biến mtDNA xuất hiện là

nguyên nhân chủ yếu gây mất chức năng cơ, thần kinh

Không phải tất cả các phần của genome ty thể phát triển ở cùng một mức độ

đột biến, phần thay đổi thường xuyên nhất của mtDNA là phần không mã hóa, phần

nằm trong vùng điều khiển gọi là D-loop (chứa hai vùng siêu biến HVR1 và HVR2

chiếm khoảng 7% genome ty thể) Một trong những phần không mã hóa được coi là

chỉ thị sinh học đặc trưng cho nguồn gốc các tộc người là phần trình tự lặp lại 9 bp

nằm trong vùng V giữa gen mã hóa cho cytochrome c oxidase (COII) và tARNLys Tuy

nhiên, đây cũng là vùng đặc trưng cho những đột biến mất đoạn ở các bệnh nhân bị

hội chứng bệnh ty thể

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về genome ty thể chưa được quan tâm nhiều

Việc nghiên cứu đột biến trong hệ gen ty thể có ý nghĩa lớn, góp phần làm sáng tỏ

nguyên nhân của nhiều bệnh di truyền và chuyển hóa cũng như đánh giá mối quan

hệ tiến hóa, di truyền trong quần thể Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật

PCR-RFLP”, trong đó chúng tôi tập trung nghiên cứu về đột biến mất đoạn 9 bp

CCCCCTCTA trong vùng không mã hóa (vùng V) nằm giữa gene mã cho

cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã hóa cho phân tử RNA vận

chuyển Lysine (tRNALys) Ngoài ra, chúng tôi cũng đồng thời nghiên cứu đột biến

điểm A3243G và A8344G được chứng minh là chiếm khoảng 80% số ca mang hội

chứng tương ứng là MELAS và MERRF, qua đó đánh giá khả năng liên quan giữa

sự mất đoa ̣n 9 bp và khả năng bị các đô ̣t biến phổ biến này

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ty thể và hệ gen của ty thể người

1.1.1 Cấu trúc của ty thể người

Ty thể là một bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật trừ tế bào hồng cầu,

bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX Năm 1857, Kolliker (nhà giải phẫu

học người Thụy Sĩ) lần đầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế bào cơ Hơn 30 năm

sau (năm 1890), nhà mô học người Đức Richard Altmann bằng phương pháp

nhuộm fuchsin đã quan sát thấy ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi

quang học [46]

Hình dạng đặc trưng của ty thể là thon dài với đường kính 0,5-2 µm và chiều

dài 7-10 µm, tuy vậy, phụ thuộc vào trạng thái tế bào, loại tế bào ty thể có hình

dạng và kích thước khác nhau (hình 1) Ty thể có khả năng thay đổi kích thước,

hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành

những cấu trúc ngắn hơn Ngoài ra ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với

những thay đổi sinh lý trong tế bào

A B C

Hình 1: Các hình dạng khác nhau của ty thể [46]

A: dạng thon dài, B và C: dạng bị biến đổi

Trong tế bào, ty thể nằm rải rác ở nguyên sinh chất nhưng cũng có thể nằm

tập trung ở khu vực cần nhiều năng lượng như đuôi của tinh trùng Tương tự, số

lượng của ty thể ở một tế bào cũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của

tế bào đó, có thể từ vài ty thể ở tế bào da cho đến vài nghìn ty thể ở tế bào cơ

Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, tương tự màng sinh chất:

màng ngoài và màng trong Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, còn

khoang giữa hai màng được gọi là xoang gian màng Màng trong ty thể ăn sâu vào

chất nền tạo thành các mào răng lƣợc

Màng ngoài ty thể chứa nhiều enzyme quan trọng khác như: kinase,

cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase

Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein với 80% là protein 20% là

lipid Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược và làm tăng diện

tích bề mặt gấp ba lần so với màng ngoài Màng trong chứa nhiều protein vận

chuyển chủ động ATP, ADP, axit béo… và các protein kênh vận chuyển các ion

Na+, K+, Ca2+ và H+ Hơn nữa, màng trong là nơi bám của bốn phức hợp (I, II, III và

IV) thuộc chuỗi vận chuyển điện tử có vai trò xúc tác cho quá trình oxy hóa

phosphoryl hóa tổng hợp nên ATP [27]

Hình 2: Cấu trúc màng trong ty thể [27]

Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi

trung chuyển các chất giữa hai màng Xoang gian màng chứa nhiều ion H+

từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử [27]

Trong màng trong là vùng chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của

chu trình Krebs, protein, ribosom, tRNA và bộ máy di truyền riêng của ty thể: hệ

gen ty thể (mtDNA) Như vậy, ở các động vật, thực vật và người ngoài hệ gen nhân,

còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể

Khi đạt kích thước lớn tối đa, ty thể tiến hành phân đôi để tạo ra hai ty thể mới

Trước tiên, hệ gen ty thể được sao mã để tăng số lượng bản sao Sau đó, màng trong

thắt lại trước rồi đến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra Tuy nhiên, nhiều ty

thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy)

Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào

1.1.2 Chức năng của ty thể người

Ty thể được xem là nhà máy sản xuất năng lượng của tế bào [27] Thức ăn

hàng ngày cơ thể hấp thụ được oxi hóa để tạo ra các chất khử giầu năng lượng mà

sau đó được chuyển thành năng lượng dự trữ ở dạng liên kết phosphate cao năng

trong ATP Khoảng hơn 90% ATP của cơ thể được tạo thành trong ty thể Có hai

giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong vùng chất nền và

quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm trên màng trong

ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme

Thức ăn khi đưa vào cơ thể được chuyển hóa thành đơn vị hóa học cơ bản

mà tế bào có thể sử dụng Ví dụ, bánh mỳ, cơm được chuyển thành đường đơn

glucose Sau đó, glucose được đưa vào tế bào và bắt đầu con đường biến đổi thành

năng lượng dự trữ ATP Giai đoạn đầu tiên, con đường đường phân, glucose được

chuyển thành pyruvate và ATP từ ADP và NADH từ NAD+ Giai đoạn này diễn ra

ở tế bào chất bên ngoài ty thể nên chưa thể hiện rõ vai trò của ty thể trong tổng hợp

năng lượng Vai trò này chỉ được thể hiện rõ ở hai giai đoạn còn lại là chu trình

Krebs và chuỗi vận chuyển điện tử kết hợp tổng hợp ATP

Pyruvate sau khi được chuyển thành acetyl-CoA, tiếp tục được oxi hóa đến

tận cùng tạo thành CO2 và tất cả điện tử còn lại đều được chuyển vào các phân tử

nhận điện tử là NAD+ và FAD để tạo thành NADH và FADH2 qua chu trình Krebs

NADH và FADH2 tạo thành từ con đường đường phân và chu trình Krebs sẽ chuyển

điện tử vừa nhận trước đó vào chuỗi vận chuyển điện tử và trở lại dạng NAD+

và FAD [27]

Chuỗi vận chuyển điện tử gồm 4 phức hợp nằm trên màng trong ty thể và hai

phân tử vận chuyển điện tử giữa các phức hệ là ubiquinone coenzyme Q (Ub CoQ)

và cytochrome c (CytC) Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận điện tử của Ub CoQ từ

NADH và succinate Phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ Ub CoQ

đến CytC Cuối cùng phức hệ IV xúc tác sự vận chuyển điện tử từ CytC tới chất

nhận cuối cùng là oxy (hình 2) Ở mỗi bước electron đi qua các phức hợp, năng

lượng được giải phóng ra dùng để bơm proton (H+) qua màng trong từ chất nền ra

xoang gian màng Một gradien H+ giữa hai phía đối lập của màng (chất nền và

xoang gian màng) được hình thành và điện thế màng xuất hiện Điện thế màng là

động lực tạo nên dòng H+ đi qua hệ thống ATP synthase để di chuyển ngược lại từ

xoang gian màng vào chất nền ty thể Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạt động và

tổng hợp ATP từ ADP và Pi [27]

Như vậy, chức năng quan trọng của ty thể là nơi diễn ra chu trình Krebs và

tổng hợp năng lượng dự trữ ATP của tế bào thông qua chuỗi vận chuyển điện tử Do

đó, một bệnh ty thể có thể làm ngừng hoạt động một số hoặc tất cả ty thể, cắt đứt

nguồn cung cấp năng lượng cơ bản này Gần như tất cả các tế bào của chúng ta dựa

vào ty thể làm nguồn cung cấp năng lượng ổn định, do đó một bệnh ty thể có thể

gây ra rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng tới không chỉ một loại tế bào, một loại mô

hay tổ chức Những triệu chứng chính xác không giống nhau ở mỗi người, bởi vì

một người với bệnh ty thể có thể có một hỗn hợp ty thể khỏe lẫn ty thể đột biến, với

sự phân bố riêng trong cơ thể Đôi khi, một người có đủ ty thể khỏe mạnh để bù đắp

cho những ty thể đột biến

Vai trò thứ hai của ty thể liên quan đến quá trình lão hóa Lão hóa là quá

trình tất yếu diễn ra trong cơ thể sinh vật và không liên quan đến cơ chế apoptosis

(chết tế bào theo chương trình)

Hình 3: Sơ đồ minh hoạ cơ chế của sự lão hoá theo học thuyết ty thể

Học thuyết ty thể về lão hoá được đề xuất bởi Harman cách đây hơn 30 năm

và mặc dù đã qua hơn 3 thập kỷ chứng kiến một số lượng lớn những dữ liệu tương

quan ủng hộ học thuyết này, nhưng chỉ gần đây mới có giả thuyết được kiểm chứng

Học thuyết ty thể về lão hoá đề xuất rằng: ty thể là nguồn gốc của phần lớn các

dạng oxy phản ứng ROS Theo học thuyết này, những tổn thương tích luỹ theo tuổi

tác trong mtDNA là nguyên nhân đi kèm với những rối loạn chức năng ty thể, dẫn

tới việc sản xuất nhiều ROS và phá huỷ mtDNA Khả năng tạo năng lượng ATP của

ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hư hại cấu thành tế bào [23]

Hô hấp tế bào là nguyên nhân sinh ra các gốc tự do gắn liền với bản chất của

sự sống Sự hô hấp tế bào về bản chất là sự chuyển điện tử từ chất dinh dưỡng đến

oxy phân tử thông qua hệ các enzym vận chuyển điện tử trong ty thể Khoảng 0,4-

4% O2 được hô hấp biến đổi thành gốc superoxide ở vị trí phức hợp I và III của

chuỗi vận chuyển điện tử

Như mọi phản ứng oxy hoá khử sinh học, chất oxy hoá chỉ có thể nhận từng

điện tử một, oxy phân tử ở đây cũng chỉ nhận được một điện tử ở nấc đầu tiên tạo ra

các gốc superoxide:

Chất dinh dưỡng→ điện tử + O 2 → O * 2

Gốc tự do superoxide là một trong những gốc tự do độc hại, nó không dừng

lại mà luôn chuyển hoá tiếp để tạo ra các dạng oxy phản ứng khác:

Hình 4: Sơ đồ minh họa cơ chế sản sinh các ROS trong ty thể

Trong số các ROS thì độc hại nhất là gốc HO*, vì nó là gốc tự do điển hình

có khả năng hoạt động khá mạnh ROS có thể tác dụng lên các chất phân tử lớn theo

cách liên ứng, chúng lần lượt tạo ra các gốc tự do từ các phân tử bị tấn công nối tiếp

nhau, gốc tự do sau được tạo thành từ các phân tử trước, cứ thế khuếch đại tác dụng

của sự tấn công ban đầu Gốc tự do sẽ phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng

thất thoát, tế bào không tăng trưởng, không được sửa chữa và chết ROS tạo ra chất

lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay

ROS tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp protein, lipid, đường, tinh bột, enzyme

trong tế bào ROS gây ra các đột biến gene, ở nhiễm sắc thể DNA, RNA Nó làm

chất collagen, elastin mất tính chất đàn hồi, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp

cứng nhắc Đồng thời gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải

chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; ROS tấn công các ty thể, lạp thể khác

phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm

suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được… gốc tự do là

nguyên nhân của sự tự huỷ hoại, sự lão hoá ở cấp độ tế bào

Sự đính của mtDNA ở màng trong ty thể được xem là thuận lợi cho bộ phận

hô hấp, nhưng lại rất gần gũi với bộ phận sản xuất ROS Gốc tự do superoxide tấn

công trực tiếp vào DNA của tế bào hoặc làm xuất hiện các gốc tự do thứ phát có

khả năng tấn công DNA Tác dụng gây tổn thương của ROS đối với DNA chủ yếu

là do kết quả của phản ứng Fenton với sự xúc tác của các ion kim loại hình thành

nên các hydroxyl; gốc này có thể tấn công và gây ra những biến đổi ở bất kỳ gốc

base nào của DNA Đối với protein, sự tấn công của ROS khởi đầu bằng việc gốc

hydroxyl tách một nguyên tử hydro ở carbon vị trí α của một axit amin bất kỳ trên

chuỗi polypetide để tạo ra gốc hữu cơ Gốc hữu cơ nhanh chóng phản ứng với oxy

để tạo ra gốc trung gian alkylperoxyl Dạng này tiếp tục chuyển thành dạng

alkylperoxide và tiếp theo là thành gốc alkoxyl Gốc alkoxyl có thể bị biến đổi

thành một hydroxyl protein Khi ở dạng này thì các chuỗi polypeptide dễ dàng bị

đứt gãy Nói chung tất cả các axit amin đều có thể bị oxi hóa bởi ROS Tuy nhiên,

nguy cơ bị oxi hóa phụ thuộc vào đó là axit amin nào, vị trí của nó trên chuỗi

polypeptide và trên cấu cấu trúc không gian của phân tử protein

Theo học thuyết ty thể về lão hoá, việc tích luỹ những hư hại ở cấu thành ty

thể bao gồm mtDNA, protein, lipid có ảnh hưởng đến chức năng ty thể Nói chung

những tổn thương mtDNA trong phạm vi rộng, thời gian dài và quá trình ngừng

hoạt động của ty thể là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị lão hoá

Ty thể còn giữ vai trò trong quá trình “chết theo chương trình” (apoptosis)

của tế bào Đây là quá trình quan trọng trong sự phát triển và điều hành mô của sinh

vật đa bào Sự sai khác chức năng ở bất cứ mức độ nào đều làm giải phóng các yếu

tố gây “chết theo chương trình” vào khoảng gian màng, làm cho tế bào bị phá hủy

Ty thể tham gia vào quá trình tự chết của tế bào có thể bằng cách giải phóng vào tế

bào chất các yếu tố có tác dụng hoạt hóa các enzyme caspase và endonuclease Tuy

nhiên vai trò của ty thể trong “chết theo chương trình” rất phức tạp và chưa được

biết đến đầy đủ Có thể quá trình tạo năng lượng của ty thể có liên quan tới “chết

theo chương trình” Nguyên nhân có thể do chuỗi hô hấp của ty thể tạo ra sản phẩm

phụ là các dạng ROS và bởi hoạt tính sửa chữa của hệ gen ty thể kém nên càng làm

tăng quá trình này

Ty thể còn có khả năng tích lũy và giữ lượng ion canxi Điều này rất quan

trọng trong việc điều hòa trao đổi chất, tạo ATP và các quá trình khác, như tiết thể

dịch thần kinh [25]

Ngoài ra, ty thể còn đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình

chuyển hóa khác như là: tổn thương tế bào thần kinh do thoát các chất trung gian

glutamate, tăng sinh tế bào, điều hòa trạng thái oxy hóa-khử của tế bào, tổng hợp

nhân heme, steroid, tạo nhiệt (giúp giữ ấm cho cơ thể) Một vài chức năng của ty

thể chỉ được thực hiện ở một số tế bào đặc hiệu nào đó Chẳng hạn, ty thể ở tế bào

gan chứa các enzyme cho phép loại bỏ độc tính của ammonia, đây là chất thải của

quá trình chuyển hóa protein Một sự đột biến các gen điều hòa ở bất cứ các chức

năng này đều có thể gây ra nhiều bệnh ty thể khác nhau

1.1.3 Hệ gen ty thể người

Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập

với hệ gen nhân Hệ gen của ty thể người được Clayton [11] mô tả lần đầu tiên vào

năm 1967 Đến năm 1981, Anderson đã công bố trình tự và cấu trúc hệ gen ty thể

người [6] Hệ gen ty thể tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đôi và có kích thước là

16.569 bp mã hóa cho 2 phân tử RNA ribosome (rRNA), 22 phân tử RNA vận

chuyển (tRNA), và 13 phân tử protein gồm thành phần trong các phức hợp của

chuỗi hô hấp: phức hợp I (ND1-6 và ND4L), phức hợp III (Cytb– cytochrome b),

phức hợp IV (COX1-3), và enzyme ATP synthase (A8 và A6) NCR là vùng không

mã hóa (D−Loop)

Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histone, điều này

làm cho mtDNA giống DNA của vi khuẩn Người ta đã đưa ra nhiều giả thuyết về

nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ

gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn, sống cộng sinh bên trong trong tế

bào sinh vật nhân chuẩn DNA ty thể không có intron (ngoại trừ một số nucleotide

không mã hóa ở giữa một vài gen) và có các gen nằm gối lên nhau Vùng không mã

hóa ở mtDNA người là vùng điều hòa (được gọi là đoạn D-loop) chiếm khoảng 7%

chiều dài ty thể, gồm 1121 bp, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng và chuỗi

nhẹ và chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng

Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng xẩy

ra trong ty thể nhưng các enzyme cho quá trình sao chép lại do hệ gen nhân mã hóa

Quá trình phiên mã và dịch mã của mtDNA được điều khiển bởi gen nhân Hệ gen

ty thể được phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, và bản phiên mã

sau đó được endonuclease phân cắt để hình thành nên các phân tử tRNA, 12S và

16S rRNA, mRNA tiền thân Phân tử mRNA hoàn thiện của ty thể không được gắn

mũ nhưng được gắn đuôi poly(A) [6] Mô hình phiên mã trên có nhiều điểm giống

với một operon của vi khuẩn Điều này càng khẳng định cho giả thuyết về nguồn

gốc ty thể từ vi khuẩn Ty thể người có hệ thống dịch mã riêng với các mã di truyền,

đặc biệt là mã khởi đầu và mã kết thúc, có nhiều điểm khác biệt so với các mã di

truyền của hệ gen nhân (bảng 1)[6]

Hình 5: Cấu trúc hệ gen ty thể người

Bảng 1: Một số mã di truyền của DNA ty thể khác DNA nhân [6]

Mã di truyền Hệ gen nhân Hệ gen ty thể

Gen COI và URF6 có mã kết thúc là AGA và AGG hay gen ATP6 có mã

khởi đầu là GUG [6] Cả 22 phân tử tRNA do hệ gen ty thể mã hóa đều tham gia

vào quá trình tổng hợp các protein Ở người, các nhà nghiên cứu không tìm thấy

hiện tượng phân tử tRNA do hệ gen nhân mã hóa đi từ nguyên sinh chất vào ty thể

để tham gia tổng hợp protein [20] Tuy nhiên, ở một số đối tượng khác như nấm

men, hiện tượng này có xẩy ra và hướng nghiên cứu cơ chế vận chuyển tRNA từ tế bào

chất vào ty thể ở đối tượng trên mở đường cho phương pháp đưa tRNA bình thường vào

ty thể của người để điều trị các bệnh liên quan đến đột biến trên gen tRNA của ty thể

Số lượng bản sao của hệ gen ty thể trong các loại tế bào khác nhau là không

giống nhau, tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của tế bào mà số lượng bản

sao là ít hay nhiều Tỷ số giữa bản sao hệ gen ty thể và hệ gen nhân ở trong cơ tim

là 6970, cao hơn nhiều ở trong cơ xương là 3650 [24]

Sự di truyền của mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất Đối với các gen

nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật vận

động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào Nhưng hệ gen ty thể lại không

tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di

truyền riêng đặc trưng cho chúng

Hệ gen ty thể người được di truyền theo dòng mẹ Ở người, trứng có rất

nhiều ty thể khoảng hơn 100.000 bản sao, trong khi đó tinh trùng chỉ chứa khoảng

100-1.500 bản sao, tập trung ở đuôi tinh trùng Trong quá trình tạo thành hợp tử, tế

bào tinh trùng chỉ đóng góp hệ gen nhân của chúng cho tế bào trứng chứ không

đóng góp hệ gen ty thể Ty thể của tinh trùng bị loại bỏ ngay khi vào trứng có thể do

quá trình phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin Vì vậy, ty thể trong hợp tử mới tạo

thành hoàn toàn của tế bào trứng và tất cả các tính trạng được mã hóa trên hệ gen ty

thể được di truyền từ người mẹ sang người con [47] Đôi khi cơ chế loại bỏ DNA ty

thể của tinh trùng có thể bị hỏng, dẫn đến hiện tượng tế bào chất của hợp tử chứa

DNA ty thể của cả bố và mẹ Hiện tượng này được gọi là hiện tượng “dị tế bào

chất” (heteroplasmy) Do tế bào có chứa số lượng ty thể khác nhau nên các đột biến

trong hệ gen ty thể có những đặc trưng riêng Cơ thể mang đột biến có cả bản sao có

đột biến và bản sao không có đột biến Hiện tượng heteroplasmy có vai trò quy định

mức độ biểu hiện của bệnh mà đột biến gây nên [46]

Hệ gen ty thể thay đổi nhanh hơn khoảng 20 lần so với hệ gen nhân vì hệ gen

dạng trần không được bảo vệ dễ dàng tiếp xúc với tác nhân gây đột biến trong chất

nền, không có các protein bảo vệ kiểu histone như hệ gen nhân, thiếu các yếu tố

kiểm tra khi sao chép, không có hệ thống enzyme để sửa chữa những sai xót do

phóng xạ hoặc oxy hoá, mtDNA không có khả năng tự phục hồi dễ dàng như DNA

nhân Đến nay hơn 270 đột biến trong hệ gen ty đã được phát hiện và chúng gây ra

các triệu chứng bệnh khác nhau, chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh, chức năng

chuyển hoá của cơ thể

1.2 Các loại đột biến trong hệ gen ty thể người và các bệnh liên quan

Ty thể có vai trò tổng hợp ra ATP nhưng genome ty thể chỉ mã hóa cho một

số lượng rất ít protein/enzym Do đó, chức năng ty thể được thực hiện nhờ vào hàng

loạt các protein/enzyme do gen nhân mã hóa Các protein này được tổng hợp trong

tế bào chất rồi được vận chuyển đến ty thể Chính vì vậy, các rối loạn ty thể có thể

phát sinh do những đột biến ở gen nhân hoặc gen ty thể Một số rối loạn ty thể chỉ

ảnh hưởng đến một cơ quan, nhưng cũng có những rối loạn ảnh hưởng đến rất nhiều

cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội (như về thần kinh-cơ) Những rối

loạn ty thể có ở bất kỳ lứa tuổi nào Những rối loạn ty thể có thể làm ảnh hưởng đến

sự hợp nhất của các enzyme trong chuỗi hô hấp (chủ yếu là thiếu hụt các enzyme)

Hầu hết các đột biến gen ty thể đều làm suy giảm chức năng của ty thể, từ đó

gây nên các hội chứng bệnh khác nhau tập trung chủ yếu ở cơ, thần kinh và chức

năng chuyển hóa của cơ thể Các đột biến ty thể hay còn gọi là rối loạn chức năng ty

thể được chia làm hai dạng, do đó cũng có thể chia những bệnh do DNA ty thể gây

ra thành hai dạng chính, đó là các bệnh do sự sắp xếp lại DNA ty thể và các bệnh do

đột biến điểm DNA ty thể

1.2.1 Đột biến điểm

Đột biến điểm là những đột biến gây ra do sự thay thế một nucleotide này

bằng một nucleotide khác (ví dụ A thay thế cho G, T thay thế cho C và ngược lại)

Đột biến điểm trong mtDNA được chia làm 3 dạng nhỏ bao gồm: đột biến gen mã

hóa protein, đột biến gen mã hóa tARN và đột biến gen mã hóa rARN

Hình 6: Các loại đột biến điểm phổ biến trên mtDNA

1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên tRNA và rRNA

Đột biến gen mã hóa tRNA gây ra các bệnh hay hội chứng bệnh MELAS,

MERRF, CPEO

Hội chứng MELAS (Mitochondrial Encephalopathy, Lactic acidosis and

Stroke-like episodes) là hội chứng viêm não tủy sinh axit lactic với các triệu chứng

giống đột quỵ Những biểu hiện ban đầu như đau đầu liên tục, nôn, nhược cơ

thường bắt đầu xuất hiện ở những trẻ em từ 2 đến 10 tuổi Nguyên nhân là do một

trong các loại đột biến A3243G hay T3271C, A3252G, C3256T, T3291C của gen

MT-TL1; đột biến G13513A và A12770G của gen MT-ND5 Các gen bị ảnh hưởng

đều mã cho tRNALeu(UUR), triệu chứng bệnh bắt đầu từ khi bệnh nhân khoảng 10

tuổi, xuất hiện các triệu chứng giống đột quỵ trước năm 40 tuổi Trong đó, đột biến

A3243G được chứng minh là chiếm 80% số ca mang hội chứng MELAS [45] Đột

biến nằm trên gen mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển leucine (UUR)

(tRNALeu(UUR)), gen MT-TL1 Đột biến làm thay đổi cấu trúc, giảm chức năng của

tRNALeu(UUR) và biểu hiện thành bệnh lý

Hội chứng MERRF (Myoclonic epolepsy associated with ragged-red fibres)

là hội chứng động kinh giật cơ với các sợi đỏ nham nhở Nguyên nhân phổ biến do

sự thay đổi A8344G, T8356C gây ra, hai gen bị ảnh hưởng đều mã hóa cho tRNALys

triệu chứng của bệnh là cơ bị co giật , mất điều hòa ở tiểu não , liệt cơ, lên cơn đô ̣ng

kinh, mất khả năng nghe, tăng lactate máu, các sợi cơ đỏ nham nhở Đột biến điểm

A8344G cũng chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [13]

Hội chứng CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội

chứng liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên, do đột biến A3243G, T4274C, hai gen

bị ảnh hưởng mã hóa cho hai tRNA tương ứng là tRNALeu(UUR) và tRNAIle triệu

chứng của bệnh là liệt mắt ngoài, liệt cơ, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và đột tử

Ngoài ra, rất nhiều các đột biến điểm khác trên gen ty thể có liên quan đến

một số bệnh như bệnh lý cơ (myopathy) liên quan đến các đột biến T14709C,

A12320G, bệnh lý cơ tim (cardiomyopathy) do các đột biến A4269G, A3243G,

G8363A, bệnh tiểu đường và câm điếc (MIDD) liên quan đến đột biến C12258A,

A3243G, bệnh lý não cơ (encephalomyopathy) liên quan đến các đột biến T10010C,

G1606A

Đột biến gen mã hóa rRNA như đột biến A1555G gây ra các bệnh điếc

không hội chứng được cảm ứng bởi aminoglycoside (AID)

1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến trên mRNA

Hội chứng Leigh (gây chết, hoại tử não) và bệnh NARP (neuropathy, ataxia

and retinitis pigmentos) gây bệnh yếu cơ ngoại biên do tổn thương thần kinh, rối

loạn cảm giác, thất điều, viêm võng mạc sắc tố đều chủ yếu do đột biến T8993G ở

gen mã hóa tiểu phần ATPase 6 dẫn đến dịch mã sai axit amin ở phần trình tự kỵ

nước của tiểu phần này, khiến cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi nên tạo ra nhiều

gốc oxy tự do gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau Hội chứng Leigh có liên

quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn đến thay thế Phe bằng Leu ở vị trí

124 (F124L) ND5 là gen chức năng gồm 1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) được

mã hóa bởi chuỗi nặng giàu G của mtDNA Sản phẩm của gen ND5 là một thành

phần của phức hệ NADH-ubiquinon oxidoreductase Sản phẩm của gen ND5 nằm ở

phần kỵ nước của phức hệ I Protein này là một trong 7 tiểu phần được mã hóa bởi

mtDNA trong số 42 tiểu phần của phức hệ I của chuỗi hô hấp Đột biến trên gen

ND5 có liên quan tới nhiều bệnh trong đó có LHON, Leigh và MELAS

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy-bệnh liệt thần kinh

thị giác di truyền Leber ) tác động chủ yếu đến võng ma ̣c , gây hô ̣i chứng teo dây

thần kinh thi ̣ giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả 2 mắt Bệnh có thể gây mù ngay

khi tuổi trẻ và thường xuất hiện ở đàn ông Nguyên nhân do các đột biến G3460A,

G11778A, T14484C ở các gen tương ứng ND1, ND4 và ND6 Ngoài ra hội chứng

LHON còn gây ra do sự thay đổi allele, chuyển Ala 458 thành Thre (A458T) Một

đột biến nữa cũng gây ra bệnh này là đột biến chuyển vị trí nucleotide 13730, dẫn

đến sự thay thế Gly bằng Glu ở vị trí 465 của chuỗi polypeptide ND5 (G465E) Các

nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến này có thể bắt nguồn trong dòng phôi của mẹ

Đột biến gen ND6 là điểm nóng gây ra bệnh LHON Gen ND6 là một trong

13 gen mã hóa protein của ty thể, nằm trên chuỗi nhẹ của mtDNA từ vị trí 14149

đến 14673 gồm 524bp [6] ND6 là gen chức năng mã hóa cho một protein nằm

trong phần protein-Fe thuộc phức hệ I của chuỗi vận chuyển điện tử Các đột biến

gen ND6: T14484C, T14459C là các đột biến gây ra thay đổi tương ứng M64V,

A72V Đột biến này không những gây ra các triệu chứng của bệnh LHON mà còn

gây ra hội chứng Leigh Ngoài ra còn có đột biến G14453A đi kèm với các triệu

chứng của bệnh LHON còn có các triệu chứng của hội chứng MELAS

Hội chứng MELAS có liên quan tới sự biến đổi A12770G của gen ND5, dẫn

đến thay thế Glu bằng Gly ở vị trí 145 (E145G)

Bệnh không chịu đƣợc vận động do các đột biến gen CYTB: gen CYTB

mã hóa cho một tiểu đơn vị của phức hệ hô hấp III, có chiều dài 1141bp, từ vị trí

14747 tới 15887, không chứa intron [6] Chuỗi polypeptide dài 380 axit amin do

gen CYTB mã hóa có vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp tế bào thông qua việc

xúc tác cho quá trình vận chuyển điện tử từ ubiquinol (Coenzyme khử Q10) đến

cytochrome c và sử dụng năng lượng để vận chuyển các proton từ màng trong ty thể

ra màng ngoài ty thể Đột biến G15615A dẫn đến thay Gly bằng Asp ở vị trí 290,

được phát hiện ở một bệnh nhân 25 tuổi với triệu chứng không chịu được vận động

[10] Đột biến G14846A dẫn đến thay Gly bằng Ser ở vị trí 34 được phát hiện từ

một trong 5 bệnh nhân bị bệnh không chịu được vận động ngay từ khi còn nhỏ với

triệu chứng yếu cơ và tăng acid lactic máu Bệnh nhân có các sợi cơ đỏ nham nhở

[7] Bên cạnh các đột biến vừa nêu người ta cũng còn phát hiện thấy một số đột biến

khác như G15242A [19], G15150A [21], G14985A và T15572C [30],T14849C

[34] , A15579G [41] đều liên quan đến gen CYTB

1.2.2 Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA

Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xẩy ra trong vùng nhỏ không mã hóa

(vùng V) nằm giữa gen mã cho cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã

hóa cho phân tử RNA vận chuyển Lys (tRNALys

)(hình7) Vùng này gồm hai trình

tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp giữa vị trí nucleotide 8272-8289 trên genome ty

thể Cytochrome c oxidase là một enzyme quan trọng của quá trình hô hấp, tham gia

vào các bước oxy hóa cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử ở ty thể

Cytochrome c oxidase bao gồm 3 tiểu phần lớn và được mã hóa trong ty thể [16]

Hình 7: Vị trí trình tự lặp lại 9 bp trên mtDNA

Đầu tiên mất đoạn 9 bp này được phát hiện thấy ở châu Á và quần thể khởi

đầu ở châu Á là Polynesia và người Mỹ bản địa, sau đó cũng thấy ở châu Phi và

châu Âu với tỷ lệ mất đoạn rất thấp Tần số mất đoạn này là ổn định ở các quốc gia

khác nhau và nó không giống nhau Tỷ lệ mất đoạn thay đổi từ Tây sang Đông, từ

lục địa tới các đảo trên thế giới Người ta đã chứng minh được kiểu mất đoạn ở

Đông Á và quần đảo Thái Bình Dương là chung một nguồn gốc Tuy nhiên kiểu

mất đoạn ở châu Á và châu Phi là có nguồn gốc khác nhau

Các nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy, do các đặc điểm như di truyền

theo mẫu hệ, mức độ đột biến cao và số lượng bản sao lớn, mtDNA là một công cụ

hữu ích để nghiên cứu sự tiến hóa ở người Những đột biến của mtDNA nếu là

trung tính sẽ không bị loại bỏ trong quá trình chọn lọc tự nhiên và có hiện tượng

phiêu bạt gen Do mtDNA được di truyền theo mẫu hệ nên nó tích lũy các đột biến

và phát tán theo các dòng phả hệ mẫu hệ Chính điều này đã tạo nên tính đa hình

của mtDNA, đặc trưng theo quần thể, tạo nên các nhóm đơn bội có quan hệ với

nhau Sự khác biệt của các trình tự mtDNA có thể được sử dụng để xây dựng các

cây phát sinh chủng loại nhằm thể hiện các mối quan hệ tiến hóa

Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, xét về sự thay đổi về chiều dài,

có 4 lớp trình tự khác nhau trong vùng di truyền ngoại gen COII/tRNALys: lớp đầu

tiên và phổ biến nhất ở con người là có 2 bản copy của trình tự lặp lại 9 bp; lớp thứ

hai là kiểu thêm nucleotide (insertion) trong một bản lặp lại 9 bp như là thêm 4 C

tìm thấy ở mtDNA một người châu Á [42], những kiểu thêm khác liên quan tìm

thấy người Indonesia [31], kiểu thêm xấp xỉ 4 nucleotide cũng thấy ở 1 người Việt

nam và 1 người Malay Aborigine [8] Lớp thứ 3 là kiểu lặp lại 3 bản copy của trình

tự 9 bp tìm thấy 1 người Chuckchi từ Siberia và 1 người Tharu từ Nepal Lớp thứ tư

là thay đổi chiều dài liên quan đến mất một bản copy 9 bp

Bệnh nhân

Dựa vào mất đoạn 9 bp cũng để nghiên cứu hành trình di cư của con người

Đầu tiên, mất 1 bản copy 9 bp là đặc trưng cho người châu Á và được giả thuyết là

bắt nguồn từ Trung Quốc Có một sự tăng tương ứng trong tần số mất đoạn 9 bp từ

Tây sang Đông: tần số này thay đổi từ 3-18% từ Nhật Bản tới châu Á lục địa tới bán

đảo Malaysia, từ 8-42% ở các đảo châu Á Sự phổ biến của mất đoạn 9 bp được

thấy trong quần thể Châu Á bao gồm Trung Quốc (15%) Việt Nam (20%), Thái Lan

(29%), Nhật Bản (20%) Nhưng tần số này thấp hơn ở những quần thể ở những

vùng khác bao gồm New Britain (8%), Nga (5%), và Caucasus (0%, Đông Nam

châu Âu và Tây Nam châu Á) Trong trình tự mtDNA hoàn chỉnh có đại diện người

Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, người Hoa bản xứ (Đài loan), Philipin, Malaisia,

Thái Lan là những người châu Á có quan hệ chủng tộc gần gũi với Việt Nam[31]

Đa hình mất đoạn 9 bp ty thể có tần số khác nhau trong dân số Nam Ấn Độ

Tần số mất đoạn 9 bp ở các bộ lạc Ấn Độ trung bình là 12% kết hợp với nhiều đa

hình ở vùng HVS-1 Ngoài ra, kiểu trình tự lặp lại 18bp (8272-8289) thay đổi trong

4 cá thể từ bộ lạc Santal và Khonda Dora của Ấn Độ, so với trình tự chuẩn

Cambridge [40] Đó là những kiểu thêm nucleotide C ở đầu 5’ hoặc 3’ của trình tự

lặp lại, do đó làm thay đổi chiều dài vùng này là 21-22bp

Quần đảo Indonesia (17.500 hòn đảo với gần 213 triệu người: sự mở rộng

văn hóa, ngôn ngữ và có lẽ đa dạng về mặt di truyền), một nghiên cứu thực hiện

trên 1.091 cá thể đại diện 15 dân tộc cho thấy tần số mất đoạn 9 bp là thay đổi ở các

nhóm dân tộc khác nhau Một số nhóm dân tộc có sự khác biệt trình tự lặp của

nucleotide đầu 5’ hay đầu 3’ (thêm C, mất T), một số lại có thêm 1 bản copy nữa

của đoạn 9 bp Chứng tỏ sự đa dạng di truyền trong dân số của quần thể này [15]

Nghiên cứu hiện tượng này sẽ góp phần hiểu được cấu trúc quần thể và

nguồn gốc phát sinh của quần thể Việt Nam, đồng thời xác định một số bệnh liên

quan mất đoạn 9 bp ở người Việt Nam

Nguyên nhân đột biến mất đoạn 9 bp là do tích lũy qua hàng ngàn năm Tần

số đột biến mất đoạn cao ở mtDNA là kết quả của sự tích lũy nhiều đột biến thay

thế base trung tính và đặc hiệu quần thể Các đột biến này được tích lũy liên tục

theo kiểu phát tán trong các dòng mẹ và được chia nhánh xấp xỉ với khoảng thời

gian các quần thể người định cư ở các vùng địa lý khác nhau trên thế giới Sự mất

đoạn này không chắc chắn rằng được phát sinh sớm trong phôi vì trong cả nguyên

phân và giảm phân, ty thể được phân chia một cách ngẫu nhiên tới tế bào con và vì

vậy mối quan hệ tỷ lệ mtDNA đột biến và mtDNA bình thường là có tính ngẫu

nhiên Giải thích đơn giản nhất và đáng tin nhất là đột biến mất đoạn 9 bp được cô

lập qua nhiều thế hệ, như xảy ra trong một vài dòng mẹ cùng với những bệnh ty thể

và hiện tượng đa hình một cách lặng lẽ

Đột biến xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản không được sửa

chữa, do quá trình sao chép bị lỗi Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuất hiện như kết quả

của một lỗi không được sửa chữa trong quá trình sao chép của mtDNA

Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp được xem xét trên hai phương diện: nguồn gốc

tiến hóa và liên quan đến bệnh tật do liên quan đến các bệnh rối loạn ty thể Một số

nghiên cứu đã đi sâu tìm hiểu sự liên quan giữa mất đoạn 9 bp với một số đột biến

khác và thấy rằng ở những người mang đột biến mất đoạn 9 bp, tỷ lệ mang hột

chứng MELAS, MERRF hay bệnh đa u nang buồng trứng cao hơn đáng kể so với

người bình thường (bảng 2)

Bảng 2: Một số hội chứng bệnh kèm theo sự mất đoạn 9 bp [22, 43]

Quốc gia Hội chứng bệnh Số mẫu

nghiên cứu

Đột biến mất đoạn 9 bp

Một nghiên cứu khác đã phát hiện thấy trong 9 bệnh nhân bị bệnh Gaucher

type I thì 6 người có đột biến mất đoạn 9 bp; trong 3 bệnh nhân bị Gaucher type II

thì 2 người mất đoạn 9 bp Điều này chứng tỏ có mối liên quan nào đó giữa hiện

tượng đột biến mất đoạn 9 bp này và bệnh Gaucher [17]

Một bệnh nhân bị hội chứng Kearns-Sayre (mất đoạn 5,5 kb ở vùng

8278-13770) đi kèm mất đoạn 9 bp trong mtDNA ở một gia đình người Nga có dòng dõi

Slavic (nhóm ngôn ngữ riêng), mẹ bệnh nhân chỉ bị mất đoạn 9 bp Sự mất đoạn 9

bp là đột biến mới lần đầu quan sát thấy ở đây, một hiện tượng rất hiếm gặp[36]

Mất đoạn 9 bp cũng được tìm thấy trong tế bào sợi cơ xương và tế bào

lympho (bạch huyết) của một người đàn ông Tây Ban Nha thuộc vùng Caucasia

(nơi mà không xảy ra sự mất đoạn)[9]

Tóm lại, mất đoạn 9 bp trong mtDNA có thể là một yếu tố nhạy cảm đối với

những tác động khác lên mtDNA

Ở Việt Nam, dường như không có dữ liệu về mất đoạn 9 bp trong dân số,

trong khi đó nhiều quốc gia đã sử dụng chỉ thị (marker) này để điều tra các nhóm

sắc tộc và bộ lạc để tìm hiểu mối quan hệ di truyền, nguồn gốc tiến hóa và phát

sinh, sự di cư (giữa đảo và lục địa, giữa các dân tộc, giai cấp và bộ lạc) và ảnh

hưởng yếu tố nhập cư cũng như quá trình thuộc địa hóa

Năm 1999, Vũ Triệu An và các nhà khoa học Pháp [18] đã nghiên cứu tính

đa hình DNA ty thể bằng phân tích sử dụng 6 enzyme cắt giới hạn (HpaI, BamHI,

HaeIII, MspI, AvaII, HincII) qua đó họ phát hiện 4 kiểu mtDNA – có vị trí đa hình

mới của enzyme chỉ có ở Việt Nam và sàng lọc sự có mặt của mất đoạn 9 bp trên 50

mẫu người khỏe mạnh dân tộc Kinh ở Việt Nam Kết quả cũng cho thấy sự mất

đoạn 9 bp gặp trong 10 cá thể chiếm tỷ lệ 20% Những dữ liệu nghiên cứu của

Ivanova [18] cho thấy Việt Nam có sự khác nhau trong dân số cao nhất Đông Nam

Á (dựa vào giá trị hệ số đồng nhất trong quần thể -F), chứng tỏ Việt Nam là dân tộc

lâu đời nhất trong vùng Nghiên cứu này công bố một số liệu đáng tin cậy được các

quốc gia khác sử dụng khi so sánh với các tộc người khác trong vùng

Theo Ballinger [8] khi nghiên cứu sự mất đoạn này ở châu Á cho thấy tỷ lệ

mất đoạn 9 bp trung bình ở dân số Việt Nam 17,9%

Quyền Đình Thi và tập thể [4] phát hiện 3 cá thể đa hình 8273:8281del (mất

đoạn 9 bp) khi xác định trình tự đoạn DNA từ vị trí 5805-8414 trong hệ gen ty thể

người Việt Nam Tuy nhiên nghiên cứu này chỉ dừng ở mức phát hiện đột biến mà

không có đánh giá gì về mức độ ảnh hưởng và tầm quan trọng của nó

Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu khác liên quan đến ty thể như nghiên

cứu đoạn HV1 thuộc vùng D-loop của hệ gen ty thể 35 cá thể Việt Nam định cư tại

Mỹ được Oota và đồng tác giả công bố 2002 [29]; trình tự đoạn HV1 được nghiên

cứu trong giám định hài cốt liệt sỹ của Lê Quang Huấn [2]; được sử dụng trong

nghiên cứu bệnh ung thư vú ở các đối tượng Việt Nam [1]

1.2.3 Các loại đột biến khác của hệ gen ty thể

Bệnh liệt mắc tăng tiến (PEO-Progressive external ophthalmoplegia) do đột

biến mất một số đoạn trên mtDNA gây ra, với các triệu chứng khác so với bệnh liệt

mắt tăng tiến kinh niên (CPEO) như nhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ

Hội chứng Kearns-Sayer (Kearns-Sayer syndrome - KSS) do mất đoạn

mtDNA khoảng 2-4 kb, thường là 4997 bp từ vị trí nucleotide thứ 8488 đến 13460

Tại điểm đứt gãy thường có một đoạn 13 bp lặp lại Ngoài những triệu chứng PEO,

KSS còn có những triệu chứng khác như nghẽn tim, thoái hóa sắc tố võng mạc

Nguyên nhân gây ra hội chứng Pearson (Pearson syndrome) cũng giống

nguyên nhân gây KSS Triệu chứng là thiếu máu do thiếu sắt, thiểu năng tuyến tụy,

tiểu đường phụ thuộc insulin

Bệnh Parkinson/hội chứng gối nhau MELAS do đột biến mất đoạn TTAA

bắt đầu ở vị trí 14787 của gen CYTB Bệnh nhân có một rối loạn nặng tiến triển bắt

đầu ở 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động tinh tế Sau này, bệnh

nhân phát triển tình trạng thay đổi hành vi, có hội chứng parkinson, rung giật cơ,

các phản xạ gân duỗi bàn chân tăng và nhồi máu não [12]

Ngoài ra, một số bệnh đột biến gen ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn

Nghiên cứu đầu tiên về một đột biến đảo đoạn gây bệnh về cơ trong mtDNA ở

người được phát hiện bởi Musumeci và tập thể [26] Đó là một người đàn ông 43

tuổi, ngay khi còn nhỏ không chịu được vận động và đau cơ Bệnh nhân được phát

hiện mang đột biến đảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng

3902 và 3908 thuộc gen mã hóa cho ND1 của NADH ubiquinone oxidoreductase

(phức hợp I) Đột biến đảo đoạn này dẫn đến thay thế 3 axit amin (D199G, L200K,

và A201V) có tính bảo thủ cao trong chuỗi polypeptide, là đột biến dị tế bào chất

(heteroplasmic 80%) thấy trong cơ nhưng lại không phát hiện thấy trong máu bệnh

nhân Đột biến này là phù hợp với những khiếm khuyết hóa sinh trong mô cơ của bệnh

nhân Sự thay đổi 3 axit amin liên tiếp từ Asp-Leu-Ala sang Gly-Lys-Val, liên quan đến

một vùng bảo thủ cao của gen ND1 có một vai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone

Tóm lại, các bệnh di truyền ty thể thường có liên quan đến nhau, được biểu hiện

bởi các triệu chứng khá giống nhau Muốn xác định được cá thể bị bệnh mang đột biến gì

để chẩn đoán được bệnh chính xác thì cần phải sử dụng đến các phân tích DNA

1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể

1.3.1 Lai DNA

Phân tích dot-blot sử du ̣ng mẫu dò có gắn phóng xạ ASO -P32 phát hiện được

nhiều đô ̣t biến điểm cùng lúc Mẫu dò ASO dài khoảng hai mươi nucleotide, vị trí

đô ̣t biến đă ̣t giữa mẫu dò Cần thiết kế mẫu dò đă ̣c trưng trình tự đô ̣t biến và mẫu dò

đă ̣c trưng trình tự không đô ̣t biến cho mỗi sản phẩm PCR

1.3.2 PCR kết hợp RFLP (PCR-RFLP)

Nỗ lực đầu tiên trong việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ DNA

được thực hiện nhờ kết hợp sử dụng các enzyme giới hạn

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân

đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn Khi ủ DNA với enzyme giới hạn

ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn

DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sử

dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc

hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ

gen Sự khác biệt về trình tự nucleotide của đối tượng này so với đối tượng kia có

thể dẫn đến sự thêm hay bớt đi các điểm phân cắt của các enzyme giới hạn, làm cho

các đoạn DNA phân cắt có kích thước khác nhau, có thể nhận biết được dựa trên

phổ băng điện di

Như vậy, biến dị xảy ra trong trình tự của DNA tại những vị trí giới hạn đặc

hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA giới hạn (RFLP) khi

được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu Hiện tượng này đã tạo ra sự

đa dạng trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel, chuyển

lên trên màng lai và dùng các probe đặc hiệu có hoạt tính phóng xạ để phát hiện thì

có thể đánh giá được các biến dị này

Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn

Kĩ thuât PCR còn gọi là kỹ thuật nhân gen in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát

minh vào năm 1985 Nguyên tắc: phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả

năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn

DNA (gen) khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu Do DNA polymerase hoạt

động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn-mồi, trong môi trường thích hợp có các

dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn Vì vậy để nhân bản được

đoạn DNA đích, người ta cần phải biết được trình tự nucleotide ở hai đầu của đoạn

DNA cần nhân bản để từ đó thiết kế nên các mồi (primer) đặc hiệu Kỹ thuật này có

hai điểm quan trọng, thứ nhất là đoạn DNA khuôn sẽ được nhân lên ở trình tự nằm

giữa hai mồi (mồi xuôi và mồi ngược), do đó không cần phải tách DNA cần nhân

lên ra khỏi đoạn gen mà chỉ cần xác định đúng mồi cho đoạn cần nhân lên để nó gắn

được với khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, thứ hai là DNA polymerase được điều

khiển để tổng hợp lên đoạn DNA đặc thù nằm giữa hai mồi này, kết quả là đoạn

DNA định trước được nhân lên Đáng chú ý là kỹ thuật phản ứng PCR rất nhạy, chỉ

đòi hỏi một lượng khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10-3g) để phản ứng có thể diễn ra

Phối hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến

dị di truyền ở mức DNA hiệu quả hơn rất nhiều so với các phương pháp cổ điển

Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát,

sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên

gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ

hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP

Các đột biến điểm trong mtDNA có thể phát hiện dễ dàng bằng kỹ thuật

PCR-RFLP Bước đầu tiên là thiết kế mồi n hân đoa ̣n mtDNA cần kiểm tra bằng

PCR, sản phẩm PCR được cắt bằng enzym e giớ i ha ̣n , sau đó điê ̣n di trên gel

polysacrylamide không biến tính Việc sử dụng enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định

trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDNA Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme

có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến điểm hoặc do chủ động thiết kế mồi mà có thể xác

định được mẫu bị đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt enzyme

Sử dụng phương pháp PCR-RFLP, một đột biến T14728C trong mtDNA của

gen mã hóa cho tRNAGlu trong một bệnh nhân nữ 56 tuổi, có biểu hiện bệnh não cơ

ty thể nặng đã được xác định bởi Nogueira và tập thể [28] Đoạn DNA nhân bản có kích

thước 153 bp, khi được cắt bằng DraI (TTT/AAA), thì mẫu DNA bình thường, có trình

tự nhận biết của DraI (TTT/AAA) sẽ bị cắt thành hai đoạn 127 bp và 26 bp, mẫu DNA

đột biến thì không có vị trí cắt của DraI nên sẽ giữ nguyên kích thước là 153 bp

Ngày nay, rất nhiều đột biến điểm trong hệ gen ty thể và hệ gen nhân đã

được phát hiện nhanh chóng bằng kỹ thuật PCR-RFLP

1.3.3 Xác định trình tự nucleotide

Giải trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger được tiến hành dựa vào

đặc tính làm ngừng phản ứng tổng hợp mạch DNA của các 2’,3’-dideoxynucleotide

Các dideoxynucleotide có cấu tạo tương tự như deoxynucleotide nhưng nhóm 3’OH

được thay bằng H Khi một dideoxynucleotide được đưa ngẫu nhiên vào mạch đang

tổng hợp thì liên kết phosphodieste không được tiếp tục tạo thành và quá trình tổng

hợp ngừng lại [32] Như vậy, từ một mạch khuôn có kích thước ban đầu thông qua

PCR tạo thành một tập hợp các mạch có kích thước khác nhau, tận cùng là các

dideoxynucleotide Tập hợp này được điện di trên gel polyacrylamide để những

đoạn có kích thước khác nhau một nucleotide cũng có khả năng tách nhau Trong hệ

thống máy tự động, mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng các chất phát

huỳnh quang khác nhau Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một

loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu và đầu đọc laser nhận biết tín hiệu và

hiển thị hình ảnh trên máy tính

Xác định trình tự nucleotide là phương pháp cho kết quả chính xác nhất

trong việc phát hiện các loại đột biến gen Tuy vậy đây cũng là kỹ thuật tốn thời

gian và chi phí cao, vì vậy kỹ thuật xác định trình tự thường được sử dụng để khẳng

định sự có mặt của các đột biến trong đó có các đột biến trong mtDNA

1.3.4 PCR định lượng

Về nguyên tắc kỹ thuật Real time-PCR cũng dựa trên khả năng nhân bản một

trình tự DNA đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme DNA polymerase Tuy

nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thường, Real time- PCR cho phép phát hiện và

định lượng sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do

trong hỗn hợp có bổ sung thêm chất phát tín hiệu Chất phát tín hiệu này khi liên kết

với sản phẩm PCR sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và được bộ phận phát hiện huỳnh

quang của máy PCR thu nhận Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh lượng sản

phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ Chính vì vậy, kỹ thuật Real time- PCR có độ

chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp

giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuếch đại

Để định lượng một loại đột biến điểm trong DNA bằng phương pháp

Real-time PCR, đầu tiên sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa đoạn chèn có đột biến và không

đột biến để xác định hàm lượng DNA có trong mẫu tách chiết plasmid bằng cách đo

độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm để xác định số bản copy có trong mẫu tách chiết,

sau đó pha loãng mẫu lần lượt thành109

copy–10 copy/l dùng làm khuôn cho phản ứng Real-time PCR Hai loại mẫu dò đánh dấu huỳnh quang được thiết kế có trình

tự nucleotide bổ sung với trình tự khuôn bị đột biến và không đột biến Sau đó tiến

hành phản ứng PCR, thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) được gắn với một module

phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại

xảy ra Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch

đại trong mỗi chu kỳ Dựa vào đồ thị chuẩn được xây dựng đồng thời trong quá

trình chạy real-time, có thể xác định được số bản copy DNA được nhân lên sau n

chu kỳ và từ đó chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính

xác và độ nhạy cao, dựa vào công thức:

N f = N o (1+Y) n-1

Trong đó Nf: số đoạn DNA cuối cùng, No: số đoạn DNA ban đầu, Y: hiệu quả kéo dài mồi [5]

Bệnh tiểu đường, bệnh điếc và bệnh não cơ ty thể, tăng acid lactic máu với triệu

chứng giống như đột quỵ được di truyền từ mẹ sang con là kết quả từ đột biến điểm

A3243G ty thể Một nghiên cứuđược thực hiện bởi Singh và tập thể [35] kiểm tra trên

293 mẫu gồm 23 mẫu dương tính, 40 mẫu âm tính và 230 mẫu từ những bệnh nhân

được phân loại lâm sàng bị tiểu đường type 2 Tất cả các mẫu dương tính được phát

hiện chính xác và tất cả những mẫu đó được định lượng, mức độ đột biến được xác

định sử dụng thí nghiệm Realtime với hệ số tương quan tốt (r2 = 0,88 và 0,93) Thiết kế

mồi và mẫu dò để nhận dạng trình tự bình thường (A) và trình tự đột biến (G) ở vị trí

nucleotide A3243G của genome ty thể Mẫu dò chỉ khác nhau 1 nucleotide để phân

biệt đột biến Gắn mẫu dò đột biến và không đột biến với chất phát huỳnh quang khác

nhau cho phép định lượng đột biến A3243G trong mỗi ống phân tích:

Bình thường VIC-CCGGGCTCTGCCAT-MGB 3237-3250

Đột biến 6FAM-CCGGGCCCTGCCAT-MGB 3237-3250

Mẫu dò gắn đầu 5’ với 6-FAM hay VIC và đầu 3’ là MGB (minor groove

binding protein) Sử dụng MGB làm tăng nhiệt độ nóng chảy của hai phần mẫu

dò/khuôn và cho phép sử dụng mẫu dò ngắn hơn, đặc trưng hơn Ngoài ra, người ta

có thể sử dung mồi chứa nucleotide cải tiến (locked nucleic acid) để tạo ra sự khác

nhau rõ rệt về nhiệt độ gắn của mẫu dò đối với dạng bình thường và đột biến chỉ

khác nhau một nucleotide

Phương pháp này có giá trị bởi thí nghiệm trộn hỗn hợp (mixing) và phân

tích đường chuẩn Plasmid có đột biến và không đột biến được trộn lẫn để tạo ra

mẫu có nồng độ đột biến A3243G thay đổi 0,01-100%, được sử dụng để xác định

mức độ thấp nhất để nhận ra đột biến dựa trên đường chuẩn Kết quả là mức độ đột

biến ở các mẫu bệnh nhân nằm trong phạm vi từ 3 tới 60% Riêng có một mẫu

dương tính (bệnh nhân nam 77 tuổi) từ 230 mẫu bệnh nhân được phân loại lâm sàng

bị tiểu đường type 2 cho thấy 0,6% heteroplasmy (đột biến A3243G), mà trước đây

này bằng phương pháp PCR-RFLP không phát hiện được đột biến ở bệnh nhân này

Chứng tỏ phương pháp này có độ nhạy rất cao [35]

Để theo dõi sự suy yếu mtDNA, một phương pháp định lượng chính xác số

bản copy mtDNA bằng realtime PCR được phát triển bởi Strand và tập thể [37]

Nghiên cứu đã định lượng đột biến A3243G trên gene tRNALeu gây hội chứng

MELAS (đột biến này cũng kết hợp với bệnh tiểu đường và mất khả năng nghe di

truyền theo mẹ) và đột biến T8993G là đột biến gene ATPase6 trên mtDNA liên

quan đến hội chứng NARP (gây bệnh yếu cơ ngoại biên do tổn thương thần kinh,

rối loạn cảm giác, thất điều, viêm võng mạc sắc tố) khi tần số đột biến thấp và gây

hội chứng Leigh khi xuất hiện với tần số đột biến cao

1.3.5 Một số phương pháp khác

Kéo dài mồi dựa trên đánh dấu huỳnh quang sử dụng VentR (exo-) DNA

polymerase để loa ̣i trừ sự hình thành heteroduplex cũng là một trong các phương

pháp được dụng trong phát hiện đột biến điểm Các DNA homoduplex đươ ̣c đánh

dấu và phân cắt b ằng enzyme giới hạn, phân tách trên máy giải trình tự DNA tự

đô ̣ng Tỷ lệ mtDNA đô ̣t biến được xác đi ̣nh theo mâ ̣t đô ̣ huỳnh quang của các đoạn

DNA đột biến và không đô ̣t biến

Kỹ thuật SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism) với

nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có một

cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó Cấu hình này được xác định bởi các liên

kết nội phân tử Các cấu hình sẽ khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một

nucleotide Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel

polyacrylamide Phương pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chưa

biết ở bê ̣nh nhân nghi ngờ rối loa ̣n mtDNA, đi ̣nh lượng mtDNA đô ̣t biến Đầu tiên,

thực hiện PCR để khuếch đa ̣i đoa ̣n DNA xung quanh vị trí đột biến (khoảng

200-350 bp, tốt nhất DNA kích thước khoảng 150 bp) với một mồi có gắn phóng xạ

(đánh dấu dATP-P32 hoặc huỳnh quang) và một mồi không gắn phóng xạ để tạo nên

đoạn DNA sợi kép ngắn Sản phẩm PCR được biến tính thành sợi đơn và phân tách

bằng điện di trên gel polyacrylamide không biến tính Gel này cho phép các sợi đơn

tái tạo lại cấu trúc, hình thành cấu trúc thứ cấp khác nhau Những mảnh DNA sợi

đơn khác nhau sẽ hình thành tập hợp những cấu trúc thứ cấp và chính vì thế tạo nên

kiểu băng điện di khác nhau trên gel Phân tích tự đô ̣ng bằng điê ̣n di ma o quản hoă ̣c

bằng autoradiography Trình tự khác nhau làm thay đổi cấu trúc DNA, do đó các

băng mang đô ̣t biến được phân biê ̣t bởi sự di trú khi điê ̣n di So sánh với đối chứng,

xác định trình tự nucleotide

Chip DNA hoặc DNA microarray là một kỹ thuật mới để phát hiện các đột

biến đặc hiệu với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng

vi tính Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide đóng vai trò của các đoạn

dò (probe) được máy cài lên một phiến kính nhỏ Mỗi phiến kính như vậy với diện

tích khoảng 1 cm2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide

khác nhau Các oligonucleotide này gồm các DNA có trình tự bình thường và các

DNA có trình tự mang các đột biến gây bệnh đã biết DNA của một đối tượng nào

đó được gắn huỳnh quang và cho lai với các oligonucleotide trên phiến kính để xác

định xem chúng lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến Mẫu lai được

phân tích trên máy vi tính để xác định DNA của đối tượng là bình thường hay mang

loại đột biến cụ thể nào

Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích

bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng

enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát

huỳnh quang (Cy3/Cy5 (cyanine), streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P,

33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin, và

nhuộm vàng/bạc Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất Cy3 là một chất

nhuộm huỳnh quang tan trong nước thuộc họ cyanine có bước sóng kích thích/bước

sóng phát huỳnh quang cực đại là 550/570 nm Cy3 thường được tổng hợp với các

nhóm phản ứng ở một hoặc cả hai vị trí của nitơ để có thể tương tác với cả axit

nucleic lẫn protein

Năm 2009, Du và cộng sự [14] đã thử nghiệm biochip trên 7 bệnh nhân có

triệu chứng lâm sàng được chẩn đoán MELAS, 5 bệnh nhân MERRF, 1 trường hợp

nghi nghờ MERRF và 25 người khỏe mạnh Sử dụng DNA khuôn gắn chất huỳnh

quang Cy5, sau đó khuếch đại bằng PCR, rồi tiến hành lai với mẫu dò-31 mẫu dò

được thiết kế để sàng lọc 31 loại đột biến điểm gây nên MELAS và MERRF, mỗi

cặp mẫu dò cụ thể cho một đột biến nhất định có trình tự giống hệt ngoại trừ một

nucleotide thay thế nằm gần giữa trình tự Các tín hiệu huỳnh quang từ tất cả các

điểm trên biochip được bắt giữ bởi một đầu đọc tín hiệu huỳnh quang (GenePix

4000B, Axon Instruments, Inc.) tại bước sóng 635 nm cho Cy5 và phân tích bởi

phần mềm GenePix Pro 4.0 Kết quả cho thấy tất cả bệnh nhân chẩn đoán MELAS

có đột biến A3243G trên tARNLeu (heteroplasmy), trong những bệnh nhân MERRF

có 4 trường hợp là đột biến A8344G trên tARNLys

(homoplasmy), 1 trường hợp T8356C trên tARNLys (heteroplasmy) Không ai trong số người khỏe mạnh mang

những đột biến này

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu: mẫu máu của 72 bệnh nhân được chẩn đoán mang

dấu hiệu bệnh ty thể và mẫu máu của bố mẹ bệnh nhân đó do Bệnh viện Nhi Trung

ương cung cấp (phụ lục 1) Các mẫu máu được bảo quản ở -20oC

Hóa chất gồm: các cặp mồi để sàng lọc các loại đột biến điểm trên mtDNA

và cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv (bảng 3) được mua từ hãng Invitrogen và

Fermentas, thang chuẩn DNA, dNTP và các enzyme được mua từ hãng Fermentas;

bộ kit tách chiết DNA được mua từ hãng Qiagen, kit pGEM-T được mua từ hãng

Invitrogen; Taq DNA polymerase của Hãng Enzynomics và Protein cung cấp, hóa

chất cho giải trình tự của hãng Beckman Coulter Các hóa chất còn lại đều đạt độ

tinh sạch cho nghiên cứu sinh học phân tử

Hai loại cặp mồi để kiểm tra sự có mặt của 2 loại đột biến điểm A3243G và

A8344G trên mtDNA gây nên các hội chứng tương ứng là MELAS và MERRF

(bảng 3) Trong đó, cặp mồi MRAGFw và MRAGRv được sử dụng để sàng lọc

đồng thời hai loại đột biến là A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA

Bảng 3: Trình tự các cặp mồi dùng trong PCR STT Tên mồi Trình tự mồi

Các cặp mồi được thiết kế để bắt cặp đặc hiệu với đoạn DNA cần nhân lên,

trong đó có những mồi chứa nucleotide không ghép cặp (mismatch) để tạo thêm

hoặc giảm bớt vị trí cắt của các enzyme giới hạn, từ đó tạo nên các băng điện di

khác nhau ở mẫu bệnh nhân bị đột biến và không đột biến

Thiết bị máy móc chính gồm: máy điện di ngang và điện di đứng, máy PCR

(Eppendorf), máy soi và chụ ảnh gel (BioRad), máy đo mật độ hấp thụ quang học (Nano

Drop), máy đọc trình tự CEQ 8000 ( Beckman Coulter) và nhiều thiết bị cần thiết khác